Здесь мы описываем процедуру анализа прогрессии репликации через патогенные, склонные к структуре повторы с использованием 2-мерного гель-электрофореза.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Электрофоретический анализ репликации через структурно-склонные повторы ДНК в эписоме человека, основанной на SV40
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Двумерный нейтральный/нейтральный гель-электрофорез (2DGE) стал эталонным методом анализа репликации ДНК через естественные препятствия. В этом протоколе описывается, как анализировать прогрессирование репликационной вилки через склонные к структуре, расширяемые повторы ДНК в эписоме на основе вируса обезьян 40 (SV40) в клетках человека. Вкратце, при трансфекции плазмиды в клетки человека промежуточные продукты репликации выделяют по модифицированному протоколу Hirt и обрабатывают ферментом рестрикции DpnI для удаления нереплицированной ДНК. Затем промежуточные продукты расщепляются соответствующими ферментами рестрикции, чтобы поместить интересующий их повтор в исходную дистальную половину фрагмента ДНК длиной 3-5 кб. Промежуточные продукты репликации разделены на два перпендикулярных измерения, сначала по размеру, а затем по форме. Следуя гибридизации методом Саузерн-блот, этот подход позволяет исследователям наблюдать остановку вилки при различных структурообразующих повторах на нисходящей половине Y-дуги репликации. Кроме того, такое расположение места остановки позволяет визуализировать различные результаты остановки вилки, опосредованной повторами, такие как реверсирование вилки, появление сходящейся вилки и рекомбинационный перезапуск вилки.
Введение
Короткие тандемные повторы (STR) представляют собой небольшие, обычно 2-9 пар оснований (.о.), повторяющиеся последовательности ДНК, которые составляют около 3% генома человека. STR играют важную роль в регуляции генов2; однако их повторяющийся состав делает их склонными к образованию неканонических вторичных структур ДНК и последующей генетической нестабильности 3,4. От левосторонних спиралей до шпилек/крестообразных, до трех- и четырехцепочечных спиралей, эти альтернативные структуры ДНК вызывают внутренние проблемы для репсомы. Естественной предпосылкой для фо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида, разработанная для нашего описанного нами анализа 2DGE в клетках млекопитающих, должна содержать источник репликации SV40 на несколько кб выше склонных к структуре повторов (рис. 2). Опережающий и запаздывающий синтез следует иметь в виду при выборе ориентации относительно происхождения повторов в плазмиду.
Рисунок 2: Расщепление плазмиды, содержащей повторы, для анализа 2DGE. Склонны....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В случае успеха, при визуализации, можно наблюдать острую дугу репликационных вилок, простирающуюся вверх и наружу от массивного пятна 1n (рисунок 5A). Размер фрагмента, или процент репликации, определяет подвижность фрагмента в первом измерении. По мере того, как промежуточные звенья развивают более сочлененную структуру, они начнут двигаться медленнее во втором измерении. Следовательно, если промежуточный продукт медленно перемещался в обоих измерениях, можно утверждать, что он является вы.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
2DGE обеспечивает полуколичественное и всеобъемлющее изображение относительных популяций промежуточных продуктов, возникающих при репликации той или иной последовательности. Учитывая, что хрупкие молекулярные структуры репликационных вилок должны поддерживаться на протяжении всей этой процедуры, следует проявлять большую осторожность для предотвращения физического сдвига и химической денатурации. Поэтому настоятельно рекомендуется избегать любого щелочного лечения во время выделения плаз.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Благодарности
Мы благодарим Хорхе Себриана и Анастасию Растокину, которые начали разрабатывать этот подход в нашей лаборатории, Массимо Лопеса за предоставленную нам плазмиду pML113 и бесценные советы, Илли Доксани за содержательные дискуссии и сотрудников лаборатории Миркина за их поддержку. Работа в лаборатории Миркина поддерживается Национальным институтом общих медицинских наук [R35GM130322] и NSF-BSF [2153071].
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 10x TBE Buffer | Bio Rad | 1610733 | |
| 20x SSC Buffer | Fisher Scientific | BP1325-1 | |
| 293T клетки | ATCC | CRL-3216 | |
| a-32P dATP, 3000 Ки/ммоль | Revvity | BLU512H250UC | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Amersham Hybond-N+ | Fisher Scientific | RPN303B | |
| BAS Накопительные люминофорные экраны | Fisher Scientific | 28956482 | |
| Черча и буфер для гибридизации Gibert | Fisher Scientific | 50-103-5408 | |
| DecaLabel DNA label набор | ThermoFisher Scientific | K0622 | |
| DMEM, с высоким содержанием глюкозы, добавка GltaMAX, пируват | ThermoFisher Scientific | 10569010 | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Также необходимо приобрести дополнительные рестрикционные ферменты |
| , а также ЭДТА 0,5 М, pH 8 | Fisher Scientific | BP2482500 | |
| этанол, 70% | Fisher Scientific | ||
| Фетальная бычья сыворотка | VWR | 97068-085 | |
| Раствор соляной кислоты, 12 М | Миллипор Sigma | 13-1683 | |
| Изопропанол | Fisher Scientific | BP26184 | |
| jetPRIME ДНК и миРНК Реагент для трансфекции с буфером | VWR | 101000027 | |
| MycoZap Plus-CL | VWR | 75870-448 | |
| NaCl Millipore Sigma | 746398-500G | ||
| Высокоскоростные центрифужные трубки Nalgene Oak Ridge | ThermoFisher Scientific | 3139-0050 | |
| Фосфатный буферный раствор, pH 7,4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Фосфатный буферный раствор, pH 7,5 | ThermoFisher Scientific | 10010024 | |
| протеиназа K | ThermoFisher Scientific | EO0491 | |
| Протеиназа K | ThermoFisher Scientific | EO0492 | |
| Бумага для хроматографии из чистой целлюлозы | Fisher Scientific | 05-714-4 | |
| Бумага для хроматографии из чистой целлюлозы | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Линейка | Fisher Scientific | 09-016 | |
| Скальпель | Fisher Scientific | 12-460-451 | |
| Додецилсульфат | натрияMillipore Sigma | 436143-25G | |
| Гидроксид натрия | Fisher Scientific | S25548 | |
| Sorval LYNX 4000 Сверхскоростная центрифуга | ThermoFisher Scientific | 75006580 | |
| Система горизонтального электрофореза с субклеткой | Bio Rad | 1704401 | |
| TH13-6 x 50 Ротор с качающимся ковшом | ThermoFisher Scientific | 75003010 | |
| Tris-HCl 1 M, pH 7,5 | Fisher Scientific | BP1757-500 | |
| Trypsin-EDTA (0,25%), фенол красный | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
Ссылки
- Liao, X., et al. Repetitive DNA sequence detection and its role in the human genome. Commun Biol. 6 (1), 1-21 (2023).
- Fotsing, S. F., et al. The impact of short tandem repeat variation on gene expression. Nat Genet. 51 (11), 1652-1659 (2019).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
