Методическая статья

Визуализация одномолекулярных FRET для наблюдения за конформационной динамикой динамин-подобной ГТФазы Атластина

DOI:

10.3791/67263

⸱

24 января 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, College of Life Sciences, Frontiers Science Center for Cell Responses, Nankai University, 2National Laboratory for Condensed Matter Physics, Institute of Physics, Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Функции белков надсемейства динаминов зависят от конформационных изменений в сочетании с гидролизом ГТФ. Система описана с использованием метода одномолекулярного FRET (smFRET) для мониторинга конформационной динамики динаминоподобного атластина ГТФазы в различных состояниях нуклеотидной нагрузки.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вращение твердого тела трехспирального среднего домена (3HB) относительно ГТФазного домена динаминоподобного белка атластина (ATL) является важнейшим фактором гомотипического слияния мембран в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР). Нарушения в этом процессе были связаны с наследственной спастической параплегией (ПШГ), нейродегенеративным заболеванием. Структурные и биохимические исследования показывают, что конформационные изменения в ATL связаны с гидролизом ГТФ, но визуализация этой конформационной динамики в режиме реального времени во время цикла гидролиза ГТФ остается сложной задачей. Чтобы лучше понять механические механизмы функции ATL, был использован одномолекулярный резонансный перенос энергии Фёрстера (smFRET). Для иммобилизации N-концевой цитозольной области ATL1 человека (ATL1cyto) в микрофлюидной камере, покрытой стрептавидином, были использованы три специфические стратегии, что облегчает применение внутримолекулярной и межмолекулярной визуализации smFRET. Это позволило точно отслеживать конформацию белков в различных состояниях загрузки нуклеотидов, обеспечивая прямое понимание поведения отдельных молекул. Этот метод может быть применен и для изучения других механохимических белков.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В эукариотических клетках белки надсемейства динаминов опосредуют ремоделирование биологических мембран, включая трубчатость мембраны, деление и слияние 1,2,3. Мутации в этих белках приводят к различным заболеваниям человека, таким как нейродегенеративные заболевания. Члены суперсемейства динаминов обычно содержат домен ГТФазы, средний домен, состоящий из спиральных пучков, мотив для связывания мембраны и эффекторный домен ГТФазы (GED). Одной из таких динаминоподобных ГТФазы является атластин (ATL), который катализирует гомотипическое мембранное слияние эндоплазматического ретикулума (ER) с образованием сети 4,5,6,7,8,9,10. У млекопитающих существует три ATL (ATL1-3). Молекула ATL состоит из N-концевой цитозольной области (ATLcyto), включающей домен ГТФазы и трехспиральный средний домен (3HB), за которыми следуют две трансмембранные области, но не имеет типичного GED. Кроме того, ATL содержит С-концевой хвост, который играет решающую роль в слиянии мембран 11,12,13.

Сообщалось, что эффективное слияние мембран основано на гидролизно-зависимой перестройке домена ГТФ вATL цито 14,15,16,17,18,19,20. Однако, по сравнению с комплексом SNARE, который использует энергию сворачивания от конформационных изменений для управления гетеротипическим мембранным слиянием21, процесс гомотипического слияния мембран, опосредованный ATL и другими слитыми динаминоподобными белками22, остается неуловимым. Определены три кристаллические структурыцито ATL1 человека в различных условиях нуклеотидной нагрузки 14,15,16,23. В структурах два 3HB в димере указывают в разных направлениях, но всеобъемлющая модель, объясняющая, как связаны конформационная динамикаATL-цито и его активность ГТФазы, до сих пор отсутствует.

В предыдущей модели мономерные молекулы ATL образуют димеры на различных мембранах ГТФ-зависимым образом, чтобы стимулировать слияние мембран. В данной работе описываются три стратегии применения одномолекулярного резонансного переноса энергии Фёрстера (smFRET) для непосредственного наблюдения и точного обнаружения поведения отдельных молекулцитоцитов ATL1. smFRET является мощным методом, широко используемым для исследования конформационной динамики и взаимодействий отдельных биомолекул в режиме реального времени, таких как GPCR-опосредованная активация β-аррестина24, ремоделирование хроматина с помощью Snf225 и доменные перестройки динаминоподобного белка MxA в сочетании с циклами гидролиза GTP26. Поскольку smFRET может эффективно обнаруживать изменения расстояния только от ~3 нм до ~8 нм, необходимы как межмолекулярные, так и внутримолекулярные эксперименты smFRET для всестороннего анализа конформацийцито ATL1 для каждого состояния нуклеотидной нагрузки. Мы создали три конструкциицитоцита ATL1 со всеми нативными цистеинами, замещенными аланинами, и K400 (ATL1cyto-K) или пара T51/K400 (ATL1cyto-TK), мутировавшей в цистеин, для мечения флуорофора. Стратегии иммобилизациицитодимера или мономера ATL1 в микрофлюидной камере, покрытой стрептавидином (рисунок 1A) для межмолекулярных или внутримолекулярных экспериментов с smFRET показаны на рисунке 1B-D. Этот метод позволяет получить более подробную информацию о конформационной динамике динаминоподобных белков на каждой стадии гидролиза ГТФ27.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Изготовление модифицированного покровного стекла для камеры иммобилизации белка

  1. Подготовка
    1. Приготовьте 50 мл раствора пираньи (в составе концентрированной серной кислоты и перекиси водорода в соотношении 3:1), медленно добавляя перекись водорода к концентрированной серной кислоте для предотвращения чрезмерных температур. Осторожно поместите его в вытяжной шкаф.
    2. Приготовьте раствор этоксида натрия. Растворите 2 г NaOH в 15 мл ddH2O, добавьте 35 мл абсолютного этанола и полностью перемешайте. Оставьте при комнатной температуре.
    3. Приготовьте раствор с высоким содержанием соли (0,1 М NaHCO3 и 0,6 М K2SO4). Растворите полностью и проведите в норме 500 μл/тюбик. Хранить при температуре -20 °C.
    4. Аликвоты SVA-mPEG и SVA-mPEG-биотин примерно по 30 мг на пробирку и 3 мг на пробирку. Хранить при температуре -20 °C.
    5. Настройте предметные стекла микроскопа (75 мм × 26 мм × 1 мм) с 6 парами отверстий диаметром 1,2 мм.
  2. Очистка поверхности покровного стекла
    1. С помощью пинцета возьмите восемь покровных листочков и положите их в баночку для окрашивания. Добавьте ацетон (~50 мл), чтобы покрыть покровные листы, поместите баночку для окрашивания в ультразвуковой очиститель на 30 минут, а затем трижды прополощите покровные листы ddH2O.
    2. Промойте покровные стекла метанолом, как описано в шаге 1.2.1.
    3. Добавьте раствор пираньи (шаг 1.1.1) в баночку для окрашивания и нагрейте ее в чайнике с водяной баней при температуре 95 °C в течение 2 часов. После того как баночка для окрашивания остынет до комнатной температуры, промойте покровные стекла не менее шести раз с помощью ddH2O.
    4. Добавьте раствор этоксида натрия в баночку для окрашивания, поместите ее в ультразвуковой очиститель на 15 минут, а затем трижды прополощите ddH2O.
    5. Добавьте ddH2O в баночку для окрашивания, чтобы покрыть покровные стекла, поместите в ультразвуковой очиститель на 15 минут, а затем прополощите 3 раза ddH2O.
  3. Аминосиланизация модификации поверхности покровного стекла.
    1. Зажмите покровные стекла в банке для окрашивания на чистой скамейке, обсушите их азотом и переложите в другую банку для окрашивания (заранее высушенную).
    2. Выпекать баночку для окрашивания в сушильном шкафу при температуре 120 °C в течение 30 минут, а затем охладить до комнатной температуры в эксикаторе.
    3. Добавьте в стакан (предварительно высушенный) 47,5 мл метанола, 2,5 мл уксусной кислоты и 0,5 мл 3-аминопропилтриэтоксисилана (APTES), равномерно перемешайте, добавьте в банку для окрашивания и выдерживайте в течение 10 минут.
    4. Промойте покровные стекла в банке для окрашивания ddH2O не менее трех раз и обрабатывайте ультразвуком в течение 5 минут.
    5. Выньте покровные стекла один за другим, промойте ddH2O, высушите азотом феном и поместите их в чашку Петри диаметром 10 см для подготовки к модификации PEG.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Модификацию APTES необходимо проводить в сухой среде.
  4. Модификация поверхности покровного стекла с помощью SVA-mPEG-Biotin и SVA-mPEG
    ПРИМЕЧАНИЕ: Модификация биотином покровной поверхности помогает сохранить биотинилированные белки (или белки, связывающиеся с биотин-анти-His) с помощью стрептавидина.
    1. Полностью растворите упакованные SVA-mPEG и SVA-mPEG-биотин в растворе с высоким содержанием соли (1 мг, что соответствует 10 мкл раствора с высоким содержанием соли). Добавьте раствор SVA-mPEG-Biotin к решению SVA-mPEG в соотношении 1:100.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Встряхните раствор с помощью вихря, чтобы убедиться, что SVA-mPEG или SVA-mPEG-биотин полностью растворены. Водный раствор SVA-mPEG или SVA-mPEG-Biotin следует приготовить перед применением.
    2. Капните приготовленный раствор смеси на покровное стекло и накройте его другим покровным стеклом. Этот процесс должен предотвратить образование пузырей. Полностью инкубируйте покровные стекла при соответствующей влажности более 2 часов или на ночь.
    3. Отделите покровные стекла после завершения модификации, промойте их ddH2O и высушите феном с азотом. Отметьте поверхность покровного стекла, которая не была модифицирована, с помощью SVA-mPEG и SVA-mPEG-биотина.
    4. Осторожно поместите модифицированную защитную крышку в микроцентрифужную пробирку объемом 50 мл. После уборки хранить при температуре -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Модифицированный покровный лист можно хранить под вакуумом в течение 1 месяца.

2. Подготовка предметных стекол микроскопа для камеры иммобилизации белков

  1. Промойте предметные стекла микроскопа, как описано для покровных стекол в шаге 1.2.
  2. Выдуйте предметные стекла микроскопа насухо азотом и поместите их в микроцентрифужные пробирки объемом 50 мл.
  3. Храните предметные стекла микроскопа, как описано в шаге 1.4.4.

3. Экспрессия и очистка белка

  1. Подготовка
    1. Плазмиды: Клонируйте представляющего интерес члена семейства атластинов или представляющую интерес патогенную мутацию в бактериальный вектор экспрессии, например, pET-28a, и добавьте Avitag27. Вводите цистеины в соответствующие позиции с помощью сайт-направленного мутагенеза (например, T51C и K400C27).
    2. Подготовьте следующие буферы.
      1. Питательная среда Лурия-Бертани (LB): Смешайте 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г хлорида натрия в 1 л ddH2O. Автоклав при 121°C в течение 20 минут.
      2. Буфер для лизиса: смешайте 25 мМ HEPES (pH 7,4), 150 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 1x полный коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТА, 10 мМ имидазола и 0,5 мМ TCEP. Хранить при температуре 4 °C.
      3. Буфер для промывки: Смешайте 25 мМ HEPES (pH 7,4), 150 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 30 мМ имидазола и 0,5 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлорида (TCEP). Хранить при температуре 4 °C.
      4. Элюированный буфер: смешайте 25 мМ HEPES (pH 7,4), 150 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 150 мМ имидазола и 0,5 мМ TCEP. Хранить при температуре 4 °C.
      5. Буфер для очистки: 25 мМ HEPES (pH 7,4), 150 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 0,5 мМ TCEP. Хранить при температуре 4 °C.
  2. Очистка белка
    1. Перенос плазмид27 в клетки Rosetta (DE3) (Biomed) E. coli с использованием методов теплового шока бактериальной трансформации. Суспензируют перенесенные клетки в культуральной среде LB с добавлением конечной концентрации 50 мкг/мкл канамицина.
      1. Культивируют при 37 °С до тех пор, пока поглощение питательной среды при 600 нм не составит 0,6-0,8. Добавьте изопропил-β-D-тиогалактозид (IPTG) в конечной концентрации 50 мкМ для индуцирования экспрессии белка при 16 °C в течение 20-24 ч.
        Скорость роста бактериальных или других микробных клеточных культур можно контролировать, измеряя оптическую плотность (абсорбцию) культуры клеточного роста при длине волны 600 нм.
    2. Соберите клетки центрифугированием при 4000 × г в течение 20 мин при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость.
    3. Ресуспендируйте клеточную гранулу 30 мл буфера для лизиса. Разрушьте ячейки три раза с помощью дробилки высокого давления.
    4. Осветить лизаты центрифугированием при температуре 2 00 000 × г в течение 1 ч при 4 °C с использованием ротора ультрацентрифуги.
    5. Выделите белок с помощью колонки Ni-NTA. Промыть колонну Ni-NTA промывочным буфером на 5 объемов колонны. Элюирующий белок с элюирующим буфером на 1 колонку объема. Соберите элюат и концентрат с помощью центробежных фильтров до ~ 500 μл.
    6. Далее очистите белок с помощью эксклюзионной хроматографии27. Соберите элюат (500 μл на пробирку).
    7. Подтвердите целевой белок по его молекулярной массе, определенной с помощью электрофореза в геле додецилсульфата натрия и полиакриламида (SDS-PAGE)27. Соберите целевой белок для дальнейшей модификации.

4. Биотинилирование белка

  1. Подготовка
    1. Приготовьте следующие исходные растворы.
      1. Тетрагидрат ацетата магния (MgOAc·4H2O) растворить в 25 мМ буфере HEPES (pH 7,7) в концентрации 100 мМ (10×). Аликвоту 100 мкл на тубу и хранить при температуре -20 °C.
      2. Аденозин-5-трифосфатдинатриевая соль (АТФ) растворить в ddH2O в концентрации 100 мМ (10×). Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью NaOH. Аликвоту 100 мкл на пробирку и хранить при температуре -80 °C.
      3. Растворить d-биотин в ddH2O в концентрации 500 мкМ. Аликвота 100 мкл на пробирку и хранить при -20 °С.
      4. Растворите стрептавидин в ddH2O в концентрации 1 мг/мл. Аликвоту 20 мкл на тубу и хранить при температуре -20 °C.
    2. Буфер для биотинилирования белка: добавьте 25 мМ HEPES (pH 7,7), 200 мМ L-глутаминовой кислоты калия и 0,5 мМ TCEP. Хранить при температуре 4 °C.
    3. Очистите биотинлигазу BirA и храните при температуре -80 °C.
  2. Биотинилирование белка
    1. Замените белковый буфер на буфер биотинилирования белка. Для биотинилирования смешайте 100 мкл 100 мкМ АТФ, 100 мкл 100 мкМ MgOAc, 100 мкл 500 мкМ d-биотина, 10 мкл 100 мкМ биотиновой лигазы BirA, 50 мкМ белка до конечного объема 1 мл и инкубируйте в течение ночи при 4 °C.
    2. Удалите свободный d-биотин с помощью центробежного фильтра 10 K MWCO.
    3. Инкубировать 20 мкл биотинилированного белка с 20 мкл 15 мкМ стрептавидина в течение 20 мин на льду. Определите эффективность биотинилирования белка с помощью SDS-PAGE27.

5. Мечение белков флуорофорами

  1. Подготовка
    1. Растворите флуорофоры LD555 (донор) и LD655 (акцептор) в диметилсульфоксиде (ДМСО) до конечной концентрации 5 мМ. Хранить при температуре -20 °C.
    2. Приготовьте буфер для мечения: смешайте 25 мМ HEPES (pH 7,4), 150 мМ KCl и 5 мМ MgCl2. Хранить при температуре 4 °C.
    3. Замените белковый буфер на буфер для мечения.
  2. Маркировка флуорофорами
    1. Для внутримолекулярных анализов smFRET смешиваютцито-ТК ATL1 с LD555 и LD655 в соотношении 1:1,2:1,2 до конечного объема 100 мкл (общий объем флуорофоров не должен превышать 1 мкл) и инкубируют в течение 5 ч при 4 °C.
    2. Для межмолекулярных экспериментов smFRET инкубируют ATL1cyto-K или ATL1cyto-T с LD555 в соотношении 1:1,2 и одновременно инкубируют биотинилированный ATL1cyto-K с LD655 в соотношении 1:1,2 в течение 5 ч при 4 °C (тот же объем инкубации, что и в 5.2.1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коинкубация белка и красителей обеспечивает гибкость в позициях мечения для LD555 (донор) и LD655 (акцептор). Тот факт, что LD555 помечен как T51C или K400C, не влияет на результаты эксперимента FRET. Приведена принципиальная схема мечения донора на участке T51C (рис. 1C,D).
    3. Удалите избыток свободных флуорофоров с помощью спиннинговых обессоливающих колонн MWCO7 K 27.
    4. Добавляйте TCEP к белкам, меченным флуорофорами, в конечной концентрации 0,5 мМ.
    5. Определение эффективности мечения белков с помощью спектрофотометра. Измерьте абсорбцию белка при 280 нм, абсорбцию LD555 при 555 нм и абсорбцию LD555 при 655 нм, а также рассчитайте молярные концентрации с использованием их коэффициентов экстинкции соответственно. Эффективность мечения белка = (молярная концентрация флуоресцентного красителя/молярная концентрация белка) x 100%.

6. Визуализация одномолекулярных FRET

  1. Подготовка
    1. Приготовьте инкубационный буфер: смешайте 25 мМ HEPES (pH 7,4), 150 мМ KCl и 5 мМ MgCl2. Хранить при температуре 4 °C.
    2. Приготовьте 1 мг/мл стрептавидина (растворенного в ddH2O) и 1 мг/мл биотинилированного антитела к Гис для иммобилизации белков.
    3. Приготовьте 25 мМ бензойной кислоты (pH 7,4; растворена в буфере, как описано в 7.1.1) и 100 мМ протокатехуат3,4-диоксигеназы (PCD) (растворена в 40% растворе глицерина) для минимизации фотообесцвечивания во время экспериментов с smFRET.
    4. Приготовьте 100 мМ гуанозин-5'-дифосфатной натриевой соли (GDP), гуанозин-5'-O-[гамма-тио]трифосфата (GTPγS) и AlCl3 , растворенных в ddH2O. Приготовьте 1 М стокового раствора NaF, растворенного в ddH2O.
    5. Достаньте вакуумную защитную крышку и предметное стекло для микроскопа и аккуратно склейте их специальной двусторонней лентой на чистом скамейке. Установите шланги и наконечники для формирования микрофлюидной камеры с шестью каналами27.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не подвергайте модифицированное защитное стекло воздействию воздуха в течение длительного периода времени. Подготовьте микрофлюидную камеру27 перед началом экспериментов с smFRET.
  2. Коррекция картографирования
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время эксперимента флуоресцентные сигналы должны быть собраны от донорского и акцепторного каналов соответственно. Из-за использования микроскопов могут наблюдаться незначительные отклонения в полях мониторинга донорского и акцепторного каналов. Чтобы уменьшить отклонение в полях мониторинга, перед началом эксперимента необходимо выполнить калибровку картографирования.
    1. Тщательно перемешайте 10% частиц полистирола (диаметр 3 мкм), добавьте 10 мкл частиц на предметное стекло микроскопа (не модифицированные) и накройте покровным стеклом (не модифицированные).
    2. Выберите поле зрения с как можно большим количеством частиц полистирола. Снимайте видео в ярком поле с помощью флуоресцентной микроскопии с полным внутренним отражением (TIRF).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения изображений с высоким разрешением использовался масляный иммерсионный объектив с высокой числовой апертурой (100x). Для экспериментов smFRET сигналы захватывались с интервалом кадров 30 мс с помощью камеры EMCCD.
    3. С помощью пользовательского скрипта выровняйте центральное положение одной и той же частицы полистирола в канале-доноре и канале акцептора и сохраните файл карты в формате txt. Пользовательский код MATLAB, использованный в этом исследовании, доступен по адресу https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET).
  3. Иммобилизация белков в камере
    1. Для межмолекулярных экспериментов smFRET смешайте меченный LD555цито-K цито-K илицито-Т ATL1 и меченный LD655цито-K-биотин ATL1 в соотношении 1:1 с конечной концентрацией 1 мМ GTPγS или GDP/AlF4-, и инкубируйте в течение 1 ч на льду для димеризации белка.
    2. Для межмолекулярных экспериментов ATL1cyto-T и ATL1cyto-K smFRET смешивают меченый LD555цито-T цито-Т и меченный LD655цито-K-биотин ATL1 в соотношении 1:1 с конечной концентрацией 1 мМ GTPγS или GDP/AlF4-, и инкубируют в течение 1 ч на льду для получения димеризованных белков.
    3. Для внутримолекулярных анализов smFRET инкубируйте LD555 и меченный LD655цито-TK ATL1 с 1 мМ GDP в течение 1 ч на льду перед проведением экспериментов smFRET в условиях GDP.
    4. Для межмолекулярных экспериментов smFRET инкубируйте 10 мкг/мл стрептавидина (разбавленного 200 мкл инкубационного буфера) в течение 10 мин для иммобилизации белков. Для внутримолекулярных анализов smFRET добавьте 10 мкг/мл биотинилированного антитела против His (разбавленного 200 мкл инкубационного буфера) и инкубируйте в течение 10 мин для иммобилизации белков. Перед добавлением каждого раствора промойте канал с помощью инкубационного буфера.
    5. Разбавьте димер ATL1 до ~0,3 нМ или мономер до ~1 нМ в инкубационном буфере объемом 200 мкл и инкубируйте в течение 10 мин для иммобилизации белков в канале. Дважды промойте канал инкубационным буфером. Добавьте в канал бензойную кислоту и ПХД в конечной концентрации 2,5 мМ (разбавленную 200 мкл буфера).
      Примечание: Для моделирования различных стадиймолекул цитоцитов ATL1 в процессе гидролиза ГТФ нуклеотиды (GDP, GTPγS и GDP/AlF4-) добавляли в конечной концентрации 1 мМ к буферам на каждой стадии после иммобилизации белка в канале. Присоединение GTPγS имитирует связывание GTP, добавление GDP/AlF4- имитирует гидролиз GTF, добавление GDP имитирует высвобождение Pi, а apo sate представляет собой высвобождение GDP.
  4. Визуализация smFRET
    1. Отрегулируйте фокальную плоскость. Используйте ручки грубой и тонкой фокусировки, отрегулируйте фокальную плоскость, чтобы привести образец в резкий фокус. Здесь для достижения оптимальной фокусировки была использована автоматизированная система фокусировки.
    2. Настройте источник возбуждения. В качестве возбуждающего источника света используйте лазер с длиной волны 532 нм. Отрегулируйте мощность лазера до подходящего уровня, чтобы возбудить флуорофоры. Здесь использовалась мощность лазера 20-40 мВт.
    3. Подключите камеру EMCCD к микроскопу. Настройте камеру на запись с интервалом кадров 30 мс. Убедитесь, что камера настроена на съемку изображений в 16-битном режиме для передачи данных с высоким разрешением.
    4. Запишите видеоролик, чтобы фокус оставался неизменным на протяжении всего процесса съемки. Продлите время лазерного облучения с длиной волны 532 нм как можно дольше до тех пор, пока большая часть флуоресцентных молекул не погаснет при регистрации сигналов флуоресценции.
    5. Сохраните записанные видеоролики в 16-битном формате TIFF для дальнейшего анализа.

7. Сбор и анализ данных

  1. Загрузите файл map txt для коррекции перед извлечением траекторий FRET из записанных фильмов. Выберите траектории FRET и сохраните данные каждой траектории FRET в формате txt для дальнейшего анализа.
  2. Извлеките данные из txt-файлов и рассчитайте значения FRET с помощью самодельных скриптов в Matlab2022a. Пользовательский код MATLAB доступен по адресу https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значение FRET рассчитывается с использованием уравнения ILD655/(γILD555+ILD655). ILD555 и ILD655 представляют интенсивности флуоресценции LD555 и LD655 соответственно. γ — это параметр, получаемый по формуле γ = FA/FD. FA представляет собой уменьшение интенсивности акцептора, а FD — приращение интенсивности донора.
  3. Подгоните данные smFRET от GaussAmp в Origin 2022, чтобы получить гистограмму распределения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для данных с несколькими состояниями FRET (данные при условии GTPγS в межмолекулярном smFRET или данные внутримолекулярного smFRET при условии GDP или Apo) можно использовать многопиковую аппроксимацию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эксперименты по smFRET проводились на микроскопе TIRF путем измерения интенсивности флуоресценции флуорофоров каждые 30 мс. Репрезентативные изображения меченых LD555 (донорской) и/или LD655 (акцепторной)цитомолекул ATL1 в отсутствие или в присутствии различных нуклеотидов представлены на рисунке 2A-C. Были зарегистрированы интенсивности флуоресценции двух флуорофоров на отдельных частицах, и выделены сотни траекторий FRET, демонстрирующих типичны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Технология FRET основана на передаче энергии между двумя флуоресцентными красителями (донорным и акцепторным). В случае их близости друг к другу (обычно 1-10 нм) возбужденный донор передает свою энергию акцептору, в результате чего происходит снижение интенсивности донорской флуоресценции и увеличение интенсивности акцепторной флуоресценции.

В экспериментах с smFRET молекулы разбавляются до очень низких концентраций и иммобилизуются на предметных стеклах, а си...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

X.B. поддерживается Национальным фондом естественных наук Китая (32371287), Фондами фундаментальных исследований для центральных университетов (63223043 и 63233053) и Проектом по подготовке талантов в Университете Нанкай (035-BB042112). Y.L. поддерживается Национальным фондом естественных наук Китая (12022409 и T2221001) и Программой ключевых исследований пограничных наук CAS (ZDBS-LY-SLH015). L.M. поддерживается Национальным фондом естественных наук Китая (32271274 и 31770812).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Центробежные фильтры 10 КАмиконUFC901096
3-аминопропилтриэтоксисилан (APTES)Sigma-Aldrich440140
45 Ti ротор
532 нм лазерOlympus
640 нм лазерOlympus
7 K MWCO спиновые обессоливающие колонныThermo Scientific89882
Аденозин 5-трифосфат динатриевая соль (АТФ)Roche11140965001
бензойная кислотаSigma-Aldrich242381
Biotin-PEG-SVA-5000Laysan Bio170-124
Биотинилированные антиантитела HisBioss Antibodiesbs-0287R-bio
d-биотинSigma-AldrichB4501
Коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТАRoche11873580001
EMCCD камераAndorIX897
Гуанозин 5′-дифосфатная натриевая соль (GDP)Sigma-Aldrich  G7127
Гуанозин 5'-О-[гамма-тио]трифосфат (ГТФ и гамма; S)Roche10220647001
Масляный иммерсионный объектив с высокой числовой апертуройNikonNikon, 100x, N.A. 1.49, масляный иммерсионный
объектив ImageJNIHhttps://imagej.net/ij/
изопропил-&бета;-D-тиогалактозидSigma-AldrichI5502
LD555-MALLumidyne4
LD655-MALLumidyne10
L-глутаминовая кислота калияSigma-AldrichG1501
Тетрагидрат ацетата магнияSigma-AldrichM0631
MatlabThe MathWorks, Natick, MAhttps://www.mathworks.com/
Микроскоп Cover glassFisherbrand18834 ( 24 мм & раз; 60 мм)
ПредметныеCustomized, (75 мм & раз; 26 мм & раз; 1 мм) с 6 парами диаметром 1,2 мм через отверстия
mPEG-SVA-5000Laysan Bio170-106
Ni Sepharose 6 Fast FlowCytiva17531802
программное обеспечение OriginOrigin https://www.originlab.com/
Частицы полистиролаQDSphereAG1265
Протокатехуат3,4-диоксигеназаSigma-AldrichP8279
СтрептавидинСангон БиотекA610492
Superdex 200 увеличение (10/300 GL)Cytiva28990944
микроскопTIRF NikonTi2
Tris(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлорид (TCEP)Thermo75259
стекла для микроскопа

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jimah, J. R., Hinshaw, J. E. Structural insights into the mechanism of dynamin superfamily proteins. Trends Cell Biol. 29 (3), 257-273 (2019).
  2. Kalia, R., Frost, A. Open and cut: Allosteric motion and membrane fission by dynamin superfamily proteins. Mol Biol Cell. 30 (17), 2097-2104 (2019).
  3. Ramachandran, R., Schmid, S. L. The dynamin superfamily. Curr Biol. 28 (8), R411-R416 (2018).
  4. Bryce, S., et al. Human atlastin-3 is a constitutive ER membrane fusion catalyst. J Cell Biol. 222 (7), e202211021(2023).
  5. Crosby, D., et al. Reconstitution of human atlastin fusion activity reveals autoinhibition by the C terminus. J Cell Biol. 221 (2), e202107070(2022).
  6. Hu, J., et al. A class of dynamin-like GTPases involved in the generation of the tubular er network. Cell. 138 (3), 549-561 (2009).
  7. Jang, E., et al. Human atlastins are sufficient to drive the fusion of liposomes with a physiological lipid composition. J Cell Biol. 222 (4), e202109090(2023).
  8. Liu, X., et al. Atlastin-1 regulates morphology and function of endoplasmic reticulum in dendrites. Nat Commun. 10 (1), 568(2019).
  9. Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like gtpase atlastin. Nature. 460 (7258), 978-983 (2009).
  10. Rismanchi, N., Soderblom, C., Stadler, J., Zhu, P. P., Blackstone, C. Atlastin GTPases are required for Golgi apparatus and er morphogenesis. Hum Mol Genet. 17 (11), 1591-1604 (2008).
  11. Faust, J. E., et al. The atlastin C-terminal tail is an amphipathic helix that perturbs the bilayer structure during endoplasmic reticulum homotypic fusion. J Biol Chem. 290 (8), 4772-4783 (2015).
  12. Liu, T. Y., et al. Lipid interaction of the c terminus and association of the transmembrane segments facilitate atlastin-mediated homotypic endoplasmic reticulum fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), E2146-E2154 (2012).
  13. Moss, T. J., Andreazza, C., Verma, A., Daga, A., Mcnew, J. A. Membrane fusion by the GTPase atlastin requires a conserved c-terminal cytoplasmic tail and dimerization through the middle domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (27), 11133-11138 (2011).
  14. Bian, X., et al. Structures of the atlastin GTpase provide insight into homotypic fusion of endoplasmic reticulum membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (10), 3976-3981 (2011).
  15. Byrnes, L. J., et al. Structural basis for conformational switching and GTP loading of the large g protein atlastin. EMBO J. 32 (3), 369-384 (2013).
  16. Byrnes, L. J., Sondermann, H. Structural basis for the nucleotide-dependent dimerization of the large g protein atlastin-1/spg3a. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (6), 2216-2221 (2011).
  17. Morin-Leisk, J., et al. An intramolecular salt bridge drives the soluble domain of gtp-bound atlastin into the postfusion conformation. J Cell Biol. 195 (4), 605-615 (2011).
  18. Pendin, D., et al. GTP-dependent packing of a three-helix bundle is required for atlastin-mediated fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16283-16288 (2011).
  19. Winsor, J., Hackney, D. D., Lee, T. H. The crossover conformational shift of the GTPase atlastin provides the energy driving ER fusion. J Cell Biol. 216 (5), 1321-1335 (2017).
  20. Yan, L., et al. Structures of the yeast dynamin-like GTPase sey1p provide insight into homotypic er fusion. J Cell Biol. 210 (6), 961-972 (2015).
  21. Rizo, J. Molecular mechanisms underlying neurotransmitter release. Annu Rev Biophys. 51, 377-408 (2022).
  22. Gao, S., Hu, J. Mitochondrial fusion: The machineries in and out. Trends Cell Biol. 31 (1), 62-74 (2021).
  23. Kelly, C. M., Byrnes, L. J., Neela, N., Sondermann, H., O'donnell, J. P. The hypervariable region of atlastin-1 is a site for intrinsic and extrinsic regulation. J Cell Biol. 220 (11), e202104128(2021).
  24. Asher, W. B., et al. GPCR-mediated beta-arrestin activation deconvoluted with single-molecule precision. Cell. 185 (10), 1661-1675.e16 (2022).
  25. Li, M., et al. Mechanism of DNA translocation underlying chromatin remodelling by snf2. Nature. 567 (7748), 409-413 (2019).
  26. Chen, Y., et al. Conformational dynamics of dynamin-like MXA revealed by single-molecule fret. Nat Commun. 8, 15744(2017).
  27. Shi, L., et al. Dissecting the mechanism of atlastin-mediated homotypic membrane fusion at the single-molecule level. Nat Commun. 15 (1), 2488(2024).
  28. Guelly, C., et al. Targeted high-throughput sequencing identifies mutations in atlastin-1 as a cause of hereditary sensory neuropathy type i. Am J Hum Genet. 88 (1), 99-105 (2011).
  29. Montagna, A., Vajente, N., Pendin, D., Daga, A. In vivo analysis of CRISPR/Cas9 induced atlastin pathological mutations in drosophila. Front Neurosci. 14, 547746(2020).
  30. Ulengin, I., Park, J. J., Lee, T. H. ER network formation and membrane fusion by atlastin1/spg3a disease variants. Mol Biol Cell. 26 (9), 1616-1628 (2015).
  31. Zhao, X., et al. Mutations in a newly identified GTPase gene cause autosomal dominant hereditary spastic paraplegia. Nat Genet. 29 (3), 326-331 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FRETFRETEMCCD

Похожие статьи