Пространственно-временной контроль активности белка через оптогенетическую аллостерическую регуляцию

Краткое содержание

Этот протокол описывает применение сконструированного домена аллостерического переключателя (LightR), активируемого синим светом, для обратимого пространственно-временного контроля активности белка. Используя тирозинкиназу Src в качестве модели, это исследование предлагает тщательно разработанный протокол для разработки и определения характеристик светорегулируемой Src (LightR-Src). Это демонстрирует универсальность этого подхода для всех классов ферментов.

Аннотация

Оптогенетика предлагает возможности для имитации сложного пространственно-временного контроля активности ферментов вплоть до субклеточного разрешения. Тем не менее, большинство оптогенетических подходов часто сталкиваются со значительными проблемами при интеграции нескольких возможностей в одном инструменте, применимом к широкому спектру белков-мишеней. Достижение точного контроля кинетики ВКЛ/ВЫКЛ, обеспечение минимальной утечки в темноте и демонстрация эффективной работы в клетках млекопитающих с субклеточной точностью являются одними из наиболее распространенных проблем, с которыми сталкиваются в этой области. Многообещающее решение заключается в применении рационально спроектированных светочувствительных доменов для аллостерического контроля активности белков. Используя эту стратегию, мы создали оптогенетический метод, сочетающий в себе все желаемые особенности. Подход включает в себя включение модуля светорегулируемого аллостерического переключателя (LightR) в целевой белок для регуляции активности фермента с помощью синего (465 нм) света. Домен LightR генерируется путем связывания двух фоторецепторных доменов Vivid (VVD), создавая светочувствительный зажим, который может быть встроен в небольшую гибкую петлю в каталитическом домене фермента. В темном состоянии зажим LightR разомкнут, тем самым искажая каталитический домен фермента и инактивируя его. Под воздействием синего света домен LightR замыкается и восстанавливает структуру каталитического домена и активность фермента. В этой рукописи мы обсуждаем стратегии проектирования для генерации регулируемой светом протеинкиназы и демонстрируем контроль над ней с помощью синего света, обратимость, кинетику и точную регуляцию на субклеточном уровне, что обеспечивает высокую пространственно-временную точность. Используя тирозинкиназу Src в качестве модели, мы демонстрируем протокол для эффективной регуляции активности киназы LightR-Src. Мы также демонстрируем применимость LightR к различным классам ферментов, расширяя полезность системы инструментов для решения механистических вопросов сигнальных путей при различных заболеваниях.

Введение

Способность клетки интерпретировать внешние сигналы и преобразовывать их в специфические реакции в физиологическом или патологическом контексте управляется специальными группами белков. Вклад любого белка в такие сложные реакции часто определяется его субклеточным расположением, уровнем экспрессии и временем транзиторной, устойчивой или колебательной активации. Анализ роли этих отдельных параметров в регуляции передачи сигналов требует методов, способных воспроизвести сложное пространственно-временное управление активностью белка на субклеточном уровне. Традиционные методы, такие как генетические манипуляции и низкомолекулярные ингибиторы, не справляются с этой задачей. В противоположность этому, оптогенетические методы обещают потенциал для препарирования биологических процессов путем манипулирования или имитации физиологических и патологических процессов. Тем не менее, современные инструменты часто не имеют широкой применимости или субклеточного контроля. Несколько существующих стратегий обеспечивают жесткую регуляцию локализации и взаимодействия белков; но отсутствует прямой контроль над ферментативной активностью 1,2,3,4. Другие обеспечивают регуляцию ферментативной активности, но могут не иметь субклеточного контроля или иметь ограниченную применимость к различным классам ферментов 5,6,7,8,9. В этом протокольном документе мы описываем новый метод белковой инженерии, который сочетает в себе преимущества оптогенетики в одном инструменте: жесткая временная регуляция, настраиваемая кинетика, субклеточный контроль и широкая^{применимость} ферментов. Мы сконструировали светорегулируемый (LightR) домен, который функционирует как аллостерический переключатель при вставке в целевой белок. Эта стратегия обеспечивает строгий пространственно-временной контроль активации и деактивации белка, представляющего интерес в живых клетках.

Здесь обсуждается разработка и стратегия применения оптогенетического инструмента LightR в нескольких классах ферментов. В этом исследовании предлагается пошаговый протокол для разработки, определения характеристик и применения светорегулируемой тирозинкиназы Src (LightR-Src). Исследование также демонстрирует возможность перестройки кинетики инактивации переключателя LightR. Медленно инактивирующий переключатель LightR может поддерживать активность ферментов с уменьшенной частотой освещения, в то время как версия с быстрым циклом, FastLightR, требует более частого включения для активации, но показывает быструю инактивацию при выключенном освещении. Активация/инактивация FastLightR-Src в живых клетках индуцирует циклы клеточного распространения и ретракции. Индуцированное FastLightR-Src распространение клеток согласуется с физиологической ролью Src-киназы^11,12. Благодаря быстрой кинетике инактивации, FastLightR-Src также может регулироваться на субклеточном уровне, что приводит к стимуляции локальных выступов и поляризации клеток. Чтобы продемонстрировать применимость инструмента LightR к другим типам ферментов, мы кратко расскажем читателям об аналогичном успехе с помощью сконструированной светорегулируемой киназы bRaf (LightR-bRaf, FastLightR-bRaf) и сайт-специфичной рекомбиназы ДНК Cre (LightR-Cre). В целом, этот подход имеет потенциал для улучшения нашего понимания сложных сигнальных путей, формирующих патофизиологию различных заболеваний.

Протокол

1. Проектирование и разработка LightR ( Рисунок 1)

1. Стратегическое планирование
   Примечание: Домен LightR состоит из двух тандемно связанных фоторецепторных доменов Vivid (VVD) из Neurospora crassa^13,14,15,16. VVD гомодимеризуются в присутствии света, и такая димеризация включает в себя конформационное изменение, в результате которого N-конец одного мономера VVD находится рядом с C-концом другого мономера VVD (Рисунок 1А). Соединение двух доменов VVD с помощью гибкого компоновщика создает зажимообразный домен, который будет открыт в темноте и закрыт при освещении синим светом. Интеграция этого зажима в каталитический домен фермента обеспечивает светоопосредованную регуляцию активности. В темноте открытый зажим искажает домен, деактивируя фермент; Подсветка синим светом приводит к тому, что зажим замыкается, восстанавливая активность фермента (Рисунок 1B). Эта концепция может быть применена к ферментам из различных семейств, включая протеинкиназы и ДНК-рекомбиназы¹⁰ (Рисунок 1С).
   1. Дизайн LightR
      1. Чтобы соединить две молекулы VVD, используйте гибкий 22-аминокислотный линкер (GGS)4G(GGS)3 между каждым мономером.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Линкер обеспечивает достаточную гибкость и длину для размещения ассоциации и диссоциации мономеров VVD.
      2. Добавьте компоновщики GPGGSGG и GSGGPG к N- и C-концам домена LightR соответственно.
         Примечание: Длина и состав линкеров могут нуждаться в корректировке для конкретного белка. Более короткие компоновщики GSG и одинарные компоновщики Gly обычно используются, когда требуется более жесткое регулирование. Размер контура вставки и его близость к каталитическим остаткам также влияют на динамический диапазон регулирования. Более короткие петли с большей вероятностью обеспечат более жесткое регулирование каталитической активности, но могут привести к снижению активности после освещения. Последовательность домена LightR представлена в дополнительной таблице 1.
   2. Вставка LightR
      Примечание: Подходящий сайт вставки LightR обеспечит жесткую регуляцию функции целевого домена, не блокируя его взаимодействия и не вызывая необратимых структурных изменений, которые повлияют на его биологическую роль. Кристаллическая структура белка-мишени является идеальным ориентиром в идентификации таких областей гибкой петли для введения LightR. При необходимости может быть достаточно кристаллической структуры близкого гомолога. Некоторые общие критерии, которые следует учитывать, приведены ниже.
      1. Убедитесь, что контур вставки структурно связан с критическими каталитическими элементами фермента. Убедитесь, что выбранная петля вставки не является существующим сайтом связывания белка и что вставка LightR потенциально не нарушает какие-либо функциональные взаимодействия из-за стерических эффектов.
      2. В качестве первоначальной стратегии замените одну аминокислоту в контуре вставки при введении LightR. Нацельтесь на середину петли введения, содержащую полярную или малую аминокислоту (например, Glu, Arg, Lys, Gly), подвергшуюся воздействию растворителя и не участвующую во внутримолекулярных взаимодействиях.
         Примечание: Если замена одной аминокислоты не приводит к созданию функционального белка, оптимизация конструкции LightR потребует замены нескольких аминокислот или всей петли вставки. Оцените функциональность нескольких мест вставки для LightR в рамках заданного цикла.
      3. Убедитесь, что целевой фермент функционирует независимо от эндогенной регуляции. Этого можно достичь, используя конститутивно активную мутантную версию фермента в качестве шаблона для вставки.
         Примечание: Ферменты дикого типа также могут быть использованы для создания конструкций LightR, но это может привести к созданию И-зависимой системы, которая будет регулироваться эндогенными механизмами и светом.
      4. Положительный и отрицательный контроль жизненно важны для анализа активности фермента LightR. Используйте конститутивно активные мутанты эндогенных белков в качестве положительного контроля и каталитически неактивные мутантные версии целевого фермента LightR в качестве отрицательного контроля.
         ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе инактивирующих мутаций крайне важно убедиться, что мутация находится на достаточном расстоянии от места вставки LightR, чтобы избежать нарушения необратимости сворачивания фермента LightR. Основываясь на вышеуказанных критериях, сайт вставки LightR в киназе Src выбирается в гибкой петлевой области, которая структурно связана с высококонсервативным мотивом GXGXXG в АТФ-связывающей G-петле/богатой глицином области петли через бета-цепь. Важно отметить, что он расположен вдали от кармана связывания АТФ и области связывания субстрата^10,17 (рисунок 1C (i)).
         Примечание: Из-за структурной гомологии между киназами, сайт вставки LightR в bRaf выбирается в той же структурной петле, что и сайт вставки в Src (рис. 1C (ii)).
         Примечание: В соответствии с принципами, изложенными в разделе 1.1.2, сайт вставки LightR в рекомбиназу Cre, некиназу, выбирают в одной из гибких петель, удаленных от каталитического ядра, т.е. сайта связывания ДНК. Тем не менее, инсерционная петля по-прежнему структурно связана с критическими каталитическими остатками в ДНК-связывающем домене через α-спираль для обеспечения успешной функциональности LightR-Cre (рис. 1C (iii)). Все сайты введения с положительным и отрицательным контролем для различных ферментов, описанные в настоящем протоколе, подробно описаны в дополнительной таблице 2.
   3. Разработка FastLightR.
      Примечание: Введение мутации I85V в оба VVD в LightR обеспечивает более быструю динамику активации-инактивации, что объясняется быстрым переходом мутанта в темное состояние^18,19. Генерация FastLightR-Src и FastLightR-bRaf с быстрой кинетикой инактивации обеспечивает жесткий временной контроль активации и инактивации. Это позволяет достичь субклеточной регуляции LightR-Src в живых клетках.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Активность Cre-рекомбиназы приводит к необратимой рекомбинации ДНК; следовательно, свойства обратимости LightR неприменимы.
      Примечание: Для упрощения идентификации конструкции LightR флуоресцентный белок или любая другая подходящая метка может быть прикреплена к N- или C-концу целевого белка. В этом исследовании использовали mCherry-myc для LightR-Src, Venus для LightR-bRaf и miRFP670 для рекомбиназы LightR-Cre.
2. Стратегия клонирования
   Примечание: Подход к клонированию, в отличие от традиционных, основан на сайт-направленном мутагенезе, который не опирается на конкретные сайты рестрикции^10,20.
   1. Создание "Мегагрунтовки"
      1. Кодон-оптимизация генов LightR для обеспечения стабильной экспрессии двух тандемных последовательностей ДНК VVD грибкового происхождения в клетках млекопитающих и для максимально различения последовательностей для безошибочного клонирования с помощью ПЦР. Для выполнения оптимизации кодонов выполните шаги 1.2.1.2-1.2.1.3.
      2. Выровняйте аминокислотную последовательность VVD и выбранных линкеров рядом, чтобы создать теоретическую карту последовательностей LightR.
      3. Вставьте последовательность в любую онлайн-платформу для оптимизации кодонов, которая использует передовой алгоритм оптимизации кодонов, чтобы определить лучший вариант последовательности с минимальной сложностью. Убедитесь, что выбран целевой организм, сохранен кадр считывания и выбраны последовательности VVD для оптимизации.
      4. Получите ДНК LightR в виде специально синтезированного фрагмента (см. дополнительную таблицу 1) или из ранее опубликованной конструкции LightR¹⁰.
      5. Амплифицируйте ген LightR для получения «мегапраймера», используя ранее описанную стратегию²⁰ , описанную на рисунке 1D. Синтезировать LightR "Megaprimer" методом ПЦР в соответствии с рекомендациями производителя для конкретной ДНК-полимеразы и с использованием следующей реакционной смеси ПЦР:
         5x ДНК-полимераза, совместимый буфер: 10 мкл
         100 мкМ Форвардный мегапраймер: 0,5 мкл
         100 μM Обратный мегапраймер: 0,5 μл
         Смесь dNTP 10 нМ: 2 мкл
         ДНК-полимераза (2000 ед/мл): 1 мкл (0,02 ед/мкл)
         50 нг Матричная ДНК: 1 мкл
         Вода для ПЦР: 35 μл
         ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используется высокоточная ДНК-полимераза с горячим стартом и универсальными температурами отжига праймера.
      6. Отделите полученный мегапраймер методом электрофореза в агарозном геле. Продукт будет иметь длину примерно 1000 нуклеотидов. Вырежьте мегапраймер из агарозного геля и очистите с помощью набора для экстракции геля, следуя рекомендациям производителя или используя аналогичную методику.
   2. Вставка гена LightR с использованием сайт-направленного мутагенеза: Вставьте LightR, заменив желаемую аминокислоту или длину аминокислот. Шаблон плазмиды будет тем, куда вставляется домен LightR. Проводят реакцию ПЦР, как описано ранее²⁰ , используя следующую смесь.
      5x ДНК-полимераза, совместимый буфер: 5 μл
      10 нМ смесь dNTP: 1 μл
      ДНК-полимераза (2000 ед/мл): 1 мкл (0,02 ед/мкл)
      50 нг ДНК-мишень: 1 мкл
      Экстрагированный мегапраймер (расчетная масса): 10 мкл
      ДМСО: 2,5 мкл
      Вода для ПЦР: 2,5 мкл
      ПРИМЕЧАНИЕ: Масса мегапраймера (нг) = желаемое молярное отношение вставки/вектора x масса вектора x отношение длины вставки к вектору. Желаемое соотношение вставки/векторного моляра составляет 3/1.
   3. После завершения ПЦР-реакции добавить 1 мкл фермента DpnI (2000 ЕД/мл) для селективного расщепления только избытка и метилированной ДНК и инкубировать смесь при 37 °С в течение 1-1,5 ч. Это значительно повысит выход модифицированного конструктива.
   4. Преобразуйте 1-2 мкл ПЦР-реакции в компетентные клетки DH5α в соответствии с протоколами производителя.
   5. Планшет трансформированных бактерий на бульоне Лурии (LB)-агаровой пластине с соответствующим антибиотиком для выбора. Инкубировать в чашке при температуре 37 °C в течение ночи или при комнатной температуре (RT; 25-30 °C) в течение 72 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Планшеты LB с выращенными на них колониями можно хранить при температуре 4 °C до 1 месяца, после чего протокол можно приостановить.
   6. ПЦР с колонийным экраном
      1. Для скрининга колоний на основе ПЦР разрабатывайте праймеры, которые отжигают во вставке LightR и нацеливают ДНК на получение фрагментов размером примерно 400-700.о.
      2. Добавьте небольшое количество колонии из LB-планшета в приведенную ниже смесь для ПЦР и приступайте к термоциклированию, следуя рекомендациям производителя для конкретной ДНК-полимеразы.
         2x Taq RED Master Mix: 5 мкл
         Вода для ПЦР: 5 μл
         100 μM Прямой праймер: 0,5 μл
         100 мкМ Обратный праймер: 0,5 мкл
      3. Проверьте наличие положительных колоний с помощью электрофореза в агарозном геле.
      4. Выберите колонии, которые генерировали желаемый размер продукта ПЦР, и инокулируйте их по отдельности в 3 мл бульона LB с антибиотиком, соответствующим устойчивости к антибиотикам в плазмидном скелете. Затем инкубируйте и встряхивайте при температуре 37 °C в течение ночи.
      5. Извлеките плазмидную ДНК из жидкой культуры, следуя инструкциям производителя на наборе для очистки плазмид для экстракции плазмидной ДНК и проверьте наличие вкладыша путем секвенирования.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Праймеры для клонирования кратко изложены в Дополнительной таблице 3.

2. Нанесение покрытий на клетки и биохимический анализ активности фермента LightR (рис. 2А)

1. Для биохимического анализа LightR-киназ (LightR Src, FastLightR Src, LightR bRaf) планшет 1 x 10⁶ клеток LinXE на 3,5 см в чашке для клеточной культуры для каждой опытной группы. Смотрите дополнительную таблицу 4.
2. Инкубируйте клетки при 37 °C и 5 %_CO2 в течение 16-18 часов.
3. На следующий день проведите трансфекцию клеток с помощью выбранной конструкции ДНК с использованием подходящего реагента для трансфекции в соответствии с рекомендациями производителя (Дополнительная таблица 4).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный реагент для трансфекции будет зависеть от конструкции, вектора и типа используемых клеток. В этом исследовании использовали 2 мкг ДНК в чашке размером 3,5 см с использованием трансфекционного реагента. Для определения оптимального реагента для трансфекции необходимо провести эмпирические испытания. Поскольку трансфицированные конструкции будут экспрессировать белки, регулируемые синим светом, все последующие шаги по работе с трансфицированными клетками должны выполняться под красным светом. Перед помещением в инкубатор оберните пластины с трансфицированными клетками алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить случайное освещение.
4. Через 16-18 ч после трансфекции подвергайте клетки воздействию синего света¹⁰. Для этого поместите в инкубатор для культуры тканей панельную систему светодиодов (LED) с длиной волны волны 465 нм. Поместите перфорированную панель из плексигласа на 10 см выше лампы, чтобы получить желаемую освещенность 3 мВт/^см2 (Дополнительный файл 1). Перфорированная панель нужна для поддержания бесперебойной циркуляции воздуха в инкубаторе. Подсвечивайте ячейки на нужный период.
5. Для активации LightR-Src и LightR-bRaf используйте непрерывную подсветку. Для непрерывного освещения включайте и выключайте светодиодную панель вручную.
6. Для поддержания цикла активации/деактивации FastLightR Src используйте циклы включения/выключения, управляемые вручную или с помощью микроконтроллера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать несколько наборов программных инструментов, которые предоставляют интегрированную среду разработки (IDE) для написания и загрузки необходимого кода. Эти наборы инструментов поддерживают программирование на C/C++ и обеспечивают доступ к вводу/выводу общего назначения (GPIO), что необходимо для управления импульсным освещением. Подробное описание протоколов и кода, используемых для этих целей, описано в Дополнительном файле 1.
7. В конце соответствующих временных точек эксперимента (Дополнительная таблица 4) соберите клетки под безопасным красным светом. Отсадите среду и промойте клетки холодным PBS.
8. Чтобы выделить белок, лизируйте клетки 500 мкл 2-кратного буфера для проб Laemmli с добавлением 5% v/v 2-меркаптоэтанола. Инкубировать лизат при 100 °C в течение 5 минут. Анализируйте клеточные лизаты с помощью электрофореза в белковом геле и вестерн-блоттинга²¹.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Состав 2х Лаеммли буфера следующий: На 500 мл: 5,18 г Трис-HCL, 131,5 мл глицерина, 52,5 мл 20% SDS, 0,5 г бромфенолового синего, конечный pH 6,8.
9. Оцените активность LightR-Src путем оценки уровня фосфорилирования эндогенного p130cas на Tyr249 и паксиллина на TyrY118^22,23 (рис. 2). Оценивайте активность LightR-bRaf путем оценки уровня фосфорилирования MEK1 на Ser217/221 и ERK1/2 на TyrY202/204^24,25.

3. Функциональный анализ активности LightR-Cre

1. Для функционального анализа активности LightR-Cre в планшете 1 x 10⁶ клеток LinXE на чашку для культивирования клеток размером 3,5 см. Инкубируйте клетки при 37 °C и 5%_CO2 в течение 16-18 часов.
2. Трансфектируйте клетки в соответствии с протоколом, описанным в разделе 2, рисунке 2А и в дополнительной таблице 5. Совместно трансфектируйте в общей сложности 2 мкг ДНК с соотношением 1:9 LightR-Cre-iRFP670 и репортерной плазмиды Floxed-STOP-mCherry².
3. Через 16-18 ч после трансфекции осветите клетки. Для эффективной активации LightR-Cre требуется длительное освещение. Поэтому, чтобы избежать фототоксичности, используйте импульсное освещение в течение 8 часов с циклами включения 2 с и выключения 20 с с использованием системы светодиодных панельных ламп с длиной волны 465 нм, управляемой микроконтроллером, как подробно описано в разделе 2 и дополнительном файле 1.
4. Выполняйте визуализацию с помощью эпифлуоресцентной микроскопии с 20-кратным воздушным объективом. Для визуализации LightR-Cre-iRFP670 используйте набор фильтров Cy5, а для визуализации mCherry из выражения Floxed-mCherry используйте набор фильтров RFP.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации используется эпифлуоресцентный микроскоп, оснащенный световыми кубами Cy5/RFP.

4. Подготовка образцов для визуализации живых клеток

1. Планшет 2 x 10⁵ клеток HeLa на 35 мм в чашке для культуры тканей в клеточных культуральных средах и инкубировать в течение 2 ч при 37 °C и 5%_CO2.
2. После того, как клетки прилипли и слияние составляет примерно 60%-70%, сотрансфектируйте клетки HeLa одной из следующих смесей: (i) 0,85 мкг FastLightR-Src-mCherry-myc/0,15 мкг Stargazin-iRFP, или (ii) 0,75 мкг FastLightR-bRaf-Venus/0,25 мкг mCherry-ERK2
   ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментах FastLightR-Src Stargazin-iRFP используется для мечения плазматической мембраны для анализа распространения клеток. Если требуется более высокая экспрессия FastLightR-Src, можно не использовать stargazin-iRFP, а вместо него можно использовать 1 μg FastLightR-Src. В этих случаях для визуализации клеток следует использовать мембранный краситель. Красители на плазматических мембранах обычно используются для мечения клеточных мембран.
3. Накройте чашку алюминиевой фольгой, чтобы избежать случайного освещения ячеек, и инкубируйте в течение 16-18 ч при 37 °C и 5% CO₂.
4. Выполните все следующие действия при освещении красным светом, чтобы избежать случайной активации конструкций. Воздействие белого света вызывает активацию LightR-киназ и может повлиять на последующие результаты.
5. В тот же день покройте 3 круглые стеклянные покровные стекла (диаметром 25 мм, толщиной 0,17 мм) на ночь 5 мг/л фибронектина в PBS при 37 °C.
6. Промойте покровные стекла PBS через 16-18 часов после трансфекции и нанесите ~1 x 10⁵ трансфицированных клеток HeLa на каждый покровный лист. Инкубировать в питательных средах в течение 2 ч при 37 °C и 5%_CO2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Низкая плотность посева необходима для того, чтобы клетки в поле зрения не соприкасались друг с другом.
7. Подготовьте фильтрующий материал, добавив FBS в фильтрующий материал Levobitz L-15 до конечной концентрации 5%. Отфильтруйте раствор через фильтр 0,22 мкм и нагрейте его до 37 °C.
8. Разогреть минеральное масло до 37 °C.
9. Промойте покровные стекла, содержащие ячейки, PBS два раза. Если вы используете мембранный краситель, перед стиркой покровных стекол нанесите краску на ячейки, следуя инструкциям производителя.
10. Осторожно поместите покровное стекло в камеру для визуализации живых клеток. Добавьте в камеру 1 мл среды для визуализации L-15.
11. Добавьте 1 мл минерального масла поверх фильтрующего материала, чтобы предотвратить испарение во время процесса визуализации.
12. Держите камеру в защищенном от света месте при температуре 37 °C до тех пор, пока она не будет готова к съемке.

5. Глобальная активация и визуализация FastLightR-Src (Рисунок 3)

1. Прикрепите синий светодиодный кольцевой светильник для микроскопа к конденсатору микроскопа, расположив его примерно на 1,5 см выше держателя образца. Подключите реле управления переменным/постоянным током для кольцевой подсветки к компьютеру микроскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментах в этом исследовании освещение контролировалось через интерфейс транзисторно-транзисторной логики (TTL) через программное обеспечение для визуализации. Эпифлуоресцентное освещение также может быть использовано для глобальной активации конструкций LightR, если внешний источник освещения недоступен. Длины волн возбуждения GFP, такие как фильтр возбуждения 490/20 нм, эффективны для активации LightR.
2. Поместите камеру на предметный столик микроскопа, предварительно нагретый до 37 °C, и выберите клетки, экспрессирующие FastLightR-Src-mCherry и Stargazin-iRFP (рис. 3B) или FastLightR-bRaf-Venus и mCherry ERK-2 (рис. 5B).
3. Для изучения экспериментов по глобальному освещению и визуализации используйте совместимые с микроскопами высокопроизводительные объективы (40x) с апохроматической коррекцией, коррекцией плоского поля и высокой числовой апертурой.
   1. Для исследований Src-киназы на основе глобального освещения, используйте фильтры возбуждения 561/10 нм и фильтры излучения 595/40 нм для визуализации FastLightR-Src-mCherry и используйте возбуждение 640/20 нм и фильтр излучения 655LP для визуализации stargazin-iRFP.
   2. Для исследований bRaf-киназы на основе глобального освещения, используйте фильтры возбуждения 514/10 нм и эмиссионные фильтры 540/21 нм для визуализации FastLightR-bRaf-Venus и используйте фильтры возбуждения 561/10 нм и эмиссионные фильтры 595/40 нм для визуализации mCherry-ERK-2.
   3. Используйте многополосное полихроичное зеркало во всех флуоресцентных каналах визуализации.
4. В зависимости от условий эксперимента учитывайте следующие рекомендации.
   1. Визуализируйте клетки не менее чем за 10 минут до освещения, чтобы установить базовую активность клеток.
      Примечание: Этот базовый уровень необходим для определения того, вызывает ли активация киназы FastLightR при освещении какие-либо изменения в поведении клетки или локализации белка. Можно также проводить более длительные периоды базальной визуализации для обеспечения большей статистической значимости.
   2. Из-за быстрой инактивации кинетики FastLightR, включение многих клеток для визуализации может вызвать деактивацию Src/bRaf между позициями стадии и может ослабить его ответ. Чтобы избежать такой ошибки, при анализе активности FastLightR-киназы в описанном протоколе необходимо визуализировать 4 ячейки/мин и каждую выбранную ячейку каждую минуту в общей сложности 110 мин (Дополнительный файл 2).
   3. Используйте импульсное освещение вместо непрерывного, чтобы уменьшить потенциальное фототоксическое воздействие синего света. Освещение в течение 12 с для каждой из 4 ячеек/мин является эффективным (Дополнительный файл 2, Рисунок 3A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Циклы освещения должны быть определены эмпирически для различных конструкций и типов источников освещения.
   4. Отключите подсветку во время визуализации клетки, чтобы избежать просачивания во флуоресцентных каналах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одновременная визуализация слишком большого количества клеток уменьшит общее время освещения, доступное для образца, что приведет к ослаблению реакции из-за недостаточной активации.
5. После создания образа сохраните видеоролики в формате . Формат файла стека TIF для анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за менее равномерного освещения при эпифлуоресценции GFP по сравнению с кольцевым светом, эксперименты с использованием эпифлуоресценции GFP потребуют более частого освещения. Это приводит к меньшему количеству изображений клеток за один эксперимент.

6. Субклеточная активация и визуализация FastLightR-Src (Рисунок 4)

1. Поместите камеру на предметный столик микроскопа, предварительно нагретый до 37 °C, и выберите одну ячейку, экспрессирующую как FastLightR-Src-mCherry, так и Stargazin-iRFP.
2. Выберите определенные области (ROI) в ячейке для подсветки. В этом исследовании выбирается небольшой участок на периферии выбранной клетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для локального освещения используется лазер с длиной волны 445 нм, сфокусированный модулем TIRF в режиме FRAP, или микрозеркальное устройство, управляемое через интерфейс TTL через программное обеспечение для формирования изображений. Для этих экспериментов подойдет любая система подсветки с рисунком. Если используется система на основе сканирования, определите интенсивность и однородность лазера для достаточной активации без повреждения клетки.
3. Визуализируйте выбранную ячейку каждую минуту в течение 20 минут в базальном состоянии до освещения, 50 минут при локальном освещении, затем через 20 минут после активации, всего 90 минут (Дополнительный файл 2).
4. Для активации и деактивации предоставьте достаточное количество времени, подходящее для целевого белка, чтобы обеспечить полную деактивацию белка LightR. Для FastLightR-Src дайте не менее 10 минут на деактивацию для удаления остаточной активности и дайте 20 минут на деактивацию в продемонстрированной экспериментальной установке для локального освещения.
5. После создания образа сохраните видеоролики как . Формат файла стека TIF для анализа.

7. Анализ распространения клеток

1. Подготовка изображений к обработке и анализу данных. Убедитесь, что изображения находятся в формате . Формат стека TIF. Сохраните их непосредственно из программного обеспечения для обработки изображений или преобразуйте с помощью программы с открытым исходным кодом.
2. Загрузите пакет скрипта CellGeo из архивированных файлов с дополнительными данными²⁶.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пакет CellGeo содержит несколько различных скриптов. Выберите нужный пакет из списка в зависимости от типа анализа, как описано в разделах 7-9 протокола.
3. Откройте и запустите скрипт под названием MovThresh , чтобы создать маску ячейки.
   1. Выберите Файл > Импорт (.tif) и выберите изображения ячеек Stargazin-iRFP.
   2. Сканируйте кадры с помощью полосы прокрутки в левом нижнем углу. Если предложенный порог подходит, перейдите к шагу 7.4.
   3. Если предложенное пороговое значение не соответствует поведению ячейки, выберите сглаженные или пользовательские кривые в разделе «Выбор кривой». Создайте пользовательскую кривую, прокрутив фреймы, а затем отрегулировав порог в правой части окна.
   4. Нажмите кнопку Повторное пороговое значение.
   5. Нажмите Файл > Сохранить как маску, Изменить имя файла и сохраните его с помощью опции Сохранить как.
4. Откройте только что созданный файл стека в программе анализа изображений с открытым исходным кодом.
5. Выберите Изображение > Настроить пороговое значение > > Применить.
6. Выберите Анализировать > Анализировать частицы > Проверить результаты отображения -> OK.
7. Рассчитайте изменение площади для каждой клетки, разделив площадь в любой момент времени на среднюю площадь той же клетки до облучения синим светом.
8. Нанесите изменение области на график в виде линейной или столбчатой диаграммы.
9. Вычислите среднее значение и 90% доверительные интервалы для каждой временной точки всех ячеек, обрабатываемых в одинаковых условиях.

8. Анализ динамики краев клеток

1. Подготовьте файлы стека, выполнив действия, описанные в разделе 7 протокола.
2. Откройте и запустите скрипт под названием ProActive.
   1. Выберите Файл > Импорт > Маски (.tif) и выберите маску, созданную с помощью скрипта MovThresh.
   2. Выберите интересующее вас действие в анализе в правом нижнем углу («Выступающее», «Втягивающее» или «Итого»).
   3. Выберите тип нормализации. Как правило, для этих анализов используется нормализация площадей.
   4. Выберите начальную систему отсчета с помощью ползунка слева. Бегунок задержки справа определяет временную задержку между двумя временными точками, используемыми для измерения площади, полученной и потерянной ячейкой.
   5. Если выбранный кадр и число задержки суммарно больше, чем количество кадров в фильме, изображение предварительного просмотра не будет отображаться. Сбросьте эти значения так, чтобы они были меньше общего количества кадров.
3. Измените пороговое значение выступа или втягивания, установив флажок «Сглаженная кривая » в разделе «Результаты ». Это позволяет усреднить пороговые значения за определенный период, что может решить проблемы, при которых незначительные колебания обнаруживаются как активность.
4. Выберите «Запустить диапазон», чтобы рассчитать активность за время, указанное ползунками кадра и задержки.
5. Сохраните числовые данные, выбрав «Файл» > «Сохранить как > результаты» (.mat), и используйте их для определения среднего выступающего или втягивающего действия.
6. Определите 90% доверительные интервалы для каждой временной точки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При этом будет сохранен массив из нескольких различных значений. Текстовый файл "How to use ProActive", включенный в состав скрипта, содержит подробное описание того, что представляет собой каждое значение и как они были определены^.
7. Сохраните визуальное представление действия, выбрав «Файл» > «Сохранить как > изображений (.tif)».

9. Анализ сдвига центроида

1. Для анализа сдвига центроида используйте любое программное обеспечение, которое может определить координаты центроида.
2. В программном обеспечении для анализа откройте стек замаскированных изображений интересующей клетки, как описано в разделе 7 протокола.
3. Выберите «Измерение» > «Интегрированный морфометрический анализ», а затем нажмите «Настройки» > «Нарисовать отметку центроида > «Проверить», затем выберите «Измерить».
   1. Запишите координаты центроида перед движением (A).
   2. Запишите координаты центроида в конце эксперимента (B).
   3. Запишите координаты для центра диаграммы направленности (C).
4. Теперь, когда три точки собраны, определим угол BAC⁸. θ₁ соответствует углу ABC, а θ₂ соответствует углу CBA (рис. 4Cii). Сделайте это с помощью следующей формулы:
   cosθ = cos(θ₁ - θ₂) = cosθ₁cosθ₂ + sinθ₁sinθ₂
   ПРИМЕЧАНИЕ: Калькулятор может быть использован для определения углов и расстояний непосредственно по координатам для удобства использования.
5. Определите смещение центроида путем умножения расстояния, которое прошел центроид ячейки в пикселях, на коэффициент преобразования, где 1 пиксель равен 0,4 мкм. Конкретное преобразование пикселей в расстояние будет зависеть от увеличения и настройки камеры в системе.
6. После того, как угол смещения центроида и расстояние будут определены, откройте программное обеспечение для построения графиков, способное создавать изображения полярных координат.
7. Вставьте угол смещения центроида в качестве измерения θ, а пройденное расстояние — в качестве радиуса. Используйте ANOVA для тестирования 95% доверительных интервалов.
8. Отобразите результаты на графике и сохраните изображение.

Результаты

LightR-Src разработан и сгенерирован в соответствии со стратегией, описанной на рисунках 1A, B. Биохимический анализ LightR-Src позволяет получить доступ к фосфорилированию известных эндогенных субстратов Src, p130Cas (Y249)²² и паксиллина (Y118)²³ в ответ на синий свет в течение 60 минут непрерывного освещения (рис. 2B). Примечательно, что фоновая активация Src-киназы не наблюдается, когда LightR-Src экспрессируется только в темноте в течение 16-18 ч после трансфекции. Кроме того, каталитически неактивный мутант LightR-Src с мутацией D388R не индуцирует фосфорилирование субстрата Src, что свидетельствует о том, что фосфорилирование осуществляется активным LightR-Src и не вызвано неспецифическим эффектом излучения синим светом (рис. 2B). Принимая во внимание сообщения об осцилляторной активности киназы Src²⁷ в живых клетках, мы исследовали, можно ли настроить LightR-Src на проявление циклической активации. Оригинальный LightR-Src показал медленную кинетику деактивации (Рисунок 2C), что привело к появлению нового варианта, Fast-LightR-Src, содержащего мутацию I85V в обоих VVD. Рисунок 2D показывает, что Fast-LightR-Src демонстрирует заметно более быструю кинетику деактивации и полностью деактивируется в течение 10 минут после выключения света, по сравнению с более чем часом для LightR-Src. Используя FastLightR-Src, мы также смогли добиться повторяющихся циклов активации/инактивации (рис. 2E). Эти результаты в совокупности демонстрируют способность инструмента LightR достигать специфической и строго контролируемой регуляции активности Src в живых клетках.

Применение FastLightR-Src также позволяет оценить влияние транзиторной активации Src на морфодинамику клеток. Активация FastLightR-Src в клетках HeLa вызывает распространение клеток, и этот процесс прекращается, как только FastLightR-Src инактивируется. После активации мы наблюдали транслокацию FastLightR-Src из перинуклеарного компартмента в очаговые адгезии и плазматическую мембрану, поведение, которое проявляют киназы Src^{дикого типа 11,12}. Светящиеся клетки, экспрессирующие каталитически неактивный мутантный D388RLightR-Src, не демонстрируют таких эффектов распространения (рис. 3B, C). Это еще раз подтверждает, что FastLightR-Src функционирует аналогично своему аналогу дикого типа. Локальное освещение клеточной области приводит к локализованной активации FastLightR-Src, на что указывает локальное накопление LightR Src в фокальной адгезии и сопровождается образованием локальных мембранных выступов (рис. 4B (i), (ii)) и смещением центроида клетки (рис. 4C (i), (ii)), что приводит к движению клетки к свету. Установив применение инструмента LightR для регуляции Src-киназы, мы продемонстрируем широкомасштабную полезность LightR, расширенную до регуляции bRaf-киназы и рекомбиназы ДНК Cre. Анализ LightR-bRaf показывает индуцированное светом фосфорилирование эндогенного субстрата bRaf, MEK1 и последующее фосфорилирование киназ ERK1/2^24,25 на уровнях^, сопоставимых с уровнями конститутивно активного мутанта bRaf (V600E) (рис. 5A). И наоборот, каталитически неактивный D575RLightR-bRaf не демонстрирует фосфорилирования MEK1 и ERK1/2, что сравнимо с неосвещенными образцами LightR-bRaf, что подтверждает специфичность регуляции LightR-bRaf. Визуализация живых клеток показала, что повторяющиеся циклы активации/инактивации FastLightR-bRaf индуцируют повторную транслокацию ERK2 внутрь и из ядра, что согласуется с известными результатами активации bRaf²⁸ (рис. 5B). Активация LightR-Cre приводит к успешной рекомбинации репортерного гена mCherry, демонстрируя применимость LightR к различным классам ферментов (рис. 5C).

Рисунок 1: Стратегия разработки подхода LightR. (A) Кристаллические структуры двух мономеров Vivid в темновом состоянии (PDB: 2PD7) и димера в освещенном состоянии (PDB: 3RH8). (B) Мультяшное изображение дизайна LightR. Два тандемно связанных фоторецептора VVD, вставленных в каталитический домен, нарушают каталитическую активность белка в темноте. Димеризация ВСД в ответ на синий свет восстанавливает активность белка. (C) Кристаллические структуры каталитических доменов (i) Src (PDB 1Y57) и (ii) bRaf (PDB 4MNF). (ii) Структура Cre рекомбиназы (PDB 1MA7). Желтые стрелки указывают на место введения LightR и указывают на замещенную аминокислоту. (D) Принципиальная схема стратегии клонирования для встраивания домена LightR в последовательность фермента-мишени¹⁹. На этапе 1 специально разработанные праймеры используются для ПЦР-синтеза фрагмента LightR, фланкированного участками отжига в гене-мишени до и после сайта вставки. На этапе 2 показано, что полученный таким образом фрагмент LightR используется в качестве «мегапраймера» для встраивания LightR в ген-мишень путем сайт-направленного мутагенеза Quick change. Панели A-C были адаптированы и модифицированы с разрешения Shaaya et ^al.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Биохимическая характеристика сконструированных белков LightR. (А) Схематическое изображение экспериментального протокола биохимической характеристики LightR Src. (В) Клетки LinXE, временно экспрессирующие конструкцию LightR Src, содержащую mCherry и метку myc на С-конце, непрерывно подсвечивали синим светом в течение 60 минут с использованием светодиодной установки с длиной волны 465 нм. Клеточные лизаты исследовали на предмет фосфорилирования субстратов Src, паксиллина и p130Cas. Результаты вестерн-блоттинга показывают фосфорилирование эндогенного паксиллина и p130Cas в ответ на активацию LightR-Src в живых клетках. (К,Г) Клетки LinXE, временно экспрессирующие указанные конструкции LightR-Src, несущие тандемную метку mCherry-myc на С-конце, непрерывно подвергались воздействию синего света в течение заданного времени (0 мин и 30 мин), а затем помещались в темноту на определенные периоды времени. Клеточные лизаты были исследованы на предмет фосфорилирования субстратов Src, что показало сравнение кинетики активации и дезактивации между (C) LightR-Src и (D) FastLightR-Src. (E) Клетки LinXE, временно экспрессирующие указанные конструкции LightR-Src, несущие тандемную метку mCherry-myc на С-конце, непрерывно подвергались воздействию синего света в течение 20 мин с последующей повторной инкубацией в темноте в течение 10 мин и на свету в течение 20 мин. Клеточные лизаты были собраны и исследованы для фосфорилирования субстратов Src, что показало эффективность цикличности киназы Src между состояниями активации и инактивации. Все эксперименты повторялись не менее трех раз с аналогичными результатами. Числа, отображаемые рядом с каждой панелью вестерн-блоттинга B-E, представляют собой молекулярную массу белков, измеряемую в килодальтонах (кДа). Панели B-E были адаптированы и модифицированы с разрешения Shaaya et ^al.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Глобальное и временное управление освещением и его влияние на активность FastLightR-Src. (A) Мультяшное представление экспериментальной схемы глобального и временного циклического освещения и последующий анализ данных. (В,В) Регуляция морфологии клеток и локализация FastLightR-Src в синем свете изображены на репрезентативных изображениях клеток HeLa, полученных из серии таймлапсов с помощью широкопольной флуоресцентной микроскопии. Эти клетки были временно коэкспрессирующими FastLightR-Src-mCherry-myc (N = 10 клеток) или каталитически неактивными D388RLightR-Src-mCherry-myc (N = 9 клеток) вместе со Stargazin-iRFP670 (маркер плазматической мембраны). Визуализация живых клеток проводилась каждую минуту, в то время как клетки были глобально освещены синим светом (синими контурами). (B) Желтыми стрелками выделена локализация FastLightR-Src в структурах, напоминающих очаговые спайки. Изображения были получены из покадровой серии клеток HeLa с помощью широкопольной флуоресцентной микроскопии. (C) Количественная оценка изменений площади клеток, вызванных активацией FastLightR-Src по сравнению с D388RLightR-Src, показана на каждой панели. Окошко подсветки обозначено синими прямоугольниками. Графики представляют средние ± 90% доверительные интервалы. Панели B и C были адаптированы и изменены с разрешения Shaaya et ^al.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Управление локальным субклеточным освещением и его влияние на активность FastLightR-Src. (А) Мультяшное изображение экспериментальной схемы управления локальным субклеточным освещением. (B) (i) Покадровая съемка, иллюстрирующая клетку HeLa, экспрессирующую FastLightR-Src-mCherry, локально освещенную синим светом (изображена синим кругом). Изображения получались каждую минуту с помощью флуоресцентной микроскопии с полным внутренним отражением (объектив 60x). Изображения представлены в виде инвертированных контрастных изображений, полученных через заданные интервалы времени. (ii) Проекционные изображения клеток, показывающие выступы, образовавшиеся в течение заданных временных интервалов. Установление пороговых значений и маскировка морфологии клеток на экспериментальной временной шкале представляет собой платформу для анализа распространения клеток и динамики клеточных краев. Указанная освещенная область ячейки обведена синим кружком. (C) (i) Полярный график для ячеек, представляющий расстояние миграции центроида (d) и угол отклонения (θ) относительно локального освещения синим светом. Черными точками обозначены отдельные клетки HeLa, экспрессирующие каталитически неактивные D388RLightR-Src (N = 6 клеток) или FastLightR-Src (N = 10 клеток). (ii) Схематическое изображение, демонстрирующее расстояние смещения центроида (d), пройденное центроидом клетки от начала (1) до завершения (2) локальной стимуляции синим светом. Угол отклонения (θ) указывает на степень отклонения движения центроида клетки от места расположения синего света. Светло-серое затенение указывает на область, выпячиваемую клеткой в ответ на местную стимуляцию FastLightR-Src. Указанная освещенная область ячейки обозначается сплошным синим кружком. Панели B и C были адаптированы и модифицированы из Shaaya et ^al.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Широкая применимость подхода LightR. (a) Регулирование LightR-bRaf. Клетки LinXE, временно экспрессирующие LightR-bRaf-Venus, каталитически неактивные D575R LightR-bRaf Venus или конститутивно активные bRaf (V600E)-Venus подвергались воздействию непрерывного синего света в течение указанного периода времени. Клеточные лизаты зондировали на предмет фосфорилирования указанных белков. (B) Репрезентативные изображения, полученные в ходе серии покадровых исследований живых клеток с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии, иллюстрируют регуляцию глобальной реакции на синий свет в клетках LinXE с временной коэкспрессией FastLightR-bRaf-Venus и mCherry-ERK2. Эти ячейки были глобально освещены синим светом (50 мс импульсов в секунду, 50 импульсов в минуту) в течение определенной длительности, обведенной синим цветом. Визуализация mCherry-ERK2 в живых клетках проводилась каждую минуту. Желтыми стрелками выделены этапы локализации ядерного ERK2, индуцированные активацией синим светом сконструированного bRaf. (C) Клетки LinXE временно ко-трансфицировали с помощью репортера Floxed-stop-mCherry и LightR-Cre-iRFP670. Клетки подвергались воздействию либо темных условий, либо пульсирующего синего света (2 с включено, 10 с выключено) в течение 8 часов. Изображения для всех временных точек каждого канала были получены с помощью широкопольного флуоресцентного микроскопа (объектив 10x) при идентичных настройках и были настроены на постоянные уровни яркости и контрастности, чтобы облегчить сравнение уровней экспрессии белка в образцах. Эксперимент был повторен по крайней мере три раза, что дало аналогичные результаты. Рисунок был адаптирован и модифицирован из Shaaya et ^al.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительная таблица 1: Последовательность LightR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 2: Описание сайтов вставки LightR и контрольный список для разработки белка LightR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 3: Праймеры для клонирования LightR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 4: Условия трансфекции для биохимического анализа активности LightR-белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 5: Условия трансфекции для анализа активности LightR-белка на основе визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 1: Импульсная подсветка с использованием интегрированной среды разработки (IDE). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Настройки освещения микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

В нашем исследовании представлен оптогенетический подход к изучению различных сигнальных путей и продемонстрирована его широкая применимость в решении различных биологических вопросов. Инструментальная система LightR обладает несколькими существенными преимуществами: (1) аллостерическая регуляция активности белка, (2) жесткий временной контроль активности, который может быть настроен для достижения различной кинетики активации и инактивации, (3) пространственное разрешение активности на субклеточном уровне, (4) специфичность модуляции передачи сигналов и биологической активности и (5) широкий диапазон применимости к различным белкам-мишеням. Примечательно, что LightR уникальным образом интегрирует все эти преимущества в одном инструменте, тем самым обеспечивая значительный шаг вперед.

Конструкция LightR в качестве аллостерического переключателя имеет ряд преимуществ. Способность LightR контролировать активность белка при вставке в небольшую гибкую петлю обеспечивает значительную универсальность для применения в различных белках с различными структурами и функциями. Являясь аллостерическим переключателем, LightR регулирует только целевой домен интересующего белка и не влияет на другие домены белка. Следовательно, этот метод позволяет осуществлять специфическую регуляцию активности без ущерба для основных функций белка, таких как взаимодействие с его партнерами по связыванию или нативная локализация в клетках. Двухкомпонентные оптогенетические системы были успешно применены для регуляции локализации белков, взаимодействий или других важных функций с использованием светоопосредованного контроля гомо- или гетеродимеризации 29,30,31,32,33,34,35 . Тем не менее, эти системы часто требуют оптимизированной эквимолярной экспрессии двух белков, что делает их применение более сложным. Аллостерическая регуляция с помощью системы LightR достигается в пределах одного белка и, таким образом, обеспечивает гораздо более универсальный подход к исследованию клеточной сигнализации.

Широкий диапазон применимости переключения LightR к различным классам белков частично достигается за счет оптимизации различных модулей в домене LightR. Линкеры, соединяющие LightR с интересующим белком, и линкер, соединяющий два домена VVD внутри LightR (интер-VVD линкер), могут влиять на эффективность регуляции. Выбор гибкого линкера между VVD (GGS)4G(GGS)3 обеспечивает достаточную гибкость и длину для обеспечения ассоциации и диссоциации мономеров VVD в домене LightR. До сих пор этот линкер обеспечивал успешную регуляцию всех целевых белков. Однако в случаях, когда домен LightR недостаточно инактивирует белок в темноте, может быть введен более жесткий линкер, который будет удерживать домены VVD дальше друг от друга, чтобы усилить раскрытие зажима LightR, тем самым сохраняя фермент неактивным. Линкер должен сохранять достаточную гибкость для обеспечения димеризации VVD и активации целевого белка. Чтобы соединить LightR с интересующим белком, мы используем короткие гибкие линкеры GPGGSGG и GSGGPG, добавленные к N- и C-концам домена LightR. Они обеспечивают достаточную гибкость соединения, тем самым предотвращая необратимое разрушение целевого белка. Тем не менее, они достаточно короткие, чтобы обеспечить искажение целевого белка в темноте, способствуя восстановлению функции белка на свету. Эти линкеры поддерживают регуляцию с помощью LightR для многих белковых применений. Однако в некоторых случаях, когда эти линкеры не могут обеспечить достаточную инактивацию белка в темноте, укорачивание линкеров может быть полезным. Такое укорачивание линкера может снизить гибкость и усилить искажения, вызванные открытым зажимом LightR в темноте, тем самым сводя к минимуму любую утечку. Тем не менее, эта корректировка может поставить под угрозу максимальную активность фермента из-за потенциальных структурных искажений в освещенном состоянии. В качестве альтернативы, замена нескольких аминокислот в петле вставки может обеспечить аналогичные преимущества сбалансированной гибкости в тех случаях, когда конформационная нестабильность не является существенной проблемой.

Многие критические сигнальные процессы активируются временно или регулируются колебательным образом 36,37,38,39,40,41,42,43. Настраиваемость инструмента LightR позволяет нам имитировать сложные сигнальные паттерны и, таким образом, обеспечивает мощный подход к исследованию биологических процессов, контролируемых во времени. Мы достигаем этого путем модуляции кинетики выключения LightR путем введения мутации I85V в оба домена VVD. Эта мутация сокращает период полувыведения димера VVD в темновом состоянии с 18 000 с до 780 с¹⁹, тем самым способствуя более быстрой инактивации в ферменте FastLightR.

Быстрая кинетика инактивации также позволяет регулировать активность белка при субклеточном разрешении. Ферменты LightR, обладающие медленной кинетикой, могут затруднить наблюдение за эффектами субклеточной активации из-за внутриклеточной диффузии активированной конструкции. При быстродействии кинетики любой фермент FastLightR, который диффундирует за пределы зоны локального освещения, будет быстро инактивирован. Селективно активируя определенные субклеточные области, исследователи могут получить представление о локальных функциях белков для лучшего понимания их вклада в сложные клеточные пути и сигнальные сети.

В то время как FastLightR бесценны для пространственного и временного оптического контроля активности белков в клетках, все еще существуют приложения, где замедление кинетики может быть желательным. LightR с медленной кинетикой может быть реализован в исследованиях, где требуется устойчивая и усиленная индуцируемая синим светом активность. Для поддержания непрерывной оптогенетической активности в этих приложениях потребуются лишь редкие импульсы освещения, что также сводит к минимуму такие проблемы, как фототоксичность. Для различных сценариев широкий спектр кинетических модификаций^10,18 может быть реализован по отдельности или в тандеме друг с другом, чтобы предложить перспективное решение для настройки производительности LightR с целью оптимизации его применения для конкретного эксперимента.

Применимость ферментов LightR определяется их способностью имитировать биологическую функцию своих эндогенных аналогов. Таким образом, крайне важно оценить их субстратную специфичность, нисходящую передачу сигналов и субклеточную локализацию. Специфичность активности LightR-Src подтверждена фосфорилированием субстратов Src, включая паксиллин и p130Cas^22,23. FastLightR-Src перемещается между перинуклеарной областью и фокальными адгезиями под действием циклического освещения, что приводит к распространению клеток. Такое явление успешно напоминает более ранние наблюдения, сделанные с нативной киназой Src, и еще раз подтверждает эффективность настоящего инструмента в исследовании биологии Src 11,12,44,45,46,47. LightR-bRaf также демонстрирует специфику в наведении на цель сигнальных комплексов типа MEK и ERK^{киназы 24,25}. Кроме того, FastLightR-bRaf проявляет циклические колебания ядерного шаттла ERK в ответ на синий свет, что является известным последствием активации bRaf²⁸. Способность ферментов LightR точно имитировать функции эндогенных белков является бесценным инструментом для изучения их функции.

Вышеприведенное обсуждение показывает способность киназ LightR реплицировать точные клеточные сигнальные пути в определенных клеточных компартментах. В соответствии с таким успехом киназ, LightR-Cre служит иллюстративной моделью, демонстрирующей функциональность исходной рекомбиназы Cre, полученной из бактериофага P1. Cre-рекомбиназа принадлежит к семейству интеграз сайт-специфичных рекомбиназ и работает, способствуя рекомбинации между двумя сайтами узнавания, называемыми loxP, на ДНК-мишени. Такая рекомбинация приводит к перестройке ДНК через событие кроссинговера. Основываясь на направленной ориентации сайта loxP на ДНК-мишени, событие кроссинговера может привести либо к делеции, либо к дупликации, либо к транслокации хромосомных элементов⁴⁸. Cre-рекомбиназа широко использовалась для создания in vivo моделей индуцируемой регуляции генов^49,50. Тем не менее, другие спонтанные, химически индуцируемые или оптогенетически индуцируемые системы рекомбиназы кре обеспечивают ограниченный контроль над тем, когда и где индуцируется рекомбинация ДНК в животной модели. LightR-Cre преодолевает эти ограничения, обеспечивая строгий временной и пространственный контроль рекомбинации ДНК. Кроме того, возможность настройки LightR позволяет нам устранить нежелательную утечку и обеспечить регулирование Cre с высокой точностью. Эти возможности открывают новые возможности для моделирования патологии заболеваний и разработки новых методов лечения.

Точная регуляция LightR в киназах и рекомбиназе ДНК является еще одним доказательством того, что этот инструмент может быть применен к нескольким белкам с одной и той же стратегией. В дополнение к активации различных классов ферментов, LightR потенциально может быть присоединен к другим типам белков, где аллостерическая модуляция может быть использована для локализации белков в определенных субклеточных областях, индуцирования белок-белковых взаимодействий, создания биосенсоров, индуцируемых синим светом, и многого другого. Благодаря аллостерическим преимуществам нацеливания на конкретные домены, LightR также можно комбинировать с другими хемогенетическими и оптогенетическими подходами в том же белке для достижения более высокой степени настраиваемости для изучения биологических процессов.

Мы успешно применили LightR к нескольким другим белкам (рукописи находятся в стадии подготовки). Несмотря на этот успех, разработка функционального белка LightR может столкнуться с потенциальными проблемами, особенно в выборе подходящего места вставки и точной имитации биологической функции белка-мишени. Когда кристаллическая структура недоступна, исследователи должны полагаться на предсказанные структуры или информацию о последовательности аминокислот, что требует более тщательного устранения неполадок для создания белков с несколькими сайтами вставки или аминокислотными заменами. Кроме того, активность сконструированного белка должна быть точно настроена для точной репликации биологической функции в клетке. Успех в этих экспериментах зависит от точной функциональной мимикрии сконструированного белка с его эндогенным гомологом, который часто требует тщательного устранения неполадок и может варьироваться в зависимости от типа клетки, класса и типа белка-мишени, а также от силы и продолжительности активации синим светом.

В заключение следует отметить, что система LightR представляет собой мощный инструмент для достижения точного пространственно-временного контроля над функцией белка. Его надежность, настраиваемость и универсальность делают его бесценным для изучения сложных клеточных процессов, разгадки сигнальных путей и выяснения регуляторных механизмов генов. Предоставляя исследователям беспрецедентный контроль над активностью белка, система LightR обещает углубить наше понимание фундаментальных биологических процессов и проложить путь к инновационным терапевтическим вмешательствам.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
#1.5 Стеклянные покровные стекла 25 мм круглые	Warner Instruments	64-0715
1,5 мл Тубы	США Научный	cc7682-3394
2x Буфер			на 500 мл: 5,18 г из  Tris-HCL, 131,5 мл глицерина, 52,5 мл 20% SDS, 0,5 г бромфенолового синего, конечный pH 6,8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Термо Научный	F538L 60 светодиодный
микроскоп Кольцевой светильник	Boli Optics	ML46241324	синий светодиод, диаметр 60 мм, 5 Вт
Agarose	GoldBiotech	A-201
Anti-Erk 1/2 Антитело	Клеточная сигнализация	9102
Антитело против GAPDH	Антитело	AM4300
Антитело против GFP	Clontech	632380
Антитело против mCherry	invitrogen	M11217
Анти-MEK	Клеточная сигнализация	9122
Анти-p130Cas	BD Biosciences	610271
Анти-паксиллиновая	клеточная сигнализация	2542
Антифосфо-Эрк 1/2 T202/Y204 Антитело	Клеточная сигнализация	9101
Антифосфо-pY249 p130Cas	Клеточная сигнализация	4014
Антифосфо-Y118 Паксиллиновая	клеточная сигнализация	2541
Анто-фосфо-S217/221 MEK	Клетка Сигнализация	9121
Arduino совместимый источник питания	Корпоративный компьютер	LJH -186
Arduino Uno Rev3	Arduino	‎
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Термоинактивированный Triple 0.1 & микро; m стерильно-фильтрованный
bRaf-V600E-Venus			Подарок от доктора Джона О'Брайана, MUSC
BSA	ГолдБиотех	А-420
Карбенициллин (Динатрий)	Gold Biotechnology	C-103-25
CellMask Темно-красный краситель для плазматической мембраны	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Генезе	42-138
DH5a компетентные клетки	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
Лестница ДНК	ГолдБио	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
Фермент Dpn1	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-дитиотреитол, реагенты Клеланда
EGTA	Acros
FastLightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162155
Фибронектин из плазмы крупного рогатого скота	Сигма	F1141
Реагент для трансфекции FuGENE(R) 6	Promega	E2692	Реактив для трансфекции
Гель Зеленый Краситель Нуклеиновых Кислот	GoldBio	G-740-500
Гелевый краситель фиолетовый 6x	NEB	B7024A
Набор для экстракции гелем GeneJET	Термо Научный	K0692	Набор для экстракции геля
Набор GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0502
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 мл
Клетки HEK 293T	ATCC	CRL-11268
Клетки HeLa	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
Iot реле	цифровых регистраторов	DLI 705020645490	реле управления переменным/постоянным током для освещения
Kanamycin Monosulfate	Gold Biotechnology	K-120-25
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
Светодиодная система освещения для выращивания растений	HQRP	884667106091218	Система светодиодных панельных ламп
LightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162154
LightR-iCre-miRFP670	Addgene	#162158
MATLAB	Mathworks	R2024a	Программное обеспечение для запуска скриптов
CellGEO Metamorph	Molecular Devices		Программное обеспечение для анализа изображений
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Минеральное масло	Sigma	M5310
Набор для мини-подготовки	Выбор гена	96-308
Mini-PROTEAN TGX Сборные гели 12 лунок	Bio-Rad	4561085
Молекулярная биология Класс Вода	Corning	46-000-CV
Многополосное полихроичное зеркало	89903BS	Chroma
NaCl	Фишер Кемикал	С271-3
PBS без Ca и Mg	Corning	21-031-CV
pCAG-iCre	Addgene	#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry	Addgene	#122963
pCEFL-ERK2			Подарок от лаборатории доктора Ченнинга Дера,
UNC PCR Tubes	labForce	1149Z65	0,2 мл 8-полосные пробирки и колпачки, жесткая полоска индивидуально прикрепленные купольные колпачки
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
pmiRFP670-N1	Addgene	#79987
Polygon 400 Узорчатый осветитель	Mightex	DSI-G-00C
Праймеры	Мембраны IDT
PVDF	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Сэндвичи с фильтровальной бумагой
T0,25% трипсин, 2,21 мМ, eDTA, 1x [-] натрия	Corning	25-053-CI
Трис-ацетат-ЭДТА (ТАЭ) 50x	Fischer	BP1332-1	Для электрофореза
UPlanSApo 40x Микроскоп Объектив	Olympus	1-U2B828
USB TTL Box	National Instruments	6501	Для интерфейса TTL
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	О3446И-100