Методическая статья

Выяснение ткане- и плазмоспецифических протеомных изменений в норме и при заболеваниях

695 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67240

⸱

23 сентября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NRC Fellow, 2Medical Readiness Systems Biology, Walter Reed Army Institute of Research, 3ORISE Fellow, 4The Geneva Foundation, 5AEOP Fellow, 6Culmen International, LLC

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Протеомика — это высокопроизводительная оценка взаимодействий, функции, состава и структуры белков и их клеточной активности. Здесь мы представляем протокол для оценки общих протеомных изменений в различных биообразцах, включая плазму и ткани. Описанная здесь методика применима ко всем биообразцам, содержащим белки.

Аннотация

Протеомика — это широкомасштабное исследование экспрессируемых белков, сосредоточенное на их структуре, функции, взаимодействиях, распространенности и посттрансляционных модификациях в биологической системе. Например, фосфопротеомика, жизненно важное подмножество тотальной протеомики, изучает паттерны фосфорилирования и изменения белков. Описанная здесь методика иллюстрирует тотальный протеомный подход к выяснению изменений в общих профилях экспрессии белков, включая паттерны фосфорилирования, в тканях плазмы, мозга, легких, селезенки и печени, собранных на исследуемых животных моделях (т.е. хорьков и мышей). Эта методика применима для других типов тканей, а также практически для любого биообразца, содержащего белки (например, культивируемых клеток). После вскрытия представляющие интерес ткани были мгновенно заморожены и хранились при температуре -80 °C. Затем ткани гомогенизировали с помощью ступки и пестика с жидким азотом для сохранения целостности белка и изменений фосфорилирования. Общий белок экстрагировали из тканевых гомогенатов с помощью буфера для лизиса с универсальной нуклеазой и ингибиторами протеазы/фосфатазы. Белки, извлеченные из ткани и эквивалентной плазмы, преобразовывали в общие пептиды путем контролируемого расщепления протеазы с использованием коммерческого набора для подготовки образцов с помощью масс-спектрометра. Пептиды были непосредственно проанализированы с помощью сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии/тандемной масс-спектрометрии Orbitrap-tribrid. Идентичность составляющих белков была восстановлена по пептидным масс-спектральным данным с использованием программного обеспечения протеомики биоинформатики, что было сопоставлено с библиотекой видоспецифичных аминокислотных последовательностей. После этого анализ должен включать строгие критерии отсечения, особенно с использованием только идентификаций белков с высокой степенью достоверности. Статистически значимые протеомные различия (изменение в >2 раза; p < 0,05) между контрольной и экспериментальной группами.

Введение

Протеомика, как комбинация экспериментов с протеомом и анализа данных, фокусируется на идентификации и количественной оценке белков, их характеристике на основе состава, взаимодействия, претрансляционных и посттрансляционных модификаций (например, фосфорилирования), субклеточной локализации и структуры в физиологических условиях1. Протеомика экспрессии занимается количественным сравнением белков, которые различаются в изменяющихся биологических условиях2. Он также имеет большое значение для профилирования карты сложных, взаимосвязанных путей, сетей и молекулярных систем, которые непосредственно контролируют основные биологические функции, такие как пролиферация клеток, дифференцировка, старение и механизмы клеточной смерти. С существенным развитием экспериментальных технологий в последние годы методы протеомики эволюционировали от традиционных подходов, включая иммуногистохимию и иммуноферментный анализ, к высокопроизводительным методам, таким как жидкостная хроматография 3,4. Подходы, основанные на протеомике, набирают обороты в определении уникальных фенотипов и подтипов заболеваний, а также в выявлении новых мишенных взаимодействий для терапевтических препаратов (фармакопротеомика). Например, стратификация пациентов в первую очередь сосредоточена на геномных подходах к определению однородных групп и назначению схем лечения. Однако статус транскрипции сам по себе не предсказывает дальнейшую судьбу транслируемых белков (например, стабильность или модификация); Таким образом, негеномные механизмы в большей степени способствуют развитию, прогрессированию, тяжести и устойчивости к терапевтическим препаратам 5,6,7.

Одной из таких областей исследований, которая значительно выиграла от количественного сравнения экспрессии и активности белков, является открытие биомаркеров в области нейродегенеративных заболеваний и черепно-мозговой травмы (ЧМТ). Основой для открытия биомаркеров является разработка диагностических методов, способствующих раннему выявлению и потенциальным мишеням для вмешательства. Количественная протеомика на основе ЖХ/МС-МС в сочетании с биоинформатикой способствовала открытию ключевых белковых биомаркеров, включая глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) и убиквитинкарбоксил-концевую изофермент гидролазы L1 (UCH-L1), с тяжелым воздействием или проникающим TBI 8,9. Например, военнослужащие часто страдают от инцидентов с ЧМТ во время выполнения своих миссий из-за воздействия взрывов бомб (т.е. взрывных ЧМТ). Тем не менее, основная патобиология неврологических дефицитов, вызванных взрывной легкой ЧМТ, остается неясной. Следовательно, понимание молекулярных и ультраструктурных механизмов взрывного повреждения головного мозга требует лучшей идентификации специфических биомаркерных суррогатов. Наблюдая за протеомными изменениями, исследования показали, что возможные механизмы окислительного стресса в мозге, вызванного взрывом, связаны с митохондриальной дисфункцией, включая нарушение динамики деления-синтеза, снижение окислительного фосфорилирования и компенсированную активность ферментов, влияющих на дыхание10. Понимание раннего патогенеза бласт-индуцированной дисрегуляции посттрансляционных модификаций, таких как ацетилирование, нитрозилирование, дезаминирование и фосфорилирование, также может обеспечить дальнейшую характеристику его влияния на функцию белка, участвующую в повреждении аксонов, воспалении и нарушении гематоэнцефалического барьера11,12. С развитием подходов системной биологии, картирование полной протеомной информации от мозга и периферических тканей у различных видов животных, включая грызунов и хорьков, стало ключевой процедурой в исследованиях взрывных травм.

В данной статье мы сосредоточимся на методологии оценки количественных аспектов экспрессии протеомики и ее посттрансляционных модификаций, начиная с ткани или плазмы, которая широко используется для мониторинга как физиологических явлений, так и патологических состояний. Использование приведенной ниже методологии обеспечивает согласованность и надежность при подготовке образцов и сборе данных. Используя эту стандартизированную методологию, можно проводить сравнения для определения сохраненных протеомных паттернов в разных типах тканей и паттернов фосфорилирования, уникальных для конкретных тканей. Наряду с этим, может быть проведен анализ нескольких доклинических животных моделей и клинических образцов человека для получения консервативных паттернов фосфорилирования, которые потенциально могут служить биомаркерами и адаптировать схемы медикаментозного лечения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Исследования проводились в соответствии с протоколом использования животных, одобренным IACUC, в учреждении, аккредитованном AAALAC International, с гарантией благополучия животных Службы общественного здравоохранения и в соответствии с Законом о благополучии животных и другими федеральными законами и правилами, касающимися лабораторных животных. Все расходные материалы, необходимые для этой процедуры, перечислены в Таблице материалов. Процедура подразделяется на семь компонентов.

ОСТОРОЖНОСТЬ. Убедитесь, что при работе с жидким азотом для гомогенизации тканей соблюдаются надлежащие протоколы безопасности. Во время гомогенизации замороженных тканей персонал лаборатории был одет в морозильные перчатки, фартук для морозильной камеры, хирургическую маску для лица и лицевой щиток. Этот метод гомогенизации может быть использован для любого типа тканей, включая чрезвычайно твердые вещества, такие как кость, просто отрегулировав размер ступки и пестика соответствующим образом. На рисунке 1A показана первоначальная настройка верстака. Размеры, используемые при гомогенизации тканей мышей и хорьков, см. в Таблице материалов .

1. Криогенное измельчение тканей ступкой и пестиком

  1. Возьмите вес пустой пробирки для сбора и запишите его. Находясь в пробирке для сбора, взвесьте ткань с помощью аналитических весов и запишите вес в лабораторный блокнот. Вычтите вес пустой трубки из ткани плюс вес трубки, чтобы получить мг используемой ткани.
    Примечание: Ткани, которые были оценены для протеомных исследований, включают мозг, легкие, печень и селезенку. Вся ткань была криогенно измельчена в порошкообразную форму с помощью ступки и пестика.
  2. Налейте жидкий азот в криокапсулу, но убедитесь, что она заполнена менее чем наполовину.
  3. Перенесите пробирку с образцом и пустую, предварительно автоклавированную микроцентрифужную пробирку (пробирки) объемом 1,5 мл на штатив для пробирок, расположенный в криокапсуле. Это гарантирует, что образец останется замороженным при охлаждении ступки и пестика, предотвращая оттаивание образца при переносе гомогенизированной ткани в пустую микроцентрифужную пробирку (пробирки) объемом 1,5 мл.
  4. Налейте жидкий азот на ступку и используйте пестик, чтобы охладить эти инструменты перед использованием. Ступка и пестик находятся снаружи криокапсулы (рис. 1A, B).
  5. Перенесите ткань в охлажденный раствор, содержащий жидкий азот (рисунок 1В).
  6. Многократно надавите на замороженную ткань с помощью пестика и сделайте вращательное, растирающее движение пестиком по ткани, пока ткань не превратится в мелкий порошок (Рисунок 1C).
    1. Следите за тем, чтобы не прикладывалось чрезмерное усилие, что может привести к высыпанию образцов из раствора. Убедитесь, что у вас есть твердый контроль над пестиком.
    2. Добавьте в раствор дополнительный жидкий азот при гомогенизации крупных тканей, чтобы снизить вероятность оттаивания образца во время измельчения.
    3. Во время шлифовки ткани проверьте, не оттаивает ли она. Если он оттаивает, внесите в ступку дополнительный жидкий азот.
  7. Окуните концы металлических шпателей в жидкий азот, чтобы охладить их. Это помогает легко перенести гомогенизированную ткань в пробирку объемом 1,5 мл. Это предотвращает оттаивание и прилипание тканей к шпателю во время переноса.
  8. После того, как ткань гомогенизируется в мелкий порошок и металлические шпатели охлаждаются, осторожно переложите гомогенизированный порошок ткани в новые пробирки объемом 1,5 мл.
    1. Разбейте образец на аликвоты в зависимости от количества анализов, которые необходимо выполнить.
      Примечание: Например, для образцов в этом исследовании необходимо было провести четыре анализа, поэтому гомогенизированная ткань была равномерно аликвотирована в четыре пробирки объемом 1,5 мл.
    2. Храните излишки гомогенизированной ткани в автоклавной пробирке объемом 5 мл с защелкивающейся крышкой.
  9. Храните аликвотированные салфетки в морозильной камере при температуре -80 °C до будущего анализа, с реалистичным использованием в течение 1 года для минимизации окисления белков воздухом и светом.
  10. Взвесьте пустую пробирку для сбора.
  11. Вычтите вес пустой пробирки для сбора из первоначального измерения (пробирка для сбора плюс образец), чтобы получить вес образца ткани.

2. Лизис тканей для выделения белка

  1. Зачерпните сухой лед в контейнер для льда.
  2. Поместите штатив для пробирок в сухой лед и дайте ему остыть.
  3. Извлеките гомогенизированные образцы тканей из морозильной камеры при температуре -80 °C и поместите в охлажденную решетку для пробирок. Это предотвращает оттаивание образцов, которое может привести к деградации белка и/или изменениям фосфорилирования в процессе взвешивания.
    1. Убедитесь, что пробирки объемом 1,5 мл с образцом остаются замороженными на штативе для пробирок в сухом льду.
  4. Поместите новую каноническую пробирку объемом 50 мл в сухой лед.
  5. Снимите колпачок с канонической пробирки объемом 50 мл и поместите одноразовые пластиковые шпатели в каноническую пробирку объемом 50 мл, чтобы они оставались прохладными. Это предотвращает прилипание образца к шпателям во время их передачи в гомогенизационные пробирки.
  6. Для лизиса тканей и выделения белка используйте 2 мл пробирки, содержащие пять керамических шариков диаметром 2,8 мм (в данном протоколе они называются гомогенизирующими пробирками).
  7. Пометьте колпачок и боковую сторону гомогенизирующей пробирки идентификатором образца с помощью перманентного чернильного маркера.
  8. Поместите пробирки с маркировкой, гомогенизирующие в штатив для пробирок, расположенный в сухом льду, чтобы пробирки оставались холодными и предотвращали размораживание проб.
  9. Поместите одну гомогенизирующую пробирку на аналитические весы и затарьте весы.
  10. Верните гомогенизирующую пробирку на решетку для пробирок на сухом льду.
  11. Снимите крышку с гомогенизирующей трубки, содержащей шарики, и с помощью одного из охлаждаемых пластиковых шпателей перенесите от 5 мг до 10 мг порошкообразного образца ткани в соответствующую гомогенизирующую пробирку.
  12. Установите крышку обратно на гомогенизирующую трубку.
  13. Взвесьте гомогенизирующую пробирку на аналитических весах и запишите количество образца в гомогенизирующей пробирке.
    1. Используйте этот вес для определения количества буфера для лизиса, необходимого для эффективной экстракции общего белка.
  14. После того, как вес будет записан, поместите гомогенизирующую пробирку с образцом обратно в штатив для пробирок на сухой лед, чтобы он оставался холодным.
  15. Утилизируйте использованный пластиковый шпатель.
  16. Используйте новый чистый пластиковый шпатель для каждой переносимой и взвешиваемой пробы, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение. Повторите шаги с 2.9 по 2.15 для всех образцов.
  17. После переноса всех образцов в отдельные гомогенизирующие пробирки рассчитайте необходимое количество Protein Lysis Master Mix.
    1. Приготовьте необходимый объем Protein Lysis Master Mix, который рассчитывается исходя из количества образцов, которые необходимо обработать, и веса каждого порошкообразного образца. Добавьте 100 мкл Protein Lysis Master Mix на 5 мг ткани в каждую пробирку.
    2. Обратитесь к рекомендациям компании по объемам реагентов для производства мастер-смеси для лизиса белка (см. Таблицу материалов).
  18. Поместите гомогенизирующие пробирки, содержащие гомогенизированные, порошкообразные образцы, в холодный блок при температуре 4 °C. Гомогенизирующие пробирки больше не могут оставаться на сухом льду. Размещение гомогенизирующих пробирок на холодном блоке предотвращает замерзание лизисного раствора.
  19. Снимите крышку с гомогенизирующих пробирок и переложите необходимое количество необходимой смеси для лизиса белка в соответствующую гомогенизирующую пробирку с помощью пипетки соответствующей емкости.
    1. Закройте крышки гомогенизирующими пробирками и поворачивайте крышки до тех пор, пока они не станут плотно закрытыми.
  20. Поместите пробирки с образцами в гомогенизатор и установите его на программу для мягких тканей (скорость 4500 об/мин, 2 x 30 с за цикл, пауза 30 с) при температуре 4 °C для гомогенизации.
  21. После завершения цикла гомогенизации извлеките пробирки из прибора и поместите их обратно в холодный блок с температурой 4 °C.
    1. Визуально осмотрите пробирки с образцами. Убедитесь, что порошкообразный образец все еще не виден. Если образец все еще визуализируется на протяжении всей смеси Protein Lysis Master Mix, снова завершите лизис тканей на приборе.
    2. Оптимизируйте настройки для типа используемой ткани. Например, порошкообразная ткань, полученная из фиброзных органов (например, сердца), может нуждаться в дополнительных циклах или более высоких оборотах.
  22. Перенесите гомогенизирующие пробирки в центрифугу. Введите на центрифуге следующие настройки: 16 000 г в течение 10 минут при 4 °C и нажмите кнопку «Пуск » на центрифуге.
  23. После завершения центрифугирования осторожно перенесите гомогенизирующие пробирки обратно в холодный блок при температуре 4 °C.
  24. Наклейте на новые пробирки объемом 1,5 мл на крышке и сбоку с указанием идентификатора образца и любой другой соответствующей информации. После нанесения этикетки поместите эти пробирки объемом 1,5 мл в холодный блок при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пробирки были помечены как минимум следующими: идентификатор животного, момент времени исследования, тип животного и тип ткани.
  25. Перенесите соответствующий лизат белка из гомогенизирующих пробирок в соответствующие меченые пробирки объемом 1,5 мл, находящиеся в холодном блоке при температуре 4 °C.
  26. Храните образцы при температуре -80 °C для дальнейшего анализа. Это безопасная остановка.

3. Количественное определение общего белка

  1. Достаньте образцы из морозильной камеры при температуре -80 °C и разморозьте образцы на влажном льду в ведре со льдом.
  2. После размораживания переведите все образцы и стандарты из набора для количественного определения белка в течение не менее 3 с.
  3. Добавьте по 10 мкл каждой реплики стандарта, образцов и соответствующих заготовок в 96-луночный микротитровальный планшет в соответствии со схематической схемой (рис. 2A).
    Примечание: Для каждого образца ткани в анализе белка используется разведение лизата белка в соотношении 1:100 до предпочтительно фосфатно-солевого буфера. Схематическое расположение может быть изменено в зависимости от количества образцов, используемых в анализе белка. Образцы, стандарты и соответствующие заготовки загружаются в 96-луночный микротитровальный планшет в трех экземплярах для оценки точности концентрации белка, но если на пластине должно поместиться много образцов, дубликаты допустимы.
    1. Для образцов с низким количеством исходной ткани (т.е. менее 5 мг) используйте только одну репликацию или дубликаты для анализа белка, чтобы максимизировать количество лизата белка, доступного для последующего расщепления белка.
    2. Убедитесь, что используется точное пипетирование и калиброванные пипетки.
  4. Переверните флакон с реагентом Protein Assay несколько раз, чтобы хорошо перемешать, а затем налейте его в резервуар для реагентов объемом 10 мл.
  5. С помощью многоканальной пипетки максимальной емкости 200 мкл добавьте 150 мкл реагента для анализа белка в колонку 1.
  6. Проводите пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы смешать реагент для анализа белка с 10 мкл содержимого, уже находящимся в лунке, чтобы уменьшить осадок в лунках.
  7. Выбросьте наконечники для дозатора и установите новые наконечники на многоканальный дозатор максимальной емкости 200 μл.
  8. Повторяйте шаги 3.5-3.7 до тех пор, пока реагент для анализа белка не будет добавлен на весь 96-луночный планшет.
    1. Используйте свежие наконечники для дозатора для каждой колонны лунок, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.
    2. Убедитесь, что по крайней мере одна лунка оставлена пустой без добавления реагентов или образцов для использования в качестве значения поглощения холостого материала для количественного определения белка.
  9. После того, как реагент для анализа белка будет добавлен во все необходимые лунки, накройте пластину на 96 лунок уплотнителем из алюминиевой фольги.
  10. Вортексируйте 96-луночный планшет на вихревом приборе в течение 1 минуты на средней скорости, а затем инкубируйте его при комнатной температуре (RT) в течение 5 минут перед считыванием показаний планшета.
  11. Осмотрите 96-луночную пластину и сальник из алюминиевой фольги. Если реагент остается прилипшим к уплотнению из алюминиевой фольги, поместите его с соответствующими весами внутрь центрифуги.
    1. Нажмите и удерживайте быстрый отжим, пока он не достигнет примерно 200 g.
    2. Выньте 96-луночную пластину и визуально осмотрите уплотнение из алюминиевой фольги, чтобы убедиться, что на фольге не осталось жидкости.
  12. Медленно снимите уплотнитель из алюминиевой фольги и установите прозрачную крышку обратно на 96-луночную пластину (Рисунок 2B).
  13. Считывание 96-луночного планшета на спектрофотометре при длине волны 660 нм, после того как колориметрическая реакция развилась в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Показания поглощения с помощью УФ/видимого спектрофотометра измеряются при комнатной температуре. Анализ белка с длиной волны 660 нм основан на связывании запатентованного комплекса красителя и металла с белком в кислых условиях, что вызывает сдвиг в максимуме поглощения красителя, который измеряется при длине волны 660 нм.
  14. Используйте показания абсорбции известных стандартов для создания стандартной кривой с помощью графического программного обеспечения (рис. 2C-E), которая в дальнейшем применяется для расчета концентраций белка для всех образцов.

4. Переваривание белка

ОСТОРОЖНОСТЬ. Убедитесь, что при работе с опасными химическими веществами, используемыми в приведенном ниже протоколе, соблюдаются надлежащие протоколы безопасности. Персонал лаборатории был одет в средства индивидуальной защиты (СИЗ) и выполнял эти действия в вытяжном шкафу для химических веществ. Перед началом работы с этими химическими веществами ознакомьтесь со всеми паспортами безопасности.

  1. Пометьте новый комплект микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл с идентификаторами образцов на крышке и боковой стороне пробирок перманентными чернилами. Включите любую другую относящуюся к делу информацию.
    1. Основываясь на уравнении стандартной кривой, показаниях абсорбции образца и коэффициенте разбавления, рассчитайте концентрацию белка в каждом образце в микрограммах на микролитр (мкг/мкл). Используйте это значение для расчета необходимого объема лизата образца, содержащего 100 μг белка (рисунок 2C-E). Перенесите этот рассчитанный объем лизата образца в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
  2. Доведите итоговый объем до 100 мкл с помощью лизисного буфера; Это начальный объем, необходимый для протокола пищеварения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный объем образца белка плюс буфер для лизиса должен составлять 100 мкл.
  3. Согласно ранее опубликованной литературе, для переваривания используют 1,5 мкл плазмы, что примерно равно 100 мкг белка.
  4. Добавьте 50 мкл восстановительного раствора (10 мМ дитиотреитола) в каждую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, закройте крышки и кратковременно перемешайте в течение 3 с. Затем добавьте 50 μL раствора алкилирования (30 мМ йодоацетамида) в каждый образец, закройте верхушки и сделайте вихрь на 3 с.
  5. Инкубируйте образцы при температуре 95 °C с помощью нагревательного блока в течение 11 мин для восстановления и алкилирования, соответственно, образца белка. Это расщепляет все дисульфидные мостики и покрывает их ацетамидной группой, предотвращая их образование, и, таким образом, денатурирует белок до полностью развернутого состояния и максимизирует воздействие на участки пептидного расщепления.
  6. После инкубации извлеките образцы из теплового блока и дайте им остыть до состояния RT.
  7. Ожидая, пока образцы остынут, восстановите лиофилизированную смесь трипсина/протеазы Lys-C (соотношение 1:1, 50 мкг каждая) с помощью раствора для восстановления ферментов, добавив 515 мкл жидкости в 1 флакон твердого реагента, т.е. по 0,1 мкг/мкл каждому. Избегайте прямого контакта кожи с раствором протеазы и всех последующих действий, так как трипсин может быть сильным раздражителем и аллергеном.
  8. После охлаждения образцов до состояния RT добавьте 50 мкл восстановленной смеси трипсина/протеазы Lys-C (2,5 мкг каждая) в раствор восстановленного и алкилированного белка и кратковременно перемешайте.
  9. Инкубируйте в термомиксере при 37 °C и установите на 1000 об/мин в течение 3 ч для переваривания образца белка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протеаза Lys-C входит в состав для расщепления любых участков, устойчивых к перевариванию трипсином из-за сворачивания или аминокислотной последовательности (например, связей Lys-Pro). Это не только восстанавливает каждый белок до многочисленных известных пептидов с достаточно малым размером и общим зарядом, но также является высоко воспроизводимым при тщательном соблюдении тех же условий пищеварения. Время инкубации в течение 3 часов во время пищеварения - это минимальное время, которое мы рекомендуем для обеспечения полного расщепления всех белков.
  10. После 3 ч инкубации извлеките из термомиксера с помощью щипцов, чтобы избежать ожогов пальцев.
  11. Добавьте 50 μL раствора для остановки разложения (6% трифторуксусной кислоты или муравьиной кислоты в воде) в образец и быстро перемешайте.
    Примечание: Это ингибирует реакцию, так как две протеазы имеют максимальную активность при нейтральном pH 7-8.
  12. Храните образцы в морозильной камере при температуре -80 °C, так как это также останавливает любую остаточную активность протеазы. Это безопасная остановка.

5. Очистка, сушка и ресуспендирование пептидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура в основном предназначена для удаления реагентов для пищеварения, особенно нелетучих солей, которые могут легко повредить инструмент LC/MS-MS, а также для выделения и концентрации полученных пептидов. Очистка пептидов осуществляется с помощью предоставленных комплектом обессоливающих спин-колонн, которые предварительно упакованы смолой для исключения размера (гель-фильтрация), которая сначала захватывает пептиды, а затем позволяет промыть особенно соли. Полный перенос реактивов комплекта на спиновые колонны в вытяжной шкаф для химикатов, так как они содержат токсичные органические растворители.

ОСТОРОЖНОСТЬ. Убедитесь, что при работе с опасными химическими веществами соблюдаются надлежащие процедуры безопасности, включая ношение СИЗ и правила содержания опасных отходов, указанные в приведенном ниже протоколе. Выполните эти шаги в вытяжном шкафу для химикатов и ознакомьтесь со всеми паспортами безопасности перед работой с этими химическими веществами.

  1. Достаньте образцы из морозильной камеры при температуре -80 °C и дайте образцам поступить в RT.
  2. Снимите белую крышку в нижней части колонки для очистки пептидов, ослабьте зеленую верхнюю крышку и поместите ее в пробирку для сбора объемом 2 мл.
  3. Поместите их в центрифугу, закройте крышку, нажмите «Пуск» и центрифугируйте при 3000 г в течение 2 минут, чтобы удалить всю жидкость для кондиционирования перед отправкой.
  4. Выбросьте проточный поток в контейнер для опасных отходов и поместите колонку для очистки пептидов в новую сборную пробирку объемом 2 мл.
  5. Пометьте зеленые крышки столбца для очистки пептидов идентификаторами образцов с помощью перфорированного чернильного маркера.
  6. Осторожно перенесите продукт для расщепления белка, объем которого составляет около 300 μл, в колонку для очистки сухих пептидов с помощью пипетки объемом 200 μл (например, 150 μл дважды).
    1. Убедитесь, что в верхней части смолы спиновой колонки не наблюдаются пузырьки. Если вы наблюдаете появление пузырьков, удалите их, осторожно постучав по колонке или используя чистый наконечник для дозатора объемом 10 мкл, чтобы рассеять пузырьки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Захваченные пузырьки воздуха могут препятствовать плавному переходу образца в смолу и, таким образом, негативно влиять на эффективность очистки пептидов и выход продукции.
  7. Поместите их в центрифугу, закройте крышку, нажмите «Пуск » и центрифугируйте при 1 500 г в течение 2 минут.
  8. Выбросьте проточный поток в контейнер для опасных отходов и поместите колонку для очистки пептидов в новую сборную пробирку объемом 2 мл.
  9. Добавьте 300 μL промывочного раствора A (вода, 0,1% трифторуксусной кислоты / TFA) поверх смолы колонки, снова используя пипетку объемом 200 μL.
    1. Убедитесь, что в верхней части смолы спиновой колонки не наблюдаются пузырьки. Если вы наблюдаете появление пузырьков, удалите их, осторожно постукивая по колонке, или используйте чистый наконечник для дозатора объемом 10 мкл, чтобы рассеять пузырьки.
  10. Поместите их в центрифугу, закройте крышку, нажмите «Старт» и центрифугируйте при давлении 1 500 г в течение 2 минут.
  11. Выбросьте проточный поток в контейнер для опасных отходов и поместите колонку для очистки пептидов в новую сборную пробирку объемом 2 мл.
  12. Добавьте 300 мкл промывочного раствора B (5% метанола, 0,1% TFA) поверх смолы колонки, снова используя пипетку объемом 200 мкл.
    1. Убедитесь, что в верхней части смолы спиновой колонки не наблюдаются пузырьки. Если вы наблюдаете появление пузырьков, удалите их, осторожно постукивая по колонке, или используйте чистый наконечник для дозатора объемом 10 мкл, чтобы рассеять пузырьки.
  13. Поместите их в центрифугу, закройте крышку, нажмите «Пуск » и центрифугируйте при 1 500 г в течение 2 минут.
  14. Выбросьте проточный поток в контейнер для опасных отходов и поместите колонку для очистки пептидов в новую сборную пробирку объемом 2 мл.
  15. Повторите шаги 5.12-5.14 еще раз, чтобы колонка была дважды промыта промывочным раствором В.
  16. Перенесите колонку для очистки пептидов в новую микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл.
    1. Убедитесь, что микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл, используемые на этом этапе, являются пробирками с низким уровнем связывания белка, поставляемых в комплекте.
    2. Чтобы сохранить доступное количество пробирок для сбора с низким содержанием белка, используйте стандартные лабораторные пробирки для предыдущих этапов промывки.
  17. Добавьте 300 μL раствора элюирования (50% ацетонитрила, 0,1% TFA) поверх смолы колонки, снова используя пипетку объемом 200 μL.
    1. Убедитесь, что в верхней части смолы спиновой колонки не наблюдаются пузырьки. Если вы наблюдаете появление пузырьков, удалите их, осторожно постукивая по колонке, или используйте чистый наконечник для дозатора объемом 10 мкл, чтобы рассеять пузырьки.
  18. Поместите их в центрифугу, закройте крышку, нажмите «Старт» и центрифугируйте при 1 500 г в течение 3 минут, чтобы собрать чистый образец пептида в новую пробирку для сбора объемом 2 мл с низким связыванием белка.
    1. При желании перелейте 125 мкл (примерно половину) элюированного раствора чистого пептида в стеклянный флакон объемом 1 мл с помощью пипетки объемом 200 мкл и храните при температуре -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта аликвота может быть использована позже для дополнительного анализа, такого как мечение пептидов тандемной меткой массы (TMT), как это делается с помощью коммерчески доступного набора, для более точного количественного определения образцов, особенно независимо подготовленных наборов.
  19. Храните оставшийся образец, примерно 175 мкл, при температуре -30 °C в пробирках объемом 2 мл с низким содержанием белка, связывающих белки, до тех пор, пока они не будут готовы к сушке и восстановлению. Это безопасная остановка.
  20. Чтобы высушить образец, разморозьте образец пептида с -30 °C до RT. Если вы приступаете к сушке и восстановлению сразу после очистки пептидов, игнорируйте этот шаг.
  21. Откройте пробирки микроцентрифуги объемом 2 мл и поместите их в концентратор вакуумных центрифуг.
    1. Убедитесь, что концентратор вакуумной центрифуги отбалансирован, если одновременно обрабатывается нечетное количество образцов.
    2. Закройте крышку концентратора вакуумной центрифуги и нажмите кнопку «Пуск».
    3. Дайте образцам поработать на концентраторе вакуумной центрифуги в течение 3 ч без применения нагрева.
    4. Периодически осматривайте пробирки, чтобы убедиться, что внутри не осталось жидкости, так как это может помешать связыванию пептидов с разделительной колонкой прибора LC/MS-MS.
    5. Если жидкость все еще наблюдается, продолжайте вращение образцов в течение дополнительного времени.
    6. Проверьте от 30 минут до 1 часа, чтобы убедиться, что в трубке осталась жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пептиды очень стабильны во время этого процесса, так как они находятся в условиях вакуума и не будут разрушаться из-за короткого периода сухости или умеренного тепла, создаваемого только работой концентратора вакуумной центрифуги.
  22. После высыхания немедленно восстановите суспендию образца в 50 мкл 0,1% муравьиной кислоты в воде класса MS (например, 5 мкл 100% муравьиной кислоты на 5 мл воды).
    1. Добавьте 50 мкл 0,1% муравьиной кислоты на дно 2 мл пробирки с низким содержанием связывания белка, содержащей высушенный образец пептида, с помощью пипетки объемом 200 мкл.
  23. Закройте крышки, затем сделайте вихрь в течение 15 с.
  24. Переложите восстановленные образцы в соответствующие стеклянные флаконы объемом 1 мл с помощью пипетки объемом 200 мкл.
  25. Храните стеклянные флаконы, содержащие восстановленные образцы, при температуре -30 °C и как можно скорее проанализируйте их методом на основе ЖХ-МС/МС.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженные образцы пептидов стабильны при температуре -30 °C при кратковременном хранении и -80 °C при более длительном хранении.

6. Сбор данных образцов пептидов на приборе СВЭЖХ/МС-МС

ОСТОРОЖНОСТЬ. Убедитесь, что при работе с тандемной системой масс-спектрометра Ultra High-Performance Liquid Chromatography/Orbitrap tribrid соблюдаются протоколы безопасности. Персонал лаборатории носил СИЗ и прошел формальное практическое обучение работе с инструментами, организованное производителем УВЭЖХ/МС-МС. Основными предостережениями являются правильное обращение с подвижными фазами кислотных и органических растворителей для УВЭЖХ и высоковольтным источником ионизации для МС.

  1. Выполняйте разделение пептидов с помощью системы сверхвысокопроизводительной жидкостной хроматографии (УВЭЖХ). Колонна LC представляет собой конструкцию с обратной фазой C18 с возможностью электрораспыления и быстрой сепарацией (RSLC) размерами 2 мкм, 100 Å, 50 мкм x 15 см, размещенную в линию после защитной предварительной колонны из того же материала.
  2. Используйте следующие подвижные фазы ВЭЖХ: 0,1% муравьиной кислоты в воде (растворитель А), 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле (растворитель В) и 0,1% муравьиной кислоты в 90% воды и 10% метанола (растворитель С).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворители, а также муравьиная кислота, используемые для приготовления подвижных фаз, имеют сертификат класса LC/MS и производятся только по мере необходимости. УВЭЖХ имеет блок фильтрации и дегазации перед насосами, поэтому подвижные фазы не фильтруются вручную и не очищаются от воздуха.
  3. Для начала запрограммируйте инъекции общего количества пептидов, приготовленных для образцов плазмы и тканей, на уровне 3 мкл, что эквивалентно ~3 мкг пептидного материала, определяемому исходным количеством используемого белка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно обеспечить идеальную интенсивность сигнала РС для максимальной идентификации белка. Объем впрыска может быть увеличен до 15 мкл для дальнейшего увеличения выходного сигнала или уменьшен до 1 мкл при явной перегрузке.
  4. Поддерживайте температуру колонки и автосамплера на уровне 40 °C и 10 °C соответственно.
  5. Установите скорость потока растворителя для получения протеомики на постоянном уровне 0,3 мкл/мин с помощью нанонасосов UHPLC с линейным градиентом разделения подвижной фазы воды (А) и ацетонитрила (В).
  6. Промывайте инъекционный шприц и контур отбора проб (емкостью 20 мкл) с использованием подвижной фазы воды и метанола (C), при этом загрузочный насос СВЭЖХ первоначально настроен на 5 мкл/мин.
  7. Во время разделения образцов в течение 80 минут установите градиент LC (линейные кривые) следующим образом: Начальный - 5% B; 0-60 мин - 32% В; 60-61 мин - 95% В; 61-65 мин - 95% В; 65-66 мин - 2% В; и 66-80 мин - 2% В. Аналогично запустите загрузочный насос при постоянной 100% А, но линейно регулируйте расход следующим образом: Начальный - 5 мкл/мин; 0-5 мин - 1 мкл/мин; 5-61 мин - 5 μл/мин; и 61-80 мин - 5 мкл/мин (рис. 3А).
  8. Вводите неизвестные образцы пептидов в виде последовательных дубликатов прогонов.
  9. Для предотвращения переноса необходимо провести не менее двух последовательных инъекций холостых инъекций 0,1% муравьиной кислоты в воду между образцами с использованием усеченного градиента LC (линейные кривые) в общей сложности в течение 35 мин следующим образом: Начальный - 5% В; 0-23 мин - 32% В; 23-24 мин - 95% В; 24-30 мин - 95% В; 30-31 мин - 2% В; и через 31-35 мин - 2% В (рисунок 3В).
    1. Убедитесь, что настройки градиента LC загрузочного насоса остаются неизменными.
    2. Для образцов пептидов с высоким уровнем эндогенных загрязнителей, таких как печень (например, желчные кислоты), включайте третью заготовку каждые 3-5 проб и в конце прогона, чтобы помочь очистить колонку LC. Он заключается в введении от 1 до 2 мкл раствора, содержащего по 25% ацетонитрила, изопропанола, метанола и воды.
    3. В качестве альтернативы или в сочетании с описанным выше шагом, выполните процентное изменение усиленного градиента LC (т.е. качели) в течение 35 минут в общей сложности в виде промывки системы следующим образом: Начальное - 2% B; 0-3 мин - 2% В; 3-4 мин - 95% В; 4-10 мин - 95% В; 10-11 мин - 2% В; и 11-15 мин - 2% В; 15-16 мин - 95% В; 16-20 мин - 95% В; 20-21 мин - 2% В; 21-25 мин - 2% В; 25-26 мин - 95% В; 26-30 мин - 95% В; 30-31 мин - 2% В; и 31-35 мин - 2% В (рисунок 3С).
  10. Проводят детектирование пептидов, т.е. соответствующих молекулярных масс, по мере их отделения и элюирования из колонки LC, с помощью системы Orbitrap и комбинированной системы тандемного квадрупольного масс-спектрометра (MS-MS) с ионной ловушкой.
    1. Перед выполнением прогонов образцов вставьте колонку LC непосредственно в лицевую сторону сменного источника наноаэрозольной ионизации (NSI) прибора MS, который расположен в верхнем левом переднем углу устройства.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При этом экспонируется встроенная игла электрораспыления колонки LC, которая подает пептиды в виде взвешенных внутри заряженных микрокапель растворителя подвижной фазы LC во входное отверстие ионообменной трубки детектора.
    2. Кроме того, для повышения эффективности улетучивания электроспрея включите встроенный нагревательный блок источника NSI и установите его на 40 °C.
  11. Кроме того, перед прогоном образца убедитесь в удовлетворительном внешнем поступлении сжатого азота и газообразного гелия в прибор MS. Для этого используются стальные баллоны со стальными баллонами размера 300 для каждого газа со сверхвысокой степенью чистоты, которые имеют регуляторные манометры, установленные на статическое давление потока 60 и 40 фунтов на квадратный дюйм соответственно.
  12. Если прибор MS выдает предупреждения о нестабильности подачи газообразного азота, то увеличьте давление максимум до 100 фунтов на квадратный дюйм. Убедитесь, что баки заполнены как минимум на 10-20%, что соответствует показаниям верхнего манометра клапана ~250-500 фунтов на квадратный дюйм; А если нет, замените их на свежие. Падение ниже 10% от полной емкости может привести к попаданию загрязняющих веществ в прибор MS, которые могут оседать на дне газовых баков.
  13. Предварительно произведите метод масс-спектрометра с использованием управляющего программного обеспечения, предоставленного шаблоном, который предназначен для оптимального обнаружения пептидов и их посттрансляционных модификаций (рисунок 3D-H), и введите следующие стандартные условия:
    1. Установите общий период обнаружения на 80 минут.
    2. Установите общий режим обнаружения на пептиды.
    3. Установите источник NSI в положительный режим (т.е. заряд пептидных ионов).
    4. Установите напряжение нано-распылительной иглы на 2000 В и удерживайте его в статическом состоянии.
    5. Установите вход газообразного азота в NSI и установите детекторы в режим статики.
    6. Установите температуру ионообменной трубки на 275 °C.
    7. Определение массы целых пептидов (т.е. родительских ионов; MS1) путем установки диапазона сканирования на 350-2000 м/з, объектива RF на 30%, максимального времени впрыска в режим Auto, а масс-анализатора orbitrap на разрешение 120 000.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативная ионная ловушка прибора здесь не используется для скрининга пептидных масс, так как она менее чувствительна для мониторинга этого типа молекул по сравнению с orbitrap.
    8. Настройте ионные фильтры таким образом, чтобы различать те пептиды, которые имеют несколько зарядовых состояний в диапазоне от 2 до 7. Это позволяет прибору во время записи данных автоматически преобразовывать изначально обнаруженные отношения массы к заряду (m/z) молекул в их точные массы. Аналогичным образом, пептид с только одним состоянием заряда (m/z = 1) не требует какого-либо коэффициента преобразования для получения его точной массы.
    9. Установите динамические затворы исключения для ионов на 1 проход при длительности 60 с, допуск по массе ±10 ppm, а также на отбрасывание любых молекул с присутствующими природными изотопными атомами (например, 14C).
    10. Обнаружение массы фрагментов подтверждения идентичности, генерируемых для пептидов (т.е. дочерних ионов; MS2) путем установки прибора в режим сбора данных, зависящий от данных (режим DDA).
    11. Захватите целые пептиды (т.е. родительские ионы) путем выделения квадруполь, используя настройку для допустимого окна вариабельности массы m/z = 1,6.
    12. Выполните фрагментацию захваченных пептидов, установив режим электронного удара в HCD (т.е. высокоэнергетическую коллизионную диссоциацию с использованием азота и гелия в качестве агента для переноса электронов), энергию столкновения на 30%, дальность сканирования на Auto, максимальное время инжекции на Auto и масс-анализатор Orbitrap на разрешение 30 000.
    13. Получение окончательных данных (ионов MS1 и MS2) путем установки формы пика сигнала в формат центроида.
  14. Поддерживайте точность определения массы для обнаруженных пептидов путем регулярной калибровки прибора, обычно перед каждым прогоном партии образца, как описано ниже.
    1. Переведите прибор MS в положение отключения питания ионного источника с помощью управляющего программного обеспечения и переключите источник NSI на альтернативный источник электрораспыления (HESI) с внутренним обогревом. Этот источник используется в тех случаях, когда могут потребоваться очень большие объемы ввода образцов и соответствующая высокая скорость потока (1-2500 мкл/мин) для насоса LC, например, для экспериментов по метаболомике и фармакокинетике лекарственных препаратов.
    2. Выберите опцию полной проверки калибровки в управляющем программном обеспечении.
    3. Наполните стеклянный шприц объемом 500 мкл с плунжером с тефлоновым покрытием и тупой иглой из нержавеющей стали коммерчески доступным стандартным раствором MS, а затем подключите капиллярную трубку из ПТФЭ к источнику HSEI (при выключенном питании).
      Примечание: Используемый здесь стандарт содержит смесь природных и синтетических молекул (всего 16, например, кофеин), которые охватывают диапазон масс m/z = 50-2800 и охватывают широкий спектр возможных типов химических связей, особенно тех, которые связаны с пептидами (например, амидные группы).
    4. Начните постоянное вливание стандарта MS в источник HSEI (при включенном питании) со скоростью 3-5 мкл/мин, как это делается с помощью шприцевого насоса. Как только в окне просмотра в реальном времени управляющего программного обеспечения будет отмечен стабильный паттерн стандартных пиков, активируйте автоматическую проверку калибровки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если не обнаружено никаких проблем с чувствительностью и точностью определения массы для стандарта, успешная полная калибровка обычно занимает < 40 минут. Аналогичным образом, только в том случае, если прибор проходит все аппаратные параметры MS, которые проверяются, он считается надежным для запуска сэмплов.
    5. Подтвердите успешность калибровки, перезагрузив источник NSI и колонку LC, а затем запустив стандартный раствор человеческого [Glu 1]-фибринопептида B (Glu-Fib) в общем вводимом количестве, охватывающем 1-10 нг (например, 1, 2, 6 и 10 нг). Используйте те же методы разделения LC и обнаружения MS, которые описаны выше для неизвестных образцов.
    6. Проверьте стандарт Glu-Fib на соответствующее время удержания LC (~20 мин), наличие ионов MS1 и MS2 (m/z = 1285,54, 813,39, 785,84, 445,12, 333,19 и 175,12) и линейность увеличивающихся пиковых областей с количеством инжекции.
    7. Затем сгенерируйте таблицы последовательностей с помощью программного обеспечения для управления и сбора данных для запуска неизвестных пептидных и пустых образцов, которые содержат столбцы для ввода типа образца, имени файла, идентификатора образца, пути к данным, метода прибора LC/MS, положения флакона и объема впрыска (рисунок 3D-E).
    8. Сохраните полученные файлы данных MS (расширение: RAW; 500 - 800 ГБ каждый) в указанную папку на жестком диске компьютера прибора. Затем перенесите эти файлы на рабочую станцию компьютера, которая достаточно мощна для работы программного обеспечения биоинформатики, как описано ниже, которое преобразует чрезвычайно обширные и сложные пептидные масс-спектральные данные (т.е. сигналы MS1 и MS2) в соответствующие профили общего состава белка.

7. Преобразование исходных данных МС в репрезентативные суммарные протеомные результаты

ПРИМЕЧАНИЕ: Необработанные данные МС, полученные для образцов пептидов, обрабатываются в профили общего состава белка (протеом) с использованием программного обеспечения биоинформатики. Короче говоря, биоинформационное программное обеспечение реконструирует исходные белки в образце, сопоставляя необработанные данные МС с их известными пептидными спектрами MS1 и MS2, найденными в веб-библиотеке видоспецифичных протеомов, посредством обширного и уникального охвата аминокислотной последовательности белка. Относительная распространенность каждого идентифицированного белка определяется программой с использованием интенсивностей сигнала MS1 соответствующих уникальных пептидов. Определенная концентрация может быть надежно сравнена между образцами, но только в том случае, если они выполняются в рамках одной и той же партии препарата и с использованием идентичных настроек LC и MS. В противном случае придется использовать ранее упомянутые абсолютные количественные методы, основанные на внутреннем восстановлении стандартных/репортерных ионов, такие как селективное мечение пептидов в каждом образце методом ТМТ.

  1. Загрузите на жесткий диск компьютера рабочей станции справочный файл протеома из веб-библиотеки.
    1. Чтобы найти это, воспользуйтесь базой данных, расположенной на веб-сайте Uniprot для интересующих вас видов (например, хорьков / Mustela furo). Это называется файлом FASTA. Используйте средство поиска Proteomes и представление таблицы , чтобы найти и загрузить файл справочника Proteome.
    2. Чтобы максимально увеличить возможное количество генерируемых идентификаций белков, выберите как рецензируемые комитетом (Swiss-Prot), так и нерецензируемые (TrEMBL) записи в базе данных Uniprot при создании файла FASTA. Аналогичным образом, выберите опцию, чтобы включить все рассмотренные изоформы белков.
  2. Откройте программное обеспечение для биоинформатики, т. е. Proteome Discoverer, на вкладке «Стартовая страница », а затем выберите вкладку « Администрирование ».
  3. Перейдите на подвкладку «Ведение файлов FASTA», а затем загрузите в программу указанный выше видоспецифичный файл FASTA, созданный для ваших экспериментов.
  4. Вернитесь на вкладку « Стартовая страница » и нажмите « Новое исследование/анализ», а в диалоговом окне введите название исследования в поле «Название исследования » и выберите папку с файлами для сохранения исследования в поле «Корневой каталог исследования ».
  5. Пока оставьте поля Processing Workflow и Consensus Workflow пустыми, так как они будут выбраны позже.
  6. Нажмите OK для сохранения и выхода из диалогового окна, после чего откроется страница Study Definition .
  7. Перейдите на вкладку «Определение исследования » и введите сведения о проекте в поле «Описание исследования », расположенном посередине слева.
  8. Перейдите на вкладку «Входные файлы » и нажмите « Добавить файлы».
    1. Это вызовет диалоговое окно, в котором можно выбрать и загрузить с жесткого диска компьютера необходимые файлы исходных данных для обработки в общий профиль состава белка (протеом).
  9. Нажмите на необработанные файлы данных MS, которые теперь перечислены на вкладке «Входные файлы », которые можно выбрать и выделить по отдельности или все сразу.
  10. Перетащите их и поместите в раздел «Файлы для анализа » в поле «Анализ», расположенное в средней правой части подполя «Шаг обработки ».
  11. Перейдите на вкладку «Рабочие процессы» и нажмите « Редактировать», которая находится рядом с заголовком «Шаг обработки » поля «Анализ», расположенного посередине справа.
  12. Нажмите кнопку «Открыть общий» и в папке ProcessingWF_Tribrid выберите файл рабочего процесса, предназначенный специально для субидентификации фосфопротеинов, как это было получено при обнаружении РС на основе фрагментации HCD (рис. 4A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: После этого в окне «Дерево рабочего процесса » появится диаграмма шагов обработки, содержащая редактируемые узлы. Будет два узла, как описано ниже, которые помечены восклицательными знаками, указывающими на то, что пользователь должен ввести информацию, относящуюся к эксперименту.
  13. На диаграмме дерева рабочего процесса обработки нажмите и откройте узел RC Spectrum Files .
    1. В категории RC «Параметры файлов спектра » найдите и выберите в параметре «База данных белков » файл FASTA, который ранее был сгенерирован с помощью веб-сайта Uniprot, для видоспецифичной справочной библиотеки пептидных MS-спектров, поиск в которой будет осуществляться для идентификации белков, представляющих экспериментальный интерес.
  14. Нажмите и откройте узел Sequest HT и внесите следующие три изменения:
    1. В параметре Protein Database выберите тот же файл FASTA, как описано выше.
    2. В параметре Enzyme Name выберите Trypsin (full) или Lys-C, которые являются основными и резервными протеазами, используемыми для приготовления оригинального пептидного расщепления.
    3. В параметре Динамические модификации убедитесь, что выбрано значение не менее Phospho / +79.966 Da (S, T, Y).
      1. Используйте последнюю настройку для выявления пептидов, ассоциированных с белками, которые посттрансляционно модифицируются фосфорилированием, путем поиска соответствующих потерь спектров МС фосфатной группы (групп) фосфатов (m/z = 79,97).
      2. Найдите занятые фосфатами аминокислотные сайты (т.е. серин, треонин или тирозин) по ожидаемым изменениям в их характере фрагментации MS2.
      3. Добавьте другие белковые посттрансляционные модификации, представляющие рутинный интерес, таким же образом к узлу Sequest-HT на этом этапе, например, метилирование, ацетилирование, миристилирование, если известна точная потеря массы родственных групп. Аналогичным образом, расширить поиск сайтов фосфорилирования на другие, менее часто встречающиеся аминокислоты, например, гистидин.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Узлы Spectrum Files RC и Sequest HT дерева рабочего процесса для этапа обработки являются единственными двумя узлами, которые требуют настройки каких-либо параметров.
    4. Оставьте остальные настройки по умолчанию, так как они уже оптимизированы производителем для получения максимального количества обозначенных идентификаций белков, представляющих интерес. Аналогично это относится ко всем остальным узлам в дереве рабочего процесса.
    5. Убедитесь, что узлы Percolator и IMP-ptmRS включены в конец дерева рабочего процесса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Percolator использует повторяющуюся подгонку для значительного улучшения конечных результатов. IMP-ptmRS имеет важное значение для сообщения о надлежащей идентификации и локализации всех белковых посттрансляционных модификаций, включая фосфорилирование.
  15. Вернитесь на вкладку «Рабочие процессы» и нажмите «Редактировать найдено» рядом с заголовком «Шаг консенсуса » поля «Анализ», расположенного в правом верхнем углу. Это приведет к появлению диаграммы дерева рабочего процесса для шага консенсуса.
  16. Нажмите кнопку «Открыть Common» и в папке ConsensusWF выберите файл рабочего процесса консенсуса, который будет выдавать желаемый формат вывода для результатов профиля состава белка (протеома) (рисунок 4B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Согласованная пошаговая диаграмма, содержащая редактируемые узлы, откроется в окне «Дерево рабочего процесса ». Диаграмма, используемая для обработки данных, создается путем модификации базового рабочего процесса консенсуса, в котором встроенные узлы Feature Mapper и Precursor Ions Quantifier были добавлены в качестве ответвления от исходного узла MSF Files , чтобы облегчить количественную оценку относительной распространенности белка. В то время как все узлы в рабочем процессе уже содержат оптимизированные параметры, установленные производителем, некоторые из них содержат очень важные записи, которые необходимо перепроверить для правильного выбора, как описано ниже.
  17. На диаграмме дерева рабочего процесса нажмите и откройте узел Precursor Ions Quantifier . Это узел, который необходим для количественной оценки относительного содержания каждого идентифицированного белка.
    1. В категории « Общие настройки количественной оценки » найдите и выберите в параметре « Пептиды для использования » опцию «Уникальный + бритва ».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Уникальные пептиды - это те, которые содержат аминокислотные последовательности, присущие исключительно одному белку; и, таким образом, используются для специфического определения его величины на основе интенсивностей сигнала МС. Бритвенные пептиды — это пептиды, общие для групп белков; и, таким образом, используются для согласования вычисленных относительных изобилий.
    2. В категории «Нормализация и масштабирование» измените параметры «Режим нормализации» и «Режим масштабирования» на вариант «Нет», так как этот тип корректировки слишком ограничен для надежного применения по всему протеому.
      Примечание: Эти настройки активируются только тогда, когда требуется нормализовать рассчитанное относительное содержание отдельных белков, представляющих интерес, по отношению к тем, которые стабильно присущи клетке, например, гены домашнего хозяйства, а затем выразить полученные значения в виде масштабированного соотношения.
    3. Затем нажмите и откройте узел Peptide and Protein Filter и в категории Peptide Filters измените параметры Peptide Confidence At Least и Keep Lower Confidence PSM на опции High и False соответственно. Таким образом, пептидные совпадения, использованные при идентификации белков, достигают наибольшего уровня значимости соответствия (т.е. ≥ 95%).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, первый параметр может быть установлен в значение Medium , чтобы ослабить строгость пептидных совпадений и, таким образом, значительно увеличить выход белковых хитов; Но это, наоборот, приводит к очень высокому риску получения большого количества ложных идентификационных данных. Кроме того, никогда не должно быть так, чтобы значение "Low" использовалось в качестве приемлемого варианта для обоих параметров.
    4. Это единственные узлы шага консенсуса, которые нуждаются в корректировке параметров, остальные оставьте с использованием их настроек по умолчанию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, рабочий процесс на этапе консенсуса обрабатывает весь постфактум анализ, т.е. определение относительной распространенности белка, достоверность идентификации (т.е. частота ложных открытий и оценки спектрального совпадения пептидов) и картированное покрытие пептидов. Статистика результатов и распределение данных также предоставляются в виде конечных таблиц.
  18. После того, как описанные выше рабочие процессы обработки и согласования будут готовы, сохраните все исследование, а затем нажмите на значок «Запустить » (шестеренки), расположенный в верхней части поля «Анализ ». Если одновременно обрабатывается несколько необработанных файлов данных MS, то перед началом обработки нажмите и отметьте галочкой ближайший значок «По файлу » (квадрат).
    Примечание: Обработка одного файла исходных данных MS в общий файл результатов протеома обычно занимает 20-40 минут, но она может дать непрерывный список из многих тысяч идентификаций белков, варьирующихся от совпадений с низкой, средней до высокой достоверности (т.е. с весом в сторону высоких попаданий), наряду с модификациями фосфатов, которые присутствуют в каждом объекте (Рисунок 4C). Основными выходными параметрами для идентифицированных белков являются FDR (достоверность), Master (если был проверен файл FASTA / запись в библиотеке), Accession #, Description, Coverage %, Sequence Coverage, Peptide Spectral Matches (например, количество уникальных пептидов), Physical Characteristics (например, MW в кДа), Relative Boungenies и Modifications (т.е. группы фосфорилирования).
    1. В столбце расположены общие протеомные результаты в порядке возрастания или убывания или полностью отфильтрованы с помощью значка воронки на панели инструментов (рис. 4C), в соответствии с исследовательскими интересами, например, показаны только те, у которых идентификация с высокой степенью достоверности (белок FDR) или высокая степень совпадения пептидов (например, по % покрытия и/или количеству уникальных найденных).
    2. Если требуется информация о посттрансляционной модификации, отфильтруйте идентифицированные белки, имеющие фосфорилирование, для дальнейшего анализа.
    3. Сохраните отфильтрованные результаты без изменения имени файла, так как их можно восстановить до исходного вывода, просто удалив примененные фильтры и обновив окно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Визуализация результатов общего протеома путем опциональной обработки в графики вулканов
Общие результаты протеома для каждого образца могут быть легко найдены по присоединению # или описанию для конкретных белков, представляющих исследовательский интерес, а связанная с ними относительная распространенность усредняется, а затем сравнивается между группами лечения для получения значимых различий (например, как с помощью p-значений, полученных с помощью t-критерия). В качестве альтернативы, поиск глобал...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В описанном выше методе использовались ткани, которые были мгновенно заморожены в жидком азоте, чтобы немедленно остановить всю биологическую активность перед переносом на -80 °C для длительного хранения. После того, как все образцы были собраны, произошла гомогенизация тканей. Во время гомогенизации крайне важно держать все ткани и инструменты в холоде, чтобы предотвратить реактивацию или деградацию белков. Кроме того, во время первоначального извлечения белка из гомогенизированной ткан...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Этот проект был частично поддержан назначением в Программу сотрудничества Национального исследовательского совета, администрируемую Офисом стипендий Национальных академий наук, инженерии и медицины, и Программой Института науки и образования Оук-Ридж в Армейском институте исследований Уолтера Рида.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Набор для анализа белка 660 нмПирс / Термо Сайентиал22662Для определения концентрации белка в образцах, содержит реагент Pierce 660nm Protein Assay и предварительно разбавленные стандарты анализа белка
Ацетонитрил, класс Optima LC/MSThermo Fisher Scientific047138.К2Сверхчистый ацетонитрил, используемый для жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии
Пластина-уплотнитель из алюминиевой фольгиБекман Коултер538619Печать, используемая при разработке пробирной пластины для анализа белка
BioTek Synergy Neo2 Многорежимный считыватель / УФ-ВИД спектрометрAgilenthttps://www.agilent.com/en/product/microplate-instrumentation/microplate-readers/multimode-microplate-readers/biotek-synergy-neo2-hybrid-multimode-reader-1623195Спектрофотометр/считыватель пробирных пластин, используемый для выполнения измерений абсорбции с длиной волны 660 нм для определения концентраций белков 
ChromaCare LC-MS Раствор для промывки инструментаThermo Fisher ScientificT111101000Раствор, содержащий по 25% ацетонитрила, изопропранола, метанола и используемого для очистки системы ЖК после отбора проб
CK28 Трубка PrecellysBertin Corp / ТехнологииP000911LYSK0A.0Гомогенизированные ткани помещаются в эти пробирки для лизиса тканей и выделения белка с помощью инструмента Precellyis. Это пробирки, используемые в нашей лаборатории, которые в протоколе называются «гомогенизирующими пробирками».
КриокапсулаБрукс / Азента Лайф Сайнсhttps://www.azenta.com/products/cryopod-carrierКонтейнер для хранения жидкого азота для охлаждения раствора во время гомогенизации тисузе
EasyPep Mini MS Набор для подготовки образцовThermo Fisher ScientificА40006Один набор может обрабатывать 20 образцов, в состав которых входит раствор лизиса для экстракции белка, универсальная нуклеаза, добавленная в раствор для экстракции, и регеанты, необходимые для этапов 1.4 и 1.5
Колонна EASY-Spray C18 LC (15 см L, 50 &; m Dia, и 2 & микро; m размер частиц)Thermo Fisher ScientificЭС901Колонка для электрораспыления ЖХ, используемая для разделения пептидов перед обнаружением РС
Решение для калибровки FlexMixПирс / Термо СайентиалА39239Смесь из 16 стандартных молекул, используемая для калибровки точности и чувствительности детектора прибора МС перед прогоном проб
Муравьиная кислота, класс LC/MSThermo Fisher Scientific85178Сверхчистая муравьиная кислота, используемая для акцидирования всех растворов и образцов LC в конечной концентрации 0,1% (v/v)
Остановить протеазу и Коктейль одноразовых ингибиторов фосфотазы (100x)Thermo Fisher Scientific78442Добавляется в экстракционный буфер для предотвращения деградации белков и фосфопротеинов в образце
Метанол, марка Optima LC/MSThermo Fisher Scientific047192.К2Сверхчистый метанол, используемый для жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии
Фарфоровый раствор, 150 млThermo Fisher ScientificFB961CЕмкость 150 мл, используется для гомогенизации небольших тканей хорька (например, мозга)
Фарфоровый раствор, 275 млThermo Fisher ScientificФБ961ДЕмкость 275 мл, используется для гомогенизации крупных тканей хорька (например, печени)
Фарфоровый раствор, 50 млThermo Fisher ScientificFB961AЕмкость 50 мл, используется для гомогенизации тканей мыши
Пест фарфоровый, 50 млThermo Fisher ScientificФБ961КДля использования с раствором объемом 50 мл
Фарфоровые пестики, 150 млThermo Fisher ScientificФБ961МДля использования с раствором объемом 150 мл
Фарфоровые пестики, 275 млThermo Fisher ScientificФБ961НДля использования с раствором объемом 275 мл
ПреселлисBertin Corp / Технологииhttps://www.bertin-technologies.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys-evolution-homogenizer/Инструмент, используемый для гомогенизации образцов тканей. Использовались следующие настройки: 4500 об/мин, 2 x 30 с за цикл, пауза 30 с.
Реагент для анализа белкаПирс / Термо Сайентиал22662Реагент для анализа белка используется на этапах 3.4– 3.8
Первооткрыватель ProteomeThermo Fisher ScientificCSW0064764Биоинформатическое программное обеспечение для анализа данных протеомики/фосфопротеомики
SureSTART MSCERT флаконы для впрыска LC (0.02– емкость 1,5 мл)Thermo Fisher Scientific6ПМКК39ТРСертифицированные для применения с высокой степенью преформенса, стеклянные флаконы с винтовой крышкой (ПТФЭ, предварительно разрезанные перегородки), используемые для содержания образцов для инъекций на приборе LC/MS     
Система Ultimate 3000 UHPLC / Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS (LC/MS)Thermo Fisher ScientificLC: со скидкой / MS: FETD2-10002, по специальному запросуПрибор для жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии с ультравысоким преформенсом (ЖХ/МС), используемый для выделения, а затем детектирования по молекулярной массе пептидов в образцах
Универсальная нуклеаза для лизиса клеток, 100 кЕ, 400 и микро; LПирс / Термо Сайентиал88702Приобретена дополнительная универсальная нуклеаза 
Вакуум ПлюсЭппендорфhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/Centrifugation/Concentrator/Vacufuge-plus-p-PF-25748Вакуум используется для сушки образцов пептидов перед восстановлением.
Вода, марка Optima LC/MSThermo Fisher Scientific047146.К2Сверхчистая вода, используемая для жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии

Ссылки

  1. Wilhelm, M., et al. Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).
  2. Souchelnytskyi, S. Bridging proteomics and systems biology: what are the roads to be traveled. Proteomics. 5 (16), 4123-4137 (2005).
  3. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
  4. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  5. Casado, P., et al. Integrative phosphoproteomics defines two biologically distinct groups of KMT2A rearranged acute myeloid leukaemia with different drug response phenotypes. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 80(2023).
  6. Fazakerley, D., et al. Phosphoproteomics reveals rewiring of the insulin signaling network and multi-nodal defects in insulin resistance. Nat Commun. 14 (1), 923(2023).
  7. Emdal, K. B., et al. Phosphoproteomics of primary AML patient samples reveals rationale for AKT combination therapy and p53 context to overcome selinexor resistance. Cell Rep. 40 (6), 111177(2022).
  8. Boutté, A. M., et al. Proteomic analysis and brain-specific systems biology in a rodent model of penetrating ballistic-like brain injury. Electrophoresis. 33 (24), 3693-3704 (2012).
  9. Peters, M. E., et al. Head injury serum markers for assessing response to trauma: Design of the HeadSMART study. Brain Inj. 31 (3), 370-378 (2017).
  10. Song, H., et al. Proteomic analysis and biochemical correlates of mitochondrial dysfunction after low-intensity primary blast exposure. J Neurotrauma. 36 (10), 1591-1605 (2019).
  11. Attilio, P. J., et al. The effects of blast exposure on protein deimination in the brain. Oxid Med Cell Longev. 2017, 8398072(2017).
  12. Zhao, Z., Zlokovic, B. V. Acetylated tau: A missing link between head injury and dementia. Med. 2 (6), 637-639 (2021).
  13. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. J Vis Exp. (168), e61941(2021).
  14. Blagoev, B., Ong, S. E., Kratchmarova, I., Mann, M. Temporal analysis of phosphotyrosine-dependent signaling networks by quantitative proteomics. Nat Biotechnol. 22 (9), 1139-1145 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи