Методическая статья

Моделирование эндотелиального гликокаликса после пневмонэктомии в 3D-жидкостном чипе - подход к изготовлению сосудистой системы орган-на-чипе

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67246

⸱

16 сентября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Worcester Polytechnic Institute

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для создания системы «орган-на-чипе» (OOC), предназначенной для имитации пневмонэктомии. Эта система исследует потенциальную корреляцию между нарушением гликокаликса и осложнениями после пневмонэктомии.

Аннотация

Эндотелиальный гликокаликс (GCX), богатый углеводами слой, покрывающий просветную поверхность эндотелиальных клеток, играет ключевую роль в регулировании клеточных реакций на раздражители. Он состоит из трансмембранных белков, служащих механотрансдукторами для клеточных реакций. В то время как он естественным образом сохраняет свою структуру и стабильность в гомеостатических условиях, воздействие сильного напряжения сдвига может вызвать повреждение с многочисленными последствиями. Общее влияние сдвигового напряжения на эндотелиальные клетки было изучено, но степень и влияние сдвигового напряжения на сосудистые системы, особенно после пневмонэктомии, не были хорошо изучены. Для исследования этого был применен комплексный подход, включающий создание модели CAD легочной сосудистой сети до и после пневмонэктомии. С помощью вычислительного моделирования жидкости были идентифицированы ключевые области повышенного напряжения сдвига и давления, которые были воспроизведены в системе «орган на кристалле» (OOC). Микрососудистые эндотелиальные клетки легких человека (HLMVECs) были посажены на форму в форме выбранных участков для характеристики эффектов повышенного напряжения сдвига in vitro. После экспериментов HLMVEC подвергали иммуноокрашиванию для качественной оценки здоровья GCX при нормальных и повышенных стрессах, вызванных пневмонэктомией. Интеграция вычислительного моделирования и экспериментального анализа расширяет наше понимание того, как изменения напряжения сдвига влияют на GCX, проясняя их влияние на сосудистую функцию и послеоперационные осложнения.

Введение

Пневмонэктомия — это инвазивное хирургическое вмешательство с высоким риском, выполняемое для извлечения правого или левого легкого1. Эта процедура обычно используется в качестве варианта лечения различных тяжелых заболеваний, таких как рак легких, туберкулез легких и травматические повреждения легких2. Несмотря на то, что процедура является многообещающей, она сопряжена со значительными рисками, о чем свидетельствует повышенная частота послеоперационных осложнений, начиная от аритмии и заканчиваяотеком легких.

Пневмонэктомия оказывает глубокое влияние на сердечно-сосудистую динамику, направляя весь сердечный выброс сердца в оставшеесялегкое. Известно, что это перенаправление кровотока увеличивает давление и сдвиговые напряжения в оставшейся легочной сосудистой сети4. При таких обширных изменениях в схемах кровотока эндотелиальный гликокаликс (GCX) играет ключевую роль в ощущении этих измененийв схемах кровотока.

GCX представляет собой гелеобразный слой, который регулирует биохимическую активность в ответ на изменения в окружающей среде 6,7. Было показано, что его экспрессия увеличивается при длительном воздействии равномерного потока и уменьшается при воздействии возмущенного потока по сравнению со статической культурой 8,9. GCX имеет переменную толщину в диапазоне от 0,1 до 1 мкм по всей сосудистой сети и функционирует как важный механотрансдукционный слой, покрывающий эндотелиальные клетки кровеносных сосудов10. Сеть состоит из плотного слоя сахаров, липидов и белков, как показано на рисунке 1. Эти сахара связываются с образованием гликанов, которые могут либо свободно существовать в кровотоке, либо прикрепляться к белкам или липидам, что приводит к образованию протеогликанов, гликопротеинов или гликолипидов 7,11. Протеогликаны состоят из цепей гликозаминогликанов (ГАГ), которые связываются с клеточной мембраной через белки плазмы или рецепторы. К таким ГАГ относятся гепарансульфат (ГС), гиалуроновая кислота (ГК), хондроитинсульфат (ХС), дерматана сульфат и кератансульфат12. Гепарансульфат является преобладающим ГАГ, составляя более 50% от общего количества ГАГ, обнаруженных в GCX. Эти боковые цепи могут прикрепляться к встроенным основным белкам, которые включают глипиканы (закрепленные гликозилфосфатидилинозитолом) и синдеканы (с доменом, охватывающим мембрану), а также CD44 (рецептор поверхностной адгезии). Описанные выше комплексы играют решающую роль в регуляции факторов роста, противовоспалительных реакций, облегчении расширения сосудов и контроле проницаемости сосудов13.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Диаграмма компонентов GCX. Схема, представляющая компоненты эндотелиального гликокаликса. На этой схеме изображен апикальный гликокаликс, который находится на просвете сосуда, показывая связанные с ним мембранные протеогликаны и гликопротеины. Создано с BioRender.com Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигурки.

Хотя точная связь между пневмонэктомией и повреждением GCX недостаточно изучена, существует вероятная корреляция между измененными моделями кровотока, вызванными пневмонэктомией, и целостностью GCX. Известно, что нарушение кровотока в сосудистой сети приводит к повреждению GCX6. Мы предположили, что увеличение нарушенного кровотока и изменения напряжения сдвига в оставшейся сосудистой сети после пневмонэктомии могут со временем привести к повреждению GCX. Это ускоренное ухудшение может стать катализатором послеоперационных осложнений и заболеваемости, тем самым увеличивая риски, присущие общему здоровью пациента13.

Этот протокол был направлен на моделирование легочной сосудистой сети после пневмонэктомии в соответствии с общей процедурой, описанной на рисунке 2. Моделирование жидкостей проводилось на компьютерной модели, воспроизводящей легочную сосудистую сеть человека с пневмонэктомией и без нее. Модели пневмонэктомии были созданы путем проектирования 3D-легочной сосудистой сети в программном обеспечении для 3D-моделирования на основе размеров, полученных из компьютерной томографии и литературных данных, а затем их дальнейшего упрощения для моделирования потока в программном обеспечении вычислительной гидродинамики (CFD). Моделирование выявило конкретные области интереса, выбранные по областям, в которых напряжение сдвига было увеличено в моделях пневмонэктомии по сравнению с контролем. Эти области были выбраны для воспроизведения для создания модели in vitro . В модели in vitro использовалась конструкция жидкостной камеры для моделирования нескольких участков сосудистой сети с нормальной геометрией и геометрией пневмонэктомии для моделирования разницы в условиях потока.

Микрососудистые эндотелиальные клетки легких человека (HLMVECs) культивировались на покрытых фибронектином полидиметилсилоксановых субстратах (PDMS), сформированных таким образом, чтобы имитировать выбранную область бифуркации. Питательные среды микрососудистых эндотелиальных клеток перфузировали через систему с помощью перистальтического насоса. Наконец, клетки и GCX фиксировали, иммуноокрашивали антителом, окрашивающим GCX, и визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа для оценки их состояния после воздействия потока жидкости. Общая хронология протокола приведена в таблице 1.

figure-introduction-2
Рисунок 2: Последовательность разработки OOC. Последовательность разработки новой системы OOC для изучения эффектов легочной пневмонэктомии легких (1) Компьютерная томография легочной сосудистой сети человека. (2) Геометрия компьютерной томографии, используемая для определения областей интереса для модели 3D CAD. (3) Моделирование потока жидкости для определения геометрии, представляющей интерес для модели in vitro . (4) Смоделирована пресс-форма PDMS, содержащая интересующие области по результатам моделирования (5) Форма вставлена в акриловый корпус для фиксации формы для перфузии (6) Завершена настройка проточной камеры (7) Полная настройка проточной камеры перенесена в инкубатор (8) Светлые и флуоресцентные изображения получены после воздействия напряжения сдвига. Создано с BioRender.com Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигурки.

Таблица 1: Общая хронология протокола. Общая последовательность выполнения шагов в рамках протокола со средней продолжительностью (ч) каждого шага. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

В этом исследовании использовались данные компьютерной томографии (КТ) из предыдущей литературы14 , которые были собраны в соответствии с Институциональными и Федеральными этическими стандартами. Все данные изображений, на которые были сделаны ссылки, получили информированное согласие участников после одобрения Институционального наблюдательного совета (IRB) для обеспечения защиты прав и конфиденциальности участников.

1. Моделирование легочной сосудистой сети в программном обеспечении САПР

  1. Исследование физиологической геометрии первичных сосудов, подлежащих моделированию.
  2. Используйте КТ-изображения сосудов, которые необходимо смоделировать, чтобы выбрать конкретную геометрию для репликации, как показано на рисунке 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола использовалась компьютерная томография легких по клиническому состоянию из предыдущей литературы14. Этот протокол также позволяет использовать любые данные компьютерной томографии для создания моделей in vitro .
    1. Откройте средство просмотра DICOM и импортируйте изображения компьютерной томографии. Перемещайтесь по срезам, чтобы определить интересующие вас сосуды. Сохраните соответствующие изображения для дальнейшего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сосудом, реплицированным для этого протокола, была сосудистая сеть легких, так как применение этого протокола заключается в моделировании эндотелиального гликокаликса в здоровых и постпневмонэктомических состояниях. Другие местоположения могут использоваться для различных целей.
  3. Используя ImageJ FIJI v1.54f15, измерьте диаметр сосудов по изображениям компьютерной томографии или литературным значениям.
    1. Открытый ImageJ FIJI и Импорт сохраненных изображений КТ: выберите Файл > Открыть.
    2. Выберите инструмент «Линия » на панели инструментов, чтобы нарисовать линию, охватывающую длину масштабной линейки на изображении компьютерной томографии.
    3. Затем выберите «Анализ» > «Задать масштаб». Введите известное расстояние (например, если масштабная линейка на изображении равна 10 мм, введите 10 в качестве известного расстояния). Введите единицу длины (например, мм). Нажмите OK.
  4. Используйте инструмент «Линия» для измерения диаметров. Для этого выберите инструмент «Линия» на панели инструментов и нарисуйте линию, охватывающую диаметр сосуда. Затем выберите «Анализировать» > «Измерить », чтобы получить значение диаметра.
  5. Повторите шаги 1.3 и 1.4 для всех интересующих вас сосудов и запишите измерения.
  6. Компилируйте измерения сосудов по типам сегментов для упрощения моделирования.
    1. Создайте электронную таблицу для категоризации измерений сосудов и пометьте каждую строку, указав название сосуда, измерение и тип сегмента (например, артерия, вена).
  7. Создание справочной таблицы по длине и диаметру сосудистых сегментов на основе литературы и рентгенографических измерений.
  8. Создайте 3D-модель с помощью программного обеспечения для 3D-моделирования, чтобы воспроизвести геометрию и размеры изображений компьютерной томографии.
    1. Откройте программу и создайте новый файл детали: выберите «Файл» > «Новая деталь > », выберите «Эскиз» > «Создать эскиз » и нарисуйте профиль с использованием размеров из ImageJ.
    2. Использование элементов по траектории и лофтинга для 3D-геометрии: для элемента по траектории выберите "Элементы" > "Выступ/основание" по траектории. Для лофтов выберите "Элементы" > "Лофтированная бобышка/основание".
    3. Уточните модель, чтобы она соответствовала точным измерениям.
  9. Определите варианты модели, которые необходимо разработать, такие как модель контроля и модель пневмонэктомии.
    1. Опишите различные состояния (например, нормальная или пневмонэктомия) и перечислите структурные изменения, необходимые для каждого варианта.
  10. Дублируйте исходную модель для модификации, чтобы создать экспериментальные модели в соответствии с вашими параметрами (т.е. правая и левая пневмонэктомия).
    1. Сохраните исходную модель, затем выберите «Файл» > «Сохранить как копию », чтобы создать копии для каждого экспериментального условия.
    2. Модифицируйте каждую копию в соответствии с заданными параметрами (например, правая и левая пневмонэктомия).
  11. Преобразуйте модель из файла детали в файл Parasolid для моделирования вычислительной гидродинамики (CFD).
    1. Выберите Файл > Сохранить как. Выберите Parasolid (*.x_t) в раскрывающемся списке типов файла, затем сохраните файл в нужном каталоге.

2. Моделирование потока жидкости

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг полезен для определения областей модифицированного напряжения сдвига после пневмонэктомии для выбора геометрии сосудов для репликации для системы in vitro . Кроме того, лицензия на программное обеспечение должна поддерживать модуль импорта.

  1. Настройте новое исследование стационарного ламинарного потока.
    1. Выберите Мастер моделей > 3D (пространственное измерение) > потоком жидкости > однофазным потоком > ламинарным потоком (spf) > выберите Добавить , чтобы добавить физический интерфейс ламинарного потока, > выберите Исследование > выберите Стационарный в разделе Общее исследование > выберите Готово.
  2. Добавьте геометрию из модели CAD.
    1. Импортируйте файл Parasolid. Выберите «Грани крышки» и в графическом окне выберите окружность внутренней стенки сосуда на каждом открытом входе и выходе. Это будут ограничивающие края граней капителей. Выберите Создать объединение и Построить все.
    2. Выберите «Удалить детали » и убедитесь, что в разделе «Детали для удаления» выбраны все параметры, а затем выберите «Построить все », чтобы удалить ненужную геометрию.
  3. Создание сетки 1 (сетчатая стенка сосуда + сетчатая область жидкости).
    1. Установите для параметра Размер значение предопределенный: сверхтонкий, калибровка для гидродинамики.
    2. Установите для параметра Размер 1 значение предопределенное: сверхтонкое, калибровка для гидродинамики, для выбора геометрического объекта, указание границы и вручную. В графическом окне выберите все видимые внешние грани области стенки сосуда, включая кольцеобразную грань вокруг грани крышки. Не выбирайте крышки на входе и выходе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите поверхность колпачка в конце удаленного сечения справа и слева от моделей пневмонэктомии, так как они считаются геометрическими границами после пневмонэктомии.
    3. В разделе Уточнение углов выберите Домен и вручную. В графическом окне выберите [Домен] 1 (стенка сосуда) и [Домен] 2 (жидкость).
    4. В разделе "Выбор границ" убедитесь, что границы совпадают с указанными в поле "Выбор геометрического объекта" из "Размера 1".
    5. В разделе Свободный тетраэдральный 1 выберите Оставшийся для параметра Уровень геометрического объекта в разделе Выбор домена.
    6. В разделах Пограничные слои 1 и Выбор геометрических объектов укажите Домен и выберите Вручную в графических окнах [Домен] 1 и [Домен] 2. Свойства пограничного слоя будут такими же, как указано в Размере 1.
    7. Создайте сетку, выбрав Построить все в разделе Сетка 1.
  4. Создание сетки 2 (только для жидкостной области с сеткой).
    1. Щелкните правой кнопкой мыши Сетка 1, выберите Импорт , чтобы создать сетку 2, и удалите Импорт 2.
    2. В разделе Импорт 1 выберите Последовательность сетки , чтобы автоматически выбрать Сетка 1. Убедитесь, что установлены флажки Построить исходную сетку автоматически, Импортировать элементы домена и Импортировать домены без сетки , а затем выберите Импорт. Все настройки, определенные в Mesh 1, будут перенесены в Mesh 2.
    3. Щелкните правой кнопкой мыши Mesh 2 и выберите Delete Entities. Для параметра «Удалить объекты 1» в разделе «Выбор геометрического объекта » выберите «Область», выберите «Вручную», в графическом окне выберите [Домен] 1 (стенка сосуда), затем выберите «Создать все », чтобы оставить только геометрию жидкости, поскольку поверхность сетки области жидкости будет находиться на границе между потоком жидкости и внутренней стенкой сосудов.
  5. Добавить проточный материал: Создайте новый материал, используя свойства крови из литературы. Щелкните правой кнопкой мыши «Материалы» и выберите «Пустой материал». Выберите Домен в выборе уровня геометрического объекта, выберите Все домены. Выберите Нетвердое для параметра Тип материала, добавьте свойства материала крови, включая вязкость и плотность.
  6. Настройка граничных условий и параметров исследования ламинарного потока.
    1. Выберите Ламинарный поток (spf), в разделе Выбор домена выберите Все домены. В списке будет только [Домен] 1. Областью 1 в данном случае является геометрия жидкости, а не стенка сосуда. Fluid Properties 1 автоматически заполняется из материала, определенного на шаге 5.
    2. Установите Начальные значения 1 давления на физиологическое артериальное давление. Задайте граничное условие для стены 1 в положение "Нескользящее".
    3. Выберите Вход 1 в графическом окне и установите граничное условие Полностью развитый поток. Убедитесь, что установлено флажок Применить условие для каждого непересекающегося выбора отдельно.
    4. В разделе Fully Developed Flow (Полностью развитый расход) выберите Flow rate ( Расход ) и введите скорость.
    5. Для выпуска 1 выберите все выпускные отверстия в графическом окне и убедитесь, что для параметра Граничное условие задано значение Давление.
    6. В разделе "Условия давления" выберите "Итого" и введите давление. Выберите «Усреднение » и «Подавить обратный поток».
  7. Подготовьте и проведите исследование.
    1. Для Шага 1: Стационарный объект в процессе исследования убедитесь, что раздел Физика и переменные соответствует предполагаемому исследованию, а компонент Выбор сетки 1 установлен как Сетка 2. Выберите Вычислить.
  8. Анализ результатов напряжения сдвига.
    1. Щелкните правой кнопкой мыши Давление (spf) и выберите Дублировать. Переименовать в Напряжение сдвига.
    2. В разделе «Напряжение сдвига» выберите «Поверхность » и измените набор данных на «Исследование 1/Решение 1 (sol1)».
    3. В разделе Выражение введите spf.sr*spf.mu , установив единицы измерения в Pa.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это означает «скорость сдвига однофазного потока * вязкость однофазного потока».
    4. Затем выберите «Печать », щелкните правой кнопкой мыши « Прозрачность 1 » и выберите «Отключить».
    5. Щелкните правой кнопкой мыши на Shear Stress и выберите Volume, чтобы изменить набор данных на Study 1/Solution 1 (sol1).
    6. В разделе Выражение введите spf.sr*spf.mu и установите единицы измерения в Pa.
    7. Выберите «График», щелкните правой кнопкой мыши «Поверхность» и выберите «Отключить» для визуального анализа «Тома 1» и определения областей интереса судна для изучения в модели OOC.

3. Подготовка пресс-форм PDMS

  1. Используя результаты моделирования жидкости, выберите геометрию для управления и пневмонэктомии, выбрав области, которые демонстрируют значительные различия в напряжении сдвига между моделями управления и пневмонэктомии, и воспроизведите их в виде отрицательных форм в CAD. Размеры моделей САПР контрольной и пневмонэктомической сосудов показаны на рисунках 3 и 4.
  2. Кроме того, спроектируйте заглушки для входа и выхода пресс-формы для предотвращения утечек во время засева ячеек.
  3. С помощью 3D-принтера напечатайте пресс-формы и заглушки с помощью нити PLA.
  4. Получите формы из полимолочной кислоты (PLA), которые были напечатаны на 3D-принтере (контроль + пневмонэктомия) (рисунок 5A).
  5. Взвесьте 10 частей основы из силиконового эластомера и 1 часть отвердителя на силиконовом эластомере, чтобы получить в общей сложности 30 мл смеси (соотношение масса/масса 10:1) для заполнения форм до толщины 3 мм (Рисунок 5B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не смешивайте исходные растворы в процессе взвешивания. Используйте отдельные материалы для взвешивания для каждого реагента.
  6. Залейте эластомерную основу и отвердитель вместе и тщательно перемешайте
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать в лодке для взвешивания.
  7. Хорошо перемешанный раствор разлить по формочкам (около 15 мл для половины формы) (рис. 5В).
  8. Дегазируйте PDMS, поместив его в вакуумную камеру на 30–60 минут или до тех пор, пока не останутся пузырьки (Рисунок 5D).
  9. Извлеките PDMS из вакуумной камеры и отверждите при комнатной температуре в течение 48 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Печь не использовалась для отверждения из-за тепловой емкости форм PLA.
  10. Извлеките PDMS из формы PLA.
  11. Обильно промойте форму PLA деионизированной водой, чтобы убедиться, что на ее поверхности не осталось примесей, чтобы ее можно было использовать снова.

figure-protocol-1
Рисунок 3: 3D CAD чертеж контрольной сосудистой сети. Размеры в мм модели контрольной сосудистой сети при виде сверху и сбоку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-protocol-2
Рисунок 4: 3D CAD рисунок сосудистой сети пневмонэктомии. Размеры модели сосудистой сети пневмонэктомии в мм при виде сверху и сбоку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-protocol-3
Рисунок 5: Создание пресс-форм PDMS. Создание пресс-форм PDMS. (A) Напечатанные на 3D-принтере формы PLA для контрольных (оранжевый) и пневмонэктомии (зеленый) экспериментов. (B) Весы для взвешивания с материалами PDMS. (C) Заливка смеси PDMS (основание 10:1 + отвердитель) в формы, напечатанные на 3D-принтере. (D) Дегазация PDMS в вакуумной камере. Создано с BioRender.com Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигурки.

4. Культивирование и посев клеток

  1. Используйте надлежащую асептическую технику в соответствии с протоколами местной лаборатории.
  2. Распылите 70% этанол и занесите все необходимые материалы и компоненты в шкаф биобезопасности (БСК) (Рисунок 6А), в том числе, кусочки PDMS и четыре куска двустороннего скотча.
  3. Поместите по два куска двустороннего скотча в каждый планшет для культивирования клеток (рисунок 6B).
  4. Поместите каждую половину сосудистой сети PDMS в отдельную чашку для клеточной культуры поверх двустороннего скотча (рис. 6C).
  5. Далее стерилизуйте все компоненты под воздействием ультрафиолетового излучения в течение 20 минут в BSC.
  6. При необходимости разморозьте трипсин, питательные среды HLMVEC и 20 мкг/мл фибронектина при 37 °C.
  7. Поместите несколько капель 30 мкл фибронектина 20 мкг/мл вдоль сосудистой сети PDMS с помощью микропипетки. Наклонив PDMS при необходимости, используйте наконечник для дозатора для равномерного покрытия PDMS (Рисунок 7A).
  8. Инкубируйте кусочки PDMS в течение 30 минут, находясь в BSC.
  9. После инкубации аспирируйте раствор фибронектина и дайте кусочкам PDMS высохнуть в BSC (рис. 7B).
  10. Принесите конфлюентную колбу с клетками HLMVEC из инкубатора (37 °C, 5%CO2) в BSC.
  11. Отсаживайте питательные среды HLMVEC из колбы для культур. Кратко смойте трипсином или стерильным PBS.
  12. Отсадите средство для промывания и добавьте в колбу 3 мл трипсина. Инкубировать при 37 °C, 5%CO2 в течение 5 минут. Понаблюдайте за клетками с помощью микроскопа, чтобы убедиться, что все клетки отделены от колбы.
  13. Добавьте 9 мл питательной среды HLMVEC, чтобы остановить действие трипсина.
  14. Перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 50 мл, затем промойте колбу 10 мл питательной среды HLMVEC для сбора оставшихся клеток.
  15. Переложите в пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте ячейки при давлении 220 x g в течение 5 мин.
  16. Когда все будет готово, визуально подтвердите наличие клеточной гранулы на дне пробирки. Опрыскайте пробирку 70% этанолом и занесите ее в шкаф биобезопасности. Аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя гранулы.
  17. Аккуратно ресуспендируйте клетки в 1 мл свежей питательной среды HLMVEC и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Рассчитайте общее количество клеток, используя уравнения ниже, где A-H — это количество клеток, подсчитанных на квадрат гемоцитометра. Держите клетки на льду.
    figure-protocol-4
  18. Доведите концентрацию клеток до 2 x 106 клеток/мл с помощью питательной среды HLMVEC.
  19. Поместите напечатанные на 3D-принтере пробки на концы каждой половины сосудистой сети, чтобы исключить утечку клеточной суспензии из формы PDMS, как показано на рисунке 5 (всего 4 пробки, по 2 на каждую деталь PDMS) (рисунок 7C).
  20. Засейте 300 мкл клеточной суспензии HLMVEC (600 k клеток) с помощью микропипетки в каждый кусочек PDMS (рис. 7D).
  21. Аккуратно перенесите кусочки PDMS, содержащие клетки HLMVEC, в инкубатор (37 °C, 5%CO2) на 1-2 часа для прикрепления (рис. 7E).
  22. Осмотрите с помощью микроскопа, чтобы визуально убедиться в успешном прикреплении HLMVEC к подложкам PDMS.
  23. Верните половинки сосудистой сети PDMS в БСК.
  24. Снимите четыре пробки, добавьте достаточное количество питательной среды HLMVEC для погружения половинок сосудистой сети PDMS и верните в инкубатор планшеты для культивирования, содержащие сосудистые фильтры PDMS (рис. 7F).
  25. Через 6-10 ч после посева вручную пипетируйте питательные среды HLMVEC, окружающие PDMS, в сосудистую сеть для обновления среды, ближайшей к клеткам.

figure-protocol-5
Рисунок 6: Крепление пресс-форм PDMS к пластинам. Основные этапы прикрепления сосудистой сети PDMS к планшетам для культивирования клеток. (А) Материалы, необходимые для размещения половинок сосудистой сети PDMS в культуральных планшетах. (В) Два куска двусторонней клейкой ленты помещаются по диагонали в каждую стерильную культуральную тарелку. (C) Половинки сосудистой сети PDMS, установленные поверх двустороннего клея. Создано с BioRender.com Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигурки.

figure-protocol-6
Иллюстрация 7: Посев HLMVEC в формы PDMS. Этапы посева HLMVEC в сосудистую сеть PDMS. (А) Заполните сосудистую сеть на 150-300 мкл 20 мкг/мл фибронектина. (B) Аспирация избытка фибронектина с помощью техники наклонного крана. (C) Закупорьте концы сосудистой половины PDMS пробками, напечатанными на 3D-принтере. (D) Засейте 500-600K клеток в среду по 300 мкл в каждую половину сосудистой сети. (E) Поместите половинки PDMS в инкубатор на 1-2 часа, чтобы облегчить прикрепление клеток. (F) Накройте половинки PDMS средой и съемными заглушками. Создано с BioRender.com Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигурки.

5. Сборка и эксплуатация проточной системы

  1. Выполняйте процедуру протока, когда клетки в половинах сосудистой сети PDMS полностью сливаются, что определяется при визуальном осмотре под микроскопом.
  2. Перед проведением эксперимента откалибруйте перистальтический насос в соответствии с протоколом производителя.
  3. Автоклавируйте все компоненты, которые можно автоклавировать, включая проточную трубку, соединительные трубки, резервуар для шприца и резиновую пробку.
  4. Погрузите акриловые блоки, винты, заглушки, 16 трубок Masterflex L/S длиной 1 дюйм и крышку чашки Петри диаметром 15 мм в 70% этанол на 15 минут и проведите УФ-обработку в течение 20 минут в BSC, перевернув наполовину.
  5. После того, как все остальное оборудование и материалы будут стерилизованы, поместите половинки сосудистой сети PDMS в BSC.
  6. Аспирируйте среду HLMVEC из чашки Петри, содержащей половинки сосудистой сети (рис. 8A, B).
  7. Поместите половинки PDMS в два поликарбонатных блока, убедившись, что они выровнены (Рисунок 8C).
  8. Нанесите силиконовый герметик на концы сосудистой сети, где трубка будет прикреплена к половинкам PDMS, и поместите трубку длиной в дюйм в два конца нижней сосудистой сети (Рисунок 8D).
  9. Переверните верхний акриловый блок (содержащий верхнюю половину сосудистой сети PDMS) на нижний акриловый блок (содержащий нижнюю половину сосудистой сети PDMS) (рисунок 8E).
  10. Закрепите акриловые блоки болтами вместе с резьбовым блоком на дне и заткните свободные концы трубок длиной в дюйм заглушками, напечатанными на 3D-принтере (Рисунок 8F).
  11. Извлеките одну пробку и осторожно введите 500 мкл питательной среды HLMVEC в сосудистую сеть, наклоняя ее, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха, затем установите пробку на место.
  12. Поместите весь собранный чип в инкубатор, чтобы силикон затвердел в течение 1-2 часов.
  13. Поместите собранный чип и все остальные стерильные материалы в BSC и соедините все для настройки системы потока в соответствии с рисунком 9. Убедитесь, что трубка, проходящая через перистальтический насос к входному отверстию сосудистой системы, прикреплена к дну резервуара шприца. Это позволит силе тяжести питать трубки и уменьшить количество пузырьков воздуха в системе.
  14. Аккуратно загрунтуйте проточную систему фильтрующим материалом HLMVEC. С помощью серологической пипетки объемом 50 мл введите 30 мл среды в верхнюю часть резервуара шприца (рис. 10B). Запустите перистальтический насос с низкой скоростью потока, чтобы заполнить трубку. Продолжайте добавлять фильтрующий материал в резервуар до тех пор, пока система не будет полностью заполнена и все пузырьки не будут удалены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки воздуха могут сдвигать ячейки во время эксперимента с потоком.
  15. Прикрепите трубку к входному отверстию резервуара (от выходного отверстия сосудистой плесени) с помощью фитинга, прикрепленного к резиновой пробке, расположенной в верхней части резервуара (рис. 10C).
  16. Отсоедините проточную систему от перистальтического насоса и установите ее на металлическую кастрюлю. Аккуратно транспортируйте всю установку из BSC в инкубатор (37 °C, 5%CO2). Подайте трубку в перистальтический насос через заднюю часть инкубатора.
  17. Снова прикрепите перистальтический насос и установите желаемую скорость потока, чтобы имитировать скорость кровотока через сосудистую модель.
  18. Запустите насос и убедитесь в отсутствии утечек. Дайте системе поработать в течение 24 часов или желаемого времени. Периодически проверяйте наличие утечек.

figure-protocol-7
Рисунок 8: Построение проточного чипа. Построение проточной микросхемы. (А) Аспиративная среда из клеточной культуральной пластины. (B) PDMS уменьшается вдвое после того, как среда была аспирирована. (C) Удалите половинки PDMS с пластины с помощью других материалов, необходимых для изготовления чипа (пробка, шприцевой фильтр, части трубки 1/2 дюйма, силиконовый герметик, 10 винтов и акриловые блоки). (D) Поместите половинки PDMS в акриловые блоки и нанесите силиконовый герметик на места, отмеченные красным цветом. (E) Поместите трубку в соответствующие вырезы. (F) Подсоедините половинки проточной камеры и прикрепите пробку и фильтр шприца. Создано с BioRender.com Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигурки.

figure-protocol-8
Рисунок 9: Настройка системы расхода. Настройка системы расхода. Вся система потока состоит из трубок, соединителей трубок, перистальтического насоса, резервуара для шприцев, опорной стойки и проточного чипа. Создано с BioRender.com Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигурки.

figure-protocol-9
Рисунок 10: Грунтовка проточной системы. Грунтовка проточной системы фильтрующим материалом. (A) Простая настройка проточной системы без использования среды. (B) Резиновая пробка удаляется из резервуара шприца, и среда непрерывно добавляется до тех пор, пока трубка не заполнится и в резервуаре не останется 20-30 мл избыточной среды. (C) Проточная система с фильтрующим материалом HLMVEC. Создано с BioRender.com Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигурки.

6. Фиксация и окрашивание

  1. Промойте каждую половинку сосудистой сети PDMS в PBS в течение 5 минут. Добавьте достаточно, чтобы погрузить весь сосудистый участок.
  2. Отсасывайте PBS из сосудистой сети, наклоняя пластину и позволяя PBS стечь, затем вакуумируйте сток вверх.
  3. Добавьте 600 мкл 4% параформальдегида (PFA) в PBS в каждую сосудистую половину и инкубируйте при комнатной температуре (RT) в течение 20 минут.
  4. Отасуньте раствор PFA в подходящий контейнер для отходов, используя метод, описанный на шаге 2.
  5. Промойте неподвижные ячейки 3 раза в PBS в течение 5 минут каждая, используя процедуру, описанную в шаге 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбросьте каждую из этих промывок в подходящий контейнер для отходов для формальдегида.
  6. Закупорьте концы половинок сосудистой сети PDMS чистыми заглушками, напечатанными на 3D-принтере.
  7. Приготовьте 3% бычий сывороточный альбумин (БСА) в PBS для блокирования.
  8. Заполните половинки сосудов 600 мкл блокирующего раствора и инкубируйте в течение 30 мин при РТ.
  9. Снимите пробки и аспираторный блокирующий раствор.
  10. Приготовьте 1:200 разведение лектина агглютинина зародышей пшеницы (WGA) с конъюгированным биотином (первичным антителом) в 3% растворе BSA для окрашивания GCX9.
  11. Верните пробки, чтобы закупорить концы сосудистой сети, и добавьте 500 мкл раствора первичного антитела в каждую сосудистую половину.
  12. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 1 ч.
  13. Осторожно аспирируйте первичное антитело, следуя ранее использованной методике.
  14. Промыть 3 раза PBS по 5 мин.
  15. Приготовьте 1:500 разведение конъюгата стрептавидина (вторичного антитела) WGA в 3% растворе БСА.
  16. Верните пробки, чтобы закупорить концы сосудистой сети и добавьте 500 мкл раствора вторичного антитела в каждую сосудистую половину.
  17. Повторите шаги 6.12-6.14.
  18. Добавьте монтажную среду DAPI на поверхность сосуда, дозируя капли по 30 мкл с интервалами, чтобы полностью заполнить сосудистую систему.
  19. Наденьте на PDMS стеклянные покровные стекла, чтобы закрыть сосудистые каналы.
  20. Заклейте края покровного стекла прозрачным лаком для ногтей.
  21. Накройте тарелки оловянной фольгой и храните при температуре 4 °C до нанесения изображения.

7. Визуализация

  1. Включите микроскоп и откройте приложение для просмотра на подключенном компьютере.
  2. Откройте микроскоп и увеличьте свет. Прикрепите подходящую платформу для образцов (универсальный держатель чашки Петри).
  3. Поместите образец на держатель чашки в микроскопе так, чтобы интересующая область была центрирована над объективом.
  4. Уменьшите огонь и закройте крышку микроскопа.
  5. В программном обеспечении микроскопа выберите параметр «Захват неподвижного изображения ».
  6. Выбирайте тип экземпляра, используйте универсальный.
  7. Выберите подходящий объектив в разделе объективов для лучшей визуализации.
  8. В программном обеспечении микроскопа отрегулируйте положение объектива в соответствии с областью интереса (ROI).
  9. Выберите автофокус, и ячейки должны примерно оказаться в фокусе.
  10. Вручную отрегулируйте фокус, чтобы полностью прояснить изображение.
  11. Отрегулируйте яркость и экспозицию, чтобы визуализировать клетки более четко.
  12. Включите многоцветность и цвет в программном обеспечении.
  13. В настройках CH включите CH1 Floor DAPI и CH2 Floor GFP.
  14. Отрегулируйте яркость каждого канала отдельно, чтобы четко визуализировать изображения.
  15. Выберите Z-Stack в программном обеспечении микроскопа.
  16. Настройте фокус на самую высокую плоскость изображения и выберите «Установить», чтобы установить верхний предел
  17. Установите фокус на самую нижнюю плоскость изображения и выберите «Установить», чтобы установить нижний предел
  18. Выберите желаемую толщину среза и нажмите «Начать захват », чтобы сделать снимок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти изображения также будут выведены в программное обеспечение для анализа микроскопа для дальнейшей модификации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Результаты исследования стационарного состояния ламинарного потока жидкости показали увеличение напряжения сдвига в некоторых бифуркациях в моделях пневмонэктомии по сравнению с контрольной моделью, показанной на рисунке 11. На шаге 2.8 протокола красными областями обозначены области с высоким напряжением сдвига, а синими — области с низким напряжением сдвига.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Сосудистое моделирование является важной новой областью для исследований. Успешное создание точной сосудистой модели имеет большие перспективы для развития тканевой инженерии и разработки лекарств. В этой статье описывается новый метод создания сосудистой системы OOC, который может быть использован для имитации пневмонэктомии или любой другой сосудистой системы или геометрии для изучения потенциальной связи между нарушением GCX и осложнениями после пневмонэктомии. В более широком масштаб...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Авторы выражают глубочайшую благодарность кафедре биомедицинской инженерии Вустерского политехнического института за поддержку и руководство. Мы хотели бы выразить особую благодарность Меган Уэллетт, Джону Мартелу и Судишу Венгату за их совместные усилия и инновационные идеи, которые значительно повысили качество и жизнеспособность этого исследования. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить Саманту Коккьяро и Удая Раттана за их вклад в работу лаборатории и их существенную поддержку и помощь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
#8-32 x 3/4 дюйма Комбинированный оцинкованный машинный винт с круглой головкой (8 шт.)Эвербилт204274613-
0,25% ЭДТА-трипсинThermoFisher Scientific25200056 -
Конические стерильные полипропиленовые центрифужные пробирки объемом 15 млТермо Сайентиал12-565-269-
Тарелка 35x10 мм, Nunclon DeltaТермо Сайентиал153066-
Конические стерильные полипропиленовые центрифужные пробирки объемом 50 млТермо Сайентиал12-565-271-
Ассорти резиновых пробокФишербранд14-132
Колбы, обработанные клеточными культурами BioLite (25 см^2)Термо Сайентиал12-556-009-
Колбы, обработанные клеточными культурами BioLite (75 см^2)Термо Сайентиал12-556-010-
COMSOL MultiphysicsКОМСОЛЬН/Д-
Двусторонний клей 3 МИН.16758005-
Epredia Richard-Allan Научное защитное стекло Термо Сайентиал22-050-218-
Фетальная бычья сывороткаThermoFisher Scientific A5256701 -
ФибронектинThermoFisher Scientific 33016015 20 μ Разведение г/мл
Водяные бани Fisherbrand Isotemp с цифровым управлением: модель 210Фишербранд15-462-10К-
Стерильный шприц Fisherbrand (60 мл)Фишербранд14-955-461-
Микрососудистые эндотелиальные клетки легких человекаСигма Олдрич540-05А -
Флуоресцентный микроскоп Keyence BZX810КейенсН/Д-
Krayden Dow Sylgard 184 Силиконовый эластометр Комплект. Прозрачный, (1,1 ФУНТА)Индекс Доу4019862-
Marga Cipta литой акриловый лист толщиной 1/2 дюйма, 48x96'Марга ЧиптаН/Д-
Насосная головка Masterflex L/S Easy-Load IIТехнология МастерФлекс77200-50
трубки для прецизионных насосов Masterflex L/S, силикон платинового отверждения, L/S 16; 25 футовТехнология МастерФлекс96410-16-
Стандартный перистальтический насос Masterflex L/SМастерфлекс07522-20
Микропипетки от 0,2 до 2 мкм; LФишербрандFBE00002-
Микропипетка от 10 до 100 мкм; LФишербрандFBE00100-
Микропипетки от 100 до 1000 LФишербрандFBE01000-
Микропипетки от 5 до 50 мкм; LФишербрандFBE00050-
Среда для роста микрососудистых эндотелиальных клеток (500 мл)Сигма - Олдрич111-500-
Стерильные шприцевые фильтры NalgeneТермо Сайентиал725-2520-
Флуоресцентный микроскоп Nikon Eclipse TS-100Компания NikonНИ-ТС100
Фосфатно-солевой буфер (DPBS, 10X), формула ДульбеккоТермо СайентиалДж61917. К3-
Prusament PLA Prusa Galaxy Black 1кгПрусаPRM-PLA-GLX-1000-
Гибридный микроскоп Rebel, вертикальный и перевернутый, Discover EchoЭХО76376-746-
Силиконовый герметик Локтит908570-
SolidWorksDassault SystèmesН/Д
Стерильные полистирольные одноразовые серологические пипетки с увеличительной полосой (10 мл)Фишербранд13-678-11Э-
Стерильные полистирольные одноразовые серологические пипетки с увеличительной полосой (25 мл)Фишербранд13-678-11-
Стерильные полистирольные одноразовые серологические пипетки с увеличительной полосой (50 мл)Фишербранд13-678-11Ф-
Стерильные полистирольные одноразовые серологические пипетки с увеличительной полосой (5 мл)Фишербранд13-678-11Д-
Стрептавидин, конъюгат Alexa Fluor 488Инвитроген С32354
Стрептавидин, конъюгат Alexa Fluor 488ИнвитрогенС32354-
Шприц resevoir БД300865
Thermo Scientific Alfa Aesar 1LT Альбумин, бычий, фракция V, 35% раствор, реагент, без жирных кислот, с азидом в качестве консервантаТермо СайентиалN12H004-
Соединители для трубокФишербранд01-000-161-
VECTASHIELD Монтажная среда с защитой от выцветания с DAPI ВектащитН-1200-10-
Инкубатор VWR с водяной рубашкой CO2Авантар 10810-744 -
Биотинилированные антитела WGAВекторВ-1025-

Ссылки

  1. Sharma, S., Beshara, M., Bora, V. Pneumonectomy. , StatPearls Publishing LLC. (2024).
  2. Grapatsas, K., et al. Pneumonectomy for primary lung tumors and pulmonary metastases: a comprehensive study of postoperative morbidity, early mortality, and preoperative clinical prognostic factors. Curr. Oncol. 30 (11), 9458-9474 (2023).
  3. Lucas, G. F. N., James, M. I., David, R. J., Victor, E. L. Chapter 24. Topics in thoracic surgery. Guerreiro Cardoso, P. F. , IntechOpen. (2012).
  4. Sentenac, P., et al. Pulmonary hypertension after pneumonectomy: a preclinical model in rats and human pulmonary endothelial cells. Eur. J. Cardiothorac. Surg. 59 (1), 147-154 (2020).
  5. Russo, T. A., Banuth, A. M. M., Nader, H. B., Dreyfuss, J. L. Altered shear stress on endothelial cells leads to remodeling of extracellular matrix and induction of angiogenesis. PLoS One. 15 (11), e0241040(2020).
  6. Milusev, A., Rieben, R., Sorvillo, N. The endothelial glycocalyx: a possible therapeutic target in cardiovascular disorders. Front. Cardiovasc. Med. 9, e897087(2022).
  7. Vittum, Z., Cocchiaro, S., Mensah, S. A. Basal endothelial glycocalyx's response to shear stress: a review of structure, function, and clinical implications. Front. Cell Dev. Biol. 12, e1371769(2024).
  8. Villalba, N., Baby, S., Yuan, S. Y. The endothelial glycocalyx as a double-edged sword in microvascular homeostasis and pathogenesis. Front. Cell Dev. Biol. 9, e711003(2021).
  9. Harding, I. C., et al. Endothelial barrier reinforcement relies on flow-regulated glycocalyx, a potential therapeutic target. Biorheology. 56 (2-3), 131-149 (2019).
  10. Alphonsus, C. S., Rodseth, R. N. The endothelial glycocalyx: a review of the vascular barrier. Anaesthesia. 69 (7), 777-784 (2014).
  11. Möckl, L. The emerging role of the mammalian glycocalyx in functional membrane organization and immune system regulation. Front. Cell Dev. Biol. 8, e00253(2020).
  12. Nian, K., Harding, I. C., Herman, I. M., Ebong, E. E. Blood-brain barrier damage in ischemic stroke and its regulation by endothelial mechanotransduction. Front. Physiol. 11, 605398(2020).
  13. Dietz, N. M. Pathophysiology of postpneumonectomy pulmonary edema. Semin. Cardiothorac. Vasc. Anesth. 4 (1), 31-35 (2000).
  14. Bozlar, U., et al. Pulmonary artery diameters measured by multidetector-row computed tomography in healthy adults. Acta Radiol. 48 (10), 1086-1091 (2007).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Kataoka, H., et al. Fluorescent imaging of endothelial glycocalyx layer with wheat germ agglutinin using intravital microscopy. Microsc. Res. Tech. 79, 31-37 (2016).
  17. Wood, K. M., Stone, G. M., Peppas, N. A. Wheat germ agglutinin functionalized complexation hydrogels for oral insulin delivery. Biomacromolecules. 9 (4), 1293-1298 (2008).
  18. Tarnowski, B. I., Spinale, F. G., Nicholson, J. H. DAPI as a useful stain for nuclear quantitation. Biotech. Histochem. 66 (6), 297-302 (1991).
  19. Emde, B., Heinen, A., Gödecke, A., Bottermann, K. Wheat germ agglutinin staining as a suitable method for detection and quantification of fibrosis in cardiac tissue after myocardial infarction. Eur. J. Histochem. 58 (4), 2448(2014).
  20. Hu, Z., Cano, I., D'Amore, P. A. Update on the role of the endothelial glycocalyx in angiogenesis and vascular inflammation. Front. Cell Dev. Biol. 9, e734276(2021).
  21. Choi, J., Lee, E. J., Jang, W. B., Kwon, S. M. Development of biocompatible 3D-printed artificial blood vessels through multidimensional approaches. J. Funct. Biomater. 14 (10), e14100497(2023).
  22. Fallon, M. E., Mathews, R., Hinds, M. T. In vitro flow chamber design for the study of endothelial cell (patho)physiology. J. Biomech. Eng. 144 (2), e4051765(2021).
  23. Basehore, S., Garcia, J., Clyne, A. M. The science, etiology and mechanobiology of diabetes and its complications. Gefen, A. , Acad. Press. 291-312 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HLMVEC

Похожие статьи