Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение и характеристика экзосом, полученных из тканей селезенки мыши

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67234

⸱

20 сентября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 2Scientific Research Center, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 3Medical Interdisciplinary Science Research Center of Western Guangdong, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе мы представляем протокол выделения экзосом, полученных из селезенки мышей, с использованием комбинации расщепления с коллагеназой I типа и ультрацентрифугирования.

Аннотация

Экзосомы (Exo) — это липидно-бислойные структуры, секретируемые различными клетками, в том числе животными, растениями и прокариотами. Предыдущие исследования показали, что Exo, полученные из гуморального или клеточного супернатанта, являются перспективными мишенями для новых диагностических или прогностических биомаркеров, подчеркивая их значительную роль в патогенезе заболевания. Экзо из тканей (Ti-Exo) привлекают все большее внимание благодаря своей способности точно отражать специфичность тканей и микроокружение. Ti-Exo, присутствующий в интерстициальном пространстве, играет решающую роль в межклеточной коммуникации и передаче сигналов между органами. Несмотря на их признанную ценность в выяснении механизмов заболевания, выделение Ti-Exo остается сложной задачей из-за сложности тканевых матриц и вариабельности методов экстракции. В этом исследовании мы разработали практический протокол выделения экзосом из ткани селезенки мышей, обеспечив воспроизводимую технику для последующего анализа идентификации и функциональных исследований. Мы использовали расщепление коллагеназы I типа в сочетании с дифференциальным ультрацентрифугированием для выделения Exo, полученного из селезенки. Характеристики выделенного Exo определяли с помощью электронной микроскопии, нанопроточного цитометра и вестерн-блоттинга. Изолированный Exo, полученный из селезенки, продемонстрировал типичную морфологию липидных бислойных везикул с размерами частиц от 30 нм до 150 нм. Кроме того, профиль экспрессии маркеров экзосом подтвердил наличие и чистоту экзосом. В совокупности мы успешно разработали практический протокол выделения Exo, полученного из селезенки, у мышей.

Введение

Экзосомы (Exo) представляют собой подгруппу внеклеточных везикул (EV) размером от 30 до 150 нм, инкапсулирующих разнообразный набор биомолекул, включая белки, нуклеиновые кислоты илипиды. Эти биомолекулы получают из родительских клеток и высвобождаются во внеклеточное пространство. Exo способствуют обмену биомолекулярной информацией между клетками и окружающим их микроокружением, играя роль как в прокариотических, так и в эукариотических системах2. Характеристики экзосом, такие как состав, размер, компоненты мембраны и клеточное происхождение, сильно варьируются и зависят от типа исходной клетки, состояния клетки и условий окружающей среды.

Экзосомы обычно классифицируются на три категории в зависимости от их источника: полученные из клеточных культур, полученные из жидкостей организма и полученные из тканей (Ti-Exo). В то время как экзосомы, полученные из клеточных культур, были широко изучены из-за их доступности и стабильного выхода, их использование ограничено потенциальными изменениями в характеристиках клеток после длительного культивирования, которые могут искажать их биологические функции 3,4,5. Кроме того, большинство клеточных культур поддерживаются в двумерных средах, которые не имитируют сложные межклеточные взаимодействия in vivo, что потенциально влияетна интерпретацию данных. И наоборот, экзосомы, выделенные из биологических жидкостей, предлагают минимально инвазивный вариант мониторинга прогрессирования заболевания в режиме реального времени7. Однако эти образцы часто содержат смесь экзосом различного происхождения, что затрудняет точную идентификацию их первичного источника8. Учитывая эти проблемы, растет интерес к Ti-Exo, которые находятся во внеклеточном интерстиции и являются ключевыми медиаторами межклеточной сигнализации.

Селезенка играет решающую роль в иммунной функции и поддержании внутреннего гомеостаза. Несмотря на существующие протоколы выделения Ti-Exo из таких органов, как мозг, печень и опухоли, о практических методах получения экзосом, полученных из селезенки, сообщается ограниченно. Это исследование было направлено на создание практического протокола для выделения экзосом из ткани селезенки у мышей, модифицированных по сравнению спредыдущим отчетом. Мы подробно описываем метод, включающий расщепление коллагеназы с последующим ультрацентрифугированием, которое сводит к минимуму разрушение клеточной мембраны и обеспечивает высокую чистоту и выход экзо, полученного из селезенки. Характеристики изолированного Exo с использованием этого установленного протокола были проверены с помощью электронной микроскопии (ПЭМ), нанопроточного цитометра (Nano-FCM) и вестерн-блоттинга, подтвердив эффективность протокола для дальнейших экспериментальных исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Образцы были получены от мышей с этическим одобрением, предоставленным Комитетом по этике Гуандунского медицинского университета. Подробное описание материалов, оборудования и программного обеспечения, используемых в этом протоколе, представлено в Таблице материалов. Детали подготовки перед экстракцией проиллюстрированы на рисунке 1, а процесс экстракции и обогащения Spleen-Exo описан на рисунке 2.

1. Подготовка

  1. Предварительно охладите высокоскоростные и сверхскоростные центрифуги до 4 °C и установите температуру настольного шейкера на 37 °C.
  2. Приготовьте чашки для клеточных культур (figure-protocol-1100 мм), стерильные центрифужные пробирки объемом 50 мл, лед и стерильное клеточное ситечко (figure-protocol-270 мкм), как показано на рисунках 1A, B.
  3. Стерилизовать ножницы и щипцы с помощью 75% спиртового спрея с последующей высокотемпературной стерилизацией. Эти инструменты показаны на рисунке 1C.
  4. Поместите ткань селезенки в стерильную figure-protocol-3чашку Петри диаметром 100 мм на льду и смойте поверхностную кровь 1x ледяным стерильным фосфатно-солевым раствором (PBS). Высушите ткани селезенки стерильной марлей и взвесьте их после сушки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань заморожена, разморозьте ее в посуде в течение 15 минут на льду, прежде чем продолжить.
  5. Увлажните клеточный фильтр (figure-protocol-470 μм), капнув 1 мл стерильного PBS в фильтр с помощью стерильной транспортной пипетки.
  6. Приготовьте пищеварительный буфер (0,1% коллагеназы I типа) с помощью 1x PBS с помощью вихревого миксера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 10 мл пищеварительного буфера на каждые 100 мг ткани селезенки. Концентрация коллагеназы была выбрана в этом исследовании на основе инструкции к продукту. Для других типов тканей исследователям может потребоваться скорректировать эти параметры в зависимости от плотности и состава тканей. Рекомендуется провести предварительные эксперименты с различными концентрациями и временем переваривания, чтобы определить оптимальные условия для каждого типа тканей.

2. Пищеварение тканей

  1. Измельчите ткань на однородные мелкие кусочки ножницами в чашке для культивирования на льду (рис. 3А) и переложите в центрифужную пробирку объемом 50 мл со стерильной передаточной пипеткой.
  2. Добавьте в пробирку буфер для пищеварения в соответствии с массой ткани селезенки, как указано выше (рис. 3В), затем встряхните пробирку под углом 45° на горизонтальном шейкере при температуре 37 °С. Следите за ходом пищеварения и останавливайте его, когда куски ткани рассеялись, и большинство из них потеряли свою форму. Время переваривания должно варьироваться в зависимости от ткани. В экспериментальных условиях в этом исследовании время переваривания составляет примерно 30 минут.
  3. Переложите сваренную смесь в клеточное ситечко (Ф70 мкм) при комнатной температуре (RT) для удаления волокнистых и более крупных остатков тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полная фильтрация сразу после сбраживания.
  4. Соберите фильтрат в новую центрифужную пробирку объемом 50 мл.

3. Выделение экзосом методом дифференциального центрифугирования

  1. Центрифуга фильтрует при давлении 500 x g в течение 10 мин при 4 °C. Гранула, содержащая остаточные клетки, клеточный мусор и ядра, может быть видна после центрифугирования, как показано на рисунке 3В.
  2. Перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку и центрифугуйте при давлении 3000 x g в течение 20 минут при 4 °C. Гранула, содержащая апоптотические тела и микросомы, может быть видна после центрифугирования, как показано на рисунке 3D.
  3. Перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку и центрифугируйте при давлении 10 000 x g в течение 30 минут при 4 °C. Гранулы, содержащие микровезикулы и плазматическую мембрану, можно увидеть после центрифугирования, как показано на рисунке 3Е.
  4. Ультрацентрифугирование полученного надосадочной жидкости при 120 000 x g в течение 2 ч при 4 °C. После центрифугирования на дне пробирки можно увидеть гранулу, как показано на рисунке 3F.
  5. Выбросьте надосадочную жидкость, промойте гранулу PBS и снова ультрацентрифугируйте при 120 000 x g в течение 2 ч при 4 °C для получения экзосом. После центрифугирования на дне пробирки можно увидеть гранулу, как показано на рисунке 3G.
  6. Растворите выделенные экзосомы стерильным PBS (200 мкл на селезенку) и храните выделенные экзосомы в новой центрифужной пробирке объемом 2 мл при температуре -80 °C.

4. Характеристика экзосом с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ)

ПРИМЕЧАНИЕ: ПЭМ был использован для определения того, проявляет ли извлеченный Exo характеристики везикул. Образцы Exo, идентифицированные с помощью электронной микроскопии, должны быть свежими образцами или храниться кратковременно при температуре 4 °C в течение короткого времени.

  1. Фиксация экзосом (2-6 г/мкл) с помощью 2% параформальдегида класса электронной микроскопии (ЭМ) в режиме ЛТ в течение 2 ч.
  2. Поместите 10 μл раствора экзосома на медную сетку, выдержите при RT в течение 10 минут, промойте стерильной дистиллированной водой, а излишки жидкости промокните абсорбирующей бумагой.
  3. Окрасьте медную сетку 2% уранилацетатом на 1 минуту, промокните лишнюю жидкость фильтровальной бумагой и просушите под лампой накаливания в течение 2 минут.
  4. Наблюдайте за подготовленным образцом под просвечивающим электронным микроскопом при напряжении 80 кВ.

5. Измерение распределения по размерам и концентрации частиц в экзосомах

  1. Загрузите стандартные наночастицы полистирола (250 нм) в нанопроточный цитометр.
  2. Измерьте концентрацию белка в образцах Exo с помощью набора для анализа белка BCA. Разбавьте образец Exo с помощью PBS в соответствии с результатами анализа белка BCA (разбавьте экзосомы до 1-10 нг/мкл), затем загрузите образцы Exo в нанопоток для измерения интенсивности бокового рассеяния (SSI).
  3. Рассчитайте концентрацию Exo в соответствии с отношением SSI к концентрации частиц в стандартных наночастицах полистирола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения размеров стандартная кривая генерируется путем загрузки стандартных наночастиц кремнезема с градиентными размерами (68 нм, 91 нм, 113 нм, 155 нм) в нанопроточный цитометр. После этого следует загрузка образца Exo. Распределение Exo по размерам было рассчитано в соответствии со стандартным лечением.

6. Лизис и иммуноблоттинг подтверждения белков экзосом

  1. Добавьте 100 мкл буфера для лизиса радиоиммунопреципитации (RIPA) в гранулу экзосомы для анализа белка.
  2. Энергично вихрите, накрываем парапленкой, качаем 20 минут на RT, затем снова вихрь.
  3. Кратковременно центрифугируйте при 1000 x g в течение 30-60 с, чтобы собрать образец, переложите в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и храните при температуре от -20 °C до -80 °C до анализа.
  4. Для иммуноблоттинга смешайте образцы с 5-кратным загрузочным буфером для достижения 1-кратной концентрации и подготовьтесь к гель-электрофорезу.
  5. Если требуется контроль гомогената всей ткани, используйте сильный буфер для лизиса с ингибитором протеазы для лизирования ткани, как описано выше. Затем центрифугируйте образцы при давлении 10 000 x g в течение 10 минут и выбросьте оставшийся внеклеточный матрикс, целые клетки или неповрежденный клеточный мусор.
  6. Буфер для образца, содержащий экзосомы или тканевый гомогенат, кипятят при температуре 95 °C в течение 5-10 минут. Загрузите одинаковое количество белка на дорожку в 10% гель SDS-PAGE. Нагрузка на белок ткани равна контролю.
  7. Проведите гель-электрофорез под напряжением 80 В в течение примерно 2 ч с использованием обычного буфера для электрофореза. Проведите вестерн-блоттинг для подтверждения экспрессии Exo-белка в очищенных лизатах и сравнения относительной концентрации Exo во фракциях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Выделение и очистка экзосом, полученных из селезенки
Для выделения экзосом из ткани селезенки мыши мы использовали комбинацию расщепления коллагеназы и дифференциального ультрацентрифугирования (рис. 2). Первоначальные шаги включали предварительную обработку ткани селезенки для удаления поверхностной крови с последующим пищеварением коллагеназой I типа. Эта ферментативная обработка способствовала расщеплению компонентов внеклеточного матрикса, тем самым высвобождая экзосо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Недавние исследования показали, что экзосомы, полученные из селезенки (Spleen-Exo), играют решающую роль в лечении рака желудка12. Для дальнейшего выяснения функций Spleen-Exo необходимо установить воспроизводимый и оптимальный метод их извлечения из ткани селезенки. В то время как существуют протоколы для выделения экзосом из рака мозга и печени13,14, методы для других тканей остаются недостаточно разрабо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82370281, 81870222), Фондом естественных наук провинции Гуандун (2022A1515012103) и Проектом конкурсного распределения Специального фонда развития науки и технологий города Чжаньцзян (2021A05086) и Фондом стартапов из Второй аффилированной больницы Гуандунского медицинского университета (23H03).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
70 &микро; m Клеточный фильтрBiologix Group Co., Ltd.США15-1070
Антитело против CD9Cell Signaling Technology, Inc (CST), США 983275
антитело против GM130Proteintech Group, Inc.Китай 66662-1-lg
Антитело против TSG101Abcam Plc, Великобритания125011
Чашка для клеточных культурWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, Китай704001
Центрифужная трубкаWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, Китай788211
Коллагеназа типа ISigma-Aldrich Corp., США
Shanghai bluepard instruments Co., Ltd., КитайTHZ-100
Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Китай  G2081-1L
Набор для анализа белка BCAShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Китай P0010S
Проточный наноанализаторNanoFCM Inc., КитайN30E
Система флуоресцентной/хемилюминесцентной визуализации Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd.,China GelView 6000Plus
HRP Goat anti-Mouse IgGProteintech Group, Inc.Китай 15014
HRP Козий анти-Кролик IgGProteintech Group, Inc.Китай 15015
считыватель микропланшетовMolecular Devices, СШАCMax Plus
МикроножницыШанхай  Медицина  Инструменты (группа) Co., Ltd.,КитайWA1010
Микроскопический пинцетШанхай  Медицина  Инструменты (группа) Co., Ltd.,КитайWA3010
Multifuge X1R Pro центрифугаThermo Fisher Scientific, США75009750
Офтальмологические ножницыШанхай  Медицина  Инструменты (группа) Co., Ltd.,КитайY00030
Офтальмологический пинцетШанхай  Медицина  Инструменты (Группа) Co., Ltd., Китай JD1060
Optima XPN-100 Ультрафильтрационная центрифугаBeckman Coulter, СШАA94469
фосфатно-солевой буфер (PBS)Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd., КитайP1003
Буфер для лизиса RIPA (сильный, без ингибиторов)Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Китай P0013K
ЛинейкаDeli  Производство  Компания, Китай
Буфер для загрузки образцов SDS-PAGE, 5xShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Китай P0015
Трансферная пипеткаBiologix Group Co., Ltd.США30-0238A1
Просвечивающий электронный микроскопHitachi, ЯпонияH-7650
Ультрацентрифужная трубкаBeckman Coulter, США355618
Western Transfer Buffer Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Китай Г2028-1Л
Настольный термостатический шейкер C2674 Буфер для электрофореза

Ссылки

  1. Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Curr Biol. 28 (8), R435-R444 (2018).
  2. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
  3. Crescitelli, R., Lasser, C., Lotvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nat Protoc. 16 (3), 1548-1580 (2021).
  4. de Jong, B., Barros, E. R., Hoenderop, J. G. J., Rigalli, J. P. Recent advances in extracellular vesicles as drug delivery systems and their potential in precision medicine. Pharmaceutics. 12 (11), 1006(2020).
  5. Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).
  6. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  7. Leung, L. L., Riaz, M. K., Qu, X., Chan, J., Meehan, K. Profiling of extracellular vesicles in oral cancer, from transcriptomics to proteomics. Semin Cancer Biol. 74, 3-23 (2021).
  8. Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. N Engl J Med. 379 (10), 958-966 (2018).
  9. Wang, X., et al. An enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue. J Vis Exp. (192), e64499(2023).
  10. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).
  11. Hoshino, A., et al. Extracellular vesicle and particle biomarkers define multiple human cancers. Cell. 182 (4), 1044-1061.e18 (2020).
  12. Chen, Y., et al. Yiwei decoction promotes apoptosis of gastric cancer cells through spleen-derived exosomes. Front Pharmacol. 14, 1144955(2023).
  13. Useckaite, Z., et al. Proteomic profiling of paired human liver homogenate and tissue-derived extracellular vesicles. Proteomics. 24 (11), e2300025(2023).
  14. Hurwitz, S. N., et al. An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neurosci Methods. 307, 210-220 (2018).
  15. Lai, J. J., et al. Exosome processing and characterization approaches for research and technology development. Adv Sci (Weinh). 9 (15), e2103222(2022).
  16. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
  17. Roh, Y. J., et al. Adipose tissue-derived exosomes alleviate particulate matter-induced inflammatory response and skin barrier damage in atopic dermatitis-like triple-cell model. PLoS One. 19 (1), e0292050(2024).
  18. Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41(2016).
  19. Kurian, T. K., Banik, S., Gopal, D., Chakrabarti, S., Mazumder, N. Elucidating methods for isolation and quantification of exosomes: A review. Mol Biotechnol. 63 (4), 249-266 (2021).
  20. Menu, E., Vanderkerken, K. Exosomes in multiple myeloma: from bench to bedside. Blood. 140 (23), 2429-2442 (2022).
  21. Shen, S., et al. Effects of lysate/tissue storage at -80 degrees C on subsequently extracted EVs of epithelial ovarian cancer tissue origins. iScience. 26 (4), 106521(2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Экзосомы селезенкиизоляция экзосомэкзосомы тканевого происхождениядифференциальное ультрацентрифугированиеколлагеназа I типатрансмиссионная электронная микроскопиянано-проточная цитометриямаркеры экзосомиммунный ответткань селезенки мыши
Выделение и характеристика экзосом, полученных из тканей селезенки мыши
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.