Выяснение ткане- и плазмоспецифических протеомных изменений в норме и при заболеваниях

Lily S. Neff; James C. DeMar; Nicholas C. Gary; Mital Y. Patel; Burook Misganaw; Aarti Gautam; Rasha Hammamieh

doi:10.3791/67240

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выяснение ткане- и плазмоспецифических протеомных изменений в норме и при заболеваниях

721 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67240

⸱

23 сентября 2025 г.

Lily S. Neff^*¹^,² , James C. DeMar^*²^,³ , Nicholas C. Gary²^,⁴ , Mital Y. Patel²^,⁵ , Burook Misganaw²^,⁶ , Aarti Gautam² , Rasha Hammamieh²

¹NRC Fellow, ²Medical Readiness Systems Biology, Walter Reed Army Institute of Research, ³ORISE Fellow, ⁴The Geneva Foundation, ⁵AEOP Fellow, ⁶Culmen International, LLC

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Протеомика — это высокопроизводительная оценка взаимодействий, функции, состава и структуры белков и их клеточной активности. Здесь мы представляем протокол для оценки общих протеомных изменений в различных биообразцах, включая плазму и ткани. Описанная здесь методика применима ко всем биообразцам, содержащим белки.

Аннотация

Протеомика — это широкомасштабное исследование экспрессируемых белков, сосредоточенное на их структуре, функции, взаимодействиях, распространенности и посттрансляционных модификациях в биологической системе. Например, фосфопротеомика, жизненно важное подмножество тотальной протеомики, изучает паттерны фосфорилирования и изменения белков. Описанная здесь методика иллюстрирует тотальный протеомный подход к выяснению изменений в общих профилях экспрессии белков, включая паттерны фосфорилирования, в тканях плазмы, мозга, легких, селезенки и печени, собранных на исследуемых животных моделях (т.е. хорьков и мышей). Эта методика применима для других типов тканей, а также практически для любого биообразца, содержащего белки (например, культивируемых клеток). После вскрытия представляющие интерес ткани были мгновенно заморожены и хранились при температуре -80 °C. Затем ткани гомогенизировали с помощью ступки и пестика с жидким азотом для сохранения целостности белка и изменений фосфорилирования. Общий белок экстрагировали из тканевых гомогенатов с помощью буфера для лизиса с универсальной нуклеазой и ингибиторами протеазы/фосфатазы. Белки, извлеченные из ткани и эквивалентной плазмы, преобразовывали в общие пептиды путем контролируемого расщепления протеазы с использованием коммерческого набора для подготовки образцов с помощью масс-спектрометра. Пептиды были непосредственно проанализированы с помощью сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии/тандемной масс-спектрометрии Orbitrap-tribrid. Идентичность составляющих белков была восстановлена по пептидным масс-спектральным данным с использованием программного обеспечения протеомики биоинформатики, что было сопоставлено с библиотекой видоспецифичных аминокислотных последовательностей. После этого анализ должен включать строгие критерии отсечения, особенно с использованием только идентификаций белков с высокой степенью достоверности. Статистически значимые протеомные различия (изменение в >2 раза; p < 0,05) между контрольной и экспериментальной группами.

Введение

Протеомика, как комбинация экспериментов с протеомом и анализа данных, фокусируется на идентификации и количественной оценке белков, их характеристике на основе состава, взаимодействия, претрансляционных и посттрансляционных модификаций (например, фосфорилирования), субклеточной локализации и структуры в физиологических условиях¹. Протеомика экспрессии занимается количественным сравнением белков, которые различаются в изменяющихся биологических условиях². Он также имеет большое значение для профилирования карты сложных, взаимосвязанных путей, сетей и молекулярных систем, которые непосред....