Мониторинг индуцированных электропорацией изменений в генерации потенциала действия в генетически модифицированных ячейках HEK с Tet-on

Summary

Для изучения реакций возбудимых клеток in vitro в протоколе описан оптический мониторинг изменений генерации потенциала действия за счет электропорации на простой возбудимой клеточной модели генетически модифицированных спайковых HEK-клеток, а также изменения трансмембранного напряжения с автоматическим выделением соответствующих параметров.

Abstract

Возбудимые клетки, такие как нейронные и мышечные клетки, могут быть основными мишенями в быстро развивающихся методах лечения, основанных на электропорации. Тем не менее, на них могут влиять электрические импульсы даже при терапии, где они не являются основными целями, и это может вызвать неблагоприятные побочные эффекты. Таким образом, для оптимизации методов лечения возбудимых и невозбудимых тканей на основе электропорации необходимо изучить влияние электрических импульсов на возбудимые клетки, их ионные каналы и возбудимость in vitro. С этой целью был разработан протокол оптического мониторинга изменений в генерации потенциала действия за счет электропорации на простой модели возбудимой клетки генетически модифицированных спайковых клеток HEK. С помощью флуоресцентного потенциометрического красителя изменения трансмембранного напряжения контролировались под флуоресцентным микроскопом, а соответствующие параметры клеточных реакций извлекались автоматически с помощью приложения MATLAB. Таким образом, можно эффективно оценить реакцию возбудимых клеток на различные электрические импульсы и взаимодействие между возбуждением и электропорацией.

Introduction

При электропорации высоковольтные электрические импульсы вызывают увеличение проницаемости плазматической мембраны для молекул, которые в противном случае плохо воспринимаются¹. Методы, основанные на электропорации, в настоящее время широко используются в медицине², биотехнологии³ и пищевых технологиях⁴.

Возбудимые клетки, такие как нейронные и мышечные клетки, являются одними из основных мишеней в быстро развивающихся методах лечения сердца, мозга и скелетных мышц, основанных на электропорации⁵. Более того, на них могут воздействовать электрические импульсы даже при терапии, где они не являются основными целями, и это может вызвать неблагоприятные побочные эффекты, такие как боль, мышечные подергивания^{и повреждение} нервов. В частности, электрические импульсы могут вызывать электрическую стимуляцию возбудимых клеток: они активируют потенциал-зависимые ионные каналы и запускают потенциалы действия (ТД). Однако при более высоких электрических полях плазматическая мембрана клеток становится проникающей,^{и дополнительный} ионный ток через поры/дефекты происходит 7. Этот дополнительный ионный ток влияет на возбудимость клетки в сложном взаимодействии между возбуждением и электропорацией. Таким образом, для оптимизации методов лечения возбудимых и невозбудимых тканей на основе электропорации необходимо изучить влияние электрических импульсов на возбудимые клетки, их ионные каналы и возбудимость in vitro.

В недавнем исследовании⁸ мы изучили генетически модифицированные клетки эмбриональной почки человека (HEK), разработанные Cohen et al.9,10, в качестве ценного инструмента для изучения электропорации в возбудимых клетках. В этих в противном случае невозбудимых клетках экспрессируется минимальный набор натриевых и калиевых каналов (Na_V1,5 и K_ir2,1), необходимых для возбудимости. Экспрессия K_ir2.1 в этих клетках контролируется индуцированной доксициклином системой tet-on, которая позволяет создать два варианта клеток: возбудимые спайковые S-HEK (содержащие Na_V1,5 и K_ir2,1) и невозбудимые неспайковые NS-HEK клетки (содержащие только Na_V1,5 каналов). Это позволяет сравнить воздействие электрических импульсов на возбудимые и невозбудимые варианты клеток одного типа. По сравнению с изолированными первичными возбудимыми клетками, возбудимыми клетками, дифференцированными из эмбриональных или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, и клеточными линиями, полученными из возбудимых тканей, клетки S-HEK имеют ряд преимуществ: они просты в обращении, культивируются и размножаются, имеют четко определенные натриевые и калиевые каналы и генерируют устойчивые АД.

Разработан протокол мониторинга изменений трансмембранного напряжения (ТМВ), вызванных электрическими импульсами различной амплитуды с использованием флуоресцентного потенциометрического красителя. Таким образом, мы можем изучить, как электропорация влияет на выработку AP в клетках S-HEK и другие изменения в TMV в клетках S-HEK и NS-HEK. Вкратце, ячейки S-HEK или NS-HEK подвергаются воздействию одного электрического импульса длительностью 100 мкс каждые 2 минуты, а относительные изменения флуоресценции регистрируются в течение примерно 3 секунд вокруг каждого импульса. Подаваемые импульсы имеют возрастающее напряжение, сначала запуская АД в ячейках, а при более высоком электрическом поле — электропорацию. Интервал в 2 минуты между подачей импульсов был выбран таким образом, чтобы свести к минимуму возможные кумулятивные эффекты последовательных импульсов, сохраняя при этом достаточно короткие эксперименты, чтобы не повредить клетки. Обработка изображений была автоматизирована с помощью специального приложения MATLAB для извлечения соответствующих параметров флуоресцентных откликов потенциометрического красителя с последующей оценкой изменений TMV (APs и устойчивой деполяризации из-за электропорации) в клетках S-HEK и NS-HEK.

Protocol

1. Подготовка реагентов и клеточной культуры

1. Приготовьте питательную среду для клеточных культур, добавив модифицированную глюкозу Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамина, пенициллин-стрептомицина (пенициллин 100 ЕД/мл, стрептомицин 100 мкг/мл), 2 мкг/мл пуромицина, 5 мкг/мл бластицидина и 200 мкг/мл генетина.
2. Готовят фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) с 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na₂HPO₄ и 1,8 мМ KH₂PO₄, pH 7,4. Отфильтруйте его через стерилизующий мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм.
3. Приготовьте раствор Тайроде с 2 мМ KCl, 125 мМ NaCl, 2 мМ CaCl₂, 1 мМ MgCl₂, 10 мМ HEPES, 30 мМ глюкозой, pH 7,3. Приготовьте раствор Tyrode с низким содержанием калия с 0,5 мМ KCl, 126,5 мМ NaCl, 2 мМ CaCl₂, 1 мМ MgCl₂, 10 мМ HEPES, 30 мМ глюкозы, pH 7,3. Оба раствора отфильтровать через стерилизующий мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм.
4. Приготовьте стоковый раствор поли-L-лизина объемом 1 мг/мл, добавив 5 мл PBS во флакон, содержащий 5 мг поли-L-лизина.
5. Приготовьте стоковый раствор доксициклина 2 мг/мл в дистиллированной воде и отфильтруйте его через стерилизующий мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм.
6. Приготовьте 4 мМ потенциометрического раствора стокового красителя ElectroFluor630 в чистом этаноле (добавьте 25 мкл чистого этанола в пробирку, содержащую 100 нМ - 73 мкг красителя).
7. Культура генетически модифицированных HEK клеток в колбе Т25 в 6 мл среды для культивирования клеток, как описано ранее⁸. Ингредиенты питательной среды светочувствительны; Таким образом, держите среду защищенной от света (оберните колбу со средой в алюминиевую фольгу) и выполняйте пассирование в условиях низкой освещенности.
8. Пропускайте ячейки каждые 3-4 дня путем посева 3 x 10⁵ или 5 x 10⁵ клеток в свежую колбу T25. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Поддерживайте клетки в мастер-колбе как невозбудимые клетки NS-HEK без добавления доксициклина, поскольку они не переносят устойчивую экспрессию K_ir2.1. В экспериментах используйте клетки из проходов ниже 14.

2. Подготовка образцов

1. Поли-L-лизиновое покрытие предметных стекол камерных стекол
   1. Пипеткой нанесите 1 мл PBS в одну лунку из 2-луночной стеклянной камеры с крышкой, добавьте 10 мкл стерильного раствора поли-L-лизина 1 мг/мл и хорошо перемешайте пипеткой.
   2. Инкубировать в течение 1,5 ч при комнатной температуре в стерильных условиях в колпаке с ламинарным потоком. Удалите PBS с поли-L-лизином без дополнительной промывки.
2. Затравка клеток
   1. Приготовьте разведение стокового раствора доксициклина в соотношении 1:10 в питательной среде в пробирке объемом 1,5 мл. Для каждой лунки необходимо 30 мкл разведения доксициклина 1:10 (3 мкл стокового раствора доксициклина и 27 мкл питательной среды), окончательный объем готовят в зависимости от общего количества опытных лунок.
   2. Извлеките питательную среду из колбы Т25 и трипсинизируйте клетки 2,5 мл раствора Трипсин-ЭДТА в инкубаторе с_СО2 при 37 °С в течение 2 мин.
   3. Добавьте 2,5 мл свежей питательной среды и с помощью аккуратного пипетирования отделите клетки от поверхности. Хорошо перемешайте клеточную суспензию.
   4. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и определите плотность клеток в суспензии.
   5. Рассчитайте объем трипсинизированной клеточной суспензии, необходимый для формирования культуры. Для 2-дневной культуры высевают 2,5 х 10⁵ клеток, а для 3-дневной культуры высевают 1 х 10⁵ клеток в лунку. При необходимости отрегулируйте точное количество ячеек.
   6. Рассчитайте объем питательной среды путем вычитания ранее рассчитанного объема клеточной суспензии из 1470 μл. Оставшиеся 30 мкл представляют собой объем разведения доксициклина в соотношении 1:10. Общий объем в каждой лунке составит 1500 мкл (клетки, доксициклин и питательная среда).
   7. Для получения образцов с возбудимыми клетками S-HEK пипеткой пипетируют рассчитанный объем питательной среды и трипсинизированной клеточной суспензии в одну лунку и добавляют 30 мкл разведения доксициклина 1:10. Используйте только одну лунку из двух луночных камер, так как эксперимент занимает много времени (около 40 минут). Хорошо перемешайте с помощью аккуратного пипетирования непосредственно перед помещением камер в инкубатор CO₂ .
   8. Для получения образцов с невозбудимыми клетками NS-HEK пипеткой пипетируют расчетный объем питательной среды в лунку и добавляют 90% от расчетного объема клеточной суспензии для клеток S-HEK без доксициклина. Клетки NS-HEK растут немного быстрее, чем клетки S-HEK.
   9. Инкубируйте камеры в инкубаторе с 5% содержанием_CO2 при температуре 37 °C в течение 2-3 дней до начала эксперимента. Для образцов с доксициклином этого времени инкубации достаточно, чтобы сделать клетки возбудимыми.
3. Маркировка ячеек
   1. Перед экспериментом пипетку пипетку 3 мкл стокового раствора потенциометрического красителя в пробирку объемом 1,5 мл и оставьте открытую пробирку при комнатной температуре в ламинарном проточном колпаке, чтобы этанол испарился, а потенциометрический краситель высох (примерно 15 мин). Добавьте в пробирку 997 мкл среды для холодных культур (из холодильника при 4 °C) и растворите краситель до конечной концентрации 12 μM.
   2. Извлеките питательную среду из лунки и добавьте в клетки 1 мл раствора потенциометрического красителя. Охладите их при температуре 4 °C и выдерживайте в течение 20 минут.
   3. Извлеките потенциометрический раствор красителя и сохраните его в пробирке для дальнейшего повторного использования (до шести последовательных экспериментов за 1 день).
   4. Аккуратно промойте ячейки 3 раза раствором Tyrode, а после последнего промывки нанесите пипеткой 1 мл раствора Tyrode с низким содержанием калия в лунку.

3. Электростимуляция и электропорация

1. Настройте синхронизацию доставки импульсов с получением изображения с помощью TTL-сигнала от микроскопа, который запускает генератор импульсов. Для генерации высоковольтных импульсов используйте пользовательский генератор импульсов¹¹ или любой генератор импульсов, который может быть срабатываем извне с помощью сигнала TTL.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В представленной экспериментальной конфигурации для получения изображений используется программное обеспечение LAS X, которое может быть сконфигурировано для отправки сигнала TTL в заранее выбранное время во время съемки с интервальной съемкой.
2. Поместите два параллельных электрода из Pt/Ir проволоки диаметром 0,8 мм и расстоянием между внутренними краями 5 мм на дно камеры и зафиксируйте камеру под микроскопом.
3. Подключите электроды к генератору импульсов. Подключите выход генератора импульсов к осциллографу с помощью пробника напряжения и тока, чтобы можно было проверить, правильно ли подавались импульсы во время эксперимента.
4. Сфокусируйте ячейки в светлом поле. Представьте себе ячейки, расположенные примерно посередине между электродами.
5. Начните первую съемку флуоресцентных изображений в режиме покадровой съемки с 40-кратным объективом, регистрируя сигнал флуоресценции во всем поле зрения. Камера должна быть достаточно быстрой, чтобы получить четкий временной ход потенциала действия (в идеале выше 25 кадров/с).
   1. Получите 80 изображений в режиме покадровой съемки с частотой не менее 25 кадров в секунду, чтобы определить ход действия в реальном времени. Общая продолжительность получения изображения составляет около 3 с. Во время получения изображения освещайте клетки с длиной волны возбуждения 635 нм, временем экспозиции 10 мс и обнаруживайте излучение на длине волны около 700 нм. При этом первом сборе не применяйте никаких импульсов - этот сбор будет использоваться для коррекции последующих сборов для фотообесцвечивания красителя. После этого приобретения подождите 2 минуты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте используется скорость 27,8 кадр/с, т.е. период 36 мс, который представляет собой время от начала получения первого изображения до начала следующего получения изображения в интервальной съемке.
6. Каждые 2 минуты записывайте таймлапс таким же образом, как в шаге 3.5. Для получения этих данных подайте один импульс длительностью 100 мкс во время получения 10-го изображения (с длительностью 324 мс). Получение изображений со следующими импульсными напряжениями: 63 В, 75 В, 88 В, 100 В, 125 В, 150 В, 175 В и 200 В. Оценка электрического поля, воздействию которого подвергаются элементы, как отношение приложенного напряжения к электродному расстоянию (E = 126, 150, 176, 200, 250, 300, 350 и 400 В/см).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При более низких электрических полях импульсы будут запускать потенциалы действия; При более высоких электрических полях они вызывают электропорацию, которая проявляется в виде длительной деполяризации. Продолжительность эксперимента на каждом образце клеток составляет примерно 40 мин (20 мин для мечения и 20 мин для микроскопии).

4. Анализ данных

1. Экспортируйте цейтраферные записи в формат tiff.
2. Поместите покадровые записи всех приложенных напряжений во время отдельного эксперимента (один образец ячеек) в одну папку. Переименуйте покадровые записи таким образом, чтобы приложение MATLAB могло распознать электрическое поле Е: Vcm (например, 126 В см для 126 В/см). Остальные части названия могут быть произвольными. Для получения данных в начале эксперимента, когда импульс не подается, переименуйте, используя фразу 000Vcm. Пример названий для цейтраферной записи: 2022_1_20 1DOX 000Vcm, 2022_1_20 1DOX 126Vcm, 2022_1_20 1DOX 150Vcm и т.д.
3. Откройте приложение, которое можно скачать по ссылке
   https://github.com/bor-kos/fluorescenceActionPotential. Нажмите «Выбрать папку данных », чтобы выбрать папку, содержащую покадровые записи одного эксперимента.
4. Выберите пиксели, которые будут использоваться для дальнейшего анализа данных. Для этого с помощью двух ползунков определите нижний порог для четкого изображения мембран (фиолетовым цветом) и высокий порог для исключения мусора (больших пятен с высокой флуоресценцией) из анализа (зеленым цветом).
5. Выберите «Анализ данных». На вкладке Анализ появляется таблица с извлеченными параметрами. В правой части таблицы приведены графики относительной флуоресценции во времени для каждого используемого E. Выберите графики для заданного E в раскрывающемся меню слева над таблицей.
6. Изучите все графики и выполните ручную коррекцию в случае обнаружения ложных пиков. Выберите Очистить АВТОПИКИ в нижней части вкладки Анализ, и пики, которые были обнаружены автоматически, будут удалены. Нажмите на график , чтобы вручную определить новую точку пикового времени.
7. Выберите «Повторить AUTO Peak Detection » в нижней части вкладки «Анализ», чтобы снова выполнить автоматическое обнаружение пиков. Извлеченные параметры теперь будут скорректированы в соответствии с новым пиком.
8. Выберите «Экспорт данных » в правом нижнем углу на вкладке «Анализ», чтобы экспортировать данные в ту же папку в виде файла .mat, файла электронной таблицы и изображений PNG для каждого используемого E.

Results

Изменения TMV в возбудимых клетках in vitro , вызванные электрическими импульсами, могут быть оптически отслежены с помощью этого протокола, а флуоресцентные сигналы могут быть проанализированы для извлечения их соответствующих параметров.

Экспериментальная установка показана на рисунке 1А. Типичный сигнал в 100 мкс электрического импульса, используемый в экспериментах, показан на рисунке 1В. Клетки в камерах, которые помещаются под микроскоп, обычно выглядят как клетки на рисунке 1C (светлопольное изображение) и рисунке 1D (флуоресцентное изображение). Мы проводим эксперимент, в котором каждые 2 минуты на те же ячейки подается электрический импульс с возрастающим напряжением. Обратите внимание, что время между импульсами в 2 минуты может быть недостаточно большим, чтобы обеспечить полное повторное герметизацию и восстановление клеточных мембран, особенно при использовании импульсов с наибольшей амплитудой, которые связаны с выраженной электропорацией. Таким образом, можно ожидать некоторого кумулятивного эффекта импульсов. Чтобы избежать этих кумулятивных эффектов, межимпульсную задержку можно продлить, но за счет уменьшения количества исследуемых амплитуд импульсов и избегания слишком долгого пребывания клеток на микроскопе.

После получения флуоресцентных изображений в экспериментах проанализируйте их с помощью специального приложения MATLAB. Во-первых, определите пороговые значения пикселей (рис. 2A); Регулируя нижний порог, мы получаем четкое изображение мембран вокруг клеток (фиолетовым цветом), а регулируя высокий порог, мы убираем сигнал мусора (зеленым). Затем приложение определяет среднюю интенсивность флуоресценции всех пороговых пикселей для каждого подаваемого последовательного импульса для получения зависящего от времени сигнала относительного изменения флуоресценции F/F0. Этот сигнал корректируется на фотообесцвечивание красителя путем вычитания наклона линейного уменьшения F, определенного из контрольной цейтраферной записи, в которой импульс не подавался (рис. 2B). После коррекции сигнала извлекаются параметры откликов в виде таблицы в приложении и графика скорректированного сигнала флуоресценции (рисунок 2C). В редких случаях алгоритм не обнаруживает очевидный пик или обнаруживает ложные шумовые сигналы как ложные срабатывания. В этих случаях у пользователя есть возможность вручную выбрать соответствующую точку в сигнале флуоресценции в качестве пика или удалить обнаруженный ложный пик (Рисунок 2D-удаление небольшого пика, который был аномально обнаружен до подачи электрического импульса).

Используя приложение MATLAB, мы можем получить изображения реакции TMV на электрические импульсы как в возбудимых клетках S-HEK (рис. 3A), так и в невозбудимых клетках NS-HEK (рис. 3B). Извлекаются следующие параметры отклика (Таблица 1): количество пиков (NoPeaks), среднее время от пика до пика (при обнаружении более одного пика, MPPT), максимальный отклик (MR), время до первого пика (TtFP) и время от пика до 25%, 50%, 75% и 90% восстановления (T25, T50, T75, T90 соответственно). Эти параметры позволяют оценить реакцию на различные электрические импульсы (например, определить количество пиков, вызванных электрическими импульсами разного E, рис. 3C) и взаимодействие между возбуждением и электропорацией.

Рисунок 1: Установка, форма сигнала и ячейки S-HEK. (A) Изображение камеры на предметном столике микроскопа. (B) Пример формы сигнала импульса, используемого в исследовании (напряжение (U) во времени). (С, Г) Изображение ячеек S-HEK ((C): светлое поле, (D): флуоресценция), масштабная линейка: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Приложение для анализа данных. (А) Изображение интерфейса приложения - пороговое значение. (В) График исходного и скорректированного сигнала изменения флуоресценции. (В) Изображение интерфейса приложения - извлеченные данные. (D) Ручная коррекция обнаружения пиков (удаление небольшого пика, который был аномально обнаружен до подачи электрического импульса, отмеченного красной стрелкой). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Репрезентативные результаты. (A, B) Инициирование изменений TMV в (A) возбудимом S-HEK и (B) невозбудимом NS-HEK с помощью электрических импульсов с длительностью 100 мкс различной амплитуды, результаты репрезентативных экспериментов. Для наглядности отображаются только отклики на выбранные импульсы в примененной последовательности импульсов. (C) Параметры откликов TMV, вызываемых импульсами с частотой 100 мкс различной амплитуды: в примере показано количество пиков. Результаты выражены в виде среднего ± SE, количество экспериментов: N = 13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Индекс	Е-сила (В/см)	Без пиков (-)	МППТ (мс)	МИСТЕР (-)	ТтФП (мс)	Т25 (мс)	Т50 (мс)	Т75 (мс)	Т90 (мс)
1	0
2	126	9	224	0.104	360	72	108	144	180
3	150	6	354	0.097	108	72	108	144	180
4	176	2	144	0.089	36	72	108	144	180
5	200	1		0.075	0	108	144	180	252
6	250	2	396	0.064	0	108	216	432	2052
7	300	1		0.059	0	180	1188	2448
8	350	1		0.053	0	1008	2340
9	400	1		0.047	0	1512

Таблица 1: Параметры откликов TMV, вызванных импульсами с длительностью 100 мкс различной амплитуды.

Discussion

S-HEK клетки представляют собой простую модель возбудимых клеток с четко определенными натриевыми и калиевыми каналами, Na_V1,5 и K_ir2,1⁹. Это позволяет проводить глубокие исследования реакции возбудимых клеток на приложенные электрические импульсы и связывать экспериментальные данные с математическими моделями, основанными на известных теоретических характеристиках каналов, выраженных в ячейках S-HEK. В нашем предыдущем исследовании⁸ мы описали реакцию этих клеток на 100 мкс импульсы увеличения E как экспериментально, так и теоретически. При более низком Е клетки S-HEK реагируют с одиночным или множественным потенциалом действия, тогда как при более высоком Е AP становятся удлиненными и трансформируются в устойчивую деполяризацию. Поскольку устойчивая деполяризация хорошо видна и в невозбудимой версии этих элементов (NS-HEK), она объясняется электропорацией и связанным с ней увеличением неселективного ионного тока.

Использование флуоресцентного потенциометрического красителя оказалось очень эффективным способом изучения АФ и электропорации в возбудимых клетках. По сравнению с классическими электрофизиологическими методами, такими как патч-зажим, оптические измерения намного удобнее, эффективнее по времени и не требуют специальных технических навыков. Более того, использование высоковольтных электрических импульсов не мешает измерениям, что может стать проблемой при измерениях с помощью патч-клещей¹². Однако основные недостатки этого протокола связаны с природой красителя. Из-за его фотообесцвечивания захваченный сигнал флуоресценции нуждается в коррекции. Краситель спонтанно диффундирует в клетку, поэтому сигнал от мембран со временем уменьшается. По этой причине краситель пригоден для мониторинга потенциалов действия и других кратковременных изменений в TMV (~3 с в этих экспериментах). Поскольку краситель позволяет получать ратиометрическую визуализацию¹³, такая визуализация могла бы избежать некоторых проблем с диффузией красителя, но за счет более низкой достижимой скорости визуализации. В этой экспериментальной конфигурации ратиометрическая визуализация была бы слишком медленной для правильного захвата формы потенциалов действия. Кроме того, измеренные изменения флуоресценции красителя дают качественную информацию об изменении TMV; Тем не менее, краситель может быть откалиброван для проведения количественных измерений.

Автоматизированный анализ изображений с помощью специального приложения MATLAB позволяет нам анализировать большой объем данных и эффективно извлекать ценные характеристики ответов TMV за короткий период времени. Приложение настроено на захват сигнала флуоресценции от мембран всех клеток в поле зрения. Это улучшает соотношение сигнал/шум, но за счет потери информации о том, как TMV изменяется на уровне отдельных клеток. В данной экспериментальной конфигурации сигнал от отдельных ячеек был слишком зашумленным, чтобы можно было провести полезные измерения. Кроме того, мембраны соседних клеток было трудно различить. Тем не менее, ячейки HEK эндогенно экспрессируют щелевые переходы, через которые они электрически соединены. Математическое моделирование, представленное в предыдущем исследовании⁸, показало, что благодаря своим электрическим связям ячейки в поле зрения находятся достаточно близко, чтобы одновременно запускать AP. Кроме того, AP распространяется вдоль монослоя ячейки с высокой скоростью (примерно 34 мм/с, оценено на основе изображений с 5-кратным увеличением объектива)^8,9. Учитывая длину боковой стороны поля зрения (~0,33 мм), точка доступа преодолела бы эту длину примерно за 10 мс, что меньше, чем наш период получения изображений. Таким образом, эффект распространения AP не может быть замечен при таком увеличении и скорости записи. Тем не менее, распространение AP от электродов в поле зрения может вызвать задержку между поданным импульсом и захваченным AP⁸.

В предыдущем исследовании⁸, а также в данной публикации описано влияние импульсов длительностью 100 мкс на взаимодействие между возбудимостью и электропорацией. Однако этот протокол может быть адаптирован для исследования электрических импульсов с другими параметрами (другой продолжительности, напряжения, количества, частоты повторения или формы) или другими возбудимыми ячейками.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 мл тубы	Ratiolab	5615000
2-луночный Nunc Lab-Tek II Chambered #1.5 Немецкая система защитного стекла	Thermo Fisher Scientific
ADP305 Дифференциальный пробник	Teledyne LeCroy
AP015 Пробник тока	Teledyne LeCroy
Blasticidin	Thermo Fisher Scientific
CO2-инкубатор	PHCbi	MCO -230AICUV
Доксициклин	Sigma-Aldrich/Merck	D9891
Dulbecco' s Модифицированный орел s Среда для роста со средним содержанием глюкозы	Sigma-Aldrich/Merck	D5671
ElectroFluor630 (Di-4-ANEQ(F)PTEA)	потенциометрические зонды	31795
Фетальная бычья сыворотка	Sigma-Aldrich/Merck	F2442
Geneticin	Thermo Fisher Scientific
Глутамин	Sigma-Aldrich/Merck	G7513
Ламинарный проточный капюшон	Iskra Pio	MC 15-2
MATLAB	Математические работы
Пенициллин– стрептомицин	Sigma-Aldrich/Merck	P07681
Poly-L-лизина гидробромид	Сигма-Олдрич/Мерк	P9155-5MG
Генератор импульсов	Изготовлено		см. артикул11
Puromycin	Thermo Fisher Scientific
T25 25см² Колба для культуры тканей	TPP	90026
Tet-on спайковые клетки HEK	Американская коллекция типовых культур ATCC	CRL-3479
Thunder Imager Живая клеточная система для флуоресцентной микроскопии	Leica Microsystems
Трипсин-ЭДТА решение	Sigma-Aldrich/Merck	T3924
WavePro 7300A Осциллограф	Teledyne LeCroy