Методическая статья

Визуализация внеклеточных ловушек нейтрофилов в брыжеечных венулах после ишемиально-реперфузионного повреждения брыжейки с помощью прижизненной микроскопии

DOI:

10.3791/67264

⸱

27 сентября 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Center for Thrombosis and Hemostasis (CTH), University Medical Center Mainz, Johannes Gutenberg-University Mainz, 2German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Rhine-Main

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе представлен метод индуцирования ишемиально-реперфузионного повреждения брыжейки и визуализации внеклеточных ловушек нейтрофилов (НЭО) в брыжеечных венулах с помощью прижизненной микроскопии. Кровоток в верхней брыжеечной артерии ограничивали в течение 1 ч с последующей реперфузией, позволяющей напрямую количественно оценить адгезию лейкоцитов и нетоз.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ишемия-реперфузионное повреждение кишечника (I/R) является острым состоянием, характеризующимся повреждением тканей в результате ограничения притока крови к брыжеечным сосудам, что приводит как к местным, так и к системным патологиям с плохим прогнозом. Как ишемия, так и реперфузия запускают ряд клеточных и молекулярных реакций, при этом воспалительные клетки выступают в качестве ключевых регуляторов патологии. Эти взаимодействия с ишемизированным эндотелием опосредованы множественными рецепторами адгезии. Было создано несколько животных моделей для имитации этой патологии и исследования вовлеченных молекулярных путей. В этом исследовании микрохирургическая модель повреждения I/R сочетается с прижизненной микроскопией для визуализации переворачивания лейкоцитов, адгезии и формирования внеклеточной ловушки нейтрофилов (НВЛ). Эта модель применяется к трансгенным мышам с дефицитом эндотелиального PAR1 (F2r) для оценки влияния PAR1 на перекатывание лейкоцитов и образование NET через 1 ч после ишемии и сразу после реперфузии. In vivo использовали окрашивание лейкоцитов Acridine Orange, а НВЛ визуализировали с помощью окрашивания нуклеиновыми кислотами. Интересно, что снижение адгезии лейкоцитов и образование НВЛ наблюдались у мышей, у которых отсутствовал эндотелиальный рецептор PAR1. Эта модель позволяет in vivo анализировать ключевые регуляторы, участвующие в повреждении внутримышечного ввода.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Острая брыжеечная ишемия (ОИМ) – редкая патология1 с высоким рискомсмертности2, характеризующаяся снижением кровотока в брыжейке из-за тромбов в целиакической оси, или верхней или нижней брыжеечной артерии. В 60-70% случаев острые окклюзии верхней брыжеечной артерии вследствие тромбоза или эмболизации являются причиной острой ишемии кишечника3. Напротив, в 5-15% случаев брыжеечный венозный тромбоз является причиной мезентериальной ишемии с вовлечением верхней брыжеечной вены и, реже, нижней брыжеечнойвены4. Гипоксия и недостаточность питания, возникающие в результате ишемии, приводят к нарушениям энергетического обмена на клеточном уровне5. Например, нарушение функции митохондрий активирует множество сигнальных путей, запуская механизмы клеточной смерти6. Хотя быстрая реперфузия позволяет восстановить аэробный метаболизм, восстановление притока крови к ишемизированной области часто вызывает обширное повреждение тканей из-за продукции активных форм кислорода (АФК)7, перегрузки кальцием8, эндотелиальной дисфункции9 и воспалительных реакций10.

Было создано множество экспериментальных моделей на животных, использующих временную окклюзию сосудов верхней брыжеечной артерии, для выяснения молекулярных механизмов во время ишемии-реперфузионного повреждения (I/R)11. Использование таких моделей в сочетании с прижизненной микроскопией (КБП) имеет основополагающее значение для получения представления о лежащих в основе клеточных взаимодействиях ипрогрессировании заболевания. Дисфункция кишечного барьера наблюдается вскоре после ишемии12, при этом эпителий теряет свою целостность13, что приводит к бактериальной транслокации во внекишечные участки, такие как брыжеечные лимфатические узлы, селезенка, печень и почки12,14. Реперфузия еще больше усугубляет повреждение слизистой оболочки15. Воспалительная реакция в артериолах проявляется раскатыванием и прочной адгезией лейкоцитов на слое эндотелиальных клеток, который зависит от таких молекул, как L-селектин16, P-селектин (CD62P)17, тромбоциты GPIIb/IIIa и фибриноген18. Интересно, что адгезия лейкоцитов к брыжеечным венулам зависит от наличия в кишечнике микробиоты19 и сигнального рецептора Toll-подобного рецептора 410. Повреждение I/R также вызывает образование внеклеточной ловушки нейтрофилов (НВЛ)10. Терапевтическое воздействие на внеклеточную ДНК, происходящую из активированных лейкоцитов, таких как нейтрофилы, улучшает исход повреждения кишечного I/R20. В печени повреждение I/R воспламеняется резидентными микрофагами21, и ингибирование микроРНК заметно ослабляет апоптоз22. Следует отметить, что повреждение внутривенного введения брыжейки приводит к дисбактериозу кишечника, который является обратимым и разрешается после реваскуляризации.

Эндотелий также подвержен разрушительному воздействию повреждения внутривенного введения, при этом ключевую роль в этом процессеиграет АФК. Наблюдаются адгезия лейкоцитов к слою эндотелиальных клеток, повреждение эндотелия и изменения метаболизма оксида азота (NO)9. Тем не менее, задействованные молекулярные пути еще не полностью изучены.

Протеаза-активируемый рецептор 1 (PAR1, F2r) представляет собой мембранный рецептор, экспрессируемый различными клетками, включая эндотелиальные клетки, и активируется во время воспалительных состояний25. Его активация происходит, когда сериновые протеазы расщепляют рецептор на N-конце, обнажая связанный лиганд, который, в свою очередь, активирует рецептор, связываясь со второй внеклеточной петлей молекулы26. Сигнальный путь рецептора эндотелиального белка С (EPCR)-PAR1 влияет на эндотелиальный гомеостаз NO и способствует восстановлению кровотока при периферической ишемии27.

В этом исследовании повреждение I/R было применено к генетической модели мыши, характеризующейся дефицитом PAR1, специфичным для эндотелиальных клеток, для визуализации скручивания лейкоцитов, адгезии и образования НВЛ. Комбинация генетической модели мыши и прижизненной микроскопии после внутримышечной микрохирургии дает ценную информацию, выделяя конкретные типы клеток, участвующие в прогрессировании заболевания. Применение I/R повреждения к генетическим мышиным моделям играет важную роль в определении потенциальных терапевтических мишеней, которые могут быть использованы для улучшения течения заболевания. Кроме того, было показано значение эндотелиального PAR1 в NETosis.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры с участием мышей были одобрены местным комитетом по законодательству о животных (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Koblenz, Germany; G21-1-041). 6-8-недельный кобель и самка В6. Для исследования использовались мыши FVB-F2rtm1a(EUCOMM) Tg/Cdh5-cre)7Mlia/tarc. Специфическая для эндотелиальных клеток регуляция F2r (PAR1) происходит через промотор28 VE-Cadherin Cre. В этом исследовании flox-F2r x VE-Cadherin Cre+ (F2RΔEC) демонстрировали сниженную экспрессию F2r (PAR1) на эндотелиальных клетках, а flox-F2r x VE-Cadherin Cre- (WT) экспрессировали нормальные эндотелиальные уровни F2r (PAR1). Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка к операции

  1. Простерилизовать необходимые хирургические инструменты (ножницы очень узкие прямые, щипцы, сосудистый зажим и т.д.).
  2. Подготовьте систему анестезии на основе кислорода и изофлурана с помощью носового конуса и нагревательной пластины.

2. Подготовка животных

  1. Взвесьте животное.
  2. Проведение анестезии: обезболивание мышей путем внутрибрюшинного (внутримышечно) введения раствора, содержащего мидазолам (5 мг/кг), медетомидин (0,5 мг/мл) и фентанил (0,5 мг/кг) (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
  3. Удалите шерсть с шеи и живота с помощью электробритвы для мелких животных.
  4. Расположите мышь в положении лежа на грелке и подключите ее к кислородной системе через носовой конус. Закрепите конечности мыши на подогреваемой подушке с помощью хирургической ленты. Убедитесь, что латексная мембрана носового конуса плотно прилегает к голове мыши. Контролируйте температуру тела животного ректально с помощью специального термометра для грызунов.
  5. Нанесите крем для удаления волос, чтобы удалить оставшиеся волосы в области операции на шее, и протрите кожу в области операции 70% этанолом.
  6. Проведите тест на защемление пальцев ног (рефлекс педали), чтобы убедиться, что животное полностью обезболито.

3. Хирургическое вмешательство

  1. Имплантация катетера в яремную вену
    1. Сделайте поперечный разрез (~0,5 см) над трахеей, удалите кожу, покрывающую шею, и изолируйте правую яремную вену.
    2. Используйте шелковую нить длиной около 5 см, закройте дистальный конец вены, и зафиксируйте его хирургическими щипцами. Поместите три шелковые нити примерно на 2 см ниже вены: одну близко к дистальному концу и две близко к проксимальному концу яремной вены. Завяжите хирургический узел, но не закрывайте сосуд.
    3. Подготовьте полиэтиленовый катетер (внутренний диаметр 0,28 мм, внешний диаметр 0,61 мм), заполненный 0,9% NaCl и заглушенный шприцем объемом 1 мл. С помощью ножниц вырежьте отверстие между вторым и третьим узлами и имплантируйте катетер в яремную вену. Аспирируйте шприц, чтобы убедиться, что кровь присутствует в катетере.
    4. Зафиксируйте катетер в вене, завязав шелковую нить, обеспечив ее надежное крепление. Используйте медицинскую ленту для фиксации шприца.
    5. Приготовьте апельсиновый акридин: развести 1:4 а 2 мг/мл стокового раствора стерильным физиологическим раствором (конечная концентрация 0,5 мг/мл) в шприце объемом 1 мл. Держите шприц в темноте и введите 50 мкл в мышь.
    6. Приготовьте краситель для нуклеиновых кислот: развести 1:1000 стоковый раствор 5 мМ со стерильным физиологическим раствором (конечная концентрация 5 мкМ) в шприце объемом 1 мл. Держите шприц в темноте и введите 50 мкл в мышь.
    7. Введите in vivo апельсиновый акридин (50 мкг/л, 50 мкл на мышь) через катетер яремной вены для визуализации окрашенных лейкоцитов и флуоресцентного красителя на основе внеклеточной ДНК аналогично окрашиванию внеклеточных ловушек нейтрофилов (НВЛ) (5 мкМ, 50 мкл на мышь). НВЛ и лейкоциты визуализируются одновременно.
  2. Модель травмы брыжеечного в/р
    1. Продезинфицируйте кожу живота 70% этанолом.
    2. Проведите лапаротомию 3-5 см по белой линии с помощью хирургических ножниц.
    3. С помощью двух смоченных в физрастворе ватных наконечников аккуратно удалите кишечник и определите место с минимальным покрытием жира. Расположите тонкие веточки кишечника на черном тесте, чтобы уменьшить фоновый сигнал.
    4. Приобретайте видео до I/R (предишемии).
    5. Сделайте компресс влажный с NaCl и поместите в него кишечник. Убедитесь, что кишечник окружен компрессом и поддерживает влажность во время шага 5.6.
    6. Окклюзируйте верхнюю брыжеечную артерию небольшим сосудистым зажимом.
    7. Аккуратно протолкните кишечник обратно в брюшную полость с помощью ватных тампонов, смоченных солевым раствором, и используйте шов 7-0, чтобы закрыть брюшную стенку, чтобы предотвратить потерю влаги и температуры. Поддерживайте ишемию в течение 60 минут, проверяя анестезию не реже одного раза в 20 минут.
    8. Через 1 ч инициируйте реперфузию, сняв зажим.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное проведение процедуры ишемии приводит к видимым изменениям. Первоначально пораженный участок будет казаться бледным или белым из-за отсутствия кровотока. После снятия зажима кровоток постепенно вернется к ишемизированной области, которая вновь приобретет свой нормальный цвет, что будет означать успешную окклюзию. Крайне важно постоянно внимательно наблюдать за мышью на протяжении всей стадии ишемии.
    9. После ишемического периода нанесите несколько капель физиологического раствора на стриженый участок, затем аккуратно удалите микрососудистые зажимы с помощью клипс-аппликатора.
    10. С помощью ватных наконечников, смоченных солевым раствором, снова аккуратно удалите кишечник, расположите маленькие ветви вены на черном тесте, снова введите 50 μL апельсина Acridine и снимите видео той же вены в том же месте (после ишемии).

4. Прижизненная высокоскоростная видеоэпифлуоресцентная микроскопия

  1. Визуализируйте лейкоциты и НВЛ с помощью высокоскоростного широкопольного флуоресцентного микроскопа, оснащенного конденсором дальнего действия, монохроматором, объективом с 10-кратным погружением в воду и камерой устройства с зарядовой связью. Получение изображения проводилось с выдержкой 30 мс и фильтрами Alexa Fluor 488 (495/519) и Rhodamine Red (570/590).
  2. Используйте программное обеспечение для обработки изображений для получения и анализа изображений.
  3. Количественно оценивайте набор клеток в пределах области интереса 0,06 мм².
  4. Количественно определите адгезивные лейкоциты как клетки, остающиеся неподвижными или прикрепленными к эндотелиальной выстилке в течение 20-секундного периода наблюдения.
  5. Идентификация НВЛ как внеклеточных структур, меченных как лейкоцитарными, так и внеклеточными флуоресцентными красителями на основе нуклеиновых кислот.
  6. Усыплять животных путем вывиха шейки матки в конце эксперимента (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).

5. Выделение эндотелиальных клеток печени (ЛЭК) и количественная ОТ-ПЦР

  1. Выделение LEC с помощью магнитной сортировки клеток (MACS)29.
  2. Изолировать общую РНК.
  3. Синтез комплементарной ДНК (кДНК)27 путем смешивания 2 г общей РНК с 2 μл RT буфера, 0,8 μл смеси dNTP, 2 μл случайных праймеров RT, 1 μл обратной транскриптазы и 4,2 μл стерильной дистиллированной H2O.
  4. Транскрипцию кДНК проводили в следующих условиях: 25 °C в течение 10 мин, 37 °C в течение 120 мин, 85 °C в течение 5 мин.
  5. Используйте 20 нг кДНК для количественной ПЦР.
  6. Используйте следующие капсюли: F2r (прямой): TGAACCCCCGCTCATTCTTTC, F2r (обратный): CCAGCAGGACGCTTTTTTTTTTTTTTTTT, L32 (прямой): CCTCTGGTGAAGCCCAAGATC, L32 (обратный): TCTGGGTTTCCGCCAGTTT. Используйте следующие условия: 95 °C в течение 30 с, 45 циклов (95 °C в течение 10 с, 60 °C в течение 25 с), от 60 °C до 95 °C в течение 6 с с ΔΤ 1 °C.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для изучения влияния эндотелиальных клеток на скручивание и адгезию лейкоцитов, а также на образование НВЛ, первоначально изучалась эффективность индуцируемого F2r-дефицита VE-кадгерина Cre в эндотелиальных клетках. Магнитная сортировка клеток была использована для выделения эндотелиальных клеток печени. Впоследствии выделяли РНК с последующей количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR). У мышей F2rΔEC , у которых отсутствовала рекомбиназа Cre, экспрессируемая под контролем промотора VE-кадгерина, наблюдалось значительно сниженное количество мРНК F2r (PAR1) (примерно на одну треть) по сравнению с контрольной группой WT (рис. 1).

После подтверждения дефицита в мышиной линии было выполнено повреждение брыжеечным в/р для изучения влияния PAR1, экспрессируемого сосудистыми эндотелиальными клетками, на скручивание и адгезию лейкоцитов, визуализированное с помощью прижизненной микроскопии (рис. 2A, B). После 1 ч ишемии зажим удаляли, и сосуду давали реперфузироваться. Наблюдалось и регистрировалось перекатывание лейкоцитов и адгезия (окрашены в зеленый цвет, обозначены белыми стрелками). Несмотря на то, что в обеих группах наблюдалось повышенное количество адгезивных лейкоцитов после повреждения I/R, дефицит эндотелиального F2r (PAR1) привел к заметному, но не значимому снижению адгезии лейкоцитов к I/R-активированному брыжеечному эндотелию, что свидетельствует об активной роли активации эндотелиального PAR1 в рекрутировании лейкоцитов в ишемизированные брыжеечные венулы (рис. 2C).

Следующей целью было изучить, регулирует ли экспрессия эндотелиального PAR1 образование НВЛ, вызванное повреждением I/R. Таким образом, внеклеточные нуклеиновые кислоты окрашивали непроницаемым для клеток красителем30 и визуализировали полученные НВЛ с помощью прижизненной микроскопии (обозначены черными стрелками) (рис. 2А, В). После повреждения I/R НВЛ наблюдались только в группе WT, экспрессируя нормальные уровни PAR1 на эндотелиальных клетках, что указывает на регуляторную роль PAR1 в нетозе (рис. 2C, D). Примечательно, что при подавлении экспрессии эндотелия F2r в поврежденных I/R брыжеечных венулах не было НВЛ.

figure-results-1
Рисунок 1: Экспрессия мРНК F2r (PAR1). Экспрессия эндотелиальных клеток печени F2r у мышей WT (n = 6) и F2rΔEC (n = 9) по отношению к гену домашнего хозяйства L32 . Данные представлены в виде медианы с 95% доверительным интервалом. Критерий Манна-Уитни был использован для сравнения двух независимых групп, *p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Эндотелиальный PAR1 влияет на адгезию лейкоцитов и образование НВЛ в I/R-поврежденных брыжеечных венулах. Репрезентативные прижизненные микроскопические изображения адгезивных лейкоцитов, окрашенных оранжевым акридином (белые стрелки), и НВЛ, окрашенных оранжевым ситоксом (черные стрелки) мышей WT и F2rΔEC до (до) и после (после) I/R повреждения (A) 10x и (B) 20x увеличения. Масштабные линейки: А, 50 мкм; B, 20 мкм. (C) адгезия лейкоцитов и (D) НЭО намм2 у мышей WT (n = 7) и F2rΔEC (n = 4) до (до) и после (после) повреждения I/R. Все данные были представлены в виде медианы с 95% доверительным интервалом. Статистические сравнения проводились с использованием двухфакторного теста ANOVA (**p< 0,01 и множественных сравнительных тестов Сидака для сравнения средних значений различных генотипов в каждый момент времени (до и после ишемии). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Повреждение брыжеечного в/р в сочетании с прижизненной микроскопией было применено к генетической мышиной модели дефицита F2r (PAR1) в эндотелиальных клетках для анализа in vivo лейкоцитов и НЭО после 1 ч ишемии. Модель мышечного внутримышечного повреждения часто используется у грызунов с ишемией и временем реперфузии от минуты до нескольких часов23,31, что влияет на воспалительный исход32 и смертность33. Модель также зависит от нескольких факторов, включая микробиоту19,34, иммунные рецепторы 10,35,36,37, пол38,39 и возраст35 лет. Помимо разного времени внутримышечного ввода, еще одной переменной в этой модели является дифференциальная реакция различных частей кишечника на повреждение, при этом тонкая кишка демонстрирует большее повреждение слизистой оболочки, чем толстая кишка40. Расположение микрососудистого клипса, воздействующего на ишемизированную область, имеет решающее значение для воспроизводимости метода 32,33. Важно отметить, что окклюзия верхней брыжеечной артерии в сочетании с прерыванием коллатерального кровотока приводит к показателям смертности, которые постоянно связаны с продолжительностью ишемии41.

В этом исследовании мышей подвергали ишемии в течение 1 ч, а адгезия лейкоцитов in vivo и образование НВЛ визуализировались сразу после реперфузии для изучения ранней воспалительной реакции, вызванной ишемическим состоянием при отсутствии экспрессии эндотелия F2r . Применение этих методов к генетическим моделям мышей позволяет исследовать, как определенные молекулы-мишени влияют на клеточное поведение и воспалительную реакцию как после ишемии, так и во время реперфузии.

В протоколе есть несколько важнейших этапов, включая поддержание целостности кишечника. Работа с кишечником должна производиться осторожно, чтобы избежать повреждения тканей. Для этой цели подходящим средством для временного отсоединения кишечника от брюшной полости являются влажные ватные палочки. Крайне важно, чтобы кишечник оставался влажным до тех пор, пока он не переместится в брюшную полость. Незначительные травмы при работе могут вызвать активацию различных типов клеток, таких как тромбоциты и эндотелиальные клетки, что может повлиять на результаты.

Для получения консистенции крайне важно визуализировать один и тот же участок кишечных сегментов до и после ишемии. Это может быть сложной задачей, потому что после ишемии кишечник перемещается в брюшную полость. Чтобы решить эту проблему, один из подходов заключается в том, чтобы поместить небольшой кусочек влажного компресса на ту часть кишечника, которая была визуализирована до ишемии.

Чтобы визуализировать скручивание и адгезию лейкоцитов, а также образование NET in vivo, мышам вводили как лейкоцитарный, так и флуоресцентный краситель нуклеиновых кислот через яремную вену. Лейкоцитарный краситель (см. Таблицу материалов) представляет собой проникающий в клетки метахроматический флуоресцентный краситель, который связывается с лейкоцитами, но не с эритроцитами, и широко используется для окрашивания лейкоцитов in vivo 17,42. Краситель вводится внутривенно и обеспечивает сильное окрашивание лейкоцитами в течение нескольких секунд. Тем не менее, специфичность может быть ограничением, поскольку она также окрашивает другие ядросодержащие клетки, такие как эндотелиальные клетки. Тем не менее, клетки кровообращения дольше сохраняют окрашивание благодаря эффекту вымывания43. Флуоресцентный краситель нуклеиновых кислот (см. Таблицу материалов) представляет собой непроницаемый для клеток краситель нуклеиновой кислоты, обычно используемый для визуализации образования NET 30,44,45. Он также может применяться внутривенно, связывается с высокой аффинностью, а также быстр и прост в использовании. Опять же, специфичность является недостатком, так как краситель будет связываться с любой клеткой с неповрежденной мембраной. В идеале его следует сочетать с нейтрофильным маркером (например, CD15, CD11b) или маркером нетоза (например, антителами против citH3) для повышения специфичности. Эти красители позволяют in vivo визуализировать лейкоциты в брыжеечных венулах лабораторных животных.

Основным ограничением метода является наличие висцерального жира, который ограничивает визуализацию кишечных капилляров и значительно затрудняет получение изображения. Чтобы избежать этого осложнения, необходимо использовать молодых экспериментальных животных (в возрасте 6-8 недель), у которых снижено образование висцерального жира. Кроме того, гистологический анализ ex vivo затруднен использованием окрашивания in vivo . Еще одним ограничением является влияние микробиоты кишечника и рациона на эту модель, которое может сильно различаться в зависимости от разведения мышей46. Чтобы устранить это ограничение, можно рассмотреть изучение моделей гнотобиотических мышей10.

В этом исследовании изучали немедленный клеточный ответ после ишемии, а также наблюдалось снижение отложения лейкоцитов до активированного брыжеечного эндотелия и образование НВЛ in vivo. Деградация НВЛ путем внутривенного введения ДНКазы через 1 ч после ишемии снижает раннюю провоспалительную реакцию и улучшает нарушение кишечного барьера47. Следует отметить, что лечение тромбомодулином, трансмембранным гликопротеином, который ингибирует активность тромбина48, улучшило выживаемость мышей с тяжелым повреждением кишечного I/R, ослабив воспалительную реакцию эндотелиальной дисфункции и уменьшив интенсивное накопление гистонов в отдаленных органах49. Было показано, что эндотелиальный тромбиновый рецептор влияет на исход внутримышечного ввода, что подчеркивает важность сочетания модели повреждения кишечного внутривенного холестерина с прижизненной микроскопией у генетически модифицированных мышей для изучения важных медиаторов патологии заболевания.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не раскрывают конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.R. выражает признательность за финансирование от Forschungsinitiative Rheinland-Pfalz и ReALity (проект MORE), BMBF Cluster4Future CurATime (проект MicrobAIome; 03ZU1202CA), Фонда Вильгельма Зандера (Nr. 2022.131.1) и Инновационного фонда «Микробиом» Deutsche Zentren der Gesundheitsforschung (DZG) (81X2210129). К.Р. является научным сотрудником Немецкого центра сердечно-сосудистых исследований (DZHK). К.Р. является членом Центра трансляционной сосудистой биологии (CTVB), Исследовательского центра иммунотерапии (FZI) и Prospectbereich EXPOHEALTH при Университете Иоганна Гутенберга в Майнце. К.Р. является членом исследовательского подразделения DFG 5644 INFINITE (RE 3450/15-1). К.Р. был удостоен стипендии Исследовательского колледжа Гутенберга при Университете Иоганна Гутенберга в Майнце. К.К. поддерживается Программой передового опыта ДЖК «Продвижение женщин-ученых» и является членом Молодой ДЖК. З.Г. и О.Д. являются аспирантами Исследовательской школы трансляционной биомедицины Майнца (TransMed).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Акридин оранжевыйСигма-Олдрич  А-6014
96-луночный планшет Multiply PCR-Platten Sarstedt721977202.00
Системы анестезии для грызуновGROPPLER medizintechnikUni Vet -Porta T-8
Aqua ad injectabiliaIVM B Braun Melsungen53402101
черным тестомStaedtlerпластилин для лепки
CD146 Микрогранулы, мышьMiltenyi Biotec130-092-007
cellSensOlympus OlympuscellSense Dimension Desktop 2.3программное обеспечение
зарядовое устройство камераHamamatsu PhotonicsORCA-R2камера
ватные палочкиBö ttger09-119-9100
Изогнутый гемостат 125мм/5"Indigo Instruments 22466
Крем для депиляцииBaleaне применимо
Dorbene Vetzoetis
Dumont ЩипцыFine Science Tools11251-35
Этанол в год 99,5 %Roth5504.20
Экстра узкие ножницы – Прямой/Острый-Острый/10,5FST14088-10
ФентанилJanssen-Cilag GmBH
Щипцы "Dumont #5" (Inox, наконечник 0,1 мм, длина 11 см)FST11251-20
GentleMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-236
GraphpadprismGraphpad Prism 10программное обеспечение
isoflurane Piramal4150097146757.00
iTaq UniversalSYBR Green Supermix 10x5млBioRad1725125.00
Leukofix медицинская лентаBSNMedical0213600
Набор для диссоциации печени, мышьMiltenyi Biotec130-105-807
LS-Разделительные колонки MACSMiltenyi Biotec130-042-401
MACS Smart Strainer 100 &микро; mMiltenyi Biotec130-098-463
Microseal B Seal SealsBioradMSB1001
Midazolamhameln5918501.00
NaClBraun2350748
ИглодержательFST12001-13
Нерассасывающийся плетеный шелковый шовный материал, размер: 7/0, 91 метр Fine Science Tools18020-70
Olympus BX51WI флуоресцентный микроскопOlympusмикроскоп
ПЦР для полосок пробирокSarstedt72985002.00
ПЦР крышки для пробирокSarstedt65989002.00
Плиетилен катетерSmith Medical Deutschland GmbH800/100/100
Пролен (8648G), Полипропилен 6-0, Нахтматериал Джонсон & Джонсон Медикал ГмбХ 8695H
Relia Prep RNA Miniprep SystemsPromegaZ6112
Набор для обратного танскриптинга (высокая емкость кДНК)Прикладные биосистемы4368813.00
Школьные весы KERN & SOHN GmbHEMB 500-1
пружинные ножницы - наклонные в сторонуFST15006-09
стереомикроскопLeicaM50
прямой гемостат 135 мм/5,5 "Indigo Instruments 22468
Шприц 1 млBraun9166017V
SYTOX OrangeThermo Fisher ScientificS11368
Регулятор температуры TC-1000FMI Fö hr Medical Instruments GmbHне применимо
Тканевые щипцы - 1x2 зубаFST18057-14
сосудистый зажимFine Science Tools18055-02
Vetiva miniWAHL1584-0480

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cudnik, M. T., et al. The diagnosis of acute mesenteric ischemia: A systematic review and meta-analysis. Acad Emerg Med. 20 (11), 1087-1100 (2013).
  2. Kassahun, W. T., Schulz, T., Richter, O., Hauss, J. Unchanged high mortality rates from acute occlusive intestinal ischemia: Six-year review. Langenbecks Arch Surg. 393 (2), 163-171 (2008).
  3. Florim, S., Almeida, A., Rocha, D., Portugal, P. Acute mesenteric ischemia: A pictorial review. Insights Imaging. 9 (5), 673-682 (2018).
  4. Kumar, S., Sarr, M. G., Kamath, P. S. Mesenteric venous thrombosis. N Engl J Med. 345 (23), 1683-1688 (2001).
  5. Dugbartey, G. J. Cellular and molecular mechanisms of cell damage and cell death in ischemia-reperfusion injury in organ transplantation. Mol Biol Rep. 51 (1), 473(2024).
  6. Ikeda, H., et al. Apoptosis is a major mode of cell death caused by ischemia and ischemia/reperfusion injury to the rat intestinal epithelium. Gut. 42 (4), 530-537 (1998).
  7. Gutierrez-Sanchez, G., Garcia-Alonso, I., Gutierrez Saenz De Santa Maria, J., Alonso-Varona, A., Herrero De La Parte, B. Antioxidant-based therapy reduces early-stage intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. Antioxidants (Basel). 10 (6), 853(2021).
  8. Jia, Z., Chen, Q., Qin, H. Ischemia-induced apoptosis of intestinal epithelial cells correlates with altered integrin distribution and disassembly of f-actin triggered by calcium overload. J Biomed Biotechnol. 2012, 617539(2012).
  9. Gordeeva, A. E., et al. Vascular pathology of ischemia/reperfusion injury of rat small intestine. Cells Tissue Organs. 203 (6), 353-364 (2017).
  10. Ascher, S., et al. Gut microbiota restricts netosis in acute mesenteric ischemia-reperfusion injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 40 (9), 2279-2292 (2020).
  11. Kiouptsi, K., Casari, M., Mandel, J., Gao, Z., Deppermann, C. Intravital imaging of thrombosis models in mice. Hamostaseologie. 43 (5), 348-359 (2023).
  12. Wang, B., Huang, Q., Zhang, W., Li, N., Li, J. Lactobacillus plantarum prevents bacterial translocation in rats following ischemia and reperfusion injury. Dig Dis Sci. 56 (11), 3187-3194 (2011).
  13. Guan, Y., Worrell, R. T., Pritts, T. A., Montrose, M. H. Intestinal ischemia-reperfusion injury: Reversible and irreversible damage imaged in vivo. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 297 (1), G187-G196 (2009).
  14. Joao, S. A., Medeiros, A. C., Diniz, S. O. F., Cardoso, V. N., Brandt, C. T. Translocation of 99mTc labelled bacteria after intestinal ischemia and reperfusion. Acta Cir. Bras. 19 (4), (2004).
  15. Parks, D. A., Granger, D. N. Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation. Am J Physiol. 250 (6 Pt 1), G749-G753 (1986).
  16. Kurose, I., et al. Molecular determinants of reperfusion-induced leukocyte adhesion and vascular protein leakage. Circ Res. 74 (2), 336-343 (1994).
  17. Massberg, S., et al. Platelet-endothelial cell interactions during ischemia/reperfusion: The role of p-selectin. Blood. 92 (2), 507-515 (1998).
  18. Salter, J. W., Krieglstein, C. F., Issekutz, A. C., Granger, D. N. Platelets modulate ischemia/reperfusion-induced leukocyte recruitment in the mesenteric circulation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281 (6), G1432-G1439 (2001).
  19. Bayer, F., et al. Colonization with altered schaedler flora impacts leukocyte adhesion in mesenteric ischemia-reperfusion injury. Microorganisms. 9 (8), 1601(2021).
  20. Boettcher, M., et al. Therapeutic targeting of extracellular DNA improves the outcome of intestinal ischemic reperfusion injury in neonatal rats. Sci Rep. 7 (1), 15377(2017).
  21. Li, T. T., et al. Fbxw5 aggravates hepatic ischemia/reperfusion injury via promoting phosphorylation of ask1 in a traf6-dependent manner. Int Immunopharmacol. 99, 107928(2021).
  22. Huang, Z., et al. Inhibition of mir-450b-5p ameliorates hepatic ischemia/reperfusion injury via targeting cryab. Cell Death Dis. 11 (6), 455(2020).
  23. Munley, J. A., et al. Chronic mesenteric ischemia-induced intestinal dysbiosis resolved after revascularization. J Vasc Surg Cases Innov Tech. 9 (2), 101084(2023).
  24. Rubio-Gayosso, I., Platts, S. H., Duling, B. R. Reactive oxygen species mediate modification of glycocalyx during ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (6), H2247-H2256 (2006).
  25. Grimsey, N. J., et al. Ubiquitin plays an atypical role in gPCR-induced p38 map kinase activation on endosomes. J Cell Biol. 210 (7), 1117-1131 (2015).
  26. Weithauser, A., Rauch, U. Role of protease-activated receptors for the innate immune response of the heart. Trends Cardiovasc Med. 24 (6), 249-255 (2014).
  27. Bochenek, M. L., et al. EPCR-PAr1 biased signaling regulates perfusion recovery and neovascularization in peripheral ischemia. JCI Insight. 7 (14), e157701(2022).
  28. Alva, J. A., et al. Ve-cadherin-cre-recombinase transgenic mouse: A tool for lineage analysis and gene deletion in endothelial cells. Dev Dyn. 235 (3), 759-767 (2006).
  29. Formes, H., et al. The gut microbiota instructs the hepatic endothelial cell transcriptome. iScience. 24 (10), 103092(2021).
  30. Tanaka, K., et al. In vivo characterization of neutrophil extracellular traps in various organs of a murine sepsis model. PLoS One. 9 (11), e111888(2014).
  31. How, C. K., et al. Induced pluripotent stem cells alleviate lung injury from mesenteric ischemia-reperfusion. J Trauma Acute Care Surg. 79 (4), 592-601 (2015).
  32. Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury. J Vis Exp. 111, e53881(2016).
  33. Henein, L., Clevenger, R., Keeran, K., Brinster, L. Rodent model of intestinal ischemia-reperfusion injury via occlusion of the superior mesenteric artery. J Vis Exp. (200), e64314(2023).
  34. Yoshiya, K., et al. Depletion of gut commensal bacteria attenuates intestinal ischemia/reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301 (6), G1020-G1030 (2011).
  35. Watanabe, T., et al. Activation of the myd88 signaling pathway inhibits ischemia-reperfusion injury in the small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303 (3), G324-G334 (2012).
  36. Watanabe, T., et al. Toll-like receptor 2 mediates ischemia-reperfusion injury of the small intestine in adult mice. PLoS One. 9 (10), e110441(2014).
  37. Tatum, P. M., Harmon, C. M., Lorenz, R. G., Dimmitt, R. A. Toll-like receptor 4 is protective against neonatal murine ischemia-reperfusion intestinal injury. J Pediatr Surg. 45 (6), 1246-1255 (2010).
  38. Wu, M., Rowe, J. M., Fleming, S. D. Eicosanoid production varies by sex in mesenteric ischemia-reperfusion injury. Clin Immunol. 220, 108596(2020).
  39. Mester, A., et al. gender-related hemorheological alterations in intestinal ischemia-reperfusion in the rat. J Surg Res. 225, 68-75 (2018).
  40. Leung, F. W., Su, K. C., Passaro, E., Guth, P. H. Regional differences in gut blood flow and mucosal damage in response to ischemia and reperfusion. Am J Physiol. 263 (3 Pt 1), G301-G305 (1992).
  41. Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. A new model for intestinal ischemia in the rat. J Surg Res. 49 (2), 168-173 (1990).
  42. Von Bruhl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. J Exp Med. 209 (4), 819-835 (2012).
  43. Cahoon, J. M., et al. Acridine orange leukocyte fluorography in mice. Exp Eye Res. 120, 15-19 (2014).
  44. Jiang, D., Saffarzadeh, M., Scharffetter-Kochanek, K. In vitro demonstration and quantification of neutrophil extracellular trap formation. Bio Protoc. 7 (13), e2386(2017).
  45. Westhorpe, C. L., et al. In vivo imaging of inflamed glomeruli reveals dynamics of neutrophil extracellular trap formation in glomerular capillaries. Am J Pathol. 187 (2), 318-331 (2017).
  46. Rausch, P., et al. Analysis of factors contributing to variation in the c57bl/6j fecal microbiota across German animal facilities. Int J Med Microbiol. 306 (5), 343-355 (2016).
  47. Wang, S., et al. DNase-1 treatment exerts protective effects in a rat model of intestinal ischemia-reperfusion injury. Sci Rep. 8 (1), 17788(2018).
  48. Li, Y. H., Kuo, C. H., Shi, G. Y., Wu, H. L. The role of thrombomodulin lectin-like domain in inflammation. J Biomed Sci. 19 (1), 34(2012).
  49. Hayase, N., et al. Recombinant thrombomodulin on neutrophil extracellular traps in murine intestinal ischemia-reperfusion. Anesthesiology. 131 (4), 866-882 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

PAR1

Похожие статьи