Для изучения реакций возбудимых клеток in vitro в протоколе описан оптический мониторинг изменений генерации потенциала действия за счет электропорации на простой возбудимой клеточной модели генетически модифицированных спайковых HEK-клеток, а также изменения трансмембранного напряжения с автоматическим выделением соответствующих параметров.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Мониторинг индуцированных электропорацией изменений в генерации потенциала действия в генетически модифицированных ячейках HEK с Tet-on
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Возбудимые клетки, такие как нейронные и мышечные клетки, могут быть основными мишенями в быстро развивающихся методах лечения, основанных на электропорации. Тем не менее, на них могут влиять электрические импульсы даже при терапии, где они не являются основными целями, и это может вызвать неблагоприятные побочные эффекты. Таким образом, для оптимизации методов лечения возбудимых и невозбудимых тканей на основе электропорации необходимо изучить влияние электрических импульсов на возбудимые клетки, их ионные каналы и возбудимость in vitro. С этой целью был разработан протокол оптического мониторинга изменений в генерации потенциала действия за счет электропорации на простой модели возбудимой клетки генетически модифицированных спайковых клеток HEK. С помощью флуоресцентного потенциометрического красителя изменения трансмембранного напряжения контролировались под флуоресцентным микроскопом, а соответствующие параметры клеточных реакций извлекались автоматически с помощью приложения MATLAB. Таким образом, можно эффективно оценить реакцию возбудимых клеток на различные электрические импульсы и взаимодействие между возбуждением и электропорацией.
Введение
При электропорации высоковольтные электрические импульсы вызывают увеличение проницаемости плазматической мембраны для молекул, которые в противном случае плохо воспринимаются1. Методы, основанные на электропорации, в настоящее время широко используются в медицине2, биотехнологии3 и пищевых технологиях4.
Возбудимые клетки, такие как нейронные и мышечные клетки, являются одними из основных мишеней в быстро развивающихся методах лечения сердца, мозга и скелетных мышц, основанных на электропорации5. Более того, на них могут воздействовать электрические импульсы даже при терапии, где они не являются основными целями, и это может вызвать неблагоприятные побочные эффекты, такие как боль, мышечные подергиванияи повреждение нервов. В частности, электрические импульсы могут вызывать электрическую стимуляцию возбудимых клеток: они активируют потенциал-зависимые ионные каналы и запускают потенциалы действия (ТД). Однако при более высоких электрических полях плазматическая мембрана клеток становится проникающей,и дополнительный ионный ток через поры/дефекты происходит 7. Этот дополнительный ионный ток влияет на возбудимость клетки в сложном взаимодействии между возбуждением и электропорацией. Таким образом, для оптимизации методов лечения возбудимых и невозбудимых тканей на основе электропорации необходимо изучить влияние электрических импульсов на возбудимые клетки, их ионные каналы и возбудимость in vitro.
В недавнем исследовании8 мы изучили генетически модифицированные клетки эмбриональной почки человека (HEK), разработанные Cohen et al.9,10, в качестве ценного инструмента для изучения электропорации в возбудимых клетках. В этих в противном случае невозбудимых клетках экспрессируется минимальный набор натриевых и калиевых каналов (NaV1,5 и Kir2,1), необходимых для возбудимости. Экспрессия Kir2.1 в этих клетках контролируется индуцированной доксициклином системой tet-on, которая позволяет создать два варианта клеток: возбудимые спайковые S-HEK (содержащие NaV1,5 и Kir2,1) и невозбудимые неспайковые NS-HEK клетки (содержащие только NaV1,5 каналов). Это позволяет сравнить воздействие электрических импульсов на возбудимые и невозбудимые варианты клеток одного типа. По сравнению с изолированными первичными возбудимыми клетками, возбудимыми клетками, дифференцированными из эмбриональных или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, и клеточными линиями, полученными из возбудимых тканей, клетки S-HEK имеют ряд преимуществ: они просты в обращении, культивируются и размножаются, имеют четко определенные натриевые и калиевые каналы и генерируют устойчивые АД.
Разработан протокол мониторинга изменений трансмембранного напряжения (ТМВ), вызванных электрическими импульсами различной амплитуды с использованием флуоресцентного потенциометрического красителя. Таким образом, мы можем изучить, как электропорация влияет на выработку AP в клетках S-HEK и другие изменения в TMV в клетках S-HEK и NS-HEK. Вкратце, ячейки S-HEK или NS-HEK подвергаются воздействию одного электрического импульса длительностью 100 мкс каждые 2 минуты, а относительные изменения флуоресценции регистрируются в течение примерно 3 секунд вокруг каждого импульса. Подаваемые импульсы имеют возрастающее напряжение, сначала запуская АД в ячейках, а при более высоком электрическом поле — электропорацию. Интервал в 2 минуты между подачей импульсов был выбран таким образом, чтобы свести к минимуму возможные кумулятивные эффекты последовательных импульсов, сохраняя при этом достаточно короткие эксперименты, чтобы не повредить клетки. Обработка изображений была автоматизирована с помощью специального приложения MATLAB для извлечения соответствующих параметров флуоресцентных откликов потенциометрического красителя с последующей оценкой изменений TMV (APs и устойчивой деполяризации из-за электропорации) в клетках S-HEK и NS-HEK.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка реагентов и клеточной культуры
- Приготовьте питательную среду для клеточных культур, добавив модифицированную глюкозу Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамина, пенициллин-стрептомицина (пенициллин 100 ЕД/мл, стрептомицин 100 мкг/мл), 2 мкг/мл пуромицина, 5 мкг/мл бластицидина и 200 мкг/мл генетина.
- Готовят фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) с 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4 и 1,8 мМ KH2PO4, pH 7,4. Отфильтруйте его через стерилизующий мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм.
- Приготовьте раствор Тайроде с 2 мМ KCl, 125 мМ NaCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 10 мМ HEPES, 30 мМ глюкозой, pH 7,3. Приготовьте раствор Tyrode с низким содержанием калия с 0,5 мМ KCl, 126,5 мМ NaCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 10 мМ HEPES, 30 мМ глюкозы, pH 7,3. Оба раствора отфильтровать через стерилизующий мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм.
- Приготовьте стоковый раствор поли-L-лизина объемом 1 мг/мл, добавив 5 мл PBS во флакон, содержащий 5 мг поли-L-лизина.
- Приготовьте стоковый раствор доксициклина 2 мг/мл в дистиллированной воде и отфильтруйте его через стерилизующий мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм.
- Приготовьте 4 мМ потенциометрического раствора стокового красителя ElectroFluor630 в чистом этаноле (добавьте 25 мкл чистого этанола в пробирку, содержащую 100 нМ - 73 мкг красителя).
- Культура генетически модифицированных HEK клеток в колбе Т25 в 6 мл среды для культивирования клеток, как описано ранее8. Ингредиенты питательной среды светочувствительны; Таким образом, держите среду защищенной от света (оберните колбу со средой в алюминиевую фольгу) и выполняйте пассирование в условиях низкой освещенности.
- Пропускайте ячейки каждые 3-4 дня путем посева 3 x 105 или 5 x 105 клеток в свежую колбу T25. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Поддерживайте клетки в мастер-колбе как невозбудимые клетки NS-HEK без добавления доксициклина, поскольку они не переносят устойчивую экспрессию Kir2.1. В экспериментах используйте клетки из проходов ниже 14.
2. Подготовка образцов
- Поли-L-лизиновое покрытие предметных стекол камерных стекол
- Пипеткой нанесите 1 мл PBS в одну лунку из 2-луночной стеклянной камеры с крышкой, добавьте 10 мкл стерильного раствора поли-L-лизина 1 мг/мл и хорошо перемешайте пипеткой.
- Инкубировать в течение 1,5 ч при комнатной температуре в стерильных условиях в колпаке с ламинарным потоком. Удалите PBS с поли-L-лизином без дополнительной промывки.
- Затравка клеток
- Приготовьте разведение стокового раствора доксициклина в соотношении 1:10 в питательной среде в пробирке объемом 1,5 мл. Для каждой лунки необходимо 30 мкл разведения доксициклина 1:10 (3 мкл стокового раствора доксициклина и 27 мкл питательной среды), окончательный объем готовят в зависимости от общего количества опытных лунок.
- Извлеките питательную среду из колбы Т25 и трипсинизируйте клетки 2,5 мл раствора Трипсин-ЭДТА в инкубаторе сСО2 при 37 °С в течение 2 мин.
- Добавьте 2,5 мл свежей питательной среды и с помощью аккуратного пипетирования отделите клетки от поверхности. Хорошо перемешайте клеточную суспензию.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и определите плотность клеток в суспензии.
- Рассчитайте объем трипсинизированной клеточной суспензии, необходимый для формирования культуры. Для 2-дневной культуры высевают 2,5 х 105 клеток, а для 3-дневной культуры высевают 1 х 105 клеток в лунку. При необходимости отрегулируйте точное количество ячеек.
- Рассчитайте объем питательной среды путем вычитания ранее рассчитанного объема клеточной суспензии из 1470 μл. Оставшиеся 30 мкл представляют собой объем разведения доксициклина в соотношении 1:10. Общий объем в каждой лунке составит 1500 мкл (клетки, доксициклин и питательная среда).
- Для получения образцов с возбудимыми клетками S-HEK пипеткой пипетируют рассчитанный объем питательной среды и трипсинизированной клеточной суспензии в одну лунку и добавляют 30 мкл разведения доксициклина 1:10. Используйте только одну лунку из двух луночных камер, так как эксперимент занимает много времени (около 40 минут). Хорошо перемешайте с помощью аккуратного пипетирования непосредственно перед помещением камер в инкубатор CO2 .
- Для получения образцов с невозбудимыми клетками NS-HEK пипеткой пипетируют расчетный объем питательной среды в лунку и добавляют 90% от расчетного объема клеточной суспензии для клеток S-HEK без доксициклина. Клетки NS-HEK растут немного быстрее, чем клетки S-HEK.
- Инкубируйте камеры в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 при температуре 37 °C в течение 2-3 дней до начала эксперимента. Для образцов с доксициклином этого времени инкубации достаточно, чтобы сделать клетки возбудимыми.
- Маркировка ячеек
- Перед экспериментом пипетку пипетку 3 мкл стокового раствора потенциометрического красителя в пробирку объемом 1,5 мл и оставьте открытую пробирку при комнатной температуре в ламинарном проточном колпаке, чтобы этанол испарился, а потенциометрический краситель высох (примерно 15 мин). Добавьте в пробирку 997 мкл среды для холодных культур (из холодильника при 4 °C) и растворите краситель до конечной концентрации 12 μM.
- Извлеките питательную среду из лунки и добавьте в клетки 1 мл раствора потенциометрического красителя. Охладите их при температуре 4 °C и выдерживайте в течение 20 минут.
- Извлеките потенциометрический раствор красителя и сохраните его в пробирке для дальнейшего повторного использования (до шести последовательных экспериментов за 1 день).
- Аккуратно промойте ячейки 3 раза раствором Tyrode, а после последнего промывки нанесите пипеткой 1 мл раствора Tyrode с низким содержанием калия в лунку.
3. Электростимуляция и электропорация
- Настройте синхронизацию доставки импульсов с получением изображения с помощью TTL-сигнала от микроскопа, который запускает генератор импульсов. Для генерации высоковольтных импульсов используйте пользовательский генератор импульсов11 или любой генератор импульсов, который может быть срабатываем извне с помощью сигнала TTL.
ПРИМЕЧАНИЕ: В представленной экспериментальной конфигурации для получения изображений используется программное обеспечение LAS X, которое может быть сконфигурировано для отправки сигнала TTL в заранее выбранное время во время съемки с интервальной съемкой. - Поместите два параллельных электрода из Pt/Ir проволоки диаметром 0,8 мм и расстоянием между внутренними краями 5 мм на дно камеры и зафиксируйте камеру под микроскопом.
- Подключите электроды к генератору импульсов. Подключите выход генератора импульсов к осциллографу с помощью пробника напряжения и тока, чтобы можно было проверить, правильно ли подавались импульсы во время эксперимента.
- Сфокусируйте ячейки в светлом поле. Представьте себе ячейки, расположенные примерно посередине между электродами.
- Начните первую съемку флуоресцентных изображений в режиме покадровой съемки с 40-кратным объективом, регистрируя сигнал флуоресценции во всем поле зрения. Камера должна быть достаточно быстрой, чтобы получить четкий временной ход потенциала действия (в идеале выше 25 кадров/с).
- Получите 80 изображений в режиме покадровой съемки с частотой не менее 25 кадров в секунду, чтобы определить ход действия в реальном времени. Общая продолжительность получения изображения составляет около 3 с. Во время получения изображения освещайте клетки с длиной волны возбуждения 635 нм, временем экспозиции 10 мс и обнаруживайте излучение на длине волны около 700 нм. При этом первом сборе не применяйте никаких импульсов - этот сбор будет использоваться для коррекции последующих сборов для фотообесцвечивания красителя. После этого приобретения подождите 2 минуты.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте используется скорость 27,8 кадр/с, т.е. период 36 мс, который представляет собой время от начала получения первого изображения до начала следующего получения изображения в интервальной съемке.
- Получите 80 изображений в режиме покадровой съемки с частотой не менее 25 кадров в секунду, чтобы определить ход действия в реальном времени. Общая продолжительность получения изображения составляет около 3 с. Во время получения изображения освещайте клетки с длиной волны возбуждения 635 нм, временем экспозиции 10 мс и обнаруживайте излучение на длине волны около 700 нм. При этом первом сборе не применяйте никаких импульсов - этот сбор будет использоваться для коррекции последующих сборов для фотообесцвечивания красителя. После этого приобретения подождите 2 минуты.
- Каждые 2 минуты записывайте таймлапс таким же образом, как в шаге 3.5. Для получения этих данных подайте один импульс длительностью 100 мкс во время получения 10-го изображения (с длительностью 324 мс). Получение изображений со следующими импульсными напряжениями: 63 В, 75 В, 88 В, 100 В, 125 В, 150 В, 175 В и 200 В. Оценка электрического поля, воздействию которого подвергаются элементы, как отношение приложенного напряжения к электродному расстоянию (E = 126, 150, 176, 200, 250, 300, 350 и 400 В/см).
ПРИМЕЧАНИЕ: При более низких электрических полях импульсы будут запускать потенциалы действия; При более высоких электрических полях они вызывают электропорацию, которая проявляется в виде длительной деполяризации. Продолжительность эксперимента на каждом образце клеток составляет примерно 40 мин (20 мин для мечения и 20 мин для микроскопии).
4. Анализ данных
- Экспортируйте цейтраферные записи в формат tiff.
- Поместите покадровые записи всех приложенных напряжений во время отдельного эксперимента (один образец ячеек) в одну папку. Переименуйте покадровые записи таким образом, чтобы приложение MATLAB могло распознать электрическое поле Е: Vcm (например, 126 В см для 126 В/см). Остальные части названия могут быть произвольными. Для получения данных в начале эксперимента, когда импульс не подается, переименуйте, используя фразу 000Vcm. Пример названий для цейтраферной записи: 2022_1_20 1DOX 000Vcm, 2022_1_20 1DOX 126Vcm, 2022_1_20 1DOX 150Vcm и т.д.
- Откройте приложение, которое можно скачать по ссылке
https://github.com/bor-kos/fluorescenceActionPotential. Нажмите «Выбрать папку данных », чтобы выбрать папку, содержащую покадровые записи одного эксперимента. - Выберите пиксели, которые будут использоваться для дальнейшего анализа данных. Для этого с помощью двух ползунков определите нижний порог для четкого изображения мембран (фиолетовым цветом) и высокий порог для исключения мусора (больших пятен с высокой флуоресценцией) из анализа (зеленым цветом).
- Выберите «Анализ данных». На вкладке Анализ появляется таблица с извлеченными параметрами. В правой части таблицы приведены графики относительной флуоресценции во времени для каждого используемого E. Выберите графики для заданного E в раскрывающемся меню слева над таблицей.
- Изучите все графики и выполните ручную коррекцию в случае обнаружения ложных пиков. Выберите Очистить АВТОПИКИ в нижней части вкладки Анализ, и пики, которые были обнаружены автоматически, будут удалены. Нажмите на график , чтобы вручную определить новую точку пикового времени.
- Выберите «Повторить AUTO Peak Detection » в нижней части вкладки «Анализ», чтобы снова выполнить автоматическое обнаружение пиков. Извлеченные параметры теперь будут скорректированы в соответствии с новым пиком.
- Выберите «Экспорт данных » в правом нижнем углу на вкладке «Анализ», чтобы экспортировать данные в ту же папку в виде файла .mat, файла электронной таблицы и изображений PNG для каждого используемого E.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Изменения TMV в возбудимых клетках in vitro , вызванные электрическими импульсами, могут быть оптически отслежены с помощью этого протокола, а флуоресцентные сигналы могут быть проанализированы для извлечения их соответствующих параметров.
Экспериментальная установка показана на рисунке 1А. Типичный сигнал в 100 мкс электрического импульса, используемый в экспериментах, показан на рисунке 1В. Клетки в камерах, которые помещаю...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
S-HEK клетки представляют собой простую модель возбудимых клеток с четко определенными натриевыми и калиевыми каналами, NaV1,5 и Kir2,19. Это позволяет проводить глубокие исследования реакции возбудимых клеток на приложенные электрические импульсы и связывать экспериментальные данные с математическими моделями, основанными на известных теоретических характеристиках каналов, выраженных в ячейках S-HEK. В нашем предыдущем исследовании
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана Словенским агентством исследований и инноваций (ARIS) в рамках исследовательской программы P2-0249, инфраструктурной программы I0-0022 и исследовательского проекта J2-2503. Работа была частично поддержана ARIS и Университетом Любляны путем финансирования исследовательских программ для стартапов. Работа была частично поддержана Европейским Союзом и ARIS через финансирование NextGenerationEU и NOO в рамках проекта MN-0023. Работа была частично поддержана Европейским Союзом через стартовый грант ERC (No 101115323 - РЕИНКАРНАЦИЯ) и стипендию Марии Склодовской-Кюри (No 893077 - EPmIC). Тем не менее, выраженные взгляды и мнения принадлежат только автору (авторам) и не обязательно отражают точку зрения Европейского Союза или Европейского исследовательского совета. Ни Европейский Союз, ни орган, предоставляющий грант, не могут нести за них ответственность. Авторы благодарят группу Адама Э. Коэна из Гарвардского университета за любезно предоставленные HEK-клетки и Душу Ходжич за ее помощь в лаборатории клеточных культур.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1,5 мл тубы | Ratiolab | 5615000 | |
| 2-луночный Nunc Lab-Tek II Chambered #1.5 Немецкая система защитного стекла | Thermo Fisher Scientific | ||
| ADP305 Дифференциальный пробник | Teledyne LeCroy | ||
| AP015 Пробник тока | Teledyne LeCroy | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher Scientific | ||
| CO2-инкубатор | PHCbi | MCO -230AICUV | |
| Доксициклин | Sigma-Aldrich/Merck | D9891 | |
| Dulbecco' s Модифицированный орел s Среда для роста со средним содержанием глюкозы | Sigma-Aldrich/Merck | D5671 | |
| ElectroFluor630 (Di-4-ANEQ(F)PTEA) | потенциометрические зонды | 31795 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Sigma-Aldrich/Merck | F2442 | |
| Geneticin | Thermo Fisher Scientific | ||
| Глутамин | Sigma-Aldrich/Merck | G7513 | |
| Ламинарный проточный капюшон | Iskra Pio | MC 15-2 | |
| MATLAB | Математические работы | ||
| Пенициллин– стрептомицин | Sigma-Aldrich/Merck | P07681 | |
| Poly-L-лизина гидробромид | Сигма-Олдрич/Мерк | P9155-5MG | |
| Генератор импульсов | Изготовлено | см. артикул11 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | ||
| T25 25см² Колба для культуры тканей | TPP | 90026 | |
| Tet-on спайковые клетки HEK | Американская коллекция типовых культур ATCC | CRL-3479 | |
| Thunder Imager Живая клеточная система для флуоресцентной микроскопии | Leica Microsystems | ||
| Трипсин-ЭДТА решение | Sigma-Aldrich/Merck | T3924 | |
| WavePro 7300A Осциллограф | Teledyne LeCroy |
Ссылки
- Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavčič, D. Membrane electroporation and electropermeabilization: Mechanisms and models. Ann Rev Biophys. 48 (1), 63-91 (2019).
- Yarmush, M. L., Golberg, A., Serša, G., Kotnik, T., Miklavčič, D. Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Ann Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).
- Kotnik, T., et al. Electroporation-based applications in biotechnology. Trend Biotechnol. 33 (8), 480-488 (2015).
- Mahnič-Kalamiza, S., Vorobiev, E., Miklavčič, D. Electroporation in food processing and biorefinery. J Memb Biol. 247 (12), 1279-1304 (2014).
- Reddy, V. Y., et al. Pulsed field or conventional thermal ablation for paroxysmal atrial fibrillation. New Engl J Med. 389 (18), 1660-1671 (2023).
- Cvetkoska, A., Maček-Lebar, A., Trdina, P., Miklavčič, D., Reberšek, M. Muscle contractions and pain sensation accompanying high-frequency electroporation pulses. Sci Rep. 12 (1), 8019(2022).
- Tung, L., Tovar, O., Neunlist, M., Jain, S. K., O'neill, R. J. Effects of strong electrical shock on cardiac muscle tissue. Ann New York Acad Sci. 720 (1), 160-175 (1994).
- Batista Napotnik, T., et al. Genetically engineered HEK cells as a valuable tool for studying electroporation in excitable cells. Sci Rep. 14 (1), 720(2024).
- McNamara, H. M., Zhang, H., Werley, C. A., Cohen, A. E. Optically controlled oscillators in an engineered bioelectric tissue. Phys Rev X. 6 (3), 031001(2016).
- Tian, H., et al. Video-based pooled screening yields improved far-red genetically encoded voltage indicators. Nat Methods. 20 (7), 1082-1094 (2023).
- Sweeney, D. C., et al. Quantification of cell membrane permeability induced by monopolar and high-frequency bipolar bursts of electrical pulses. Biochim Biophys Acta Biomembranes. 1858 (11), 2689-2698 (2016).
- Pakhomov, A. G., et al. Long-lasting plasma membrane permeabilization in mammalian cells by nanosecond pulsed electric field (nsPEF). Bioelectromagnetics. 28 (8), 655-663 (2007).
- Lee, P., et al. In vivo ratiometric optical mapping enables high-resolution cardiac electrophysiology in pig models. Cardiovasc Res. 115 (11), 1659-1671 (2019).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
