Комплексная характеристика минерализации тканей в модели ex vivo

Краткое содержание

Предлагаемый протокол предполагает глобальный подход к оценке костеобразования в контексте регенерации костной ткани с использованием мультимодальных анализов. Он направлен на предоставление качественной и количественной информации о формировании новой кости, повышение строгости и достоверности основных и доклинических исследований.

Аннотация

Обширная характеристика минерализации тканей в контексте регенерации кости представляет собой серьезную проблему, учитывая многочисленные модальности, которые в настоящее время доступны для анализа. В данной работе мы предлагаем рабочий процесс для всесторонней оценки образования новой кости с использованием соответствующего костного экспланта ex vivo крупного животного. В эксцентрированной головке бедренной кости овцы создают костный дефект (диаметр = 3,75 мм; глубина = 5,0 мм) и вводят макропористый костный заменитель, загруженный проостеогенным фактором роста (костный морфогенетический белок 2 - BMP2). Впоследствии эксплант сохраняется в культуре в течение 28-дневного периода, что позволяет провести клеточную колонизацию и последующее формирование костной ткани. Для оценки качества и структуры вновь минерализованной ткани используются следующие последовательные методы: (i) Характеристика и 3D-изображения всего экспланта с высоким разрешением с использованием микрокомпьютерной томографии с последующим анализом изображений с глубоким обучением для усиления дискриминации минерализованных тканей; ii) наноиндентирование для определения механических свойств вновь образованной ткани; (iii) Гистологические исследования, такие как гематоксилин/эозин/шафран (HES), трихром Гольднера и пентахром Мовата, для качественной оценки минерализованной ткани, в частности, в отношении визуализации остеоидного барьера и наличия костных клеток; (iv) картирование методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) с методом обратного рассеяния с внутренней привязкой для количественной оценки степени минерализации и получения подробного представления о морфологии поверхности, минеральном составе и границе раздела кости и биоматериала; (v) Спектроскопия комбинационного рассеяния света для определения молекулярного состава минерализованной матрицы и получения представления о стойкости BMP2 в цементе путем обнаружения пептидных связей. Этот мультимодальный анализ обеспечит эффективную оценку вновь образованной кости и всестороннее качественное и количественное понимание минерализованных тканей. Благодаря стандартизации этих протоколов мы стремимся облегчить межисследовательские сравнения и повысить достоверность и надежность результатов исследований.

Введение

Костные дефекты, вызванные травмой, резекцией опухоли, врожденными аномалиями или инфекцией, представляют собой серьезную проблему для регенеративной медицины. Эти изменения нарушают структурную целостность костной системы, что приводит к дискомфорту, функциональным нарушениям и снижению качества жизни пациентов.

Для преодоления этих проблем были разработаны инновационные стратегии восстановления костной ткани, направленные на усиление остеогенеза и регенерацию костной ткани. Эти подходы включают использование имплантируемых, инъекционных или напечатанных на 3D-принтере заменителей кости, которые могут иметь природное происхождение (например, макромолекулы биологического происхождения, гидроксиапатит животного происхождения) или синтетические (например, биоочки, фосфаты кальция)¹. Чтобы усилить их низкую врожденную способность направлять и стимулировать регенерацию кости, костные заменители могут быть загружены остеоиндуктивными факторами, такими как костные морфогенетические белки (BMP), чтобы способствовать остеогенной дифференцировке клеток-предшественников и улучшать^{формирование кости}.

Формирование костной ткани основано на первоначальном образовании коллагенового матрикса, который затем минерализуется кристаллами гидроксиапатита, тем самым укрепляя костную структуру³. Этот процесс придает кости определенную жесткость и прочность. Качество минерализованной ткани в сложной степени определяется ее микроструктурными особенностями и степенью минерализации⁴. Это качество играет ключевую роль в заживлении кости и функциональности регенерированной кости⁵. Тем не менее, характеристика костной минерализации остается сложной задачей из-за присущей ей вариабельности в многофакторных исследованиях ^6,7,8.

Кроме того, первоначальные оценки биосовместимости, цитосовместимости и дифференцировочного потенциала заменителей костного трансплантата обычно проводятся in vitro. Однако методологические различия препятствуют бесшовному сравнению результатов. Кроме того, эти исследования in vitro не полностью охватывают многоклеточные взаимодействия и сложный диалог между клеточными популяциями, включая клетки костного мозга, которые необходимы для регуляции процесса регенерации кости⁹. Такое отсутствие точного представления микроокружения кости может поставить под угрозу точность последующих доклинических исследований¹⁰.

Несмотря на то, что оценки in vivo обеспечивают более точное представление о физиологических контекстах, они ограничены этическими, логистическими и финансовыми соображениями. Следовательно, оценки ex vivo играют ключевую роль в качестве связующего звена между исследованиями in vitro и in vivo, выступая в качестве необходимого промежуточного шага перед переходом к экспериментам на живых субъектах 11,12,13.

В этом контексте необходимо внедрение комплексных методологий характеризации для оценки качества регенерированной костной ткани и обеспечения актуальности стратегии перед переходом к доклинической модели. Следовательно, мы предлагаем протокол, основанный на анализе модели экспланта с использованием ткани коленного сустава овцы. Эта инновационная методология включает в себя введение в экспланты цемента, загруженного BMP2, и проведение детального анализа минерализации тканей после 28 дней культивирования.

Технические подходы, использованные в этом исследовании, разнообразны и дополняют друг друга, в совокупности обеспечивая комплексный подход к оценке качества регенерированной костной ткани (Рисунок 1). Микрокомпьютерная томография с высоким разрешением позволяет детально визуализировать 3D-структуру кости, предоставляя ценную информацию о минеральной плотности, морфологии и целостности вновь образованной ткани. Этот метод имеет решающее значение для оценки эффективности регенерации кости и мониторинга прогрессирования минерализации с течением времени. Наноиндентирование — это точный подход к определению механических свойств ткани, таких как ее твердость и прочность. Измеряя реакцию материала на приложенную силу в нанометрическом масштабе, этот метод позволяет оценить прочность и качество минерализованной ткани. Гистологические исследования с использованием распространенных красителей, таких как гематоксилин/эозин/шафран (HES), трихром Гольднера и пентахром Мовата, дают бесценную информацию о структуре и составе тканей. Эти окрашивания позволяют дифференцировать различные компоненты тканей, включая клетки, внеклеточный матрикс и минеральные отложения, тем самым позволяя всесторонне качественно оценить процесс регенерации кости. Картирование методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) с помощью обратного рассеяния обеспечивает визуализацию поверхности образцов с высоким разрешением, что позволяет детально анализировать степень минерализации костного матрикса, а также границы раздела между имплантированным материалом и тканью хозяина. Наконец, рамановская спектроскопия предоставляет информацию о молекулярном составе ткани, в частности, путем идентификации конкретных компонентов, таких как белки, липиды и минералы. Этот подход позволяет охарактеризовать минерализованный матрикс и обнаружить факторы роста, такие как BMP2, тем самым предоставляя важную информацию о стойкости проостеогенных стимулов в регенерационной среде.

Используя междисциплинарный подход, объединяющий различные аналитические методы, наше исследование направлено на то, чтобы обеспечить тщательную и всестороннюю оценку качества регенерированной костной ткани, тем самым обеспечивая прочную основу для оценки заменителей костного трансплантата и их потенциального клинического применения.

Протокол

Это исследование было одобрено комитетом по этике и благополучию животных и Национальным управлением ветеринарии и продовольствия Франции под номером G44171.

1. Подготовка и культивирование остеохондральных эксплантов

1. Соберите образцы овечьих суставов у только что усыпленных животных в асептической среде. Расположите овцу в положении лежа на спине и оббрейте левую заднюю конечность. Подготовьте путем дезинфекции спиртом вокруг коленного сустава. Используйте латеральную парапателлярную артротомию для обнажения передней и задней крестообразных связок с последующим вывихом надколенника для выявления бедренной трохлеи.
   1. После забора ткани создайте дефект диаметром 4,75 мм в латеральном мыщелке с помощью системы переноса остеохондрального аутотрансплантата.
2. С помощью ортопедического молотка создайте дефект глубиной 10 мм и извлеките эксплант из мыщелка. Затем выполнить второй дефект диаметром 8 мм, центрированный вокруг первого, с использованием системы переноса остеохондрального аутотрансплантата. В результате получаются остеохондральные экспланты размером 8 мм x 10 мм, содержащие центральный дефект 4,75 мм x 10,0 мм.
3. Если это необходимо по логистическим причинам, транспортируйте экспланты в сбалансированном солевом растворе Хэнка (hBSS) с добавлением 1% пенициллин-стрептомицина и храните при температуре 4 °C.
4. Промойте экспланты 3 раза фосфатно-соевым буфером (PBS), затем введите дефект размером 4,75 мм x 10,0 мм кальциевым фосфатом с добавлением 40 мкг/мл BMP2. Приготовьте цемент, как описано ниже.
   1. Получить α-трикальцийфосфат (α-TCP) путем термической обработки апатитных стержней трикальцийфосфата (изостатический пресс при 120 МПа) при 1364 °C в течение не менее 12 ч с последующей закалкой на воздухе¹⁴.
   2. Измельчите стержни α-TCP в абсолютном этаноле с помощью планетарного шара мельницы 2 раза в течение 5 мин при 500 об/мин до получения мелкодисперсного порошка размером 13,1 ± 1,7 мкм (измерено с помощью лазерной дифракции, как описано ранее¹⁴).
   3. Стерилизовать порошок α-TCP путем сухого нагрева до 180 °C в течение 45 минут. Приготовьте кальций-фосфатный цемент, смешав порошок α-TCP с фильтрованным раствором 2,5% (масс./об.) Na₂HPO₄ 0,22 мкм (соотношение жидкость/порошок 0,35) в течение 1 минуты.
   4. Перед инъекцией загрузите цементную пасту в шприц объемом 3 мл с помощью иглы 18 G.
5. Через 10 минут при комнатной температуре (RT) переложите экспланты в колбу площадью 25 см² и осторожно добавьте 10 мл полной питательной среды, состоящей из модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицина.
6. Экспланты выдерживают до 28 дней в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%_CO2 и каждые 2 дня меняют всю питательную среду под ламинарным проточным колпаком.
7. Промойте экспланты 3 раза с PBS. Переложите их в пробирки объемом 50 мл, добавьте 20 мл 4% параформальдегида (PFA) и держите при температуре 4 °C в течение 3 дней. Затем промойте экспланты PBS и храните их в 70% этаноле перед последующими анализами.

2. Микро-компьютерный анализ

1. Проведите микротомографию с использованием микрокомпьютерной томографии и рентгена. Получение рентгеновских проекций с разрешением 10,7 мкм, временем экспозиции 1200 мс и алюминиевым фильтром 1 мм (80 кВ и 125 мкА). Усредняйте три изображения с каждым шагом поворота на 0,45°, чтобы улучшить соотношение сигнал/шум.
2. Реконструируйте трехмерные (3D) изображения с помощью программного обеспечения производителя для реконструкции после выравнивания по X/Y с помощью эталонного скана, со следующими параметрами - Сглаживание: 0, Артефакт кольца: 3, Упрочнение луча: 35%. Очистите стопки изображений с помощью программного обеспечения для обработки изображений и наблюдайте с помощью инструментов двухмерной (2D) и 3D-визуализации.

3. Анализ изображений с помощью глубокого обучения

1. Проводите сегментацию изображений с помощью специального специализированного программного обеспечения. Используйте встроенный мастер сегментации для обучения модели глубокого обучения для различения костей и цементов.
2. Выберите репрезентативную зону (т.е. кадр), содержащую кость, цемент и фон из восстановленных изображений микрокомпьютерной томографии. Сегментируйте этот первый кадр вручную с помощью простых (например, пороговых) или мощных инструментов (например, для распространения), предоставляемых программным обеспечением.
3. Создайте модель глубокого обучения на вкладке «Модель» и выберите «Подпрограмма 3D-Unet » в раскрывающемся меню. Определение его экспериментальных параметров в сопоставлении с анализируемыми изображениями путем щелчка правой кнопкой мыши по сгенерированной модели; здесь: глубина 5, размер патча 32 x 32, алгоритм Adadetla, коэффициент шага 0,25, увеличение данных x10.
4. Используйте сегментированную рамку для обучения процедуры глубокого обучения (нажмите кнопку «Обучение»), которая признана актуальной благодаря своим возможностям быстрой и точной сегментации изображений ^3,15. После завершения обучения определите вторую рабочую зону (кадр) и автоматически сегментируйте с помощью функции прогнозирования.
   1. При необходимости примените ручную коррекцию для получения более точных обучающих данных. Снова тренируйтесь. Повторяйте процесс до тех пор, пока не будет получен удовлетворительный результат; Количество дополнений данных постепенно уменьшается по мере увеличения числа обучающих кадров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Индекс DICE, предоставленный во время обучения модели, дает представление о точности модели (по сравнению с входной информацией), но его недостаточно. Подтверждение актуальности модели должно быть осуществлено путем валидации автоматически сегментированных данных 3 независимыми опытными исследователями.
5. Опубликуйте модель, нажав кнопку «Экспорт », и примените ее ко всему набору данных микро-КТ, нажав «Сегментировать > экспортированную модель > сегментировать полный набор данных».

4. Встраивание

1. Обезвоживайте костные экспланты, поместив их в стеклянный флакон объемом 40 мл, содержащий 25 мл раствора для обезвоживания, состоящего из 70% ацетона и 30% ксилола. Поместите стеклянный флакон на вращающееся колесо на 1 час при температуре RT. Повторите этот шаг 3 раза.
2. Замените раствор для обезвоживания 25 мл ксилола и поместите стеклянный флакон на вращающееся колесо на 1 ч при температуре RT.
3. Замените раствор ксилола 25 мл метилметакрилата, обогащенного (MMA) 10% пероксидом бензоила (BPO) и 10% дибутилфталатом (DBP). Поместите его на вращающееся колесо на 1 час в RT. Повторите этот шаг 2 раза.
4. Замените раствор ММА 25 мл ММА, обогащенным 10% БПО, 10% ДАД и 450 мкл N, N диметиланилина, разведенного в соотношении 1:20 в пропан-2-оле. Поместите стеклянный флакон при температуре -20 °C на ночь. Раствор приобретает желтоватый оттенок.
5. Поместите эксплант в форму для заделки среднего размера и залейте в форму анилин MMA-BPO-DBP-N, N. Поместите форму в пластиковый ящик и проветрите потоком азота в течение 5 минут. Герметично закройте коробку и поместите ее при температуре 4 °C на 48 часов для полимеризации и затвердевания MMA.
6. Извлеките смолу, содержащую эксплант, из формы и держите ее при температуре 4 °C до обработки для последующего анализа.

5. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) - количественная визуализация обратно рассеянных электронов (qBEI)

1. Разрежьте блок pMMA, содержащий эксплант, алмазной пилой вдоль его длинной оси. Первую половину блока оставьте для гистологического анализа. Разрежьте вторую половину дальше, чтобы получился участок толщиной 1,5 мм. Выполняйте резку при 3000 об/мин со скоростью 3 мм/мин.
2. Измельчите срез бумагой из карбида кремния с возрастающими числами, соответствующими меньшему размеру зерна: SiC 320 в течение 10 с, SiC 1000 в течение 15 с, SiC 2000 в течение 30 с и SiC 4000 в течение 30 с.
3. Отполируйте участок алмазной пастой и специальной одеждой: полировальную салфетку раствором алмаза Mol B3 3 мкм в течение 1 минуты и флисовую ткань раствором алмаза Nap B1 1 мкм в течение 1 минуты.
4. Промойте секцию под двойной дистиллированной водой и очистите ватной палочкой от частиц алмаза. Просушите секцию под газообразным азотом.
5. Нанесите углеродное покрытие на толстый участок (толщина углеродной пленки 10 нм) и установите его на алюминиевый заглушку с серебристой краской. Сделайте серебряный мост между верхней частью секции и заглушкой, чтобы обеспечить эвакуацию заряда электронов на землю.
6. Поместите заглушку на сцену SEM. Рядом с образцом вставьте контрольный заглушку, состоящую из чашки Фарадея со стандартами углерода, алюминия и кремния, в камеру SEM. Это будет использоваться для калибровки электронного пучка и преобразования уровней серого в проценты Ca. Закройте камеру SEM и проведите вакуум.
7. Включите электронный пучок и настройте параметры SEM для работы в режиме обратного рассеяния электронов. На обратном рассеянии уровень серого стандарта углерода равен 25, стандарта алюминия — 225, а стандарта кремния — 253. В качестве ориентира, на используемой системе используются следующие параметры СЭМ: ускоряющее напряжение 20 кэВ, ток зонда, измеренный с помощью чашки Фарадея: 250 пА, рабочее расстояние: 15 мм, апертура: 30 мкм, разрешение изображения: 1024 x 768 пикселей, вакуум: < 4,10-4 Па, время задержки 100 мкс/пиксель, яркость ~38 и контрастность ~72.
8. Когда СЭМ откалиброван в соответствии со стандартами, получите изображения образца в режиме обратного рассеяния электронов.
9. Используйте изображение образца с помощью обратного рассеяния электронов, чтобы преобразовать уровни серого в содержание кальция, как описано в Roschger et ^al.16. Выполните это с помощью любого программного обеспечения для анализа изображений.
10. Построен график распределения содержания кальция. Распределение содержания кальция показывает распределение по Гауссу. Рассчитываются три основных параметра, представляющих интерес:_{среднее значение} Ca как среднее содержание кальция на изображении,_пик Ca как наиболее частая концентрация кальция, встречающаяся на изображении, и_ширина Ca как полная ширина при половине максимума распределения содержания кальция.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Воспроизводимость qBEi была исследована путем визуализации одной и той же области интереса в течение 5 дней подряд (один сбор данных в день). Это означает, что электронный луч включался и выключался между сеансами. Процент ошибок_{в среднем} Ca,_пике Ca и Cawidth был оценен как 0,5%, 0,7% и 1,2% соответственно. Содержание кальция также исследовали с помощью энергодисперсионного рентгеновского анализа (EDS). Была установлена очень хорошая линейная зависимость между_{средним значением} Ca и содержанием кальция, оцененным с помощью EDS со значением R² 0,99, аналогично данным, полученным Roschger et al. ранее¹⁷.

6. Гистология

1. Для каждого образца вырезают срезы 7 мкм с помощью микротома твердой ткани с вольфрамовым лезвием ^18,19. Окрашивайте срезы морилкой Goldner trichrome, HES и MOVAT с помощью автоматической системы окрашивания.
2. Для депластификации последовательно замочите образцы в ацетоне на 5 минут и повторите 2 раза. Промойте образцы в дистиллированной воде в течение 5 минут и повторите 2 раза.
3. Выполните трихромное окрашивание Голднера, как описано ниже.
   1. Поместите образцы в гематоксилин железа Вайгерта на 20 минут. Умывайтесь водой из-под крана. Погрузить образцы в 0,5% кислотный спирт на 30 с-1 мин. Умываться водопроводной водой в течение 20 минут.
   2. Поместите образцы в раствор Понсо/фуксиновой кислоты/азофлоксина на 5 минут. Погрузить в 1% уксусную кислоту на 1 мин.
   3. Окрашивать фосфомолибдиновой кислотой/раствором Orange G в течение 20 мин. Погрузить в 1% уксусную кислоту на 1 мин.
   4. Окрашивать быстрым зеленым раствором в течение 15 мин при комнатной температуре или 8 мин при 60 °C. Тщательно промойте водой из-под крана; Повторите 3 раза.
4. Выполните окрашивание Movat Pentachrome, как описано ниже.
   1. Окрашивание Alcian Blue: погрузить образцы в раствор Alcian Blue на 30 минут. Промойте образцы в водопроводной воде в течение 5 минут. Поместите образцы в щелочной этанол на 60 минут. Промойте образцы в водопроводной воде в течение 10 минут. Проведите окончательное полоскание дистиллированной водой.
   2. Окрашивание гематоксилином Вейгерта: поместите образцы в гематоксилин железа Вейгерта на 20-30 минут. Промойте образцы в водопроводной воде в течение 15 минут. Еще раз промойте дистиллированной водой.
   3. Окрашивание Crocein Brilliant/фуксиновой кислотой: погрузить образцы в раствор Crocein Brilliant/Acid Fuchsin на 10 минут. Промыть 0,5% уксусной кислотой. Погрузите образцы в 5% раствор фосфовольфрамовой кислоты на 20 минут. Смыть 0,5% уксусной кислотой в течение 2 мин. Выполните три последовательных полоскания 100% этанолом, каждое продолжительностью 5 минут.
   4. Окрашивание с помощью Safran du Gatinais: поместите образцы в Safran du Gatinais на 15 минут. Проведите заключительное полоскание водой из-под крана.
5. Выполните окрашивание HES, как описано ниже.
   1. Окрашивание гематоксилином Вейгерта: погрузите образцы в гематоксилин Вейгерта на 30 минут. Смыть водой из-под крана в течение 2 минут.
   2. Обесцвечивание: погрузить образцы в солянокислый спирт на 10 с. Смыть водой из-под крана в течение 2 минут.
   3. Нейтрализация: погрузить образцы в раствор карбоната лития на 1 мин. Смыть водой из-под крана в течение 2 минут. Заключительное полоскание дистиллированной водой в течение 1 минуты.
   4. Окрашивание эозин-эритрозином: поместить образцы в раствор эозин-эритрозина на 3 мин. Смыть водой из-под крана в течение 10 с.
   5. Обезвоживание: Погрузите образцы в 95% спирт на 15 секунд. Переведите на 100% спирт на 15 с. Повторите погружение в 100% спирт в течение 30 с.
   6. Окончательное окрашивание спиртовым сафранином: погрузить образцы в спиртовой сафранин на 10 минут. Проведите заключительное полоскание водой из-под крана.
6. Выполните монтаж на салазках, как описано ниже.
   1. Промойте образцы в 95% этаноле, затем в 100% этаноле, затем в метилциклогексане и повторите это 3 раза для каждого этапа.
   2. Установите образцы с помощью монтажного комплекта и добавьте покровное стекло. Отсканируйте изображения с помощью цифрового сканера слайдов.

7. Рамановская микроспектроскопия

1. Используйте ту же секцию, которая используется для комбинационного анализа, что и СЭМ. Кратко отшлифуйте и отполируйте срез, как описано в шагах 5.2 - 5.3, чтобы удалить тонкий слой углерода, добавленный для СЭМ, который ухудшает отвод тепла от образца.
2. Поместите секцию на столик рамановского микроспектрометра. Откалибруйте волновое число, чтобы обеспечить точность и юстировать лазер перед измерением. Поскольку такие процедуры специфичны для каждого инструмента, они не будут описываться в этой статье.
3. Определите интересующие участки ткани, которые необходимо проанализировать. Расположите анализируемую зону в центре видеоприбора и соберите спектры комбинационного рассеяния света со следующими параметрами: используется лазер 785 нм при 30 мВт, время интегрирования: 20 с повторено 3 раза, спектральный диапазон: 350-1800 ^см-1, решетка 1200 линий/мм.
4. Соберите 10 спектров встраиваемой смолы с теми же параметрами комбинационного рассеяния света и усредните их. Используйте это для вычитания вклада смолы на шаге 7.6.
5. Предварительная обработка спектров для удаления вклада флуоресценции, шума и смолы выполняется следующим образом: коррекция базовой линии с помощью пятипорядкового полиномиального аппроксимирования, фильтр Савицкого-Голе со степенью 4 и размером окна от 17 до 21, цифровое вычитание смолы с использованием пика смолы ~812 ^см-1 . Такая предварительная обработка может быть выполнена с помощью различного программного обеспечения, предназначенного для анализа и визуализации данных.
6. Дальнейший анализ предварительно обработанных спектров для извлечения ценных параметров путем нормирования пиковой интенсивности интересующей вибрации с пиковой интенсивностью опорной вибрации. Например, для анализа кости используйте следующие параметры для его вычисления.
   1. Отношение минералов к матрице: разделите пиковую интенсивность колебаний v1PO4 на ~960 ^см-1 на пиковую интенсивность колебательных мод амида I (~1668 ^см-1), амида III (~1250 ^см-1), CH2-wag (~1450 ^см-1) или суммы колебательных мод пролина (~854 ^см-1) и гидроксипролина (Hyp, ~872 ^см-1). v2PO4, расположенный на ~430 ^см-1, или v4PO4, расположенный на ~600 ^см-1, также может использоваться и соотносить с Amide III vibration²⁰. Эти параметры представляют собой степень минерализации органической фазы костного матрикса.
   2. Карбонат/фосфат: разделите пиковую интенсивность v1CO₃, расположенного на ~1070 ^см-1, на v1PO4. Это представляет собой величину замещения карбоната типа B в решетке апатита. Hyp/Pro, представляет содержание гидроксипролина, ~1375 ^см-1/амид III, представляет содержание протеогликанов, ~1150 ^см-1/CH2-wag и ~1495 ^см-1/CH2-wag, представляет количество конечных продуктов гликирования карбоксимелицина и пентозидина, 1670 ^см-1/1690 ^см-1 и 1670 ^см-1/1640 ^см-1 представляют собой неупорядоченную вторичную структуру коллагена, также известную как коллагеновая зрелость, и упорядоченные структуры в виде α-спирали в коллагене I типа соответственно.
7. Оцените воспроизводимость рамановских измерений, исследуя одну и ту же область интереса в 5 последовательных измерениях (по одной регистрации в день). Для каждого анализируемого параметра дисперсия была ниже 0,2% от значения параметра, что обеспечивает хорошую воспроизводимость. Специфика каждого исследуемого пика широко обсуждалась в полевых условиях, и обзор представлен в недавнем обзоре Unal²¹.

8. Наноиндентирование

ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за деструктивной природы наноиндентирования, оно обычно выполняется в конце процедуры анализа образца. Система наноиндентирования, которой мы владеем, оснащена пирамидальным алмазным индентором Берковича. Тем не менее, существует несколько форм инденторов, и в литературе не было достигнуто консенсуса по образцам костей или биоматериалов.

1. Гидратируйте внедренный костный образец в физиологическом растворе в течение 16 ч в режиме ЛТ перед испытанием наноиндентированием.
2. Откалибруйте систему наноиндентирования с помощью плавленого диоксида кремния и запишите полученный модуль индентирования. Для плавленого диоксида кремния модуль вдавливания составляет примерно 72 ГПа при коэффициенте Пуассона 0,17.
3. После калибровки системы наноиндентирования поместите образец, используемый для комбинационного анализа, в оптическую систему устройства для наноиндентирования, чтобы указать места, где будет выполняться наноиндентирование.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод варьируется от одного оборудования к другому; Мы не подробно описываем, как работает система наноиндентирования и программное обеспечение, но даем общие советы о различных шагах, которые следует выполнить.
4. После того, как выбрано место наноиндентирования, переместите образец под устройство для индентирования и выполните индентирование. Выполняйте наноиндентирование на постоянной глубине 900 нм, со скоростью загрузки/разгрузки 40 мм/мин и паузой 15 с между загрузкой и разгрузкой. Установите коэффициент Пуассона для костной ткани равным 0,3.
5. Извлеките различные параметры из кривых наноиндентирования и вычислите их в соответствии с теорией Оливера и Фарра²².
   1. Модуль вдавливания (E_IT) выводится из известных свойств наконечника вдавливания и приведенного модуля упругости и сочетает в себе локальный модуль упругости образца. Вычисление отступов следующим образом:
      
      Где v_s,_{v i}, E_i и E_r представляют коэффициент Пуассона образца, принятый равным 0,3 для кости, коэффициент Пуассона алмазного индентора, принятый равным 0,07, модуль упругости алмазного индентора, зафиксированный на уровне 1140 ГПа, и приведенный модуль, рассчитанный как:
      
      Где S представляет собой наклон разгрузочного сегмента, а Ap — прогнозируемую площадь и вычисляется как:
      
   2. Твердость (H_IT): соответствует устойчивости кости к возникновению и распространению трещин. Другими словами, это показатель прочности костей. Compute H_IT как:
      
   3. Скорость ползучести вдавливания (C_IT): Отражает деформацию кости с течением времени при постоянной нагрузке, указывающую на вязкоупругие свойства образца, рассчитывается как:
      
   4. Максимальная нагрузка (L_m): Это соответствует противоположной нагрузке, необходимой для проникновения на указанную глубину в минерализованный костный матрикс.
   5. Вдавливание (W_plast): Соответствует площади под кривой деформации нагрузки/разгрузки. Это прямое отражение энергии, рассеиваемой для индуцирования пластической деформации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Воспроизводимость наноиндентирования сложнее оценить на образцах кости из-за деструктивного характера этой методологии. Тем не менее, мы оценили воспроизводимость стандартного и однородного образца плавленого диоксида кремния. Для всех вышеуказанных параметров дисперсия была оценена ниже 0,26% (5 последовательных измерений в течение 5 отдельных дней), что свидетельствует об очень хорошей воспроизводимости. С другой стороны, из-за анизотропной природы образцов костей оценить их воспроизводимость сложнее.

Результаты

Микрокомпьютерная томография экспланта показана на рисунке 2. Использование ручной сегментации не может оптимально отделить кость от цемента, присутствующего в центральном канале, с помощью глобального порога. Чтобы улучшить распознавание трабекулярной кости и цемента, мы предлагаем использовать глубокое обучение. Глубокое обучение является мощным средством распознавания характеристик биоматериала и помогает улучшить разделение между костью и цементом, что позволяет лучше оценивать взаимодействие цемента и кости. Это имеет первостепенное значение для точного количественного определения количества кости, сформированной на границе с цементом, и для того, чтобы не включить в этот расчет ложные пиксели.

Тем не менее, простого количественного определения кости на границе раздела недостаточно для характеристики вновь образованной кости. Требуется более глубокое изучение качества костного матрикса и клеточного состава, чтобы лучше понять прочность новой кости и клеточные механизмы, которые привели к формированию этого нового матрикса. Костный матрикс может быть охарактеризован с помощью двух взаимодополняющих подходов: qBEI и рамановской микроспектроскопии. Пример изображения qBEI представлен на рисунке 3. С помощью qBEI каждый пиксель, закодированный в оттенках серого, преобразуется в концентрацию кальция. Это является предпосылкой для оценки распределения содержания кальция в трабекулярной кости и для понимания (i) степени минерализации новообразованной кости на границе с цементом и (ii) нарушает ли присутствие цемента минерализацию трабекулярной кости. Преимуществом qBEI является его способность получать изображение с высоким разрешением за очень короткое время, в отличие от рамановской микроспектроскопии, которая требует более длительного времени получения. Параметры qBEI, такие как_{среднее значение} Ca,_пик Ca и_ширина Ca, могут быть получены из распределения кальция и использованы для сравнения реакции между двумя цементами или биоматериалами.

С другой стороны, qBEI не предоставляет никакой информации о качестве органической фазы костного матрикса на границе раздела с биоматериалом. Дополнительная информация о свойствах материала органической фазы получена с помощью рамановской микроспектроскопии. Рамановская микроспектроскопия выполняется на том же образце, который используется для qBEI, после быстрой шлифовки и полировки поверхности с целью удаления проводящего углеродного слоя. В рамановской микроспектроскопии спектры регистрируются в каждом месте расположения пикселя. Примеры необработанных и обработанных спектров комбинационного рассеяния света представлены на рисунке 4. Каждый спектр содержит информацию о составе анализируемого пикселя и включает в себя пики, относящиеся к встраиваемой смоле, в данном случае pMMA, минеральную фазу, пики v1PO4 и v1CO3, а также органические фазы, пики Pro, Hyp, CML, Amide III, PG, CH2, Pen. и Амид I. В примере на рисунке 4 необработанный спектр показывает вклад смолы покрытия в ~812 ^см-1 и ненулевую искривленную базовую линию из-за флуоресценции, хотя используется красный лазер ближнего инфракрасного диапазона. Обработка спектра является необходимым условием для обеспечения точного расчета различных параметров комбинационного рассеяния света, в частности устранения фоновой флуоресценции. При получении данных пользователь должен обеспечить как точное позиционирование, так и избежание насыщения детектора для подтверждения наличия пика v1PO4, расположенного на расстоянии ~960 ^см-1. После постобработки вычисляются соотношения пиковой интенсивности в соответствии с расположением характеристической колебательной моды.

Тем не менее, сомнительно, что изменения в составе материала привели к изменениям в биомеханической реакции. Для сбора информации о биомеханике новообразованной кости мы систематически проводим исследования наноиндентирования на том же образце, который использовался для рамановской микроспектроскопии. Механическая информация о тканях получается из кривых наноиндентирования, представленных кривыми зависимости нагрузки от глубины (рис. 5). Стоит отметить, что глубина не возвращается к нулю в конце испытания, что представляет собой пластическую деформацию и необратимое повреждение материала. Скорость ползучести при вдавливании рассчитывается на основе зависимости глубины от временной кривой.

Наконец, гистологическое окрашивание используется для оценки реакции тканей на биоматериал на клеточном уровне (рис. 6). Предложенные гистологические окрашивания позволяют не только определить наличие остеоидной ткани, но и идентификацию клеток (макрофагов, многоядерных гигантских клеток, остеокластов, остеобластов) и возможное наличие волокнистой капсулы на границе с биоматериалом. Это очень важно для понимания биосовместимости биоматериала, а также стойкости новой кости при деградации биоматериала.

В целом, многометодный подход позволяет глубоко изучить формирование кости, качество вновь сформированной кости и клеточный состав. При проведении в предложенном последовательном порядке все исследования могут быть выполнены на одном и том же образце, что снижает стоимость и время обработки.

Рисунок 1: Графическая аннотация. Краткое изложение этапов протокола приведено здесь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Микро-КТ и глубокий анализ обучения. (A) 3D-реконструкция микро-КТ изображений. (B) Сегментация костей и цемента: сравнение между ручной сегментацией и глубоким обучением. Масштабная линейка = 5 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Количественная визуализация обратно рассеянных электронов для определения содержания кальция. (A) Обратное рассеянное изображение, состоящее из уровней серого, полученных в сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), преобразуется программным обеспечением для анализа изображений в (B) карту кальция, показывающую горячие точки образца кости. (C) Построен график распределения содержания кальция в зависимости от площади кости, а также вычислены три основных параметра qBEI: Camean, Capeak и_ширина Ca. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Пример спектров комбинационного рассеяния света. (А) Исходный необработанный рамановский спектр, полученный в спектральном диапазоне 800 - 1800 ^см-1. Фон флуоресценции хорошо виден, так как спектры не начинаются с 0. Вклад смолы (pMMA) хорошо виден при ~812 ^см-1. (B) Обработанный спектр. Положение различных колебательных мод, представляющих интерес, указывается на спектре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Исследование механических свойств ткани с помощью наноиндентирования. (A) Устройство для наноиндентирования состоит из оптической части, используемой для определения местоположения интересующей области на поверхности блока образца, а затем блок перемещается под часть индентирования. (B) Зависимость нагрузки от времени и глубина от времени строятся во время испытания на индентирование и используются для создания (C) зависимость нагрузки от глубины. В данном примере выбранная глубина была зафиксирована на уровне 400 морских миль. Максимальная нагрузка (L_м), глубина в конце нагружения (ч_л), глубина после периода паузы (ч_м), наклон участка разгрузки (S) и площадь под фазой загрузки-разгрузки испытания (W_пласт) рассчитываются на основе кривой зависимости нагрузки от глубины и используются для расчета различных параметров наноиндентирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6: Гистологический анализ остеохондральных эксплантов, обработанных цементом, после 28 дней культивирования. (A) Окрашивание Movat демонстрирует структуру ткани, включая кость и цемент, заполняющий дефект. (B) Окрашивание HES иллюстрирует интеграцию тканей и клеточную реакцию вокруг цемента. Масштабная линейка: 2,5 мм. (C) Увеличение выделенной области на рисунке (B), которое детализирует границу раздела между цементом и окружающими тканями, где можно наблюдать проникновение клеток в цемент. Масштабная линейка: 500 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Восстановление костных дефектов является основной задачей в регенеративной медицине для восстановления подвижности, уменьшения боли и улучшения качества жизни пострадавших людей. Использование эксплантных моделей дает ряд преимуществ по сравнению с исследованиями in vivo для изучения восстановления костных дефектов. В дополнение к этическим соображениям, эта модель позволяет осуществлять строгий контроль условий эксперимента и снижать биологическую изменчивость, тем самым способствуя получению более точных и воспроизводимых результатов. Кроме того, механические и биологические свойства костей овец тесно связаны с человеческими костями по сравнению с другими животными ^23,24. Это делает модель экспланта овец особенно актуальным выбором для доклинических исследований и репрезентативной моделью клинических состояний человека.

Наряду с развитием методологии визуализации и материаловедения, описанная здесь модель экспланта представляет собой хорошую модель для исследования влияния регенеративной медицины на скелетные ткани в контролируемой среде, снижающей экспериментальную систематическую ошибку. Размеры и морфология экспланта являются оптимальными для детального анализа неоостеогенеза и свойств материала, что позволяет провести всестороннюю оценку и^{характеризацию}. Эти результаты подчеркивают потенциал модели для клинического перевода, предлагая надежную основу для оценки заменителей костного трансплантата и повышая вероятность успешных клинических результатов в терапии регенерации кости. Кроме того, модель способствует точной оценке остеоинтеграции и производительности биоматериала, которые являются критическими факторами в разработке эффективных стратегий восстановления кости.

Чтобы обеспечить успех исследования, крайне важно скрупулезно следовать ключевым шагам протокола. Одним из наиболее важных аспектов является обеспечение полного обезвоживания образца в процессе закладки. Любая оставшаяся влага может препятствовать правильному заделыванию смолы, что приводит к образованию размытой и непрозрачной смолы, что может нарушить четкость и точность результатов, а также может привести к образованию отверстий во время гистологического среза. Такое пристальное внимание к деталям имеет важное значение для получения надежных и воспроизводимых результатов. Чтобы обеспечить точное преобразование уровней серого в карту содержания кальция, важно использовать калибровку с использованием чашки Фарадея и стандартов C, Al и Si для анализа СЭМ. Крайне важно обеспечить согласованность в использовании одного и того же СЭМ для всех образцов, так как различия в детекторах обратного рассеяния электронов могут привести к изменчивости результатов. В спектроскопии комбинационного рассеяния света калибровка волнового числа и тщательная коррекция базовой линии необходимы для исключения флуоресцентного фона и дифференциации пиков от встраиваемой смолы и образца. Для наноиндентирования достижение идеально гладкой поверхности имеет решающее значение, учитывая пределы смещения инденторов, а для обеспечения надежных измерений необходима калибровка с помощью известного стандарта, такого как плавленый диоксид кремния.

Модификации и устранение неполадок в этих методах часто учитывают анизотропную природу костного материала, которая может влиять на согласованность измерений. Например, в спектроскопии комбинационного рассеяния света поляризация падающего лазера может оказывать значительное влияние на регистрируемую интенсивность. Использование 20-кратного объектива с низкой числовой апертурой может помочь в решении этой проблемы. Кроме того, крайне важно обеспечить согласованные условия калибровки и измерения для всех образцов для поддержания целостности данных. Присущая кости анизотропия представляет собой ограничение этих методологий, поскольку она может повлиять на однородность измерений, особенно в таких методах, как рамановская спектроскопия. Кроме того, необходимость точной калибровки и контроля окружающей среды может ограничить общую применимость, если эти аспекты не будут тщательно контролироваться.

Потенциальная применимость этих подходов в значительной степени распространяется на оценку новых биоматериалов и терапевтических стратегий для восстановления кости. Способность модели точно имитировать физиологию костей человека обеспечивает надежную платформу для доклинических испытаний, позволяющую тщательно оценить безопасность и эффективность новых методов лечения в контролируемых условиях. Полезность этой модели особенно актуальна для ускорения трансляционного пути от лабораторных исследований к клинической практике, способствуя раннему выявлению перспективных кандидатов для терапии регенерации кости. Предоставляя надежный и воспроизводимый метод оценки материалов для восстановления кости, этот метод способствует развитию регенеративной медицины и разработке клинически жизнеспособных решений.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,20 фильтра	VWR	28145-501
Игла 18 G (1,2x40 мм)	Sterican	4665120
шприц	3 мл HENKE-JECT	8300005762
37% соляной кислоты	VWR	1.00317.1000
Уксусная кислота (ледяная)	Сигма	А6283
Ацетон	VWR	20063-365
Alcian Blue 8GX	VWR
Гидроксид аммония	VWR
Апатиновый трикальцийфосфат	Центр биомедицинской и медицинской инженерии (шахты Сент-Этьен, Франция)	TV26U
Азофлоксин	Сигма
Бензоил пероксид	Sigma	8.01641.0250
БМП2	Medtronic	InductOs 1,5 мг/мл Brillant
crocein	Олдрич
CTVox	Bruker-DataViewer
		Skyscan-Алмазный
диск	Struers	MOD13
Алмазная пила	Struers	Accutom-50
DiaPro Mol B3 алмазный раствор	Struers	40600379
DiaPro Nap B1 алмазный раствор	Struers	40600373
двухосновного фосфата натрия (Na2HPO4)	Sigma
Дибутилфталата	Химие-Плюс Лаборатории	28656
Программное обеспечение DragonFly	ОРС	2022.1.0.1231.
Модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, GlutaMAX(TM), пируват	ThermoFisher Scientific	31966-021
Eosine Y- Surgipath	Сигма
Эритрозин В	Сигма
Этанол абсолютный	VWR
Eukitt	Dutscher	6.00.01.0003.06.01.01
Falcon 50 мл	Sarstedt	62.547.254
Гексагидрат хлорида железа (FeCl3, 6H2O)	Merck	1.03943.0250
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)	Eurobio	CVFSVF00
фуксиновая кислота	Merck	1.05231.0025
Сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS)	Biosera	MS01NG100J
гематоксилина	сигма	86.118.9
Изостатический пресс	Nova Suisse	Pmax 1500 бар
Лазерная дифракционная гранулометрия	Malvern	Mastersizer 3000
Светло-зеленый	Prolabo
Карбонат лития	Sigma	А13149
Салфетка для полировки MD-Mol	Struers	40500077
Метилциклогексан	VWR	8.06147.1000
Метилциклогексан	VWR	8.06147.1000
Метилциклогексан	VWR	8.06147.1000
Метилметакрилат	Сигма	8.00590.2500
Микрокомпьютерная томография, микросканер	Bruker	Skyscan 1272
Одноосновной фосфат натрия (NAH2PO4)	Sigma	71496
Раствор	Fritsch	Пульверизатор 6
N,N, диметиланилин	сигма	803060
Станция наноиндентирования	Anton Paar	NHT2
ND-Nap полировальная салфетка	Struers	40500080
OATS Osteochondral Autograft Transfer System, 4,75 мм	Arthrex	AR-1981-04S
OATS Osteochhondral Autograft Transfer System, 8 мм	Arthrex	AR-1981-08S
Orange G	Ral	M15
Параформальдегид (PFA)	Sigma	P6148
Одноразовые встраиваемые формы	Polysciences, Inc	18646C-1
Пенициллин/стрептомицин (P/S)	ThermoFisher Scientific	15140122
фосфатный буферный раствор (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010023
фосфомолибдоновая кислота	Сигма	221856-100 г
Фосфовольмовая кислота	Aldrich	12863-5
Полировальная машина	Sturers	DAP V
Poupinel	MEMMERT	TV26U
Рамановский микроспектрометр	Renishaw	InVia Qontor
Safran du Gâ tinais	Лабонорд
Сканирующий электронный микроскоп	Carl Zeiss	Evo LS 10
SEM Zeiss		Carl Zeiss Evo LS10
SiC фольга/Шлифовальная бумага	Struers	40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)
Серебряная краска	Электронная микроскопия науки	12686-15
Стандартный заглушка с чашкой Фарадея, углеродом, алюминием и кремнием стандарты	Micro-Analysis Consultants Ltd	8602
T25 колба	Corning	430639
ксилол	VWR	28975.325
Ксилидин Понсо	Олдрич	19.976-1