В настоящем протоколе описана пошаговая, воспроизводимая модель односторонней обструкции мочеточника.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Незрелая мышиная модель обратимой односторонней обструкции мочеточника
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Односторонняя обструкция мочеточника (НВО) является распространенной причиной хронической болезни почек (ХБП), приводящей к прогрессированию интерстициального фиброза почек и в конечном итоге приводящей к необратимому повреждению почек. Решающее значение имеет облегчение ситуации с UUO. В литературе было создано несколько животных моделей обратимой односторонней обструкции мочеточника (RUUO), что позволяет наблюдать за структурными изменениями и функциональными повреждениями, а также моделировать физиологические и патофизиологические изменения после облегчения обструкции мочеточника. В этом исследовании была создана обратимая модель обструкции в одностороннем мочеточнике мыши с использованием силиконовой трубки. Значительное повреждение почек наблюдалось до снятия обструкции, а после отмечалось частичное восстановление. В отличие от НВО, эта модель предотвращает прогрессирующий гидронефроз, приводящий к отчетливым патологическим исходам. Эта простая хирургическая процедура демонстрирует высокий процент успеха и является перспективной моделью в качестве классической модели для изучения обратимой обструктивной нефропатии и потенциальных методов лечения интерстициального фиброза почек. Кроме того, она обеспечивает практическую платформу для изучения механизмов восстановления после обструктивной нефропатии, регенерации почечных клеток и ремоделирования тканей.
Введение
Обструкция уретры в значительной степени способствует почечному интерстициальному фиброзу и хронической болезни почек (ХБП), потенциально приводя к необратимым структурным повреждениям и функциональным нарушениям в почке1. В то время как односторонняя обструкция мочеточника (НН) широко используется для изучения повреждения почек и ХБП, она не точно воспроизводит механизмы спонтанного восстановления, которые происходят после устранения обструкции. Модель UUO включает в себя наложение швов на левый мочеточник, что приводит к постоянной обструкции, расширению мочеточника, гидронефрозу, сдавливанию почечной паренхимы и истончению коры головного мозга. Гистологическое исследование обычно выявляет канальцевую дилатацию, некроз эпителиальных клеток канальцев, а также прогрессирующее интерстициальное воспаление и фиброз2. Эта модель в первую очередь исследует интерстициальный фиброз почек и необратимую потерю функции почек из-за стойкой обструкции.
Тем не менее, многие заболевания почек, встречающиеся в клинической практике, такие как обструкция, вызванная камнями мочеточника или опухолями, являются обратимыми. Модель обратимой односторонней обструкции мочеточника (RUUO) позволяет частично восстановить структуру почек и функцию мочевыводящих путей, что в конечном итоге устраняет гидронефроз. Выздоровление может быть оценено с помощью методов визуализации, гистологического исследования и анализа биомаркеров для количественной оценки уменьшения повреждения почек и фиброза3. Эта модель близко имитирует фазу выздоровления при обструктивной нефропатии в клинических условиях и более подходит, чем UUO, для изучения ключевых процессов, таких как воспаление, иммунные реакции, регенерация клеток и ремоделирование тканей 4,5,6,7,8.
Модель RUUO позволяет исследователям анализировать восстановление и регенерацию почек после облегчения травмы, устраняя ограничения UUO в динамических исследованиях. Сравнивая различные временные моменты до и после обструкции, исследователи могут исследовать молекулярные пути, участвующие в травме и восстановлении, включая воспаление, апоптоз, фиброз и регенерацию. Этот подход улучшает понимание механизмов восстановления почек и определяет потенциальные терапевтические мишени 2,3,4,5,8,9,10. В то время как почечный фиброз часто считается необратимым, клинические наблюдения показывают, что раннее облегчение обструкции на начальных стадиях фиброза может остановить или даже обратить вспять прогрессирование заболевания. Модель RUUO представляет собой ценную экспериментальную платформу для исследования этого явления11.
Кроме того, модель RUUO облегчает изучение реверсивного фиброза после снятия обструкции, предлагая понимание механизмов восстановления и потенциальных антифибротических методов лечения 3,4. Следовательно, эта модель очень практична для трансляционных исследований. Основной целью этой экспериментальной модели является индуцирование обструктивной нефропатии через канюляцию мочеточника с последующей стандартизированной разгрузкой в заранее определенный момент времени для обеспечения согласованности. Он оптимизирован для обеспечения простоты, воспроизводимости и безопасности, что делает его эффективным инструментом для экспериментальных исследований.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Это исследование на животных проводилось в соответствии с руководящими принципами Хельсинкской декларации и было одобрено Комитетом по этике научных исследований Детской больницы Чунцинского медицинского университета. В общей сложности 27 самцов крыс Sprague Dawley (SD) были коммерчески получены и размещены в Центре лабораторных животных Детской больницы Чунцинского медицинского университета (SPF, номер лицензии: SYXK (Chongqing) 2007-0016). Крысы содержались в контролируемых температурных условиях с 12-часовым циклом свет/темнота и имели свободный доступ к пище и воде.
Протокол проведен на крысах-самцах SD в возрасте 6-8 недель и применим к крысам всех возрастов с двусторонними мочеточниками. В этом исследовании пятнадцать 6-недельных самцов крыс SD были случайным образом распределены в три группы: родная группа (n = 5), группа UUO (n = 5) и группа RUUO (n = 5). Кроме того, пять 8-недельных крыс SD (n = 5) были включены в качестве дополнительной контрольной группы. Для создания модели RUUO было использовано 12 крыс, а также 7 дополнительных крыс с учетом потенциальных рисков, таких как интраоперационная и послеоперационная смертность, неудачи хирургических операций, неполная обструкция и неудачное обращение. Это обеспечивало минимум 5 крыс в группе для последующих анализов.
Все хирургические процедуры проводились в строгом соответствии с институциональными и национальными рекомендациями по уходу за лабораторными животными и их использованию. Хирургический персонал придерживался протоколов использования средств индивидуальной защиты (СИЗ), включая хирургические маски, перчатки и халаты. Для каждой процедуры использовались стерильные хирургические инструменты, которые были автоклавированы до и после использования для поддержания стерильности. Отходы, в том числе острые предметы и биологические образцы, были утилизированы в соответствии с протоколами обращения с опасными отходами для снижения рисков загрязнения и обеспечения безопасности.
1. Подготовка животных и инструментов
- Проводить все процедуры с использованием стерильных (автоклавных) инструментов и расходных материалов. Разрежьте стерилизованную силиконовую трубку (внутренний диаметр: 1,5 мм, внешний диаметр: 2,5 мм) на сегменты примерно по 1 см. Сделайте продольный надрез вдоль одной стороны стенки трубки для последующего использования.
- Обезболивание крыс путем внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала (40 мг/кг) (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Подтвердите адекватную анестезию, проверив отсутствие рефлекторных реакций, таких как рефлекс отмены педали, при защемлении пальца ноги. Нанесите ветеринарную офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить пересыхание роговицы во время анестезии.
- Депилируют брюшную полость крысы от мечевидного отростка к лобковому симфизу и простирают двусторонне до средней линии.
- Расположите крысу в лежачем положении на подогреваемой хирургической подушке и закрепите ее конечности резиновыми веревками.
- Накидывайте стерильный фенестрированный лист для поддержания стерильности поля. Подготовьте кожу раствором повидон-йода. Сделайте разрез кожи по средней линии вдоль живота, простирающийся от субксифоидной области до чуть ниже пупка, чтобы обеспечить адекватное обнажение почек и верхних отделов мочеточника.
- Надрезать подкожные ткани и фасцию по средней линии с помощью хирургических ножниц. Тщательно рассеките кожу и подлежащие ткани слой за слоем и полностью обнажите забрюшинное пространство с помощью тканевых щипцов.
2. Обструктивная хирургия при обратимой односторонней обструкции мочеточника
- Втяните кишечник в правую сторону брюшной полости с помощью стерильного тампона, чтобы облегчить прямую визуализацию левого мочеточника. Накройте мочеточник марлей, пропитанной солевым раствором, чтобы предотвратить высыхание.
- Рассеките и мобилизуйте левый мочеточник с помощью микроскопических щипцов, освободив примерно 1,5 см от окружающих тканей.
- Поместите силиконовую трубку длиной 1 см (внутренний диаметр: 1,5 мм, внешний диаметр: 2,5 мм) под освобожденный мочеточник. Используйте щипцы, чтобы обеспечить полное прилегание к трубе.
- Перевязать силиконовую трубку и среднюю часть мочеточника шелковой нитью 3-0, чтобы вызвать обструкцию мочеточника. Избегайте чрезмерной силы лигирования. Постепенно протяните силиконовую трубку вдоль продольной оси мочеточника, чтобы обеспечить надежное, но нескользящее перевязку.
- Осторожно переместите кишечник в брюшную полость, обеспечивая правильное выравнивание без напряжения или препятствий.
- Непрерывно сшивайте мышцы живота и фасциальные слои с помощью нерассасывающегося шовного материала 2-0 с изогнутой режущей иглой для обеспечения достаточной прочности на разрыв. Закройте кожу нерассасывающимся швом 4-0, обеспечивая анатомическое выравнивание и равномерное натяжение, чтобы способствовать заживлению и свести к минимуму риск расхождения раны.
- Продезинфицируйте место разреза раствором повидон-йода. Дайте крысам восстановиться в контролируемых условиях при постоянной температуре в течение 7 дней.
3. Релейная хирургия обратимой односторонней обструкции мочеточника
- Подготовьте необходимых животных и инструменты, обеспечив стерильную установку для повторного открытия брюшной полости и полного обнажения брюшной полости.
- Аккуратно рассеките узел силиконовой трубки с помощью лезвия скальпеля. Извлеките трубку и орошите брюшную полость обычным физиологическим раствором, чтобы свести к минимуму спайки и риск инфекции.
- Вправьте кишечник и зашите разрез брюшной стенки слоями с помощью 4-0 нерассасывающихся швов. Место разреза простерилизовать раствором повидон-йода. Поместите крысу в среду с контролируемой температурой на 7-дневный послеоперационный период восстановления.
- На 14-й день после операции сделайте крыс под наркозом (следуя процедуре, описанной в шаге 1.2) и соберите образцы почек, поперечно разрезав почки на две половины.
- Храните одну половину в 4% параформальдегиде для гистопатологического исследования, а другую половину быстро замораживайте в жидком азоте для хранения при температуре −80 °C для последующего молекулярного анализа. Соберите образцы крови для биохимических анализов.
- Провести эвтаназию с помощью удушения CO2 с последующим вывихом шейки матки в соответствии с этическими рекомендациями.
4. Последующая оценка
- Отслеживайте массу тела после RUUO для оценки общего восстановления. Сравните изменения веса с контрольной группой и группой UUO.
- Измерьте массу и объем почек для оценки восстановления почек.
- Мониторинг уровня креатинина (Scr) в сыворотке крови как индикатора улучшения функции почек9.
- Введите метиленовый синий в почечную лоханку для подтверждения проходимости мочеточника. Наблюдайте за перистальтикой и окраской мочеточника для оценки восстановления после обструкции.
- Проводите окрашивание H&E для оценки целостности канальцев и структуры почек после RUUO 8,10.
- Проведение трихромного окрашивания по Массону для оценки регрессии почечного интерстициального фиброза 8,10.
- Сравните баллы повреждения почек 3,8 между группами UUO и RUUO для количественной оценки восстановления тканей.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Оценивали влияние UUO и его последующего высвобождения (RUUO) на массу тела, массу почек, объем почек и уровни креатинина (Scr) в сыворотке крови, как показано в таблице 1. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (SD), при этом n = 5 на группу.
Через 6 недель средняя масса тела у нативной группы составила 234 г ± 16 г, масса почек составила 0,9107 г ± 0,0475 г, а объем почек составил 0,8962 см³ ± 0,0502 см³. К 8 неделям в контрольной группе наблюдалось до...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этой модели используется силиконовая трубка для окружения мочеточника, обеспечивающая структурную поддержку, с последующим лигированием шелковой нитью для вызова полной обструкции мочеточника за счет компрессии. Через семь дней лигирование и силиконовая трубка удаляются, чтобы облегчить декомпрессию почек и восстановить целостность и функциональность мочевыводящих путей.
Силиконовые трубки, изготовленные из силиконовых эластомеров, обеспечивают превосходную ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Эта работа была поддержана Программой молодежных инноваций в медицине будущего, Чунцинский медицинский университет (W0056), Совместный проект по инновациям и применению технологий ТКМ в Чунцине (2020ZY023877).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Щипцы | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | 20220032 | |
| Марля | Sichuan Kelun Co., Ltd | 20172140152 | |
| Набор для окрашивания гематоксилина и эозина | Solarbio | G1120 | |
| иглы для инсулина | KDL Medical Devices | 20193140938 | |
| Masson' s Набор для окрашивания Trichrome Solarbio | G1340 | ||
| Медицинские ватные шарики | Sichuan Kelun Co., Ltd | 20170037 | |
| Медицинские ватные палочки | Sichuan Kelun Co., Ltd | 20172140026 | |
| Метиленовый синий | Tianjin Dengfeng Chemical Reagent Factory | 14038-43-8 | |
| Микроскопические щипцы | Suqian Shifeng Medical Devices Co., Ltd | S50985 | |
| Иглодержатели | Suqian Shifeng Medical Devices Co., Ltd | S7005 | |
| Раствор повидон-йода | Sichuan Kelun Co., Ltd | 514001 | |
| Saline | Sichuan Kelun Co., Ltd | 20220004 | |
| SD Rats | SPF (Пекин) Biotechnology Co., Ltd | D025 | |
| Силиконовая трубка | Taizhou Chunshi New Materials Co., Ltd | CS356 | |
| Шелковый шовный материал | Qiangsheng Medical Devices Co.,Ltd | SA84G | |
| Хирургическое лезвие | Huanan Yunyue Medical Devices Co.,Ltd | CE0434 | |
| Хирургические ножницы | Shanghai Medical Devices Co.,Ltd | J21130 | |
| Шприц | Tongmai medical devices | 20183140304 | |
| тканевые щипцы | Jiangxi Yuyuan Medical Equipment Co., Ltd | J36030 |
Ссылки
- Chaves, L. D., et al. Contrasting effects of systemic monocyte/macrophage and CD4+ t cell depletion in a reversible ureteral obstruction mouse model of chronic kidney disease. Clin Dev Immunol. 2013, 836989(2013).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney Int. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Aranda-Rivera, A. K., et al. Sulforaphane protects from kidney damage during the release of unilateral ureteral obstruction (RUUO) by activating nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (nrf2): Role of antioxidant, anti-inflammatory, and antiapoptotic mechanisms. Free Radic Biol Med. 212, 49-64 (2024).
- Narváez Barros, A., et al. Reversal unilateral ureteral obstruction: A mice experimental model. Nephron. 142 (2), 125-134 (2019).
- Cochrane, A. L., et al. Renal structural and functional repair in a mouse model of reversal of ureteral obstruction. J Am Soc Nephrol. 16 (12), 3623-3630 (2005).
- Kaeidi, A., et al. The therapeutic approaches of renal recovery after relief of the unilateral ureteral obstruction: A comprehensive review. Iran J Basic Med Sci. 23 (11), 1367-1373 (2020).
- Liu, Y., et al. A porcine model of relief of unilateral ureteral obstruction: Study on self-repairing capability over multiple time points. Mol Cell Biochem. 419 (1-2), 115-123 (2016).
- Puri, T. S., et al. Chronic kidney disease induced in mice by reversible unilateral ureteral obstruction is dependent on genetic background. Am J Physiol Renal Physiol. 298 (4), F1024-F1032 (2010).
- Chevalier, R. L., Kim, A., Thornhill, B. A., Wolstenholme, J. T. Recovery following relief of unilateral ureteral obstruction in the neonatal rat. Kidney Int. 55 (3), 793-807 (1999).
- Hesketh, E. E., et al. A murine model of irreversible and reversible unilateral ureteric obstruction. J Vis Exp. (94), e52559(2014).
- Klahr, S., Morrissey, J. Obstructive nephropathy and renal fibrosis. Am J Physiol Renal Physiol. 283 (5), F861-F875 (2002).
- Jin, B., et al. Loss of men1 leads to renal fibrosis and decreases HGF-ADAMTS5 pathway activity via an epigenetic mechanism. Clin Transl Med. 12 (8), e982(2022).
- Fischer, N. G., He, J., Aparicio, C. Surface immobilization chemistry of a laminin-derived peptide affects keratinocyte activity. Coatings (Basel). 10 (6), 560(2020).
- Song, J., et al. Losartan accelerates the repair process of renal fibrosis in UUO mouse after the surgical recanalization by upregulating the expression of tregs. Int Urol Nephrol. 51 (11), 2073-2081 (2019).
- Song, J., et al. Regulatory t cells accelerate the repair process of renal fibrosis by regulating mononuclear macrophages. Am J Med Sci. 361 (6), 776-785 (2021).
- Yao, Y., et al. Interferon-γ improves renal interstitial fibrosis and decreases intrarenal vascular resistance of hydronephrosis in an animal model. Urology. 77 (3), e768-e761.e713 (2011).
- Chevalier, R. L., Thornhill, B. A., Chang, A. Y., Cachat, F., Lackey, A. Recovery from release of ureteral obstruction in the rat: Relationship to nephrogenesis. Kidney Int. 61 (6), 2033-2043 (2002).
- Lucarelli, G., et al. Delayed relief of ureteral obstruction is implicated in the long-term development of renal damage and arterial hypertension in patients with unilateral ureteral injury. J Urol. 189 (3), 960-965 (2013).
- Ito, K., et al. Renal damage progresses despite improvement of renal function after relief of unilateral ureteral obstruction in adult rats. Am J Physiol Renal Physiol. 287 (6), F1283-F1293 (2004).
- Song, J., et al. A modified relief of unilateral ureteral obstruction model. Ren Fail. 41 (1), 497-506 (2019).
- Morrissey, J., et al. morphogenetic protein-7 improves renal fibrosis and accelerates the return of renal function. J Am Soc Nephrol. 13 (suppl_1), S14-S21 (2002).
- Ulm, A. H., Miller, F. An operation to produce experimental reversible hydronephrosis in dogs. J Urol. 88, 337-341 (1962).
- Park, H. C., et al. Postobstructive regeneration of kidney is derailed when surge in renal stem cells during course of unilateral ureteral obstruction is halted. Am J Physiol Renal Physiol. 298 (2), F357-F364 (2010).
- Forni, L. G., et al. Renal recovery after acute kidney injury. Intensive Care Med. 43 (6), 855-866 (2017).
- Varela, S., Omling, E., Borjesson, A., Salo, M. Resolution of hydronephrosis after pyeloplasty in children. J Pediatr Urol. 17 (1), e101-e102.e7 (2021).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
