Методическая статья

Генерация 3D-органоидов среднего мозга из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

DOI:

10.3791/67228

⸱

14 февраля 2025 г.

 ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Centre for International Health, Department of Global Public Health and Primary Care, University of Bergen, 3Department of Neurosurgery, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает новый метод создания трехмерных органоидов среднего мозга из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, направляя их формирование таким образом, чтобы имитировать нативную ткань среднего мозга, тем самым помогая в изучении развития и нарушений.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разработка органоидов среднего мозга (МО) из плюрипотентных стволовых клеток человека (ПСК) представляет собой значительный прогресс в понимании развития мозга, способствуя точному моделированию заболеваний и продвигая терапевтические исследования. В этом протоколе описан метод получения специфичных для среднего мозга органоидов с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с использованием стратегического подхода к дифференцировке. Ключевые методы включают двойное ингибирование SMAD для подавления передачи сигналов SMAD, введение фактора роста фибробластов 8b (FGF-8b) и активацию пути Sonic Hedgehog с использованием агониста пурморфамина, направляя ИПСК к судьбе среднего мозга.

Органоиды, полученные с помощью этого метода, достигают диаметра до 2 мм и включают в себя разнообразный набор типов нейроэпителиальных клеток, отражая присущее среднемозговому мозгу клеточное разнообразие. Валидация этих органоидов в качестве аутентичных структур среднего мозга включает в себя экспрессию специфичных для среднего мозга маркеров, подтверждающих их идентичность. Примечательным результатом этой методики является эффективная дифференцировка ИПСК в дофаминергические нейроны, характерные для среднего мозга.

Значение этого протокола заключается в его способности производить функционально зрелые, специфичные для среднего мозга органоиды, которые точно повторяют основные аспекты среднего мозга, предлагая ценную модель для глубокого исследования процессов развития среднего мозга и патофизиологии связанных с ними расстройств, таких как болезнь Паркинсона. Таким образом, этот протокол служит важнейшим ресурсом для исследователей, стремящихся улучшить наше понимание человеческого мозга и разработать новые методы лечения нейродегенеративных заболеваний, что делает его незаменимым инструментом в области неврологических исследований.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человеческий мозг с его сложной архитектурой и сложным клеточным и молекулярным составом представляет собой огромную проблему в исследованиях в области нейробиологии, особенно в контексте моделирования заболеванийи разработки клеточной терапии. Эти проблемы еще больше осложняются ограниченной доступностью сложных моделей in vitro, которые действительно представляют сложность человеческого мозга. Тем не менее, недавние достижения в технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSC), позволяющие контролировать дифференцировку в конкретные подтипы нейронов, открыли многообещающие возможности для изучения развития мозга человека, патогенеза заболеваний и клеточных терапевтических стратегий.

Традиционно, двумерные (2D) нейронные культуры, полученные из ИПСК были краеугольным камнем исследований in vitro, направленных на имитацию физиологии и патологии нейронов человека. Эти монослойные культуры сыграли важную роль в улучшении нашего понимания неврологических заболеваний и в открытии нейропротекторных агентов 2,3,4,5,6,7. Несмотря на свою полезность, эти двухмерные системы не в состоянии эмулировать истинное клеточное разнообразие и трехмерную (3D) структуру человеческого мозга.

Появление технологии органоидов мозга представляет собой значительный скачок в моделировании in vitro, предоставляя инструмент, который точно имитирует сложную биологию человеческого мозга в рамках физиологически релевантнойструктуры. Ранние методы развития органоидов мозга использовали присущие ИПСК регуляторные свойства спонтанно образовывать производные эктодермы, тем самым имитируя ранние стадии развития мозга 5,9,10,11,12. Учитывая сложные сети, образованные нейронами с другими нейронными и ненейрональными клетками, 3D-моделирование становится необходимым для точного изучения нейродегенеративных заболеваний. 3D-культуры обеспечивают более репрезентативную среду in vivo, способствуя ускоренной дифференцировке нейронов и формированию сетей 12,13,14, а также способствуют более широкой экспрессии нейрональных генов по сравнению с 2D-культурами 15. Нейроны, разработанные в 3D-контекстах, приобретают морфологию и физиологические атрибуты, более напоминающие их аналоги in vivo.

Последние достижения в области 3D-моделей мозга сыграли ключевую роль в более эффективном отражении пространственной и функциональной сложности человеческого мозга. За последнее десятилетие развитие различных протоколов для создания как органоидов всего мозга, так и регионально-специфичных моделей мозга 11,17,18,19,20,21,22 оказалось неоценимым в моделировании неврологических расстройств, таких как микроцефалия11, болезнь Альцгеймера 14,23 и болезнь Паркинсона24. Целью данного протокола является разработка и совершенствование метода создания 3D человеческих МО, полученных из человеческих ИПСК. Этот протокол специально направлен на создание органоидов, обогащенных дофаминергическими нейронами и пространственно организованных таким образом, чтобы точно имитировать естественную структуру и функциональность среднего мозга человека. Основная цель этих органоидов состоит в том, чтобы служить передовыми моделями in vitro для изучения болезни Паркинсона, обеспечивая более точную и физиологически актуальную систему для изучения процессов развития нервной системы и патологий, связанных с этим состоянием. Используя полученные от пациента иПСК для создания этих органоидов, специфичных для среднего мозга, протокол направлен на улучшение понимания механизмов болезни Паркинсона, облегчение обнаружения потенциальных терапевтических мишеней и улучшение разработки клеточной терапии. Благодаря этому инновационному подходу протокол направлен на преодоление ограничений традиционных 2D-культур нейронов и внесение значительного вклада в область исследований нейродегенеративных заболеваний, предлагая мощный инструмент для моделирования заболеваний in vitro и изучения новых стратегий лечения.

За последние 10 лет различные исследовательские группы разработали органоиды среднего мозга (МО)8,21,25,26,27,28, используя методологии, которые демонстрируют несколько ключевых сходств. Стремясь углубить понимание болезни Паркинсона, мы разработали протокол для создания 3D-человеческих МО, полученных из человеческих ИПСК. Эти органоиды, обогащенные пространственно расположенными дофаминергическими нейронами, представляют собой идеальную модель для изучения болезни Паркинсона. Наша разработка и совершенствование протоколов органоидов, специфичных для среднего мозга, привели к созданию передовых моделей in vitro, которые внесли значительный вклад в наше понимание процессов развития нервной системы и нейродегенеративных заболеваний. Эти модели, особенно применительно к полученным от пациента МО, продемонстрировали свою эффективность в качестве мощных инструментов для моделирования заболеваний in vitro, предлагая новые перспективы и методологии в области передовых 3D-клеточных культур.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ИПСК получены из нормальных фибробластов человека Detroit 551 и человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) линии hESC 360, как описано ранее4. ИПСК были получены с одобрения Комитета по этическим исследованиям в области здоровья Западной Норвегии REK nr. 2012/919. Все клетки регулярно контролировались на предмет контаминации микоплазмой с помощью набора для обнаружения микоплазмы MycoAlert. Таблица материалов содержит информацию обо всех материалах, реагентах и оборудовании, используемых в данном протоколе. В таблице 1 приведены используемые носители и другие материалы.

1. Размораживание ИПСК

  1. Пластина с матричным покрытием и основной 8 (E8) средний препарат
    1. Разморозьте флакон с базальной мембраной на льду на ночь. Разведите 1:100 в холодном Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Ham's F12 DMEM/F12 (1% конечной концентрации) (см. Таблицу материалов и Таблицу 1). Хранить аликвоты при температуре -20 °C для длительного использования.
    2. Разморозьте разбавленную базальную мембрану при 4 °C; Нанесите на 6-луночный планшет 1 мл раствора на лунку. Выдерживать при 37 °C в течение 1 ч.
    3. Извлеките пластину из инкубатора и дайте ей сбалансироваться до комнатной температуры (RT).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тарелки можно хранить в холодильнике не более 2 недель (перед использованием убедитесь, что они прогреты до RT). Для длительного хранения добавьте 1 мл E8 Medium (см. Таблицу материалов и Таблицу 1) в пластину с покрытием, чтобы избежать высыхания геля.
  2. Подготовка среды Е8
    1. В стерильных условиях сочетайте базальную среду Е8 с добавкой Е8 (см. Таблицу материалов и Таблицу 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Его можно хранить при температуре 4 °C в течение 2 недель. Разморозьте замороженную добавку E8 в течение ночи при температуре 4 °C перед приготовлением полной среды. Не размораживайте при 37 °C, так как это может нарушить его стабильность. Перед использованием нагрейте только необходимый объем E8 средней и комнатной температуры (RT) до тех пор, пока он не перестанет быть холодным на ощупь.

2. Посев ИПСК

  1. Подогрейте планшеты с матричным покрытием и E8 Medium в режиме RT или инкубаторе при 37 °C.
  2. Аспиратная питательная среда; промыть иПСК, конфлюенция которых составляет 60%-70%, фосфатно-солевым буфером Дульбекко без кальция и магния (DPBS Ca2+/Mg2+-free,4 мл на лунку в 6-луночном планшете).
  3. Добавить этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА, 0,5 мМ, 1 мл на лунку, см. Таблицу материалов и Таблицу 1); Инкубировать при 37 °C до тех пор, пока края колонии не отделятся (3-5 мин).
  4. Отсасывайте диссоциативный раствор; Чтобы отделить колонии, осторожно направьте предварительно подогретую среду E8 (4 мл на лунку) непосредственно на колонии с более сильной, чем обычно, силой пипетки, которая создает локализованное движение жидкости по поверхности клетки.
  5. Разделите ячейки в соотношении 1:2, перенеся их в две новые лунки из 6-луночного планшета с матричным покрытием, добавив 2 мл среды на лунку. Затем инкубируйте при 37 °C.
  6. Обменивайтесь носителями ежедневно, пока колонии не достигнут 80% слияния.
  7. Используя микроскоп с 10-кратным увеличением, понаблюдайте за колониями, чтобы убедиться, что они имеют соответствующий размер, обычно характеризующийся отчетливой круглой формой диаметром от 0,5 до 1 мм. Убедитесь, что колонии представляют собой плотные, компактные структуры с очерченными, плавными границами.

3. Нейронная индукция

  1. Подготовка к середине и подготовка к дню 0
    1. Приготовьте по 500 мл химически определенной среды (CDM), нервной индукционной среды (NIM) и среды, не содержащей сыворотки нейронных стволовых клеток (NSC SF), в соответствии с Таблицей материалов и Таблицей 1.
    2. Промойте клетки в 6-луночном планшете 4 мл DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+- free) на лунку, а затем добавьте 3 мл NIM на лунку для установки в день 0.
    3. Замените NIM (3 мл на лунку) в 1, 3 и 5 дни; Ежедневно наблюдайте под микроскопом.
    4. На 6-й день отделите нейронные розетки в культуру суспензии, выполнив следующие действия.
      1. Аккуратно промойте один раз DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (4 мл на лунку в 6-луночном планшете). Добавьте коллагеназу в/в (1 мл на лунку в 6-луночном планшете) и инкубируйте в течение 1 минуты. Удалите коллагеназу внутривенно и аккуратно промойте один раз DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (4 мл на лунку в 6-луночном планшете).
      2. Добавьте по 2 мл NSC SF Medium в каждую лунку 6-луночного планшета. Отделите ячейки, соскребая дно лунок, создав сетки с наконечником для пипетки объемом 200 мкл.
      3. Переложите клеточную суспензию из 6-луночного планшета в 10-сантиметровую неадгезивную посуду. Отрегулируйте объем до 12 мл с помощью NSC SF Medium.
      4. Поместите неадгезивную чашку на шейкер (компактный орбитальный шейкер ssm1) со скоростью 85 об/мин под углом 0° в инкубатор, установленный на 37 °C с 5%CO2 , чтобы предотвратить скопление.

4. Структурирование среднего мозга

  1. На 7-й день добавьте 12 мл CDM со 100 нг/мл FGF-8b; Поместите на орбитальный вибростенд-инкубатор.
  2. На 8-13 день меняйте носитель каждые 2 дня; Наблюдайте под микроскопом ежедневно.
  3. На 14-й день добавьте 12 мл CDM со 100 нг/мл FGF-8b и 1 μМ пурморфамином (PM); Поместите на орбитальный встряхиватель.
  4. На 15-20 день меняйте носитель каждые 2 дня; Наблюдайте под микроскопом ежедневно.

5. Встраивание Matrigel и терминация и созревание MO

  1. Матригель разморозить на льду при температуре от 2 °C до 8 °C в течение 1-2 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разморозьте достаточное количество Матригеля, чтобы обеспечить 15 мкл для каждого эмбриоидного тела (БЭ). Храните Матригель охлажденным на льду, чтобы избежать ранней полимеризации. Охладите всю пластиковую посуду, которая будет контактировать с Matrigel, до -20 °C в течение минимум 30 минут перед использованием.
  2. Положите стерильный лист для заделки органоидов в пустую миску.
  3. С помощью наконечника для дозатора с широким отверстием объемом 200 мкл аккуратно извлеките органоид из чашки и перенесите его на закладную поверхность с помощью одного органоида на лунку. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока на поверхности заделки не соберется 12-16 EB.
  4. Осторожно удалите излишки среды из каждого ЭБ, а затем добавьте 15 мкл холодного Матригеля по каплям на каждый ЭБ. С помощью пипетки переместите EB к центру капли Matrigel.
  5. Инкубируйте планшет в инкубаторе, установленном при температуре 37 °C, в течение 15-20 минут, чтобы дать Матригелю полимеризоваться.
  6. С помощью стерильных щипцов приподнимите закладной лист с каплями Матригеля. Держите лист прямо над одной лункой в 6-луночной пластине со сверхнизкой адгезией. Нанесите пипеткой 3 мл CDM с концентрацией 10 нг/мл нейротрофического фактора мозга (BDNF) и нейротрофического фактора (GDNF) глиальной клеточной линии с концентрацией 10 нг/мл и аккуратно промойте капли Matrigel с листа в каждую лунку. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока все 6-8 капель Матригеля не перейдут в одну лунку.
  7. Поместите планшеты на орбитальный шейкер в инкубатор при температуре 37 °C при 85 об/мин и меняйте CDM на 10 нг/мл BDNF и 10 нг/мл GDNF каждые 3 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте дифференцирующие культуры до 3 месяцев; Нейронная морфология проявляется через 2 недели после прерывания беременности. BDNF и GDNF не требуются для выращивания более 3 месяцев.

6. Иммунофлюоресцентное окрашивание

  1. С помощью пипетки объемом 1 000 мкл аккуратно извлеките органоид из среды и аккуратно поместите его на предметное стекло микроскопа с минимальным количеством среды.
  2. Дайте ему полностью высохнуть на воздухе при RT. Добавьте 4% параформальдегид (PFA) (300 μл на образец) в течение 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ПФА опасен и может обладать канцерогенными свойствами. Обращайтесь с ним с осторожностью, воздерживайтесь от прямого контакта с кожей и глазами и обеспечьте использование в вытяжном шкафу для химикатов.
  3. Добавьте 30% раствор сахарозы (300 μл на образец) в предметные стекла и дайте им инкубироваться в течение ночи при 4 °C.
  4. Блокируйте и проникайте в органоиды, добавляя блокирующий буфер (BB) (300 мкл на образец), который включает PBS (с Ca2+/Mg2+), 0,3% Triton X-100 и 10% обычной козьей сыворотки, в течение 2 ч при RT (или на ночь при 4 °C). Используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы разграничить органоиды и ограничить буфер на предметном стекле.
  5. Покройте образцы соответствующим объемом первичного антитела в блокирующем буфере (300 мкл на образец), анти-вилочном бокс-белке G1 (FOXG1, 1:200), антиортодентальном гомеобоксе 2 (OTX2, 1:100), анти-вилочном боксе A2 (FOXA2, 1:100), антитирозингидроксилазе (TH, 1:100), анти-SRY (область определения пола Y)-боксе 2 (SOX2, 1:100), антипарном бокс-белке (PAX6, 1:100) и антимикротрубочном ассоциированном белке 2 (MAP2 1:500), и инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C в темное время суток (см. Таблицу материалов).
  6. Промойте образцы в 1x PBS в течение 3 часов с двумя-тремя сменами буфера на мягко покачивающейся платформе.
  7. Инкубируйте с вторичным антителом (300 мкл на образец), анти-Alexa Fluor 488 (1:800), анти-Alexa Fluor 594 (1:800) и анти-Alexa Fluor 647 (1:800) в течение ночи при 4 °C во влажной темной комнате. Добавьте одновременно ядерное пятно Hoechst 33342 (1:5,000) (см. Таблицу материалов).
  8. Удалите антитело, быстро промойте PBS, а затем добавьте PBS, содержащий 0,01% азида натрия, в течение 1-2 дней при 4 °C для ингибирования загрязнения.
  9. Отсадите PBS, удалите излишки раствора и установите органоиды с помощью монтажной среды (см. Таблицу материалов). Установите покровное стекло, предотвращая образование пузырьков воздуха, и храните в темной комнате при температуре RT не менее 12 часов, чтобы монтажная среда полностью полимеризовалась.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь образец готов к наблюдению с помощью флуоресцентного микроскопа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы представляем новаторский протокол для получения MO из iPSCs. Центральное место в нашей методологии занимает инновационное использование двойного ингибирования SMAD, синергетически сочетающегося с FGF-8b и агонистом пути звукового ежа (SHH) пурморфамином (PM). Этот подход представлен на рисунке 1. Процесс дифференцировки начинается с направления иПСК к линии нейроэктодермы, образуя колонии нейроэпителиальных или нервных розеток. Это достигается за счет двойного ингибиро...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы разработали методологию дифференциации МО от ИПССК. В нашем протоколе используется стратегия двойного ингибирования SMAD, усиленная морфогенными факторами, включая FGF-8b и агонист SHH PM. Этот подход точно имитирует сигналы развития, имеющие решающее значение для онтогенеза среднего мозга. Разработанный нами путь дифференцировки стимулирует формирование нейроэпителиальных структур, напоминающих нейронные розетки, наблюдаемые при естественном развитии мозга. Эта тр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 1 создан с использованием BioRender.com. Мы благодарим University of Bergen Meltzers Høyskolefonds (номер проекта: 103517133), Герду Мейер Найквист Гульдбрандсон и Гердта Мейера Nyquists legat (номер проекта: 103816102) за финансирование.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ПЗС-микроскоп Камера Leica DFC3000 GLeica Microsystems, Германия
Химически определенный липидный концентратThermo Fisher Scientific11905031CDM ингредиент
коллагеназа  IVThermo Fisher Scientific17104019Реагент для щадящей диссоциации иПСК человека
Corning  блюда для необработанных культурSigma-AldrichCLS430589Суспензия культура 
DMEM/F-12, добавка GlutaMAXThermo Fisher Scientific10565018Астроцитарная дифференцировка базальная среда
DPBSThermo Fisher Scientific14190250Используется для различных промывки клеточных культур
EDTAThermo Fisher Scientific15575020Реагент для мягкой диссоциации иПСК человека
Essential 8 Базальная средаThermo Fisher ScientificA1516901Базальная среда для культуры iPSC
Essential 8 Supplement (50x)Thermo Fisher ScientificA1517101Добавка для культуры iPSC
FCCPAbcamab120081Устраняет потенциал митохондриальной мембраны и окрашивание TMRE
FGF-basicPeproTech100-18BСреда для дифференцировки астроцитов ингредиент
Система аспирации жидкости BVC controlVacuubrand, Германия
Формальдегид (PFA) 16%Thermo Fisher Scientific28908Фиксация клеток 
GDNFPeprotech450-10DA нейроны средний ингредиент
Geltrex (матрица базальной мембраны)Thermo Fisher ScientificA1413302Используется для прикрепления и поддержания иПСК человека
GlutaMAX ДобавкаThermo Fisher Scientific35050061Добавка для культуры NSC
Heracell 150i CO2 ИнкубаторыFisher Scientific, США
IMDMThermo Fisher Scientific21980032Базальная среда для CDM
InSolution AMPK ИнгибиторSigma-Aldrich171261Нейроиндукционная среда
ИнсулинRoche1376497CDM ингредиент
iPSCs, полученные из Detroit 551 fibroblats ATCCCCL-110
Leica TCS SP8 STED конфокальный микроскопLeica Microsystems, Германия
MatrigelLife Science354230Matrigel встраивание
МонотиоглицеринSigma-AldrichM6145CDM ингредиент
Нормальная козья сывороткаThermo Fisher ScientificPCN5000Используется для блокировки
буфера Orbital шейкеры - SSM1Stuart Equipment, Великобритания
Лист для встраивания органоидовSTEMCELL Technologies8579Matrigel Лист для
встраивания органоидовSTEMCELL Technologies 8579
PBS 1xThermo Fisher Scientific18912014Используется для различных смывок
Поли-D-лизина гидробромидSigma-AldrichP7405Способствует прикреплению и росту нервных клеток in vitro
раствор поли-L-орнитинаSigma-AldrichP4957Способствует прикреплению и росту нервных клеток in vitro
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36930Монтаж покровного стекла для конфокального изображения
PurmorphamineSTEMCELL Technologies72204Способствует дифференцировке нейронов DA
Рекомбинантный белок человека/мыши FGF-8b НИР D Systems423-F8-025/CFСпособствует дифференцировке нейронов DA 
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPНейроиндукционная среда
Ингредиент TRITON X-100VWR International9002-93-1Используется для проникновения клеток в иммуноокрашивающих анализах
SSM1 компактный орбитальный шейкерNorrscope51901-10 SSM1 Встряхиватель, орбитальный, мини 230ВВращатель для культивирования органоидов.
Водяная баня Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments, США
Антитела, используемые для иммуноокрашивания
Primary Антитела
anti-DATAbcamab128848, RRID:AB_2665470Rabbit; 1:100 
anti-FOXA2ProteinTech22474-1-AP, RRID:AB_2879110Кролик; 1:100 
anti-FOXG1Abcamab196868, RRID:AB_2892604Кролик; 1:200
anti-LMX1Abcamab139726, RRID:AB_2827684Кролик; 1:100 
anti-MAP2Abcamab5392 ,RRID:AB_2138153Курица; 1:500
анти-OTX2ProteinTech13497-1-AP, RRID:AB_2157176Кролик; 1:100 
anti-THAbcamab75875, RRID:AB_1310786Кролик; 1:100 
<сильное>вторичное антитело<сильное>разведение (μ L)
  Алекса Флуор  594 козий антикроличьи IgGThermo Fisher ScientificA-11012  1:400
Alexa Fluor  488 козий анти-кролик IgGThermo Fisher ScientificA- 11008  1:400
Alexa Fluor  488 козий анти-кролик IgGThermo Fisher ScientificA- 11008  1:400
Alexa Fluor  488 козий анти-кролик IgGThermo Fisher ScientificA- 11008  1:400
Alexa Fluor  594 козий анти-кролик IgG Thermo Fisher ScientificA-11012  1:400
Alexa Fluor  594 козий анти-кролик IgG Thermo Fisher ScientificA-11012  1:400
Alexa Fluor  647 козий антикуриный IgG Thermo Fisher ScientificA-21469  1:400

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Markram, H. Seven challenges for neuroscience. Funct Neurol. 28 (3), 145-151 (2013).
  2. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Exp Neurol. 33 (7), 113-536 (2021).
  3. Chen, A., et al. Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations. Front Cell Dev Biol. 9, 304-737 (2021).
  4. Liang, K. X., et al. Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations. EMBO Mol Med. 12 (10), 121-146 (2020).
  5. Xu, P., et al. Human midbrain dopaminergic neuronal differentiation markers predict cell therapy outcomes in a Parkinson's disease model. J Clin Invest. 132 (14), 156-768 (2022).
  6. Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Sci Transl Med. 4 (141), 141-190 (2012).
  7. Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8 (3), 267-280 (2011).
  8. Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 12 (1), 73-102 (2021).
  9. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  10. Qian, X., Song, H., Ming, G. L. Brain organoids: advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074(2019).
  11. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  12. Shariati, L., Esmaeili, Y., Haghjooy Javanmard, S., Bidram, E., Amini, A. Organoid technology: Current standing and future perspectives. Stem Cells. 39 (12), 1625-1649 (2021).
  13. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
  14. D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37 (10), 1139-1148 (2015).
  15. Sun, A. X., Ng, H. H., Tan, E. K. Translational potential of human brain organoids. Ann Clin Transl Neurol. 5 (2), 226-235 (2018).
  16. Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).
  17. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  18. Asgrimsdottir, E. S., Arenas, E. Midbrain dopaminergic neuron development at the single cell level: In vivo and in stem cells. Front Cell Dev Biol. 8, 463(2020).
  19. Zagare, A., et al. Midbrain organoids mimic early embryonic neurodevelopment and recapitulate LRRK2-p.Gly2019Ser-associated gene expression. Am J Hum Genet. 109 (2), 311-327 (2022).
  20. Mohamed, N. V., et al. Midbrain organoids with an SNCA gene triplication model key features of synucleinopathy. Brain Commun. 3 (4), fcab223(2021).
  21. Jo, J., et al. Midbrain-like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuromelanin-producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  22. Kwak, T. H., et al. Generation of homogeneous midbrain organoids with in vivo-like cellular composition facilitates neurotoxin-based Parkinson's disease modeling. Stem Cells. 38 (6), 727-740 (2020).
  23. Karmirian, K., et al. Modeling Alzheimer's disease using human brain organoids. Methods Mol Biol. 2561, 135-158 (2023).
  24. Smits, L. M., et al. Modeling Parkinson's disease in midbrain-like organoids. NPJ Parkinsons Dis. 5, 5(2019).
  25. Qian, X., et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  26. Smits, L. M., et al. Single-cell transcriptomics reveals multiple neuronal cell types in human midbrain-specific organoids. Cell Tissue Res. 382 (3), 463-476 (2020).
  27. Sozzi, E., Nilsson, F., Kajtez, J., Parmar, M., Fiorenzano, A. Generation of human ventral midbrain organoids derived from pluripotent stem cells. Curr Protoc. 2 (9), 555(2022).
  28. Tieng, V., et al. Engineering of midbrain organoids containing long-lived dopaminergic neurons. Stem Cells Dev. 23 (13), 1535-1547 (2014).
  29. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  30. Mercurio, S., Serra, L., Pagin, M., Nicolis, S. K. Deconstructing Sox2 function in brain development and disease. Cells. 11 (10), 1604(2022).
  31. Hettige, N. C., Ernst, C. FOXG1 dose in brain development. Front Pediatr. 7, 482(2019).
  32. Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Mol Cell Neurosci. 45 (3), 258-266 (2010).
  33. Millet, S., Bloch-Gallego, E., Simeone, A., Alvarado-Mallart, R. M. The caudal limit of Otx2 gene expression as a marker of the midbrain/hindbrain boundary: a study using in situ hybridisation and chick/quail homotopic grafts. Development. 122 (12), 3785-3797 (1996).
  34. Surmeier, D. J. Determinants of dopaminergic neuron loss in Parkinson's disease. FEBS J. 285 (19), 3657-3668 (2018).
  35. Chen, A., Yangzom, T., Sullivan, G. J., Liang, K. X. Mitochondrial dysfunction and neuronal anomalies in POLG mutant midbrain organoids. bioRxiv. , (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SMADSonic Hedgehog
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи