Методическая статья

Масштабируемый рабочий процесс биопроизводства для производства и выделения внеклеточных биотерапевтических средств для лечения рака на основе естественных клеток-киллеров

1.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67227

⸱

16 августа 2024 г.

 ,  ,  , 
1Biologic and Radiopharmaceutical Drugs Directorate, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology Institute, University of Ottawa, 3Centre for Infection, Immunity and Inflammation Institute, University of Ottawa, 4Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Внеклеточные везикулы, полученные из естественных киллерных клеток (NK-EVs), обладают многообещающим потенциалом в качестве биотерапевтических средств для лечения рака. В этом исследовании, основанном на методологии, представлен масштабируемый рабочий процесс биопроизводства с замкнутым циклом, предназначенный для непрерывного производства и изоляции больших количеств NK-EV высокой чистоты. Контрольное тестирование в процессе производства проводится на протяжении всего рабочего процесса биопроизводства, что гарантирует, что электромобили соответствуют стандартам качества для выпуска продукции.

Аннотация

Внеклеточные везикулы, полученные из естественных киллерных клеток (NK-EVs), исследуются в качестве биотерапевтических средств для лечения рака. Они обладают уникальными свойствами в качестве цитотоксических нановезикул, нацеленных на раковые клетки, и в качестве иммуномодулирующих коммуникаторов. Масштабируемый рабочий процесс биопроизводства позволяет производить большие партии NK-EV высокой чистоты для удовлетворения доклинических и клинических потребностей. В рабочем процессе используется биореактор с полым волокном замкнутого цикла, обеспечивающий непрерывное производство NK-EV из клеточной линии NK92-MI в условиях без сыворотки, без ксено, без кормушек и антибиотиков в соответствии со стандартами надлежащей производственной практики. В этом исследовании, основанном на протоколе, описывается процесс биопроизводства для выделения NK-EV с использованием эксклюзионной хроматографии, ультрафильтрации и стерилизации на основе фильтров. Основная характеристика продуктов NK-EV выполняется с помощью анализа с отслеживанием наночастиц, а их функциональность оценивается с помощью валидированного анализа жизнеспособности клеток против раковых клеток. Этот масштабируемый биопроизводственный процесс обладает значительным потенциалом для продвижения клинической трансляции биотерапевтических средств на основе NK-EV за счет соблюдения передовых практик и обеспечения воспроизводимости.

Введение

В 21веке были достигнуты замечательные успехи в борьбе с раком. В основном это связано с ростом иммунотерапии рака, класса препаратов, которые используют иммунную систему для борьбы с раком. Внеклеточные везикулы, полученные из естественных киллерных клеток (NK-EVs), представляют собой многообещающих соперников в расширяющейся области иммунотерапии. Интегративные для врожденного и адаптивного иммунитета, NK-клетки играют решающую роль в защите организма от вирусинфицированных, стрессовых и злокачественных клеток. Они используют полный арсенал противораковых механизмов для уничтожения аномальных клеток с помощью цитотоксических средств 1,2,3. Среди этих механизмов — производство и секреция EV, наноразмерных бислойных структур, содержащих различные биомолекулы, такие как белки, РНК и ДНК, которые имеют решающее значение для облегчения межклеточной коммуникации 4,5,6. NK-EV являются перспективными бесклеточными терапевтическими средствами благодаря своим уникальным свойствам-носителям. К ним относятся их небольшой размер, позволяющий проводить стерилизацию с помощью фильтров, высокая биосовместимость, преимущественное накопление в опухолях, широкий спектр доставки грузов, способность преодолевать биологические барьеры, такие как гематоэнцефалический барьер, и минимальный профиль токсичности. По нескольким причинам NK-EV устраняют необходимость в лимфодеплеции пациента с помощью химиотерапии перед введением: 1) обычно лимфодеплеция используется для создания более благоприятной среды для клеточной терапии, что позволяет инфузионным клеткам размножаться и оказывать свое терапевтическое действие; 2) в отличие от клеток, ВВ не обладают способностью к репликации и значительно меньше по масштабу; 3) ВВ действуют по различным механизмам и демонстрируют сниженную иммуногенность по сравнению с клетками 5,6,7. Кроме того, NK-EV последовательно демонстрируют эффективность in vitro против различных моделей рака, а также демонстрируют иммуномодулирующее действие на иммунные клетки, которые стимулируют противораковые реакции 8,9. Результаты in vivo подтверждают эти выводы, демонстрируя регрессию рака после лечения NK-EV и незначительную токсичность 10,11,12. Таким образом, препараты на основе NK-EV имеют большие перспективы для решения проблем лечения холодных, иммунологически инертных солидных опухолей 13,14,15,16,17.

Наше недавнее исследование направлено на устранение значительного узкого места в клинической трансляции NK-EV через биопроизводство7. В статье представлено доказательство концепции экономически эффективного и масштабируемого рабочего процесса биопроизводства электромобилей NK-EV, тщательно разработанного для обеспечения контроля качества в процессе производства. В рамках этого подхода непрерывно производились большие количества биотерапевтических средств для лечения рака на основе NK-EV высокой чистоты, при этом тщательная характеристика продукта проводилась в соответствии с рекомендациями MISEV201818. Масштабируемость рабочего процесса биопроизводства может быть достигнута за счет увеличения размера картриджа или параллельной работы нескольких биореакторов. Аналогичным образом, масштабируемость рабочего процесса изоляции EV может быть легко достигнута с помощью таких методов, как эксклюзионная хроматография (SEC) на основе быстрой белковой жидкостной хроматографии (FPLC), ультрафильтрация (UF) и стерилизация на основе фильтров. Система биореактора с полыми волокнами (HFB) с замкнутым контуром выращивала самодостаточную линию NK-клеток IL-2 (клетки NK92-MI) без необходимости приема добавок в сыворотку, системы питания и антибиотиков. Это было достигнуто с использованием коммерчески доступной химически определенной среды, не содержащей ксеносов (в настоящее время коммерчески доступна версия GMP). В результате, большое количество NK-клеток (109 жизнеспособных клеток) и NK-EV (1012 EV) было успешно получено в течение 5-7 дней с использованием одного картриджа биореактора среднего размера, при этом оба продукта были подробно охарактеризованы. На протяжении всего процесса биопроизводства здоровье клеток ежедневно контролировалось с использованием количественных показателей, таких как pH, уровень глюкозы и лактата, а также визуальных показателей, таких как цвет среды и любые признаки загрязнения, которые являются важными предикторами качества клеток и EV. Оценка жизнеспособности и функциональности NK-клеток, генерируемых в системе HFB, в частности, цитотоксичности, показала значительное улучшение по сравнению с культурами на основе колб7. Аналогичным образом, очищенные NK-EV демонстрировали высокий профиль чистоты, лишенные бактерий, микоплазмы, распространенных вирусных образований и клеточных компонентов, а также с незначительными уровнями эндотоксинов. Важно отметить, что очищенные NK-EV составили более 99,9% всех наночастиц, обнаруженных в конечном продукте7. Наконец, эти очищенные NK-EV сохранили ключевые характеристики NK, включая поверхностные маркеры (CD2, CD45, CD56), полезную нагрузку цитокинов (GzmB, PFN, IFN-g), и продемонстрировали мощную цитотоксичность в отношении лейкозных клеток K562, что является золотым стандартом для оценки цитотоксичности NK-клеток.

В настоящем протоколе подробно описан масштабируемый рабочий процесс биопроизводства, о котором говорилось выше. В статье разъясняется методология выделения NK-EV, произведенных с использованием FPLC-SEC в сочетании с УФ и стерилизацией на основе фильтров. Кроме того, в протоколе описаны ключевые этапы, включая определение характеристик продукта с помощью анализа с отслеживанием наночастиц (NTA), оценку качества с использованием различных инструментов (количественное определение белка/дцДНК и микробиологическое тестирование) и функциональную валидацию очищенного продукта NK-EV против раковых клеток с помощью анализа жизнеспособности клеток. Как правило, этот рабочий процесс дает 1,0 - 1,5 мл продукта NK-EV со средней концентрацией 1,18 x 1012 EVs/мл7, что в общей сложности составляет минимум 1 x 1012 EV из расчета примерно 40 мл CM с высоким содержанием EV. Этот процесс позволяет выпускать продукт для различных последующих применений, таких как исследовательские, доклинические и мультиомные исследования (протеомика, транскриптомика, геномика, метаболомика, липидомика и эпигеномика), требующие большого количества высококачественных EV и в то же время обладающие потенциалом для клинической трансляции с продемонстрированной воспроизводимостью.

Протокол

1. Биопроизводство NK-EV из клеток NK92-MI с использованием биореактора замкнутого цикла

ПРИМЕЧАНИЕ: NK-EV производятся с использованием масштабируемого биопроизводственного процесса, который соответствует надлежащей производственной практике (GMP) и использует клетки NK92-MI (см. Рисунок 1). В нашей недавней публикации подробно рассматривается процедура биопроизводства, а также профили идентичности и безопасности продуктов NK-EV7.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Биопроизводство внеклеточных везикул, полученных из естественных киллерных клеток (NK-EVs) в биореакторе с полыми волокнами (HFB) с замкнутым контуром и масштабируемым рабочим процессом изоляции. Схематическое изображение рабочего процесса биопроизводства для производства больших партий продуктов NK-EV высокой чистоты. Самодостаточные клетки NK92-MI IL-2 засевают в картридж HFB с замкнутым контуром и культивируют в условиях, не содержащих сыворотки (SF), ксено (XF), фидеров и антибиотиков, где они выращиваются для непрерывного сбора кондиционированной среды, богатой EV. Выделение NK-EV из КМ, богатого EV, выполняется с помощью эксклюзионной хроматографии (FPLC-SEC) на основе быстрой белковой жидкостной хроматографии в сочетании с ультрафильтрацией (UF). NK-EV характеризуются и оцениваются с помощью множественных анализов, а их функциональность против клеток лейкемии K562 оценивается с помощью анализа жизнеспособности. Этот рисунок был изменен из7 (создан с помощью Biorender.com). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

  1. Начиная с 1 - 5 x 106 клеток NK92-MI и поддерживая плотность клеток в диапазоне 3 - 8 x 105 клеток/мл, культивируйте клетки в колбах T25 - T175 с использованием предварительно подогретой питательной среды. Инкубировать при 37 °C с 5%CO2 (см. Таблицу материалов). Заменяйте среду каждые 2 - 3 дня до тех пор, пока не будет получено 1 x 108 элементов NK92-MI с жизнеспособностью не менее 70%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При повторном посеве клеток сохраняйте 1/5-1/3 часть кондиционированной среды (КМ), так как она содержит благоприятные факторы роста.
  2. Выполните подготовку картриджа HFB со средой и инокуляцию NK-клеток, как описано ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все манипуляции должны выполняться внутри бокса биобезопасности класса II для обеспечения и поддержания стерильности. Перед перемещением картриджной системы в шкаф биобезопасности обильно распылите 70% этанола, уделяя особое внимание узкому месту резервуара и соединениям шприца.
    1. Подготовьте картридж HFB в соответствии с инструкциями производителя19 (см. Таблицу материалов; см. Рисунок 2), как описано ниже.
      1. Оберните соединения Luer Lock восковой пленкой и отрегулируйте расход насоса в соответствии с инструкциями производителя19. Кондиционируйте картридж HFB, дав 150 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS; см. Таблицу материалов) циркулировать в течение не менее пяти дней.
      2. Чтобы удалить воздух из внеклеточного капиллярного пространства (ЭКС; объем составляет примерно 29 мл), введите примерно 40 мл PBS через левый порт ECS и дайте воздуху выйти через правый порт ECS. При этом закройте зажимы левого и правого торцевых портов. Убедитесь, что шприц всегда подключен к левому и правому портам ECS.
      3. По завершении поместите картридж на проточный насос (см. Таблицу материалов) внутрь инкубатора, настроенного на 37 °C и 5%CO2. Убедитесь, что после нескольких дней циркуляции не было утечек.
    2. Замените PBS 150 мл питательной среды в бутылке резервуара и ECS за 2 дня до засева клеток в картридж. Повторите предыдущие этапы кондиционирования (шаг 1.2.1.) с использованием питательной среды, но в течение 2 дней обращения.
    3. Перед посевом ячеек замените содержимое в резервуарной бутылке и ЭКС 250 мл свежей питательной среды.
    4. Приобретите колбу с культурой из инкубатора и переложите клетки в пробирку объемом 50 мл. Вращайте при 300 x g в течение 5 минут. Ресуспендируйте клеточную гранулу, используя 21 мл питательной среды.
    5. Приготовьте две аликвоты по 20,5 мкл каждая из клеточной суспензии для подсчета клеток на автоматизированном счетчике клеток (см. Таблицу материалов). К каждой аликвоте суспензии клеток объемом 20,5 мкл добавьте равное количество красителя AO/PI (см. Таблицу материалов) и перемешайте вверх и вниз не менее 10 раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы не рекомендуем Trypan Blue для точного подсчета NK-клеток. В качестве альтернативы можно использовать гемоцитометр для ручного подсчета.
    6. Загрузите по 20 мкл в каждую счетную камеру счетного стекла и выполните автоматический подсчет ячеек с помощью соответствующей программы. Рассчитайте среднюю концентрацию живых клеток и обратите внимание на жизнеспособность.
    7. Смешайте раствор NK-клеток несколько раз перед его аспирацией с помощью шприца объемом 20 мл и иглы 18 г для поддержания стерильности. Этот раствор должен содержать примерно 1 x 108 живых NK-клеток примерно в 20 мл или примерно 5 x 106 клеток/мл.
    8. После извлечения иглы из шприца аккуратно введите NK-клетки в картридж через левый порт ECS. Чтобы обеспечить равномерное рассеивание клеток по всему картриджу, аккуратно введите раствор ячейки не менее 10 раз с помощью шприцев, подключенных к левому и правому портам ECS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: раствор должен иметь одинаковую мутность на обоих шприцах, при этом левый и правый концевые порты должны быть закрыты.
    9. Откройте левый и правый концевые порты и введите то, что осталось внутри шприцев. Закройте левый и правый порты ECS с помощью зажимов.
    10. Перенесите картридж в инкубатор и дайте ему постоять 30 минут, прежде чем правильно установить его на проточный насос. Оставьте картридж для биопроизводства. Отрегулируйте расход в соответствии с производителем.
    11. Чтобы контролировать показатели здоровья клеток, ежедневно приобретайте 0,5 мл аликвоты среды из тщательно перемешанной среды в бутылке-резервуаре и храните ее при температуре -20 °C после проверки уровня глюкозы и pH. Уровень L-лактата может быть проверен позже (см. Таблицу материалов).
    12. Заменяйте среду в резервуаре (250 - 500 мл) каждые 1 - 2 дня для поддержания содержания глюкозы выше 50% от исходного уровня, обнаруженного в среде, и pH выше 7,0 (диапазон от 7,0 до 8,0).
  3. Выполняйте сбор NK-EV-rich CM ежедневно после 1 дня отдыха при первой загрузке картриджа, как описано ниже.
    1. Переместите картриджную систему в шкаф биобезопасности. Осторожно введите примерно 21 мл питательной среды через левый порт ECS, чтобы протолкнуть эквивалентный объем насыщенного EV CM через правую ECS - не смешивайте (см. рис. 3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте новую пластиковую посуду для предотвращения загрязнения.
    2. Перелейте богатый электроэнергией раствор CM в пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут. Тем временем переместите картриджную систему обратно в инкубатор на проточном насосе.
    3. Перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку и центрифугуйте при давлении 2000 x g в течение 10 минут. Снова переложите надосадочную жидкость в новую трубку. Затем равномерно распределите богатый EV CM по 3,50 мл пробирок (~7 мл/тюбик) и храните при температуре −80 °C до дальнейшей обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательно собранный КМ с высоким содержанием электромобилей объединяется по этим трем пробиркам, образуя три технически повторяющиеся пробирки с образцами.
  4. Выполните сбор HFB-NK-клеток, чтобы продолжить производство EV-rich CM с использованием того же картриджа HFB, как описано ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: NK-клетки могут быть собраны из ECS HFB, выполнив протокол сбора HFB-NK-клеток, как только картридж достигнет слияния (максимум 1 x 109 клеток). Это происходит через 5 - 7 дней для каждой партии или когда содержание глюкозы оказывается ниже предела обнаружения глюкометра (например, отсутствие показаний или показания ~ 0) в течение 2 дней подряд. Если это окончательный забор клеток, среду можно заменить на PBS для промывки картриджа и извлечения клеток.
    1. Соберите EV-rich CM точно так же, как описано выше в шаге 1.3.
    2. Введите примерно 50 мл среды через левый порт ECS. Чтобы обеспечить однородное рассеивание клеток по всему картриджу, осторожно проталкивайте раствор клеток вперед и назад с помощью шприцев, подключенных к левому и правому портам ECS, не менее 10 раз, чтобы ослабить клетки, прежде чем в конечном итоге протолкнуть и собрать их шприцем через правый порт ECS. Переложите собранный КМ с высоким содержанием электромобилей в пробирку объемом 50 мл. Отставьте пока при температуре 37 °C (водяная баня или инкубатор).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отталкивающее действие помогает вытеснить клетки до того, как они будут полностью выведены и собраны шприцем через правый порт ECS. Раствор должен иметь одинаковую мутность на обоих шприцах, при этом левый и правый концевые порты должны быть закрыты. Постукивание по картриджу биореактора (физическое нарушение) может помочь превентивно сместить кластер клеток в нижней части картриджа. Агрессивное обратное перемешивание клеточной суспензии может негативно сказаться на жизнеспособности восстановленных клеток. Следует проявлять осторожность и терпение, чтобы добиться максимальной жизнеспособности.
    3. Повторите последний шаг 2 раза. Всего должно быть восстановлено 150 мл клеточной суспензии. Центрифугируйте при 300 х г в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость.
    4. Ресуспендируйте обе клеточные гранулы в 20 мл свежей среды каждая и соедините их. Соберите две аликвоты по 20,5 мкл каждой клеточной суспензии для подсчета клеток на автоматизированном счетчике клеток (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, требуется многократное разведение клеток с использованием PBS в качестве разбавителя, чтобы попасть в динамический диапазон счетчика клеток.
    5. К аликвоте суспензии клеток объемом 20,5 мкл добавьте равное количество красителя AO/PI (см. Таблицу материалов) и перемешайте вверх и вниз не менее 10 раз. Загрузите по 20 мкл в каждую счетную камеру счетного стекла и выполните автоматический подсчет ячеек с помощью соответствующей программы.
    6. Усредните концентрацию живых клеток по всем подсчетам, скорректированным на разведение, определите общее количество живых клеток и зарегистрируйте жизнеспособность. Как описано выше, для непрерывного производства КМ, богатых электромобилями, с использованием одного и того же картриджа биореактора, повторно засейте 1 x 108 NK-клеток, произведенных HFB.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При желании NK-элементы, произведенные HFB, могут храниться с использованием криоконсервационной среды для замораживания и контейнера для замораживания для контроля скорости замерзания (см. Таблицу материалов).

figure-protocol-2
Рисунок 2: Компонент системы биореактора с полыми волокнами (HFB) и настройка. Резервуарный баллон (1) содержит всю среду, которая циркулирует через картридж биореактора (2) под действием перистальтического насоса (не показан), действующего на трубку насоса (3). Клетки вводятся во внеклеточное капиллярное пространство (ЭКС) через левый (4) и правый (5) боковые порты ЭКС. После закрытия скользящих зажимов ECS открываются левый (6) и правый (7) торцевые порты, что позволяет среде циркулировать по всей системе. Обратите внимание на добавление восковой пленки на соединение замка Люэра рядом с крышкой резервуара бутылки со средой для предотвращения потенциального загрязнения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-protocol-3
Рисунок 3: Схематическое изображение процесса изоляции NK-EV. После ежедневного сбора кондиционированной среды (КМ), богатой ЭВ, раствор дифференцировали для удаления клеток (первый спин при 300 x g в течение 5 минут) и клеточного мусора (второй спин при 2000 x g в течение 10 минут). Очищенный КМ, обогащенный электромобилями, хранился при температуре -80 °C до дальнейшей обработки. После того, как замороженный КМ с высоким содержанием электромобилей будет готов к выделению NK-EV, его размораживают и центрифугируют еще раз, чтобы обеспечить удаление клеточного мусора (третий спин при 10 000 x g в течение 30 минут). Затем КМ, обогащенный EV, обрабатывают в течение 2-4 часов при 37 °C эндонуклеазой для расщепления нуклеиновых кислот, считающихся загрязнителями клеток хозяина. Затем КМ, обогащенный EV, обрабатывается методом эксклюзионной хроматографии на основе быстрой белковой жидкостной хроматографии (FPLC-SEC) для очистки EV с использованием бимодальной смолы. Элюированные фракции объемом около 10 - 15 мл объединяют и фильтруют с фильтрами 0,22 мкМ для обеспечения стерильности конечного продукта NK-EV. Ультрафильтрация позволяет концентрировать продукт примерно в 35 - 50 раз, получая гарантированную концентрацию более 1 x10 12 EVs/мл, что в сумме составляет 1,0 - 1,5 мл. Этот рисунок был изменен из7 (создан с помощью Biorender.com). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

2. Очистка NK-EV с помощью FPLC-SEC в сочетании с УФ и стерилизацией на основе фильтров

  1. Приготовьте следующие растворы и дважды отфильтруйте их с помощью фильтра 0,1 мкм (см. Таблицу материалов): вода (проводимость 0 мСм/см), PBS: 50 мл 10x PBS + 450 мл воды (проводимость около 14,7 мСм/см), 20% этанол, чистящий раствор (0,5 М NaOH и 30% изопропиловый спирт в воде).
  2. Выполните инициацию системы FPLC в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Выполняйте операции безразборной мойки (CIP) до и после запуска в соответствии с инструкциями производителя. Промойте все линии и смолу колонки и промойте водой с двойной фильтрацией (DF), чистящим раствором, DF-водой и DF-PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стоит отметить, что при необходимости безразборная мойка может быть проведена в другой день.
  3. Используйте хроматографическую колонку, наполненную бимодальной смолой (см. Таблицу материалов) с высотой слоя 20 см. Выполняйте соединения методом «капля-капля», чтобы убедиться, что воздух не попадает внутрь колонны.
  4. Настройте коллектор фракций с соответствующими пробирками для сбора и измените настройки фракционирования на желаемый объем сбора (например, 15 мл). Поместите достаточное количество пробирок и две дополнительные пробирки, чтобы собрать весь объем пробы.
  5. Проведите подготовку образцов, как описано ниже.
    1. Возьмите 40 - 80 мл EV-rich CM из морозильной камеры при температуре -80 °C и быстро разморозьте при 37 °C. Загрузите образец в ультрацентрифугу и вращайте при температуре 10 000 x g в течение 30 минут при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пробирки должны быть точно сбалансированы по весу, а не по объему.
    2. После отжима соберите надосадочную жидкость и переложите ее в новую пробирку. Чтобы снизить уровень дцДНК, обрабатывайте КМ, богатую EV, 50 Ед/мл эндонуклеазы и 1,5 мМ MgCl2 (см. Таблицу материалов). Инкубировать в течение 2 - 4 ч в инкубаторе (37 °C), обеспечивая умеренное перемешивание.
  6. Как только система (линии и колонка) будет готова к изоляции EV, загрузите EV-rich CM в шприц объемом 60 мл и подключите его к линии для отбора проб. Запустите систему, нажав кнопку Ручной запуск и установив расход на 0. Следуйте инструкциям программного обеспечения, чтобы заранее сохранить прогон, затем нажмите кнопку «Пуск».
  7. Выберите линию B (DF-PBS) и работайте со скоростью потока 150 см/ч (расход 2,0 мл/мин). Убедитесь, что решение проходит через столбец.
  8. Как только проводимость стабилизируется, нажмите Auto Zero UV. Измените траекторию потока, чтобы направить пробу в бутылку для отходов перед колонной. Убедитесь, что в систему не попадают пузырьки.
  9. Максимум через 5 - 20 с направьте образец в колонку. Нажмите «Фракционирование», когда показания УФ-излучения достигнут примерно 230 мАЕ.
  10. После того, как проба будет полностью введена через систему, переключите буферную систему в режим DF-PBS (на клапане для пробы) для продолжения очистки. Нажмите «Фракционирование» еще раз, когда значение УФ-излучения достигнет примерно 1600 мАЕ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это соответствует пересечению между показаниями УФ-излучения и показаниями проводимости. Более длительное фракционирование только разбавляет ретентат без увеличения выхода EV.
  11. Соедините все фракции (разбавленные NK-EVs) и храните их при температуре 4 °C до тех пор, пока они не будут готовы к стерилизации и ультрафильтрации на основе фильтров (UF).
  12. Продолжайте использовать DF-PBS до тех пор, пока значение УФ-излучения не достигнет приблизительно 1000 мАЕ. После этого остановите выполнение и сохраните хроматограмму в формате PDF.

3. Стерилизация и концентрирование продукта НК-ЭВ на основе фильтра методом УФ

  1. Охладите центрифугу до 10 °C. Продезинфицируйте каждый компонент УФ-аппарата (см. Таблицу материалов) путем промывки 20-30 мл 90% этанола. Вращайте при 4000 x g в течение 5 - 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтр изготовлен из регенерированной целлюлозы MWCO емкостью 10 кДа.
  2. Откажитесь от потока, а затем повторите полоскание с использованием стерильного PBS для балансировки устройства. Повторите в общей сложности 2 раза.
  3. Для достижения максимальной стерильности разбавленный раствор NK-EV следует отфильтровать с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм, предварительно смоченного DF-PBS (см. Таблицу материалов). Соберите фильтрат непосредственно в стерилизованный концентрационный аппарат.
  4. Отжим при 4000 x g в течение 15 - 40 мин (время отжима зависит от образца). Смешайте раствор в верхнем отсеке фильтра с помощью серологической пипетки после отжима. Вращайте при давлении 4000 x g еще 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этап смешивания является необязательным, так как он просто облегчает этап концентрирования, предотвращая засорение мембраны электромобилями.
  5. Временно отложите проточный поток и соберите пробу НК-ЭВ, перевернув фильтрующее устройство и присоединив его к сборному устройству.
  6. Вращайте при 2000 x g в течение 2 минут. Переложите очищенный продукт NK-EV в пробирку объемом 2 мл. Храните очищенный продукт NK-EV при температуре 4 °C для кратковременного использования (≤ 7 дней) или замороженном при -20 °C для длительного использования.

4. Определение характеристик NK-EV с помощью анализа слежения за наночастицами (NTA)

  1. Приготовьте раствор и дважды отфильтруйте его при 0,1 мкм (см. Таблицу материалов): вода, PBS, чистящий раствор (10% хлорная известь (ОСТОРОЖНО) в воде).
  2. Запустите систему NTA в соответствии с инструкциями производителя. Аналогичным образом выполните действия безразборной мойки (CIP) до и после прогона. Промойте все линии и промойте водой с двойной фильтрацией (DF), чистящим раствором и водой DF. Уравновесьте линии с помощью DF-PBS.
  3. Проверьте проточную ячейку и проверьте наличие пузырьков воздуха. Удалите пузырьки, если они есть. Когда все станет ясно, осторожно снова вставьте проточную ячейку в прибор NTA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что это не рекомендуется производителем, очень трудно удаляемые пузырьки воздуха можно легко удалить, промыв 20% этанолом, а затем DF-водой.
  4. Когда проточная ячейка будет установлена на место и дверца закроется, нажмите кнопку Запустить камеру. При заполнении линий DF-PBS на экране должно отображаться абсолютное минимальное количество частиц.
  5. Измените настройки захвата на коэффициент усиления экрана 2 и уровень камеры 14. Кроме того, включите нагреватель для стабилизации температуры проточной ячейки.
  6. Нажмите « Стандартное измерение », чтобы создать сценарий на вкладке «СОП» для сбора одного захвата в течение 1 минуты при расходе 30 частиц/кадр и температуре 23 °C.
  7. Чуть ниже добавьте имя папки и файла к имени пути, чтобы сохранить данные.
  8. Заранее приготовьте разведения очищенного продукта NK-EV с помощью DF-PBS. При работе с NTA для точного количественного определения требуется 30–80 частиц на кадр.
  9. Сделайте образец вихревым путем перед загрузкой его в шприц (см. Таблицу материалов).
  10. Осторожно подсоедините шприц для сбора данных объемом 1 мл к линии загрузки инструментов. Воздух не должен присутствовать, так как это негативно скажется на сборе и анализе. Медленно протолкните половину образца, оставив в шприце около 0,5 мл.
  11. Как только частицы станут видны на экране, сфокусируйте камеру так, чтобы вокруг каждой частицы было максимум одно ореоло. Нажмите кнопку Infuse на вкладке Hardware со скоростью 1000 в течение 5 секунд. Затем уменьшите его до 30.
  12. Нажмите Run Script и следуйте инструкциям. Программное обеспечение проверит установленную температуру и спросит правильность настроек. Нажмите «Да» и следуйте инструкциям программы.
  13. После завершения захвата нажмите кнопку «Отмена », когда программное обеспечение попросит обработать или экспортировать файлы. Нажмите кнопку Infuse на вкладке Hardware со скоростью 1000 в течение 10 - 15 секунд. Тем временем снова включите обогреватель и камеру. Затем уменьшите скорость до 30, пока частицы не начнут двигаться.
  14. Соберите еще четыре снимка, повторив предыдущие шаги. После того, как на одно разведение было зарегистрировано в общей сложности пять захватов, проведите анализ после импорта всех пяти захватов.
  15. Выберите файлы для обработки, выделив их. Нажмите кнопку «Обработать выбранные файлы». На вкладке Процесс настройте параметры анализа до 2 и порога обнаружения 15.
    Настройки зависят от выборки; Убедитесь, что на кадре видно 30 - 80 частиц.
  16. Проверьте и нажмите OK для анализа.
  17. Как только файлы будут обработаны, программное обеспечение попросит их экспортировать. Нажмите « Да », не нажимая дополнительные поля, или нажмите «Экспорт».
  18. Повторите для всех разведений или образцов EV. Выключите прибор NTA после того, как все пробы будут завершены и безразборная мойка.

5. Тестирование для обеспечения качества

  1. Проводите микробиологическое тестирование с использованием двух тестов: 1) небольшая аликвота очищенных NK-EV добавляется в среду для автоклавного бульона LB и 2) небольшая аликвота очищенных NK-EV используется для обнаружения микоплазменных ПЦР (см. Таблицу материалов).
    1. Тест 1: культуральная среда LB при температуре 37 °C в течение 5 дней с положительным и отрицательным контролем. При необходимости запишите внешний диаметр600.
    2. Тест 2: выполнить обнаружение микоплазменной ПЦР в соответствии с протоколом производителя.
  2. Количественно оценивайте белок и дцДНК в очищенных разведениях NK-EV с помощью анализов на основе флуориметра в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).

6. Оценка активности раковых клеток, обработанных NK-EV, с использованием валидированного высокочувствительного анализа жизнеспособности клеток на основе резазурина 20

  1. Культивирование клеток лейкемии человека K562 с использованием RPMI-1640 с 10% инактивированным при нагревании FBS в течение нескольких дней перед проведением анализа потенции (см. Таблицу материалов). Поддерживайте плотность в диапазоне от 2 до 8 x 10 до5 клеток/мл и заменяйте среду каждые 2 - 3 дня.
  2. Приобретите 96-луночный планшет с плоским дном (см. Таблицу материалов) и заранее добавьте объем пробирной среды (с добавлением 5% обедненного EV FBS), необходимый для нормализации (см. Таблицу материалов). Конечный объем составляет 150 μл/лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пипеттор-репитер для уменьшения вариаций от скважины к скважине.
  3. Получите культуру клеток и перенесите клетки в пробирку. Вращайте при 300 x g в течение 5 минут. Ресуспендируйте клеточную гранулу в одноклеточный раствор с использованием 2 - 5 мл исследуемой среды.
  4. Соберите аликвоту 20,5 мкл клеточной суспензии для подсчета клеток на автоматизированном счетчике клеток (см. Таблицу материалов).
  5. К аликвоте суспензии клеток объемом 20,5 мкл добавьте равное количество красителя AO/PI (см. Таблицу материалов) и перемешайте вверх и вниз не менее 10 раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем AO/PI для точного подсчета клеток. В качестве альтернативы можно использовать гемоцитометр для ручного подсчета.
  6. Загрузите по 20 мкл в каждую счетную камеру счетного стекла и выполните автоматический подсчет ячеек с помощью соответствующей программы. Усредните концентрацию живых клеток и зарегистрируйте жизнеспособность.
  7. Перенесите примерно 1 x 106 клеток во вторичную трубку. Разбавьте клетки ровно до 7 мл тестовой среды и повторите подсчет клеток. Концентрация должна составлять примерно 1,2 - 1,5 х 105живых клеток/мл.
  8. Как описано выше, отрегулируйте концентрацию суспензии одиночных клеток до 1 x 105 живых клеток/мл и при необходимости повторите подсчет клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент вариации между техническими дубликатами должен составлять менее 25%; как правило, он составляет менее 5% при подсчете AO/PI.
  9. Как только желаемая концентрация будет достигнута, перелейте 50 мкл (± 1 мкл) этого раствора в каждую лунку, чтобы максимально приблизиться к 5000 клеток/лунка (4900 - 5100 клеток/лунка). Подготовьте технические тройки для каждого условия анализа и используйте пипеттор-репитер для уменьшения вариаций от скважины к скважине.
  10. Перенесите пластину в орбитальный вибростенд (350 - 500 об/мин) на 2 минуты. Перенесите клетки обратно в инкубатор до тех пор, пока они не будут готовы к лечению NK-EV.
  11. Приготовьте необходимые разведения NK-EV (1:5, 1:10 и 1:100) с помощью пробирной среды.
  12. Из этих разведений протестируйте следующие концентрации EV: 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010 и 1 x 1011 частиц/мл. Объем дозирования ограничен 20% от общего объема анализа.
  13. Когда все будет готово, переведите требуемый объем заданного разбавления в лунки, требующие желаемой концентрации EV для обработки. Добавьте 15 мкл 10-кратного Тритона-Х в положительную контрольную лунку (см. Таблицу материалов). Конечный объем лунки должен быть нормализован до 150 μл.
  14. Добавьте пластину в орбитальный шейкер (350 - 500 об/мин) на 2 минуты. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 в течение 3 часов.
  15. Предварительно нагрейте считыватель планшетов (см. Таблицу материалов) до 37 °C и загрузите следующий сценарий: 37 °C (уменьшает колебания температуры), перемешивание со скоростью 450 об/мин в течение 1 минуты (обеспечивает однородность образца) и считывание.
  16. Добавьте по 15 мкл реагента на основе резазурина в каждую лунку (см. Таблицу материалов). Защищайте реагент от света и используйте пипеттор-репитер, чтобы уменьшить колебания от скважины к скважине.
  17. Добавьте пластину в орбитальный шейкер (350 - 500 об/мин) на 2 минуты. Перенесите планшет в инкубатор и инкубируйте в течение 60 минут. Удалите пузырьки воздуха с помощью наконечника пипетки, пропитанного этанолом. Считывающая пластина с использованием возбуждения 560 нм и излучения 590 нм.
  18. Анализ данных: Средние технические реплики были усреднены и скорректированы на фон перед проведением анализа доза-реакция с использованием нелинейной регрессии для эффекта ингибирования, показывающей логарифмический (ингибитор) и нормализованный наклон переменной отклика без ограничений. Запишите значения Hillslope и EC50 .

Результаты

NK-EV обладают присущими цитотоксическими функциями и продемонстрировали высокую эффективность против различных моделей рака. Тем не менее, в текущих исследованиях необходимо больше стандартизации в отношении рабочего процесса биопроизводства, подходящего для крупномасштабного производства NK-EV 6,21. В нашем предыдущем исследовании была описана возможность создания системы полноволоконного биореактора (HFB) с замкнутым циклом для производства больших количеств продуктов NK-EV высокой чистоты7. В качестве последующего наблюдения, это основанное на протоколе исследование подробно описывает рабочий процесс биопроизводства и демонстрирует его воспроизводимость путем производства и изоляции продукта NK-EV (Рисунок 1). Кроме того, перед выпуском продукта необходимо провести необходимую характеристику и валидацию, в результате чего в данном исследовании представляются новые и оригинальные данные.

Система HFB была выбрана для производства NK-EV из-за ее простоты использования, надежности, масштабируемости и соответствия GMP7. В соответствии с конфигурацией системы HFB, NK-клетки вводятся через левый порт ECS и засеваются в картридж биореактора (рис. 2). В то же время бутылка со средой подключается к HFB через боковые порты, и фильтрующая среда пропускается по всей системе. NK-клетки культивируются в среде, не содержащей сыворотки, ксеноса, питателя и антибиотика, где среда заменяется, когда содержание глюкозы падает ниже 50% для поддержания и максимального улучшения здоровья клеток с течением времени. CM собирается ежедневно, обрабатывается с помощью дифференциального центрифугирования и хранится в замороженном виде (-80 °C) до тех пор, пока не будет готов к дальнейшей обработке. После этого изоляция EV проводится с помощью комбинации дифференциального центрифугирования и FPLC-SEC в сочетании с ультрафигрейдом и фильтрацией (рис. 3). В результате получается концентрированный и стерильный продукт NK-EV с конечным объемом примерно 1,0 - 1,5 мл. Представлена репрезентативная хроматограмма выделения NK-EV с помощью FPLC-SEC (рис. 4). Перед обработкой FPLC-SEC насыщенный NK-EV CM обрабатывают эндонуклеазой, что значительно снижает уровень дцДНК, потенциального загрязнителя клеток хозяина (NK)7. Таким образом, описанный процесс выделения EV удаляет клеточный мусор и загрязнители РНК/ДНК из продукта NK-EV, что имеет важное значение для обеспечения низкого и нежелательного иммуногенного потенциала и того, чтобы конечный продукт был пригоден для последующих исследований.

figure-results-1
Рисунок 4: Выделяющая хроматограмма NK-EV, полученная во время исключения размера с помощью жидкостной хроматографии быстрого белка. Синяя линия представляет поглощение (мАЕ; максимальное значение 2000 мАЕ), красная линия представляет проводимость, красный текст представляет журнал прогона, а серая затененная область представляет фракционированные NK-EV (обозначаются долями T2 - T7). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

После выделения используются базовые характеристики NK-EV и испытания по обеспечению качества, чтобы оценить, можно ли выпустить продукт NK-EV для дальнейших экспериментов. Диапазон размеров и концентраций частиц продукта NK-EV измеряют с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA) с размерами в диапазоне от 76,30 до 174,30 нм в диаметре (D10 от 78,38 ± 2,07 нм, D50 от 106,72 ± 2,43 нм и D90 от 169,80 ± 4,17 нм) и средней концентрацией 1,39 x10 12 EVs/мл (рисунок 5A-B). Кроме того, количественное определение флуориметром показало, что концентрация белка и дцДНК составляет 298,90 ± 66,62 мг/мл и 225,60 ± 37,7 нг/мл для конечного продукта соответственно (рис. 5C-D). Это соответствует среднему соотношению 5,06 x 106 EV/μг белка и 6,16 x 1012 EV/μг ДНК. Микробное и микоплазменное тестирование дали отрицательные результаты (данные не показаны). Эти результаты согласуются с характеристикой NK-EV, полученной в предыдущей работе7. В более ранней публикации7 также представлена дальнейшая углубленная характеристика продуктов NK-EV в соответствии с рекомендациями MISEV (т.е. ПЭМ, вестерн-блоттинг, уровень эндотоксинов, вирусные образования и проточная цитометрия для поверхностных антигенов и цитокинов).

Наконец, функциональность продукта NK-EV (т.е. цитотоксичность в отношении раковых клеток) оценивали с помощью валидированного высокочувствительного анализа жизнеспособности клеток на основе резазурина после лечения NK-EV лейкемической клеточной линией K562 7,20. Обработка клеток K562 NK-EV в течение 3 ч оказывала дозозависимый эффект на жизнеспособность клеток, соответствующий EC50 9,33 x 109 EVs/мл (т.е. дозировка, которая соответствует уничтожению 50% клеточной популяции; Рисунок 6А-В). Таким образом, следуя изложенным критериям выпуска продукта, продукт NK-EV считается пригодным для дальнейших экспериментов.

figure-results-2
Рисунок 5: Характеристика очищенного продукта NK-EV. (A) Распределение продукта NK-EV по размерам, измеренное с помощью NTA, показано как среднее значение из 5 независимых экспериментов, каждый из которых имеет 10 технических повторений (5 видеозахватов x 2 разведения). (B) Концентрация продукта частиц NK-EV (частицы/мл), измеренная с помощью NTA, представленная в виде среднего значения ± SD по результатам 5 независимых экспериментов, каждый из которых имеет технические дубликаты. (C) Концентрацию белка продукта NK-EV (мг/мл) измеряли с помощью флуориметра, представленного в виде среднего ± SD из 5 независимых экспериментов, каждый из которых имел технические тройки. (D) Концентрация дцДНК продукта NK-EV (нг/мл), измеренная с помощью флуориметра, представленная в виде среднего ± SD из 5 независимых экспериментов, каждый из которых имеет технические тройки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 6: Функциональная валидация очищенного продукта NK-EV. NK-EV демонстрируют дозозависимую цитотоксичность в отношении клеток лейкоза K562 человека, обработанных в различных концентрациях NK-EV в течение 3 часов с использованием высокочувствительного анализа жизнеспособности клеток на основе резазурина. (А) Нормализованные показания анализа (зеленая линия представляет необработанный контроль клеток лейкоза K562, а черная пунктирная линия представляет контроль мертвых клеток лизированного лейкоза K562; обработан детергентом). Данные представлены в виде среднего ± SEM из 11 независимых экспериментов с техническими тройками. (B) Анализ кривой EC50 с переменным наклоном для лечения NK-EV с 95% доверительным интервалом/полосами прогнозирования (красная пунктирная линия представляет 50% отклика). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Несколько исследований показывают, что NK-EV обладают огромным потенциалом в качестве противоракового терапевтического средства 4,5,7,9,16,22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Тем не менее, для дальнейших доклинических испытаний и будущих клинических применений требуется масштабируемая биопроизводственная система, соответствующая требованиям GMP, способная производить большое количество NK-EV высокой чистоты. Чтобы решить эту проблему, в предыдущем исследовании использовалась система HFB с замкнутым контуром для непрерывного производства NK-клеток и богатых NK-EV CM, пригодных для последующих экспериментов. Благодаря своему 3D-дизайну, системы HFB точно отражают состояние сосудистой системы и обладают невероятно высоким отношением площади поверхности к объему, что позволяет более миллиарда клеток оставаться в культуре, что в конечном итоге приводит к улучшению производства EV 7,31,32. Важно отметить, что эта работа была первой, в которой когда-либо сообщалось об использовании системы HFB для культивирования NK-клеток, вероятно, из-за самодостаточности клеточной линии IL-2.

Необходимо принять дополнительные меры для обеспечения стерильности системы HFB и производства NK-EV высокой чистоты. Эти меры предосторожности особенно важны при отсутствии стерильного, чистого помещения, что может иметь место в случае нескольких исследовательских центров. Перед входом в бокс биобезопасности система HFB тщательно распыляется 70% этанолом для дезинфекции всех внешних поверхностей. Кроме того, все соединения замка Люэра оборачиваются восковой пленкой, чтобы свести к минимуму риск загрязнения. Это особенно важно, поскольку в этом процессе биопроизводства не используются антибиотики, которые, как известно, влияют на биохимический профиль клетоки продуктов их происхождения. Для оценки здоровья клеток во время биопроизводства клеточного продукта использовались различные метрики. Например, проводилась ежедневная оценка уровня pH, глюкозы и лактата в резервуарной среде, поскольку они являются жизненно важными суррогатами здоровья клеток для мониторинга. В дополнение к количественным оценкам, качественные наблюдения за системой HFB (например, цвет среды и визуальные признаки загрязнения, такие как мутность) также полезны для мониторинга здоровья клеток. Не было обнаружено, что количество клеток в ежедневно извлекаемых КМ не является репрезентативным показателем жизнеспособности для здоровья культуры (данные не показаны). Вероятно, это результат того, что мертвые клетки, извлеченные во время отбора проб КМ, были обнаружены внутри трубки, где среда не могла циркулировать (небольшой участок между ЭКС и портом шприца ЭКС), тем самым недооценивая жизнеспособность всей клеточной культуры. Только собранные NK-клетки, произведенные HFB в конце производственной партии, могут обеспечить надежную метрику здоровья культуры. Эти ячейки неизменно показывали значения жизнеспособности выше 70% во всех производственных партиях7. В совокупности эти методы оценки качества обеспечивают непрерывное производство электромобилей NK-EV высокой чистоты.

Для очистки и изоляции электромобилей было разработано несколько методов изоляцииэлектромобилей 34. Один из методов, SEC, использует колонку, заполненную пористым материалом - смолой, что позволяет разделять молекулы на основе дискриминации по размерам. Здесь более крупные электромобили быстрее проносятся через колонну; Этот метод известен как проточная очистка, основанная на исключении из размера. В то же время более мелкие загрязнители (дцДНК, свободно плавающие белки, такие как эндонуклеаза, соли, феноловый красный и т. д.) остаются позади смолы и далее удерживаются внутри смолы под действием электростатических сил (т. е. использовалась бимодальная смола). Процессинг на основе SEC удаляет белки, не связанные с EV, сохраняя при этом исходную структуру и функциональность EV35,36. Кроме того, очистка на основе SEC легко масштабируется без ущерба для высокой производительности и чистоты, что делает ее подходящим выбором для выделения NK-EV для биотерапевтических целей. Несмотря на эти преимущества, SEC имеет некоторые недостатки, такие как относительно разбавленный проточный (элюент); Следовательно, УФ необходим для концентрации продукта, но он также обеспечивает буферный обмен. Нестерильный УФ-аппарат промывают 70% этанолом и PBS и хранят в биобезопасном шкафу перед использованием для обеспечения стерильности. Как правило, проточный поток может быть сконцентрирован до 35x-50x от первоначального объема, при этом удаляются мелкие молекулы, которые могли попасть в элюент. Дифференциальное центрифугирование и эндонуклеазное лечение проводятся перед FPLC-SEC в сочетании с УФ для удаления остаточных клеток, клеточного мусора и длинных нитей антигенной дцДНК7.

После выделения продукта NK-EV, определение характеристик и функциональная валидация выполняются в соответствии с указаниями в MISEV2018 и MISEV2023 для определения пригодности продукта для дальнейшего использования 6,18. Из каждой изоляции получается 1,0 - 1,5 мл продукта NK-EV высокой чистоты при минимальной концентрации 1 x10 12 EVs/мл, со средней концентрацией 1,39 x 1012 частиц/мл. Ранее Gupta et al. определили, что медиана дозы EV in vivo составляет 3,37 x 108 EVs/кг массы тела37 мышей. Для лечения со средней дозировкой потребуется 8,43 x 106 EV на мышь с массой тела 25 г, что намного ниже гарантированного минимума (1 x 1012 частиц/мл), полученного в этом процессе. Таким образом, описанный рабочий процесс биопроизводства может производить более чем достаточное количество NK-EV для доклинических экспериментов или для достижения целевых дозировок. Каждая изоляция проверяется на наличие микоплазмы и микробов в рамках оценки контроля качества продукта. Кроме того, предыдущее исследование продемонстрировало отсутствие общих вирусных образований и эндотоксина в конечном продукте, а также отсутствие клеточных компонентов, считающихся загрязнителями клеток-хозяев (по данным вестерн-блоттинга)7,34. Наконец, функциональная оценка проводилась с использованием валидированного высокочувствительного анализа жизнеспособности клеток на основе резазурина для оценки функциональности NK-EV20. Описанный анализ жизнеспособности функционирует путем восстановления резазурина (слабофлуоресцентного) до резоруфина (высокофлуоресцентного) метаболически активными клетками, что позволяет оценить жизнеспособность клеток после лечения NK-EV. По сравнению с другими альтернативными анализами жизнеспособности клеток, анализ на основе резазурина, используемый в исследовании, очень чувствителен к изменениям жизнеспособности клеток (очень низкий фоновый шум) и позволяет сократить время инкубации для получения результатов (менее 30 минут для получения статистически значимых результатов)20. Как правило, NK-EV проявляют дозозависимое влияние на жизнеспособность K562. В совокупности представленные результаты представляют собой продукт NK-EV, который соответствует критериям выпуска продукта для доклинической оценки и подходит для последующих применений.

В заключение, это основанное на протоколе исследование описывает биопроизводство NK-EV с клиническим потенциалом. Как уже говорилось, NK-EV производятся с использованием замкнутой системы HFB в условиях без сыворотки, без ксено, без кормушки и без антибиотиков7. Комбинация FPLC-SEC/UF изолирует и очищает продукт NK-EV. Прежде чем выпустить продукцию для последующего применения, электромобили NK-EV должны быть охарактеризованы и функционально проверены, чтобы убедиться, что они пригодны для использования. Как показано, следование этому протоколу биопроизводства может успешно генерировать большое количество NK-EV высокой чистоты, которые проявляют целевую цитотоксичность в отношении раковых клеток. Таким образом, описанный протокол биопроизводства может быть полезен для будущих исследований, требующих производства NK-EV клинического класса.

Раскрытие информации

Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов или разглашении информации.

Благодарности

Авторы выражают признательность докторам Саймону Сове, Роджеру Таму и Сюй Чжану за критический обзор рукописи. Эта работа была поддержана операционными грантами от Инициативы по исследованиям и разработкам в области геномики (GRDI) Фаза VII (2019-2025) от правительства Канады, полученными JRL, LW, а также операционными грантами от Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям RGPIN-2019-05220, Общества исследования рака/Университета Оттавы 24064, Исследовательского операционного гранта Канадских институтов здравоохранения (CIHR) 175177 полученных LW, стипендия CIHR MSc, полученная MK, и стипендия королевы Елизаветы II в области науки и техники (QEII-GSST), полученная FSDB.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,1 & микро; m вакуумная фильтрующая установка Filtropur V50 Сарштедт83 3941 002
0,22 & микро; m Шприцевой фильтр Acrodisc Pall CorporationPN4612
1 мл шприц Thermo Fisher ScientificMB9204560TF-LAB
10 кДа Centricon Plus-70 Центробежный фильтрSigmaUFC701008
шприц 60 мл BD Biosciences309653
96-луночные плоские микропланшеты с черным прозрачным дном и черным полистиролом, обработанные TC Costar3603
Агароза Thermo Fisher ScientificR0491
AKTA Быстрый белковый жидкостный хроматограф GE Lifesciences29022094
BD PrecisionGlide Игла - 18GBD Biosciences305196
бензоназы нуклеаза SigmaE1014-25KU
BioTek Synergy H1 Многорежимный считывательBioTek SH1M2G-SN
Буфер для загрузки геля Blue Juice Смола Invitrogen10816015
CaptoCore 700 Cytiva17548102
Cellometer Auto 2000 Замораживающая среда Nexcelom BioScience LLC
CryoStor CS10 SigmaC2874
DPBS−/−  FisherBP399-1
Двойной светодиодный трансиллюминатор сине-белого света InvitrogenLB0100
Duet P3202 FiberCell Systems
Dulbecco
Коммерческие спиртыP006EAAN
обедненные экзосомами FBS GibcoA2720803
флуоробрит DMEM GibcoA18967-01
ГлюкометрAccuCheckModel 930
HiScale хроматографическая колонка 10/40 Cytiva29360550
ImmunoCult-XF (альтернатива среде GMP)StemCell Technologies100-0956
ImmunoCult-XF Среда для расширения Т-клеток StemCell Technologies10981
Изопропиловый спирт EMDPX1834-1
K562 элементыATCCCCL-243
LB медиа BioBasicSD7002
Набор для анализа L-лактата Abcamab65331
Картридж из полых волокон среднего размера FiberCell SystemsC2011
MgCl2 SigmaM1028
Набор для обнаружения микоплазменных ПЦР Abcamab289834
NanoSight NS300 Malvern
NaOH Клетки SupelcoSX0607N-6
NK92-MI ATCCCRL-2408
Полоски для pH-Mquant Sigma1,09533
PrestoBlue HS Анализ жизнеспособности клетокInvitrogenP50200
Qubit 4 Invitrogen
Qubit dsDNA BR Assay KitInvitrogenQ33262
Qubit dsDNA HS Assay KitInvitrogenQ33231 
Полоски для пробирки Qubit Flex InvitrogenQ33252
Qubit Flex InvitrogenQ33327
BR InvitrogenA50669
Quick Load 1Kb Plus DNA ladder NEBN0469S
SYBRSafe DNA Гелевое окрашивание InvitrogenInvitrogenS33102
Насос для шприцев Гарвардский аппарат984730
Triton-X 100 Буфер SigmaT-9284
UltraPure TAE Раствор для окрашивания Invitrogen15558042
ViaStain Acridine Orange и Propidium Iodide (AO/PI) ESBE ScientificCS2-0106
Счетчик жизнеспособности Насос для управления потоком Фосфатно-солевой буферный раствор Gibco 14190250 этанол от FiberCell Systems  Флуориметр Флуориметр Набор для анализа белка кубита

Ссылки

  1. Cheng, M., Chen, Y., Xiao, W., Sun, R., Tian, Z. NK cell-based immunotherapy for malignant diseases. Cell Mol Immunol. 10 (3), 230-252 (2013).
  2. Sheridan, C. Industry appetite for natural killer cells intensifies. Nat Biotechnol. 41 (2), 159-161 (2023).
  3. Shimasaki, N., Coustan-Smith, E., Kamiya, T., Campana, D. Expanded and armed natural killer cells for cancer treatment. Cytotherapy. 18 (11), 1422-1434 (2016).
  4. Elsharkasy, O. M., et al. Extracellular vesicles as drug delivery systems: Why and how. Adv Drug Deliv Rev. 159, 332-343 (2020).
  5. St-Denis-Bissonnette, F., et al. Applications of extracellular vesicles in triple-negative breast cancer. Cancers. 14 (2), 451(2022).
  6. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  7. St-Denis-Bissonnette, F., et al. A clinically relevant large-scale biomanufacturing workflow to produce natural killer cells and natural killer cell-derived extracellular vesicles for cancer immunotherapy. J Extracell Vesicles. 12 (12), e12387(2023).
  8. Federici, C., et al. Natural-killer-derived extracellular vesicles: Immune sensors and interactors. Front Immunol. 11, 262(2020).
  9. Lugini, L., et al. Immune surveillance properties of human NK cell-derived exosomes. J Immunol. 189 (6), 2833-2842 (2012).
  10. Zhu, L., et al. Novel alternatives to extracellular vesicle-based immunotherapy - exosome mimetics derived from natural killer cells. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 46 (sup3), S166-S179 (2018).
  11. Cochran, A. M., Kornbluth, J. Extracellular vesicles from the human natural killer cell line NK3.3 have broad and potent anti-tumor activity. Front Cell Dev Biol. 9, 698639(2021).
  12. Kim, H. Y., et al. Delivery of human natural killer cell-derived exosomes for liver cancer therapy: an in vivo study in subcutaneous and orthotopic animal models. Drug Deliv. 29 (1), 2897-2911 (2022).
  13. Alvarez-Erviti, L., et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol. 29 (4), 341-345 (2011).
  14. El-Sahli, S., et al. A triple-drug nanotherapy to target breast cancer cells, cancer stem cells, and tumor vasculature. Cell Death Dis. 12 (1), 8(2021).
  15. Sulaiman, A., et al. Co-targeting bulk tumor and CSCs in clinically translatable TNBC patient-derived xenografts via combination nanotherapy. Mol Cancer Ther. 18 (10), 1755-1764 (2019).
  16. Farcas, M., Inngjerdingen, M. Natural killer cell-derived extracellular vesicles in cancer therapy. Scand J Immunol. 92 (4), e12938(2020).
  17. Murphy, D. E., et al. Extracellular vesicle-based therapeutics: natural versus engineered targeting and trafficking. Exp Mol Med. 51, 1-12 (2019).
  18. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  19. FiberCell-Systems. FiberCell systems user manual & quick start guide. , https://www.fibercellsystems.com/wp-content/uploads/2024/03/FiberCell-Systems-User-Manual-Quick-Start-Guide.pdf (2024).
  20. St-Denis-Bissonnette, F., et al. Evaluation of resazurin phenoxazine dye as a highly sensitive cell viability potency assay for natural killer cell-derived extracellular vesicle-based cancer biotherapeutics. J Extracell Biology. 3 (7), e166(2024).
  21. Herrmann, I. K., Wood, M. J. A., Fuhrmann, G. Extracellular vesicles as a next-generation drug delivery platform. Nat Nanotechnol. 16 (7), 748-759 (2021).
  22. Andaloussi, E. L. A., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov. 12 (5), 347-357 (2013).
  23. Federici, C., et al. Exosome release and low pH belong to a framework of resistance of human melanoma cells to cisplatin. PLoS One. 9 (2), e88193(2014).
  24. Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
  25. Neviani, P., et al. Natural killer-derived exosomal miR-186 inhibits neuroblastoma growth and immune escape mechanisms. Cancer Res. 79 (6), 1151-1164 (2019).
  26. Sun, H., et al. Natural killer cell-derived exosomal miR-3607-3p inhibits pancreatic cancer progression by targeting IL-26. Front Immunol. 10, 2819(2019).
  27. Jiang, Y., et al. Engineered exosomes: a promising drug delivery strategy for brain disease. Curr Med Chem. 29 (17), 3111-3124 (2022).
  28. Dosil, S. G., et al. Natural killer (NK) cell-derived extracellular-vesicle shuttled microRNAs control T cell responses. Elife. 11, e76319(2022).
  29. Geeurickx, E., et al. The generation and use of recombinant extracellular vesicles as biological reference material. Nat Commun. 10 (1), 3288(2019).
  30. Nathani, A., et al. Combined role of interleukin-15 stimulated natural killer cell-derived extracellular vesicles and carboplatin in osimertinib-resistant H1975 lung cancer cells with EGFR mutations. Pharmaceutics. 16 (1), 83(2024).
  31. Gobin, J., et al. Hollow-fiber bioreactor production of extracellular vesicles from human bone marrow mesenchymal stromal cells yields nanovesicles that mirrors the immuno-modulatory antigenic signature of the producer cell. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 127(2021).
  32. Sun, L., et al. A 3D culture system improves the yield of MSCs-derived extracellular vesicles and enhances their therapeutic efficacy for heart repair. Biomed Pharmacother. 161, 114557(2023).
  33. Ryu, A. H., Eckalbar, W. L., Kreimer, A., Yosef, N., Ahituv, N. Use antibiotics in cell culture with caution: genome-wide identification of antibiotic-induced changes in gene expression and regulation. Sci Rep. 7 (1), 7533(2017).
  34. Meng, W., et al. Prospects and challenges of extracellular vesicle-based drug delivery system: considering cell source. Drug Deliv. 27 (1), 585-598 (2020).
  35. Yang, Y., et al. Extracellular vesicles isolated by size-exclusion chromatography present suitability for RNomics analysis in plasma. J Transl Med. 19 (1), 104(2021).
  36. Gamez-Valero, A., et al. Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents. Sci Rep. 6, 33641(2016).
  37. Gupta, D., Zickler, A. M., El Andaloussi, S. Dosing extracellular vesicles. Adv Drug Deliv Rev. 178, 178(2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

EVNK92 MI

Похожие статьи