В этом протоколе представлены три быстрых и простых метода получения, которые используют условия окружающей среды для запуска самосборки пептидов в гидрогели. Кроме того, описана характеристика пептидных гидрогелей, демонстрирующая, что механически стабильные пептидные гидрогели могут быть образованы в этих простых условиях.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Получение механически стабильных самоорганизующихся пептидов гидрогелей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Пептидные гидрогели представляют собой высокогидрофильные трехмерные сетчатые гели, образованные путем самосборки нановолокон или полимеров, создающих водоблокирующие сети. Их морфология очень похожа на внеклеточный матрикс, что позволяет им проявлять как биологические функции пептидов, так и свойства реагирующего гелеобразования. Эти уникальные характеристики привели к их широкому применению в тканевой инженерии, трехмерных клеточных культурах, терапии рака, регенеративной медицине и других биомедицинских областях. В данной статье описаны три метода получения пептидных гидрогелей ECF-5 с использованием самоорганизующихся пептидов с экологически чувствительными процессами гелеобразования: (1) pH-чувствительное гелеобразование: различные уровни pH индуцируют протонирование или депротонирование аминокислотных остатков, изменяя электростатические взаимодействия между молекулами пептидов и способствуя их самосборке в гидрогели; (2) Добавление ионов металлов: поливалентные ионы металлов хелатируются отрицательно заряженными аминокислотными остатками, действуя как мостики между пептидами с образованием сетевого гидрогеля; (3) Обмен растворителями: гидрофобные пептиды первоначально растворяются в неполярных органических растворителях и впоследствии индуцируют самосборку в гидрогели при переходе в полярную водную среду. Эти методы используют традиционные экспериментальные процедуры для облегчения самосборки пептидов в гидрогели. Разрабатывая пептидные последовательности в соответствии с конкретными условиями, вызывающими гелеобразование, можно достичь тонко настроенных микро/наноструктур и биологических функций, подчеркивая значительный потенциал пептидных гидрогелей в биомедицинской сфере.
Введение
Благодаря конструированию пептидных последовательностей нековалентные взаимодействия между пептидами индуцируют самосборку, что приводит к образованию упорядоченных микро- и нанометровых структур, включая нанотрубки, наноленты, нановолокна и сферические структуры1. При самосборке в микро- и нанометровые волокна/ленты эти структуры макроскопически проявляют гидрогелевые свойства. Пептидные самоорганизующиеся гидрогели отличаются от полимерных тем, что они самоорганизуются за счет нековалентных взаимодействий, их гелевая форма обратима, и они легко реагируют на определенные условия при переходе междурастворной и гелевой фазами. Например, пептиды ароматических аминокислот могут быть индуцированы к желатинизации на основе переключения растворителей 3,4,5, пептиды RADA16 образуют гели посредством катионных и анионных электростатических взаимодействий6, а пептид E1Y9 индуцируется образованием гидрогеля с помощью ионовCa2+ 7. Природные аминокислоты могут метаболизироваться в организме человека и обеспечивают отличную биосовместимость, чего не могут достичь полимерные гидрогели8. Белки — это молекулы, которые выполняют биологические функции, а различия в последовательностях пептидов создают их специфические биологические функции. Таким образом, встраивание специфических биофункциональных пептидных последовательностей и наделение их свойствами самоорганизации может привести к созданию пептидных самоорганизующихся гидрогелей с уникальными биологическими функциями и морфологией 9,10,11. В этой статье представлены три метода приготовления пептидных гидрогелей, в которых процесс гелеобразования запускается реакцией на окружающую среду. В ней также кратко рассматриваются методы определения характеристик механических свойств и морфологии пептидных гидрогелей.
pH регулирует заряд аминокислот, запуская гелеобразование некоторых пептидов. Например, положительно заряженные аминокислоты (например, аргинин, лизин, гистидин) регулируются pH для достижения положительного или нейтрального состояния. Отрицательно заряженные аминокислоты регулируются pH для достижения отрицательного или нейтрального состояния, удаляясь от своей изоэлектрической точки и тем самым изменяя свою гидрофильность в водных растворах. Таким образом, контроль электростатических и гидрофобных взаимодействий между пептидами способствует их упорядоченной самосборке. Zhang et al. разработали амфифильный pH-чувствительный самоорганизующийся пептид, связанный с метотрексатом KKFKFEF, который реагирует на слабокислую среду как in vitro, так и in vivo, обеспечивая фазовый переход от золя к гелю. Это приводит к эффективному поглощению клетками и эндоцитозу, тем самым доставляя противораковые препараты иповышая эффективность химиотерапии. Shen et al.13 разработали пептид FF8 (KRRFFRRK), который легко самоорганизуется в волокна при pH более 9,4. В нейтральных условиях микроорганизмы нейтрализуют свои положительные заряды за счет электростатического взаимодействия с отрицательно заряженными фосфолипидными мембранами, координируясь с молекулами фосфолипидов для самосборки, вызывая разрыв мембраны и усиливая бактерицидныеэффекты.
Запуск пептидной супрамолекулярной самосборки в гидрогели с использованием координационных металлов является относительно редким методом14. Когда ионы металлов электростатически взаимодействуют с пептидами, они образуют солевые мостики, которые соединяют молекулы пептидов, что приводит к нековалентным взаимодействиям и самосборке, что приводит к гелеобразующим свойствам. Например, Абуль-Хайя и др.15 разработали трипептид FFD, который переходит из жидкости в гидрогель при добавлении ионов меди. Tao et al.16 разработали глутаминовую кислоту и богатый фенилаланином пептид E3F3, который самоорганизуется в волокнистые гидрогели в присутствии ионов цинка и используется для доставки лекарств от простаты.
Образование пептидных гидрогелей в результате обмена растворителей является наиболее распространенным условием, запускающим супрамолекулярную самосборку. После того как гидрофобные пептиды растворяются в органических растворителях, их гидрофобные группы полностью обнажаются. При переходе в водную фазу гидрофобные группы сближаются друг с другом, а молекулы воды способствуют образованию пептидных водородных связей, что приводит к быстрой самосборке и легкому образованию гидрогелей. Например, Zhang et al.17 разработали пептид, который может стабильно растворяться при высоких концентрациях в полярных органических растворителях и при разбавлении водой самоорганизуется в β-листовые структуры с образованием пептидных волоконных гидрогелей. Shen et al.13 разработали восстановительный пептид ECF-5 (ECAFF), предварительно растворенный в диметилсульфоксиде (ДМСО), а затем введенный в водную фазу с образованием восстановительного гидрогеля, используемого для целенаправленного удаления активных форм кислорода, образующихся в результате ишемии-реперфузии, которые впоследствии разлагались в раствор после очистки.
В этом исследовании были выбраны три простые, быстрые и высоко обобщаемые стратегии получения пептидного гидрогеля, основанные на предыдущем опыте: (1) Метод реакции pH: пептиды растворяют в растворе с pH, далеким от их изоэлектрической точки, а затем pH корректируют до уровня, близкого к изоэлектрической точке. Это изменение позволяет определенным самоорганизующимся пептидам образовывать волокна и создавать пептидные гидрогели; (2) Метод присоединения ионов металлов: координационные катионы добавляются к водорастворимым, отрицательно заряженным самоорганизующимся пептидам. Координационное хелатирование металлов между пептидами приводит к их самосборке в гидрогели; (3) Метод обмена растворителями: пептиды высокой концентрации растворяются в органических растворителях, а затем разбавляются в водную фазу, вызывая гелеобразующее поведение.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Подробная информация о плазмидах, реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.
1. Метод отклика на pH
- Добавьте 5 мг пептидов ECF-5 в 400 μл деионизированной воды. Обрабатывайте ультразвуком на частоте 40 кГц в течение 30 минут и тщательно перемешайте.
- Добавьте в раствор пептида 40 мкл гидроксида натрия (1 М, отфильтрованный через фильтр 0,22 мкм). Перемешайте и тщательно перемешайте. Продолжайте ультразвуковую обработку в течение 15 минут, пока раствор полностью не осветлит.
- Добавьте 60 μл соляной кислоты. Быстро завихрить и обеспечить тщательное перемешивание. Дайте смеси постоять при комнатной температуре более 30 минут, чтобы способствовать образованию гидрогеля.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости замените деионизированную воду на желаемый буферный раствор. Если твердые частицы крупные, заранее измельчите их. Ультразвуковой обработкой можно добиться получения однородной смеси частиц в жидкости. Если пептид не переносит щелочные условия, сначала добавьте 1 М раствор соляной кислоты и повторите описанные выше действия. При необходимости отрегулируйте количество кислоты и основания, чтобы достичь изоэлектрической точки или желаемого pH, сохраняя гелеобразующие свойства.
2. Метод добавления ионов металлов
- Подготовка материала
- Приготовьте 0,15 М Tris и 0,1 М NaCl буфера при pH 7,4. Профильтруйте через фильтр 0,22 мкм и храните при температуре 4 °C до одной недели.
- Приготовьте раствор самоорганизующегося пептида ECF-5 в концентрации 10 мг/мл с использованием буфера, приготовленного на шаге 1.1.1. Растворить ультразвуком и хранить при температуре 4 °C.
- Приготовьте раствор хлорида кальция в концентрации 50 мг/мл с использованием деионизированной воды. Хранить при температуре 4 °C.
- Индуцированное добавлением ионов металлов пептидное гидрогелеобразование
- Добавьте 40 мкл раствора хлорида кальция к 460 мкл раствора пептида ECF-5. Перемешайте и тщательно перемешайте. Дайте смеси настояться при комнатной температуре более 2 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования фосфатного буфера, так как это может привести к выпадению ионов кальция в осадок.
- Добавьте 40 мкл раствора хлорида кальция к 460 мкл раствора пептида ECF-5. Перемешайте и тщательно перемешайте. Дайте смеси настояться при комнатной температуре более 2 часов.
3. Метод обмена растворителем
- Подготовка материалов
- Весить 10 мг лиофилизированного порошка пептида ECF-5. Добавьте его в 100 мкл ДМСО. Тщательно перемешайте с помощью ультразвука и храните при температуре 4 °C.
- Приготовьте 10 мМ буферного раствора PBS. Процедить и простерилизовать. Хранить при температуре 4 °C и использовать в течение 1 недели.
- Индуцированное растворителем пептидное гидрогелевое образование
- Быстро введите 1 мл PBS в ДМСО-солюбилизированный пептид. Перемешайте и тщательно перемешайте. Дайте постоять при комнатной температуре 5 минут.
- Добавьте 500 μL PBS, дайте постоять 15 минут, выбросьте надосадочную жидкость и оставьте нижний гель. Повторите этот процесс три раза, чтобы удалить ДМСО.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если ДМСО влияет на последующие эксперименты, рассмотрите возможность растворения пептида в более высокой концентрации ДМСО, чтобы свести к минимуму его воздействие.
4. Реомеханическая характеристика гидрогеля
- Реологический анализ
- Выложите гидрогель ложкой на алюминиевую параллельную пластину диаметром 25 мм. Проведите динамический реологический анализ пептидных гидрогелей с помощью реометра18.
- Частотный и тензометрический анализ
- Проводите частотный и тензометрический анализ18 систематически с использованием контролируемой деформации 0,3% и частоты 10 рад/с. Убедитесь, что контроль температуры установлен на уровне 25 °C.
5. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) для определения морфологии волокон
- Подготовка материалов
- Приготовьте раствор 95% этанола и добавьте 5% APTES. Хранить при температуре -20 °C и использовать в течение 1 месяца.
- Нанесите двусторонний клей, чтобы удалить слой слюды. Приклейте слюдяные поверхности с помощью раствора APTES и дайте постоять 5 минут. Перед применением тщательно смойте чистой водой.
- Разведите и тщательно перемешайте гидрогель. Капните его на модифицированную поверхность слюды и дайте статической адсорбции в течение 5 минут. Промойте поверхность чистой водой и высушите ее перед использованием.
- Метод обнаружения
- Используйте многомодовую АСМ, оснащенную сканером, для изучения морфологии пептидного волокна или гидрогеля. Используйте кремниевые консоли с номинальной постоянной пружины 48 Н/м.
- Инициализируйте прибор для позиционирования иглы. Выберите режим касания , чтобы отсканировать образец и получить изображения.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Три описанных в этой статье метода приготовления пептидных гидрогелей обеспечивают быстрое, доступное и простое производство. Функция гидрогеля связана с его пептидной последовательностью. В данном случае пептид ECF-5 используется в качестве репрезентативного примера для демонстрации его физических характеристик, включая микроскопическую морфологию и механические свойства.
Как показано на рисунке 1А и дополнительном рисунке 1, пептид ECF-5 содержи...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В последние несколько десятилетий, после открытия самоорганизующихся пептидных последовательностей, полученных из амилоидных белков, на основе их свойств было разработано множество самоорганизующихся пептидов, демонстрирующих значительный потенциал для применения в биомедицине и материаловедении. Пептидные гидрогели продемонстрировали уникальные возможности биофункционализации в культуре тканей, доставке лекарств и лечении опухолей20.
<...Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Благодарности
Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (NoNo 11674344 и 22201026) и Ключевой исследовательской программой передовых наук, CAS (грант No QYZDJ-SSW-SLH019).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 3-Аминопропил)триэтоксисилан | Аладдин | A107147 | / |
| Атомно-силовая микроскопия | Bruker | Многомодовый наноскоп VIII | / |
| CaCl2 | Аладдин | C290953 | / |
| Дифенилаланин (FF) | Китайский пептид | настраиваемый | > 95% |
| ДМСО | Сигма-олдрич | 34869 | / |
| ECF-5 Пептиды Последовательность | китайских пептидов | : ECAFF | Purity > 95% |
| Соляная кислота | Аладдин | H399657 | / |
| Слюда | сигма-олдрич | AFM-71856-02 | / |
| Фосфат буферизированный физиологический | Аладдин | P492453 | / |
| Реометр | Anton Paar GmbH | MCR302 | / |
| Кремниевые консоли | MikroMasch | XSC11 | / |
| Хлорид натрия | Аладдин | C111549 | / |
| Гидроксид натрия | Аладдин | S140903 | / |
| ТРИС гидрохлорид | Аладдин | T431531 |
Ссылки
- Whitesides, G. M., Mathias, J. P., Seto, C. T. Molecular self-assembly and nanochemistry: a chemical strategy for the synthesis of nanostructures. Science. 254 (5036), 1312-1319 (1991).
- Matson, J. B., Zha, R. H., Stupp, S. I. Peptide self-assembly for crafting functional biological materials. Curr Opin Solid State Mater Sci. 15 (6), 225-235 (2011).
- Itzha, G., et al. Peptide self-assembly as a strategy for facile immobilization of redox enzymes on carbon electrodes. Carbon Energy. 5 (11), e411(2023).
- Rosa, E., et al. Incorporation of PEG diacrylates (PEGDA) generates hybrid Fmoc-FF hydrogel matrices. Gels. 8 (12), 831(2022).
- Balasco, N., et al. Self-assembled materials based on fully aromatic peptides: The impact of tryptophan, tyrosine, and dopa residues. Langmuir. 40 (2), 1470-1486 (2024).
- Bolan, F., et al. Intracerebral administration of a novel self-assembling peptide hydrogel is safe and supports cell proliferation in experimental intracerebral haemorrhage. Transl Stroke Res. , (2023).
- Tsutsumi, H., et al. Osteoblastic differentiation on hydrogels fabricated from Ca2+ responsive self-assembling peptides functionalized with bioactive peptides. Bioorg Med Chem. 26 (12), 3126-3132 (2018).
- Li, S., et al. Self-assembled peptide hydrogels in regenerative medicine. Gels. 9 (8), 653(2023).
- Guan, T., Li, J., Chen, C., Liu, Y. Self-assembling peptide-based hydrogels for wound tissue repair. Adv Sci. 9 (10), e2104165(2022).
- La, M. S., Di, N. C., Onesto, V., Marasco, D. Self-assembling peptides: From design to biomedical applications. Int J Mol Sci. 22 (23), 12662(2021).
- Gao, Y., et al. Advances in self-assembled peptides as drug carriers. Pharmaceutics. 15 (2), 482(2023).
- Zhang, J., et al. Injectable and pH-responsive self-assembled peptide hydrogel for promoted tumor cell uptake and enhanced cancer chemotherapy. Biomater Sci. 10 (3), 854-862 (2022).
- Shen, Z., et al. Biomembrane induced in situ self-assembly of peptide with enhanced antimicrobial activity. Biomater Sci. 8 (7), 2031-2039 (2020).
- Shao, T., Falcone, N., Kraatz, H. B. Supramolecular peptide gels: Influencing properties by metal ion coordination and their wide-ranging applications. ACS Omega. 5 (3), 1312-1317 (2020).
- Abul-Haija, Y. M., et al. Cooperative, ion-sensitive co-assembly of tripeptide hydrogels. Chem Commun. 53 (69), 9562-9565 (2017).
- Tao, M., et al. Zinc-ion-mediated self-assembly of forky peptides for prostate cancer-specific drug delivery. Chem Commun. 54 (37), 4673-4676 (2018).
- Apostolopoulos, V., et al. A Global review on short peptides: Frontiers and perspectives. Molecules. 26 (2), 430(2021).
- Zhang, R. S. T., et al. Rheological characterization and mechanical properties of self-assembled peptide hydrogels. Soft Matter. 15 (11), 2370-2380 (2019).
- Li, T., et al. Peptide-based nanomaterials: Self-assembly, properties and applications. Bioact Mater. 11, 268-282 (2021).
- Sedighi, M., et al. Multifunctional self-assembled peptide hydrogels for biomedical applications. Polymers (Basel). 15 (5), 1160(2023).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
