Методическая статья

Использование Mycobacterium smegmatis в качестве биоиндикатора условий роста, ограниченных цинком у микобактерий

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67274

⸱

20 сентября 2024 г.

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, University of Hawaiʻi at Mānoa

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе подробно описывается приготовление Zn2+-ограниченных сред, ростовых сосудов и посевных культур для производства Zn2+-ограниченных рибосом у микобактерий. Следы Zn2+ приводят к Zn2+-ограничивающему росту, и описаны морфогенные признаки, используемые в качестве биоиндикаторов для верификации ограничения Zn2+ in vitro у модельной бактерии Mycobacterium smegmatis и возбудителя человека M. tuberculosis.

Аннотация

Многие бактерии строят альтернативные рибосомы в условиях Zn2+, ограничивающих рост, заменяя Zn2+-связывающие рибосомальные белки на Zn2+-независимые паралоги. Определение системы для изучения этих альтернативных рибосом оказалось сложным, потому что загрязнение Zn2+ в лаборатории является обычным явлением. Чтобы решить эту проблему, в питательные среды иногда добавляют хелатирующие агенты, но такой подход закручивает биологическую реакцию на постепенное ограничение Zn2+ и связан с гибернацией рибосом. Здесь изложена подробная инструкция по подготовке сред и посеву культур для Zn2+-ограниченного роста без добавления хелаторов. Следуя этому методу, модельная бактерия, Mycobacterium smegmatis, подвергается морфогенезу, который зависит от альтернативных рибосом. Поскольку морфогенез поддается лечению и происходит только в условиях, ограничивающих Zn2+, M. smegmatis может быть использован в качестве биоиндикатора для проверки биологически значимых условий роста. Описаны три биоиндикаторных фенотипа (плотность клеток, длина клеток и флуоресценция коэнзима F420), указывающих на ограничение Zn2+ у дикого типа, и описаны изменения в этих биоиндикаторах для делеционного мутанта, который не может строить альтернативные рибосомы. Поскольку загрязнение следовыми следами Zn2+ трудно контролировать для каждой партии среды, а точное количественное определение Zn2+ в каждом препарате среды является чрезмерно обременительным, следование фенотипу этого биоиндикатора является доступным способом валидации приготовления питательных сред с ограничением Zn2+. Чтобы помочь определить надлежащие условия для Zn2+-ограничивающего роста и альтернативной продукции рибосом, изменения в фенотипах биоиндикаторов были профилированы для Zn2+ загрязненных или сильно истощенных Zn2+ препаратов Zn2+ сред с ограниченным Zn 2+. Представлены дополнительные сведения о достижении Zn2+-ограничивающего роста и альтернативной продукции рибосом у M. tuberculosis, а также о связанном с ним фенотипе биоиндикатора. В целом, описанные здесь подробные инструкции и фенотипы биоиндикаторов помогут стандартизировать выработку трансляционно активных альтернативных рибосом у микобактерий.

Введение

Ион цинка (Zn2+) является важным микроэлементом и стандартным компонентом микробиологических сред. Тем не менее, многие бактерии выдерживают ограничение Zn2+ в окружающей среде, поскольку условия ограничения Zn2+ широко распространены; soil1, marine2, а ниши внутри host3 часто ограничены Zn2+. Таким образом, большинство бактерий развили механизмы для преодоления ограничения Zn2+ и сохранения клеточной функции4. Системы, участвующие в поддержании гомеостаза Zn2+, находятся под жестким транскрипционным контролем5 и участвуют в очистке Zn2+ с помощью высокоаффинных систем импорта Zn2+, мобилизации клеточных резервов Zn2+ и замене определенных Zn2+-связывающих белков альтернативными Zn2+-независимыми paralogs6. Примером последнего являются Zn2+-независимые рибосомальные белки (РБ), которые являются общей чертой Zn2+-чувствительных регулонов в классе бактерий4. Эти сильно расходящиеся Zn2+-независимые RP отличаются от их Zn2+-связывающих паралогов нарушением Zn2+-связывающего CXXC мотива 7. Более половины секвенированных прокариотических геномов содержат по крайней мере одну пару дуплицированных RP, где во многих из них один RP связывается с Zn2+, в то время как его paralog not8. В то время как нотация C+/C- (указывающая на наличие/отсутствие богатого цистеином Zn2+-связывающего мотива) обычно используется по отношению к этим паралогичным парам RP 7, Zn2+-независимые RP также описываются как альтернативные (Alt) версии первичных (Prim), Zn2+-связывающих паралогов RP, поскольку AltRP служат альтернативными RP для биогенеза рибосом в Zn2+-ограниченное состояние у некоторых бактерий и это ключевое слово с лучшей поисковой доступностью9,10,11.

Поскольку экспрессия AltRP жестко регулируется Zn2+, логично предположить, что экспрессия AltRP обеспечивает функциональную избыточность для Zn2+-зависимых рибосомальных белков в условиях ограничения Zn2+. Действительно, эта особенность AltRPs была продемонстрирована на модельной почвенной бактерии Bacillus subtilis, рост которой спасается во время ограничения Zn2+ высвобождением поверхности PrimRP L31 и заменой на AltRP L3112,13. Тем не менее, некоторые AltRP паралогичны по отношению к основным PrimRP, например, S14, что означает, что их включение требуется во время биогенеза рибосом12,13. Восстановление рибосомы с помощью AltRPs — это целенаправленная, энергоемкая программа. В то время как эти основные AltRP могут служить для высвобождения Zn2+ из рибосомы, также возможно, что некоторые AltRP развили дополнительную функцию в среде, ограниченной Zn2+. Это подтверждается наблюдением, что AltRP отличаются от своих паралогичных PrimRP; гомология последовательности генов AltRP часто выше среди гомологов у разных видов, чем у Zn2+-связывающей последовательности гена PrimRP в пределах одного и того же вида7,10. Поскольку гены, кодирующие сильно дивергентные AltRP, находятся под Zn2+-зависимым транскрипционным контролем, они удаляются из-под селективного давления, оказываемого на жестко регулируемые и высококонсервативные рибосомальные суперопероны14. Разъединенное селективное давление на генетическую информацию, кодирующую рибосомный механизм и AltRP, подвергает эти RP другим эволюционным траекториям, чем гомологичные PrimRP, и может позволить провести специфичную для линии эволюцию одного и того же AltRP у разных бактерийsup class="xref">15. Широкое распространение AltRPs у бактерий и несвязанная генетическая регуляция этих уникальных RP поднимают интересный вопрос о том, придает ли включение AltRPs в бактериальные рибосомы особое свойство AltRP-содержащим рибосомам (Alt-рибосомам).

Микобактерии - идеальная группа бактерий для исследования механистических свойств альтернативных рибосом. Во-первых, микобактерии обладают высококонсервативным опероном altRP, содержащим четыре гена, которые кодируют AltRPs: S14-2, S18-2, L28-2 и L33-28,9. AltRP микобактерий значительно отличаются от паралогов PrimRP; во всех четырех парах PrimRP/AltRP данный ген AltRP более похож у всех видов микобактерий, чем к гену PrimRP у того же вида10. Линейно-специфичная эволюция AltRP также очевидна в микобактериях, о чем свидетельствуют AltRPs S18-2 и L28-2 у Mycobacterium tuberculosis и M. bovis, которые содержат уникальные последовательности на С-конце, которые отсутствуют у других микобактерий10. Во-вторых, эта группа высокородственных бактерий содержит непатогенных и патогенных членов, которые обитают в различных средах от почвы (например, M. smegmatis) до множества хозяев: человека (например, M. tuberculosis), крупного рогатого скота (например, M. bovis), водных (например, M. marinum) и птиц (например, M. avium), и это лишь некоторые из них. Высококонсервативная природа оперона altRP у микобактерий, специфичная для линии эволюция специфических генов AltRP и совершенно различные среды, в которых существуют члены этой группы, предоставляют уникальную возможность проанализировать консервативную и специфичную для линии эволюцию функции AltRP и механистических свойств Alt-рибосом. Несмотря на обилие AltRP в геномах прокариот, роль AltRP и Alt-рибосомов была исследована только у нескольких бактерий9,10,11,12,13,16,17,18,19. Создание стандартизированной системы со специфическими метриками для валидации условий роста Zn2+, ограничивающих рост микобактерий, улучшило бы результаты экспериментов и углубило бы понимание Alt-рибосом в области исследований рибосом.

Zn2+ является микроэлементом, поэтому следы загрязнения Zn2+ в химикатах и воде способствуют биодоступности Zn2+, даже если они отсутствуют в средстве. Следовые количества Zn2+, присутствующие в воде или химических веществах, могут сильно различаться в разных лабораториях, тем самым влияя на результат Zn2+-ограничивающего рост. Эмпирическое количественное определение [Zn2+] в каждом независимом препарате среды является чрезмерно обременительным для большинства лабораторий, проводящих рутинные анализы роста, но механизм, исключающий возможность загрязнения Zn2+ в питательных средах, был бы само по себе ценным. С этой целью здесь представлен подробный метод получения химически определенной Zn2+-ограниченной среды (ZLM), ростовых сосудов и посевных культур для Zn2+-ограничивающего рост и продукции Alt-рибосомы у M. smegmatis и M. tuberculosis. Ключевые морфогенные характеристики (плотность клеток, измеренная по OD600, длина клетки и флуоресценция коэнзима F420) после роста в ZLM используются для подтверждения того, что было достигнуто ограничение Zn2+. Коэнзим F420 является кофактором деазафлавина, который играет важную роль в катаболизме и защите от окислительного стресса в метаногенах и микобактериях20,21. Важно отметить, что микобактерии автофлуоресцентны при возбуждении на длине волны 420 нм из-за обилия этого кофактора22. Молекулярная связь между [Zn2+] и флуоресценцией F420 остается невыясненной, но наблюдение за флуоресценцией F420 в культурах является управляемым и надежным биоиндикатором.

У M. smegmatis фенотипы биоиндикаторов встречаются у бактерий дикого типа, но делеционный мутант, лишенный оперона altRP, не проходит ту же морфогенную программу и может быть использован в качестве дифференциального биоиндикатора10. Хотя M. tuberculosis не следует той же морфогенной программе, что и M. smegmatis во время ограничения Zn2+, M. tuberculosis имеет устойчивый и глобальный ответ на Znограничение 2+ и ключевой фенотип биоиндикатора в соответствии с этим методом23. Таким образом, описанная здесь система позволяет генерировать Prim- и Alt-рибосомы при одинаковых условиях роста (т.е. при ограничении Zn2+), облегчая механистическое препарирование функции Alt-рибосом и ее роли в формировании физиологии бактерий. Этот метод роста был использован для определения структуры активных альт-рибосом и демонстрации их трансляционной активности в классе M. smegmatis24. Кроме того, этот метод роста и фенотип биоиндикатора подчеркивают биологическую функциональность AltRPs во время ограничения Zn2+, экспрессия AltRP необходима для Zn2+-зависимого морфогенеза и оказывает глубокое влияние на транскриптом и протеом Zn2+-ограниченного M. smegmatis10,25. Тот же метод, с незначительными изменениями в количестве инокулюма и времени инкубации, используется для получения Zn2+-ограниченных культур M. tuberculosis9,23. Здесь подробно описаны протоколы и фенотипы биоиндикаторов для достижения Zn2+-ограничивающего роста как у M. smegmatis, так и у M. tuberculosis, с акцентом на M. smegmatis, поскольку эта бактерия более чувствительна к контаминации Zn2+ в среде и более широко доступна, чем медленно растущий патоген.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Штаммы, использованные в данном исследовании, — это дикий тип M. smegmatis mc2 155 (предоставлен доктором Робертом Хассоном, Детская больница Бостона) и делеционный штамм ΔaltRP (получен из лаборатории Prisic10). Их можно культивировать в лаборатории с уровнем биобезопасности 1 (BSL1) или BSL2, в зависимости от местных правил биобезопасности и имеющихся ресурсов. В данном случае протокол написан для лаборатории BSL2. При работе в лаборатории BSL1 использование асептической техники с горелкой Бунзена может заменить бокс биологической безопасности. Кроме того, исследователям, желающим включить другие штаммы или условия, потребуется рассчитать объем необходимой среды в зависимости от общего количества анализируемых культур. Манипуляции с патогенным штаммом M. tuberculosis H37Rv (Mtb-H37Rv; предоставлен доктором Робертом Хассоном, Детская больница Бостона) следует проводить в лаборатории BSL3 с использованием респиратора (например, PAPR или N95). Не используйте колбы повторно при культивировании высоковирулентных микобактерий, таких как Mtb-H37Rv. Ауксотрофный штамм M. tuberculosis mc26206 (Mtb-Aux) является аттенуированным, и работа с ним может проводиться в лаборатории BSL2 (предоставлен доктором Уильямом Р. Джейкобсом-младшим, Медицинский колледж Альберта Эйнштейна).

1. Подготовка колб

ПРИМЕЧАНИЕ: Условия роста с ограничением по Zn2+ достигаются в многоразовых (автоклавируемых) поликарбонатных колбах Эрленмейера объемом 250 mL. Не используйте стеклянные колбы для культивирования в условиях ограничения по Zn2+ и не пытайтесь изучать или сравнивать строгие процедуры промывки кислотой с результатами, представленными в данном протоколе19. Совершенно новых колб достаточно для создания условий роста с ограничением по Zn2+, однако никогда не смешивайте новые и старые колбы в одном эксперименте. Утилизируйте колбы с признаками износа (обычно по швам) или те, что использовались более 20 раз. Регулярно проверяйте фильтры крышек на предмет износа и утилизируйте их в случае повреждения. Если они имеются, удалите навинчивающиеся верхние крышки, которые закрывают фильтры. В данном методе описаны меры предосторожности по очистке колб и их подготовке к повторному использованию.

  1. Нанесите на колбы постоянную маркировку, чтобы данный набор использовался только для условий с ограничением по Zn2+. Отметьте другой набор колб для роста в условиях избытка Zn2+. Использование разных цветов при маркировке поможет избежать смешивания колб.
  2. Не допускайте высыхания остатков культуры в колбах. Сразу после декантирования культуры добавьте в колбу воду (например, 100 mL). Если по окончании роста сбор культуры не производится, опорожните колбы, вылив всю культуру в емкость для жидких отходов с конечной концентрацией отбеливателя 10% после регистрации фенотипов биоиндикаторов, как описано в данном протоколе.
  3. Автоклавируйте колбы в режиме для жидкостей (не менее 121 °C при 15 psi) в течение 20 min с водой внутри и закрытыми крышками.
  4. После автоклавирования вымойте колбы неионогенным низкопенным моющим средством и тщательно протрите мягкой щеткой. Выделите отдельную щетку исключительно для мытья колб, использовавшихся для роста с ограничением по Zn2+. Убедитесь, что колбы чистые, без остатков веществ или загрязнений. Не трите крышки щеткой и не используйте для них мыло, аккуратно промойте их деионизированной водой.
  5. Тщательно промойте колбы водопроводной водой, затем трижды промойте деионизированной водой (типа II или III) и еще как минимум один раз — ультрачистой водой (типа I) (18.2 MΩ-cm при 25 °C и ≤ 5 ppb общего органического углерода).
  6. Поставьте колбы вертикально вверх дном, чтобы вода не скапливалась на дне. Не используйте стандартные настенные лабораторные сушилки, так как они удерживают колбы под наклоном, что приводит к образованию небольших лужиц воды. Подойдут стандартные подставки для посуды. Дайте колбам и крышкам полностью высохнуть.
  7. После высыхания закрутите крышки на колбах и оберните их алюминиевой фольгой. Прикрепите к фольге кусочек индикаторной ленты для автоклавирования, чтобы подтвердить стерильность и защитить фильтры крышек от пыли.
  8. Автоклавируйте очищенные колбы (не менее 121 °C при 15 psi) в течение 20 min, после чего выполните вакуумирование в конце цикла для просушки содержимого (если автоклав оснащен данной функцией). Храните колбы в сухом месте, защищенном от пыли.

2. Приготовление среды с ограниченным содержанием Zn2+ (ZLM)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления сред используйте только пластиковые стаканы, мерные цилиндры и другие расходные материалы. Выделите набор лабораторной посуды, используемой исключительно для приготовления сред с ограниченным содержанием Zn2+. Тщательно промывайте всю лабораторную посуду ультрачистой (типа I) водой до и после использования. Используйте химические реактивы высокой степени чистоты и, по возможности, закупайте их у одних и тех же поставщиков.

  1. Приготовьте среду Сотона с ограниченным содержанием Zn2+ без добавления солей Zn2+26, смешав следующие химические вещества с ~950 mL ультрачистой воды в пластиковом стакане объемом 1 L с магнитным перемешивателем:
    0.5 g KH2PO4 (0.05%; MW: 136.09)
    0.5 g MgSO4 x 7H2O (0.05%; MW: 246.48)
    2 g лимонной кислоты, безводной (0.2%; MW: 192.12)
    4 g L-аспарагина, 99% (0.4%; MW: 132.12)
    60 mL глицерина (6%)
    189 µL 1 M цитрата аммония-железа (0.005%; MW: 265)
    1. Добавьте глицерин, используя одноразовую пластиковую серологическую пипетку объемом 50 mL. Тщательно промойте пипетку, совершив около 10 циклов всасывания и вытеснения жидкости в среде, пока в ней не останется глицерина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глицерин обладает высокой вязкостью, и его сложно отмерить. В качестве альтернативы глицерин можно налить в мерный цилиндр и несколько раз промыть его примерно 30 mL ультрачистой воды, которую затем добавят в среду. При использовании этого метода начинайте с меньшего объема (~600 mL), чтобы итоговый объем после добавления глицерина и промывных вод из мерного цилиндра в среду не превышал ~950 mL.
  2. Доведите объем среды примерно до 950 mL и тщательно перемешайте. L-аспарагину требуется несколько минут для растворения; подождите до полного исчезновения белых хлопьев, прежде чем продолжить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор цитрата аммония-железа придает среде светло-желтый цвет.
  3. Приготовьте 15 mL свежего раствора NaOH (~10% масс./об.) с использованием ультрачистой воды в пластиковом контейнере (например, в конической пробирке объемом 15 mL).
  4. Перед использованием тщательно промойте pH-метр ультрачистой водой и погрузите в среду только электрод pH-метра. Оставьте pH-метр в среде при осторожном перемешивании во время регулировки pH. С помощью одноразовой пластиковой пипетки-дозатора добавляйте свежеприготовленный NaOH до достижения конечного значения pH 7.4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Исходный pH среды сильно кислый. Для доведения pH до нейтрального диапазона требуется большой объем раствора NaOH. Сначала добавьте 4-6 mL раствора NaOH; как только pH достигнет значения около 6.5, добавляйте раствор NaOH по каплям. Не превышайте целевое значение pH 7.4. Если это произошло, не пытайтесь скорректировать pH с помощью HCl или других кислот — утилизируйте среду. Рекомендуется использовать отдельный pH-метр для приготовления ZLM и не использовать его для измерения pH других сред и буферов, чтобы избежать загрязнения электрода.
  5. Перенесите среду в мерный цилиндр и доведите ее до конечного объема 1 L ультрачистой водой. Стерилизуйте среду путем фильтрации через одноразовую фильтровальную колбу с порами 0.2 µm.
  6. В асептических условиях добавьте 2.5 mL стерилизованного фильтрацией 20% раствора Tween-80 (конечная концентрация 0.05%). Храните при 4 °C в защищенном от света месте до 6 месяцев.

3. Рост M. smegmatis в условиях ограничения Zn2+

ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за вариаций содержания Zn2+ в разных партиях среды ZLM крайне важно использовать одну и ту же партию среды или несколько партий, которые были тщательно перемешаны, для всех культур в рамках одного эксперимента. Помимо среды, необходимой для постановки культур, требуется примерно 100 mL дополнительного объема для промывки и нормализации инокуляционных культур.

  1. Выполняйте все этапы в боксе биологической безопасности. Подготовьте инокуляты за 18 ч до начала эксперимента по культивированию. Не используйте переросшие или склонные к слипанию культуры. Для каждого штамма достаточно одного инокулята.
    1. Асептически внесите 5 мл среды 7H9-ADC (бульон Middlebrook 7H9 с 0,05% Tween 80 и 10% обогатителя ADC [конечная концентрация: 0,5% бычьего сывороточного альбумина, 0,2% декстрозы, 0,085% NaCl и, опционально, 0,0003% каталазы]) в пробирку для биореактора объемом 50 мл.
    2. Асептически внесите 10 µL размороженных клеток из глицеринового стока (подготовленного согласно26) непосредственно в среду. Закрутите крышку пробирки.
    3. Плотно закрепите пробирки в шейкере-инкубаторе под углом примерно 45°, чтобы при встряхивании жидкость заполняла пробирку примерно наполовину.
    4. Инкубируйте пробирки при 37 °C с встряхиванием при 120 rpm в течение примерно 18 ч.
  2. Проверьте ночные культуры, чтобы убедиться, что культура равномерно мутная и не имеет значительного слипания. Оптическая плотность при 600 нм (OD600) ночной культуры в идеале должна составлять около 0,5-0,8.
  3. Осадите ночные культуры в пробирках для биореактора, использованных для роста, путем центрифугирования при 3 000 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
  4. Слейте или аспирируйте супернатант и ресуспендируйте осадок в 5 мл ZLM. Повторите этапы центрифугирования и ресуспендирования 2 раза (всего три промывки).
    1. Во время этапов центрифугирования заполните кювету 70% этанолом до перелива для стерилизации. Оставьте заполненную кювету в боксе биологической безопасности на 10 мин, затем трижды тщательно промойте её ZLM с помощью пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс нормирования клеток требует времени и практики для достижения эффективности. Нормирование клеток непосредственно в стерилизованной этанолом кювете значительно ускоряет этот процесс.
    2. Подготовьте количество кювет, соответствующее числу штаммов, включенных в исследование; например, для данного протокола требуются две стерилизованные кюветы: одна для дикого типа и одна для мутанта ΔaltRP.
  5. После трех промывок с ZLM ресуспендируйте каждый клеточный осадок в 2 мл ZLM.
  6. Обнулите спектрофотометр, используя кювету с 600 µL ZLM. Эту кювету стерилизовать не нужно. Отставьте кювету в сторону и используйте её для обнуления спектрофотометра перед нормированием каждой культуры (т. е. штамма).
  7. Работая с одним штаммом за раз, перенесите 600 µL промытых клеток из этапа 3.5 в стерилизованную кювету, подготовленную на этапе 3.4.1, и измерьте исходную OD600. Если OD600 выше 1, переходите к этапу 3.8. Если OD600 ниже 1, выполните подэтапы 3.7.1 и 3.7.2.
    1. Если исходное значение OD600 из этапа 3.7 ниже 1, соберите всю культуру из кюветы, добавьте её обратно к оставшимся промытым инокулятным клеткам в центрифужной пробирке и снова центрифугируйте культуру, как в этапе 3.3. Ресуспендируйте культуру в объеме меньшем, чем использовался в этапе 3.5 (например, 1 мл), чтобы достичь более высокой плотности клеток, и повторите этап 3.7.
    2. Если после этапа 3.7.1 OD600 всё еще ниже 1, значит, культура недостаточно плотная; начните процедуру заново с этапа 3.1. Инкубируйте культуры дольше или увеличьте количество инокулята при постановке ночных культур так, чтобы конечная плотность ночной культуры была около OD600 = 0,5-0,8, как описано в этапе 3.2.
  8. Рассчитайте объем ZLM, который необходимо добавить к 600 µL промытых клеток в кювете для получения OD600 = 1, используя следующее уравнение и значение OD600, измеренное на этапе 3.7:
    Объем ZLM (μL) = (исходная OD600 - 1) × 600 μL
  9. Добавьте объем ZLM, рассчитанный в этапе 3.8, в кювету, подготовленную в этапе 3.7, тщательно перемешайте пипетированием 5-10 раз и повторно измерьте OD600.
  10. Доведите OD600 до значения в пределах 5% от OD600 = 1, следуя подэтапам, перечисленным ниже. Используйте две пипетки, одна из которых (размера P1000) предназначена только для перемешивания культуры, чтобы избежать чрезмерного расхода наконечников при каждой корректировке.
    1. Если OD600 выше 1, добавляйте ZLM по каплям (~50 µL за раз), тщательно перемешивайте, всасывая и вытесняя жидкость пипеткой 5-10 раз, и измеряйте OD600. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока культура не окажется в пределах 5% от OD600 = 1.
    2. Если в процессе нормирования OD600 опускается ниже 1, добавьте больше промытых клеток (~20 µL для начала) из этапа 3.5, тщательно перемешайте пипетированием 5-10 раз и измерьте OD600. Повторяйте этот процесс по мере необходимости (или добавляйте больше ZLM, как описано в этапе 3.10.1, если OD600 превысит 1), пока культура не окажется в пределах 5% от OD600 = 1.
    3. Следите за тем, чтобы объем в кювете во время нормирования клеток не превышал ~1,5 мл, чтобы избежать проливания культуры в спектрофотометр. При разведении, если это необходимо, удаляйте часть культуры из кюветы. Также убедитесь, что объем культуры в кювете превышает минимум, необходимый для точного измерения OD600 на данном спектрофотометре. Большинству спектрофотометров требуется не менее 600 µL.
  11. Повторите этапы нормирования клеток (3.6 - 3.10) для всех штаммов и условий, включенных в исследование.
  12. Подготовьте общее количество колб, необходимых для эксперимента, асептически внеся по 50 мл ZLM в пластиковые колбы Эрленмейера объемом 250 мл, подготовленные согласно описанию в этапе 1.
  13. Инокулируйте колбы, асептически внося 50 µL нормированной культуры с OD600 = 1 непосредственно из кюветы до конечного значения OD600 = 0,001 (разведение нормированного инокулята 1:1000).
  14. Для культур, выращиваемых без ограничения по Zn2+ (т. е. в среде с достаточным содержанием Zn2+, ZRM), добавьте 30 µL стерильного 10 mM ZnSO4 (свежеприготовленного из стерильного стокового раствора 1M) непосредственно в колбы с культурой до конечной концентрации 6 µM ZnSO4.
  15. Инкубируйте колбы при 37 °C с встряхиванием при 100 rpm в течение 3 дней до достижения стационарной фазы (День 0 — день инокуляции).
  16. Каждый день роста используйте микропланшетный ридер с монохроматором или на основе фильтров для измерения следующих показателей роста, используя 200 µL культуры в 96-луночном микропланшете с плоским дном. Проводите считывание планшета сразу после распределения клеток, чтобы они не успели осесть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительный нагрев ридера не требуется, так как абсолютные значения флуоресценции менее информативны, чем соотношения и сканы флуоресценции, а малый измеряемый объем быстро уравновешивается с температурой комнаты во время установки планшета. Флуоресценцию можно измерять сверху или снизу планшета, если на крышке образуется конденсат, хотя при считывании снизу значения интенсивности флуоресценции в целом ниже.
    1. Плотность клеток (т. е. OD600): чтобы привести значение OD600, полученное на микропланшетном ридере, к стандартному оптическому пути 1 см, постройте калибровочную кривую для пересчета показаний с учетом длины пути в микропланшете при заданном объеме (например, 200 µL).
    2. Флуоресценция кофактора F420 (возбуждение 420 нм/эмиссия 475 нм): для фильтровых микропланшетных ридеров используйте ближайший набор фильтров (например, возб. 430 нм/эм. 488 нм) и черные 96-луночные микропланшеты.
    3. Измерьте фоновую флуоресценцию при 375 нм (возб. 375 нм/эм. 475 нм).
    4. При использовании монохроматора выполните скан интенсивности флуоресценции в диапазоне возбуждения 230 - 440 нм с шагом 5 нм и фиксированной эмиссией 475 нм.
    5. При использовании монохроматора рассчитайте процент интенсивности флуоресценции при 375 нм по отношению к 420 нм по формуле:
      F375/420 (%) = (F375/F420) x 100

4. Запись и измерение длины клеток

  1. На 3-й день визуализируйте и зафиксируйте длину клеток. Очистите предметное и покровное стекла салфеткой без ворса. Пипеткой нанесите каплю культуры объемом 10 µL на предметное стекло и поместите покровное стекло непосредственно поверх культуры. Осторожно нажмите на покровное стекло, чтобы культура распределилась и почти полностью заполнила область под стеклом. Подготовьте препараты и приступите к визуализации немедленно, чтобы предотвратить высыхание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если культура распределяется плохо или присутствуют частицы мусора, препятствующие плотному контакту, движение воды помешает захватить клетки в фокусе. В этом случае подготовьте новый препарат.
  2. Используя сложный микроскоп (или DIC, см. ниже) с масляным иммерсионным объективом 100x и окуляром 10x (общее увеличение 1000x) и камерой, визуализируйте подготовленный препарат.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки гораздо легче увидеть благодаря контрасту, который обеспечивает дифференциально-интерференционный контраст (DIC) микроскопия10. По возможности используйте этот тип микроскопа для получения высококачественных изображений. Для рутинного анализа и проверки статуса роста при ограничении Zn2+ достаточно стандартного сложного светового микроскопа.
  3. Сделайте снимки участков предметного стекла, где находятся несколько клеток, которые находятся в фокусе, лежат в одной плоскости (т. е. видна вся длина клетки) и не двигаются. Сделайте достаточное количество снимков различных областей стекла (или нескольких стекол с одной и той же культурой), чтобы было измерено не менее 100 клеток.
  4. Используя тот же микроскоп и объектив, снимите калибровочный предметный предмет.
  5. В программе Fiji27 с помощью инструмента «прямая линия» (straight-line tool) проведите линию по всей длине калибровочного стекла. Выберите Analyze > Set scale и введите известное расстояние и единицу измерения шкалы. Выберите Global, чтобы применить этот масштаб ко всем последующим изображениям и измерениям.
  6. Откройте микрофотографию. С помощью инструмента «прямая линия» проведите линию по длине клетки и нажмите клавишу M на клавиатуре, чтобы измерить клетку. Измерьте не менее 100 клеток каждой культуры.
  7. Скопируйте данные о длине, сгенерированные в появившемся окне Fiji, в программу для работы с электронными таблицами или сохраните их в виде файла со значениями, разделенными запятыми (.csv), для последующего статистического анализа.

5. Модификации для выращивания Zn2+ограниченный M. tuberculosis (Mtb)

ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от Mtb-H37Rv, штамм Mtb-Aux не способен синтезировать L-лейцин и D-пантотенат, поэтому данные добавки вводятся в питательные среды28Добавление добавок для Mtb-Aux не влияет на Zn2+ ограничение, и оба штамма демонстрируют схожие фенотипы в ZLM23Данный протокол представляет собой модифицированную версию ранее опубликованного протокола.23основное различие заключается в том, что культуры выращивают в течение 8 дней вместо 10, чтобы уменьшить агрегацию и обеспечить обогащение одиночными клетками, что необходимо для последующих этапов, таких как инфицирование макрофагов. Для ознакомления с другими незначительными различиями, пожалуйста, обратитесь к оригинальной публикации23Метод инокуляции отличается от M. smegmatis в связи с необходимостью использования значительно большего количества инокулята для инициирования роста M. tuberculosis.

  1. Для Mtb-Aux во все среды добавьте дополнительные добавки: 50 µg/mL L-леуцина и 48 µg/mL D-пантотената. Стерилизуйте путем фильтрации через фильтр 0.2 µm 1000-кратные стоковые растворы L-леуцина (50 mg/mL) и пантотената кальция (48 mg/mL), затем добавьте их в стерилизованные среды.
  2. В асептических условиях добавьте 1 mL размороженного глицеринового стока клеток в 4 mL среды 7H9-ADC в пробирку с круглым дном и зажимной крышкой объемом 14 mL (для Mtb-Aux) или в трубку биореактора объемом 50 mL (для Mtb-H37Rv).
  3. Инкубируйте при 37 °C без встряхивания до достижения культурой OD600 ~1. Это займет около 1 недели. Аэрируйте культуру один раз в день, открывая пробирку в боксе биологической безопасности и несколько раз перемешивая культуру с помощью пипетирования.
  4. Инокулируйте 1 mL стационарной культуры в 50 mL среды 7H9-ADC в вентилируемую пластиковую колбу объемом 250 mL. Одной 50 mL культуры в 7H9-ADC достаточно для проведения биологических трипликатов для каждого штамма и условия (например, дикого типа в ZLM и ZRM). Чтобы избежать появления крупных комков (т. е. крупных клеточных агрегатов), дайте культуре отстояться в течение 5-10 мин перед инокуляцией, чтобы комки осели на дно пробирки, и берите культуру из верхнего слоя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инокуляция с крупными комками приводит к образованию комковатых культур, что влияет на нормализацию и воспроизводимость культуры.
  5. Инкубируйте при 37 °C с встряхиванием при 100 rpm до достижения культурой OD600 0.5-0.8 (средняя логарифмическая фаза). Это займет 3-5 дней.
  6. Перенесите культуру в коническую пробирку объемом 50 mL и осадите клетки центрифугированием при 3,000 x g в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант, аспирировав 40 mL серологическим пипеточником и удалив оставшийся супернатант микропипеткой P1000.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап критически важен для минимизации переноса Zn2+ из среды 7H9-ADC.
  7. Ресуспендируйте осадок в 5 mL среды ZLM и доведите общий объем культуры в конической пробирке до 50 mL с помощью ZLM.
  8. Повторите центрифугирование при 3,000 x g в течение 10 мин при комнатной температуре для осаждения клеток. Удалите супернатант. Ресуспендируйте клеточный осадок до конечного объема 50 mL, как описано в пункте 5.7.
  9. Измерьте OD600 промытых посевных клеток и рассчитайте объем, необходимый для получения начальной OD600 0.05 (для Mtb-H37Rv) или 0.08 (для Mtb-Aux) в 50 mL, используя следующее уравнение:
    Уравнение объема посевной культуры; формула оптической плотности для микробиологических экспериментов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рост Mtb-Aux при начальной OD600 0.05 нестабилен; поэтому для обеспечения стабильного роста используется более высокая OD600 0.08.
  10. Перенесите рассчитанный в пункте 5.9 объем посевной культуры в новую коническую пробирку объемом 50 mL и доведите объем до 50 mL средой ZLM. Перелейте промытую и нормализованную культуру из конической пробирки в пластиковые колбы Эрленмейера, подготовленные согласно описанию в пункте 1. Повторите процедуру, используя ту же коническую пробирку для всех биологических повторностей каждого штамма и условия.
  11. Для культур, выращиваемых без ограничения по Zn2+ (т. е. в средах с достаточным содержанием Zn2+, ZRM), добавьте 30 µL стерильного 10 mM ZnSO4 непосредственно в колбы с культурой до конечной концентрации 6 µM ZnSO4.
  12. Инкубируйте колбы с культурой при 37 °C с встряхиванием при 100 rpm в течение 8 дней. Измеряйте OD600 и флуоресценцию F420 на протяжении всего роста, как описано в пункте 3. Утилизируйте культуры, если они стали комковатыми в первые несколько дней роста (т. е. культура не выглядит мутной, и по всему объему видны комки).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале в первые несколько дней роста культуры должны быть преимущественно планктонными (т. е. без крупных комков, видимых невооруженным глазом). Культуры Mtb, особенно в среде ZLM, становятся всё более комковатыми по мере роста; появление хлопьев комков на поверхности среды ожидаемо к поздней логарифмической фазе23.

Результаты

Фенотипы-биоиндикаторы M. smegmatis
Дикий тип M. smegmatis культуры, выращенные в среде ZLM, которые достигают Zn2+—ограничении роста имеют три основных биоиндикаторных фенотипа по сравнению с клетками, выращенными в условиях содержания Zn2+-условия избытка питательных веществ: [1] снижение оптической плотности (OD)600, [2] удлиненные клетки и [3] снижение пика флуоресценции при 420 нм. Мутант с отсутствием AltRP (ΔaltRP) не имеет того же содержания Zn2+-зависимый морфогенез в качестве дикого типа10, и его уникальный фенотип в Zn2+Ограниченные по питательным веществам среды могут быть использованы в качестве дифференциального биоиндикатора. Следовательно, сначала следует оценить все три показателя биоиндикации для дикого типа, выращенного на средах ZRM и ZLM. Если ожидаемый уровень Zn2+наблюдается фенотип, ограниченный диким типом, ΔaltRP Затем следует оценить делеционный штамм. Рост в среде ZLM не всегда обеспечивает достаточное содержание Zn2+-ограниченные условия, что и обусловливает необходимость в биоиндикаторах. Уникальные штаммы дикого типа и ΔaltRP фенотипы биоиндикаторов подтверждают наличие биологически значимого Zn2+были достигнуты лимитирующие условия. Если в культурах, выращенных на среде ZLM, не достигается лимит Zn2+—ограничение роста из-за дефицита Zn2+ загрязнение среды или культуральных сосудов (ZLM-C), эти фенотипы биоиндикаторов будут выражены менее ярко, как показано в Рисунок 1 и Рисунок 2Напротив, если концентрация Zn2+ в ZLM слишком низкий, рост нарушен из-за дефицита Zn2+ истощение (ZLM-D), которое проявляется в низкой мутности культуры и изменении фенотипов биоиндикаторов, что также подробно описано в Рисунок 1 и Рисунок 2.

Плотность клеток является надежным показателем ограничения Zn2+. Культуры, выращенные в ZRM, спустя 72 ч стабильно достигают высокой мутности (OD600 выше 5), иногда с образованием агрегатов, и визуально имеют более желтый цвет (данные не представлены) по сравнению с культурами, выращенными в ZLM (Рисунок 1A). Ограничение Zn2+ подавляет рост (что характеризуется снижением OD600) всех штаммов по сравнению с условиями достаточного содержания Zn2+, при этом штамм ΔaltRP имеет более низкую плотность клеток, чем дикий тип (Рисунок 1A). Рост в условиях ограничения Zn2+ в ZLM стабильно дает OD600 выше 3,5 и ниже 5 для дикого типа и ниже 3 для штамма ΔaltRP (Рисунок 1A). Культуры, выращенные в ZLM с загрязнением Zn2+ (ZLM-C), достигают плотности клеток (OD600 выше 5), аналогичной культурам с достаточным содержанием Zn2+, выращенным в ZRM (Рисунок 1A). Если концентрация [Zn2+] в ZLM слишком низка, в культурах возникает сильный дефицит Zn2+ (ZLM-D), и рост нарушается, о чем свидетельствует снижение плотности клеток в культурах дикого типа (OD600 ниже 3; Рисунок 1A). Плотность клеток дикого типа (3,5 < OD600 < 5) должна служить первым контрольным пунктом фенотипа биоиндикатора для подтверждения условий ограничения Zn2+. К рассмотрению следует допускать только те культуры дикого типа, которые выросли до ожидаемой плотности клеток; анализ штамма ΔaltRP должен проводиться после подтверждения фенотипа биоиндикатора ограничения Zn2+ у дикого типа.

Культуры дикого типа в стационарной фазе, выращенные в среде ZLM с ограниченным содержанием Zn2+ имеют вытянутую форму со средней длиной клетки около 9 µm, в то время как Zn2+—культуры, выращенные в среде ZRM с избытком питательных веществ, характеризуются малой длиной, при этом средняя длина клетки составляет около 3 µm (Рисунок 1B). Культуры дикого типа, выращенные в среде ZLM с Zn2+ загрязнение (ZLM-C) не элонгируются полностью, но они немного длиннее, чем Zn2+-клетки с соответствующим наполнением и средней длиной клетки, составляющей 5 µmБиоиндикация цинка (Zn)2+ Загрязнение всех партий ZLM указывает на возможную контаминацию в процессе приготовления, тогда как загрязнение отдельных культур (т. е. колб) свидетельствует о контаминации из-за ненадлежащего промывания колб или подготовки культур. Культуры дикого типа, выращенные в ZLM с сильным дефицитом Zn2+ (ZLM-D) характеризуются менее выраженным удлинением со средней длиной клетки около 7 µm (Рисунок 1B). Удлиненный фенотип дикого типа не наблюдается у ΔaltRP штамм, и ΔaltRP клетки с ограниченным содержанием Zn2+ имеют среднюю длину клетки около 5 µm (Рисунок 1B). Рисунок 2 представлены репрезентативные изображения клеток, выращенных в различных препаратах ZLM или ZRM (после шага 2) и визуализированных с помощью светового комбинированного микроскопа. После шага 4 клетки из многочисленных полей зрения на изображениях, подобных представленному на Рисунок 2 используются для расчета средней длины клеток в культурах, представленных на Рисунок 1BФенотип удлинения дикого типа специфичен для Zn2+—лимитирующие условия; при дефиците Zn в культурах удлинение клеток не наблюдается2+-с достаточным или критически низким уровнем Zn2+-обедненный (Рисунок 1B и Рисунок 2).

Фенотип биоиндикатора со сниженной флуоресценцией F420 лучше всего наблюдается при флуоресцентном сканировании (Рисунок 1C). Снижение флуоресценции кофактора F420 количественно оценивают путем вычисления процентного отношения интенсивности флуоресценции при 375 нм (фон) к интенсивности при 420 нм (автофлуоресценция кофактора F420), как описано в шаге 3.16.5; данный показатель обозначается как F375/420. Для монохроматических планшетных ридеров без функции флуоресцентного сканирования для расчета F375/420 подходят точечные измерения при 375 нм и 420 нм (в обоих случаях с эмиссией при 475 нм). Культуры дикого типа, выращенные в условиях достаточного содержания Zn2+ (т.е. в ZRM), имеют высоковоспроизводимое значение F375/420 около 17% (Рисунок 1D). Снижение флуоресценции F420 в культурах с ограниченным содержанием Zn2+, выращенных в ZLM, характеризуется увеличением F375/420 примерно до 27% (Рисунок 1D). Флуоресценция F420 в штамме ΔaltRP в условиях ограниченного содержания Zn2+ значительно ниже, чем у дикого типа в тех же условиях, что наглядно видно при флуоресцентном сканировании (Рисунок 1C). Значение F375/420 в штамме ΔaltRP при дефиците Zn2+ более вариабельно и составляет от 50% до 80% (Рисунок 1D). Культуры, выращенные в ZLM, но демонстрирующие биоиндикацию контаминации Zn2+ (ZLM-C), имеют сниженный показатель F375/420 (около 21%), а культуры с истощением запасов Zn2+ (ZLM-D) имеют F375/420 около 35% (Рисунок 1D).

Таким образом, для подтверждения статуса лимитирования по Zn2+ в культурах, выращенных в среде ZLM, следует оценить три фенотипа биоиндикаторов в штаммах дикого типа и ΔaltRP. Для биологически релевантного роста в условиях лимитирования Zn2+ показатели биоиндикаторов должны быть следующими: [1] OD600 дикого типа составляет 3,5–5, а штамма ΔaltRP — менее 3; [2] длина клеток дикого типа составляет около 10 µm, а клеток ΔaltRP — в два раза меньше; и [3] F375/420 штамма ΔaltRP высокая, т. е. выше 50%.

Фенотипы биоиндикаторов M. tuberculosis
M. tuberculosis в условиях ограничения Zn2+ не проявляет ту же морфогенную программу, что и M. smegmatis. В частности, различие в OD600 между культурами с достаточным содержанием Zn2+ и ограниченным содержанием Zn2+ отсутствует, и культуры с ограничением Zn2+ не демонстрируют какого-либо очевидного морфологического фенотипа, т. е. они не удлиняются23. Аналогичным образом, в M. tuberculosis не наблюдается фенотипа биоиндикатора при дефиците Zn2+ (т. е. снижения плотности клеток), который отмечается у M. smegmatis. Культуры с ограничением Zn2+ имеют более выраженную склонность к образованию комков по сравнению с культурами с достаточным содержанием Zn2+, хотя к 10-му дню обе группы характеризуются значительным слипанием (наблюдалось как для Mtb-H37Rv, так и для Mtb-Aux). Ключевым фенотипом биоиндикатора при ограничении Zn2+ у M. tuberculosis является снижение пиковой флуоресценции F420, о чем сообщалось ранее23. Чтобы минимизировать слипание, здесь представлены результаты для культур, выращиваемых в течение 8 дней, а не 10. Снижение флуоресценции F420 в культурах с ограничением Zn2+ заметно как на монохроматических (Рисунок 3), так и на фильтровых планшетных ридерах. При использовании фильтровых планшетных ридеров и штамма Mtb-H37Rv значения необработанной флуоресценции в культурах с ограничением Zn2+ (т. е. выращенных в ZLM) составляют около 50% от значений в культурах с достаточным содержанием Zn2+ (т. е. выращенных в ZRM; данные не представлены). При использовании монохроматического планшетного ридера в режиме считывания снизу и штамма Mtb-Aux культуры с достаточным содержанием Zn2+ имеют F375/420 около 75%, и культуры ZLM, контаминированные Zn2+, имеют аналогичные значения. Снижение флуоресценции F420 в культурах с ограничением Zn2+, выращенных в ZLM, отражается в значении F375/420 более 100%. Штамм ΔaltRP при ограничении Zn2+ демонстрирует рост и флуоресценцию F420, аналогичные дикому типу при ограничении Zn2+ (Рисунок 3), и не может быть использован в качестве биоиндикатора для M. tuberculosis так, как это делается для M. smegmatis (Рисунок 1). Следовательно, рекомендуется тестировать среды, предназначенные для выращивания M. tuberculosis, на быстрорастущем штамме M. smegmatis.

Кривые роста, распределение по длине и анализ флуоресценции в исследовании бактерий; графики и диаграммы размаха.
Рисунок 1: Фенотипы биоиндикаторов M. smegmatis, выращенных в условиях лимитирования Zn2+, а также влияние загрязнения Zn2+ и истощения Zn2+ на эти фенотипы. Репрезентативные примеры фенотипа биоиндикатора, представленные на каждой панели, получены из одних и тех же культур через 72 ч. Примеры результатов роста при загрязнении Zn2+ (ZLM-C), лимитировании Zn2+ (ZLM-L) и истощении Zn2+ (ZLM-D) получены из независимых партий сред, приготовленных по одному и тому же методу, описанному здесь (шаг 2). Репрезентативные фенотипы штаммов дикого типа и ΔaltRP при лимитировании Zn2+ получены из одной партии ZLM. Для всех штаммов и условий использованы три биологических повторности (n=3). (A) Кривые роста, показывающие оптическую плотность при 600 нм (OD600) и снижение плотности клеток при лимитировании и истощении Zn2+. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение между повторностями. (B) Длина клеток штаммов дикого типа и ΔaltRP, демонстрирующая удлиненный фенотип дикого типа при лимитировании Zn2+. Диаграмма размаха показывает межквартильный размах, минимум, максимум и медиану длины клеток в µm. (C) Репрезентативные сканы флуоресценции культур, показывающие снижение пика флуоресценции F420 при лимитировании Zn2+ и уменьшение флуоресценции F420 у штамма ΔaltRP при лимитировании Zn2+. Для каждой из различных партий сред показана только одна репрезентативная культура из трех биологических повторностей. При сканировании флуоресценции использовался диапазон длин волн возбуждения от 230 нм до 440 нм с шагом 5 нм и длина волны эмиссии 475 нм. Вставка в верхнем левом углу представляет собой увеличенное изображение штаммов дикого типа и ΔaltRP при лимитировании Zn2+ для акцентирования снижения пика флуоресценции на 420 нм у штамма ΔaltRP при лимитировании Zn2+. Единицы осей совпадают с основным графиком. Все легенды такие же, как в (A). (D) Количественная оценка снижения флуоресценции кофактора F420, рассчитанная на основе процентного соотношения F375/420. Проценты рассчитаны по значениям, полученным при сканировании флуоресценции в (C). Диаграмма размаха показывает межквартильный размах, минимум, максимум и медиану процентов. Сокращения, обозначающие статус среды по Zn2+ (указаны в скобках после типа среды): R = насыщенная Zn2+, C = загрязненная Zn2+, L = лимитированная Zn2+, D = истощенная по Zn2+; прочие сокращения: WT = штамм дикого типа, a.u. = произвольные единицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты электрофореза статуса Zn²⁺, WT против ΔaltRP, анализ разделения белков.
Рисунок 2: Репрезентативные микрофотографии M. smegmatis через 72 ч. Изображения получены из культур, показанных на Рисунке 1. Снимки клеток были сделаны с помощью светового составного микроскопа при общем увеличении 1000x с использованием иммерсионного объектива 100x. Масштабный отрезок — 10 µm. Сокращения, обозначающие статус Zn2+ в среде, указанные в скобках после типа среды: R = достаточное содержание Zn2+, C = загрязнение Zn2+, L = ограниченное содержание Zn2+ и D = дефицит Zn2+; другие сокращения: WT = штамм дикого типа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

График спектра возбуждения флуоресценции; длина волны в зависимости от флуоресценции; анализ исследования белков.
Рисунок 3: Потеря фенотипа биоиндикатора F420 у M. tuberculosis в условиях ограничения Zn2+, продемонстрированная на репрезентативных сканах флуоресценции ауксотрофного штамма Mtb mc26206 (Mtb-Aux). Примеры результатов роста в условиях загрязнения Zn2+ и ограничения Zn2+ получены из независимых партий сред. Штаммы дикого типа и ΔaltRP в условиях ограничения Zn2+ получены из одной партии ZLM. Для всех штаммов и условий использовались три биологических повтора (n=3). На графике представлена только одна репрезентативная культура из биологических трипликатов для каждого из различных вариантов сред и штаммов. Сканирование флуоресценции проводилось в режиме считывания с нижней поверхности после 8 дней роста в диапазоне длин волн возбуждения от 230 nm до 440 nm с шагом 5 nm и длине волны испускания 475 nm. Сокращения, обозначающие статус среды по отношению к Zn2+ и указанные в скобках после типа среды: R = насыщенная Zn2+, C = загрязненная Zn2+, L = ограниченная по Zn2+ и D = обедненная по Zn2+; другие сокращения: WT = штамм дикого типа, a.u. = произвольные единицы. Нажмите здесь, чтобы просмотреть этот рисунок в большем размере.

Обсуждение

Существенным вкладом в пробел в знаниях о механистической основе альт-рибосом является сложность достижения Zn2+-ограничивающих условий in vitro. Загрязнение следами Zn2+ в лабораторных условиях является распространенным явлением; таким образом, достижение воспроизводимых условий роста, ограниченных Zn2+, является сложной задачей. Загрязнение Zn2+ может происходить из нескольких источников, хотя наиболее значительным и распространенным источником загрязнения и изменчивости является сверхчистая вода, используемая для ополаскивания лабораторной посуды и изготовления сред. Системы сверхчистой воды должны обслуживаться надлежащим образом и должны быть промыты в течение 1 минуты перед полосканием лабораторной посуды или использованием воды для сред. Колбы, которые не были тщательно промыты или промыты сверхчистой водой, могут вызвать загрязнение Zn2+ , и это будет очевидно по повышенной плотности клеток в некоторых колбах, но не в других из той же партии ZLM. Совершенно новые колбы могут быть использованы для оценки того, является ли источником загрязнения Zn2+ повторно использованные колбы или фильтрующий материал. Загрязнение Zn2+ в ZLM должно быть устранено путем более тщательной промывки предметов, используемых для изготовления среды, и специального набора материалов для приготовления ZLM. Если ни одна из этих мер не окажется успешной в достижении ожидаемых фенотипов биоиндикаторов, следует количественно оценить [Zn2+] в ультрачистой воде и ZLM, чтобы исключить возможность того, что источник воды загрязнен Zn2+. Как сообщалось ранее, [Zn2+] ZLM составляет 115 ± 37 нМ23, а концентрации ниже 70 нМ и выше 150 нМ обычно приводят к обеднению Zn2+ и загрязнению Zn2+ фенотипами соответственно. Тем не менее, хорошая подготовка среды является лишь одним из факторов, влияющих на результат, и недостаточное или избыточное содержание Zn2+ может возникнуть из-за неправильной подготовки инокулята и/или культивирования, т.е. плохого сцеживания Zn2+ изобилующей среды во время промывки. Все включенные здесь культуры M. smegmatis были получены одинаково - результаты роста Zn2+ (ZLM-C) и Zn2+ обедненные (ZLM-D) включены для того, чтобы подчеркнуть изменчивость, которая может иметь место между различными партиями сред с использованием одной и той же системы сверхчистой воды, даже при правильном проведении экспериментов.

Чтобы гарантировать, что культивирование клеток в ZLM дает воспроизводимые Zn2+-ограничивающие биоиндикаторные фенотипы, важно иметь уникальную маркировку колб, всегда использовать их для одного и того же состояния (т.е. с ZLM или ZRM), отслеживать колбы в течение нескольких использований и утилизировать колбы, которые находятся в конце своего жизненного цикла или продолжают давать фенотипы, загрязненные Zn2+, с помощью ZLM. Правильная подготовка инокулюма очень важна для достижения Zn2+-ограничивающего роста, поскольку Zn2+ уносится из недостаточно промытых семенных клеток является распространенным источником Zn2+-загрязнения, который может быть трудно разобрать из Zn2+-загрязненного ZLM. Культуры M. smegmatis следует анализировать и собирать после 72 ч роста в ZLM (и ZRM при параллельном выращивании). Морфогенез и фенотипы биоиндикаторов ярко выражены от 48 до 72 ч; таким образом, слишком ранняя (или слишком поздняя) оценка или сбор культур на ограничение Zn2+ может не дать полного фенотипа биоиндикатора. Культуры, обедненные Zn2+ , будут иметь длину клеток, аналогичную той, которая загрязнена Zn2+; таким образом, для их дифференциации следует использовать флуоресценцию F420 и наружный диаметр600 . Аналогичным образом, культуры, загрязненные Zn2+, не всегда могут расти лучше, чем бактерии с ограниченным Zn2+, но флуоресценция F420 и длина клеток дикого типа и мутанта ΔaltRP должны показать, достигнуто ли условие, ограниченное Zn2+.

То же самое относится и к M. tuberculosis, так как потеря фенотипа биоиндикатора F420 в культурах, ограниченных Zn2+, выражена между 8-10 днями роста в ZLM. Несмотря на то, что M. tuberculosis не проявляет сильного Zn2+-ограниченного биоиндикаторного фенотипа, как M. smegmatis, представленный здесь метод роста был использован для связывания потери фенотипа биоиндикатора F420 с Zn2+-ограниченным ростом с использованием функциональных анализов и транскриптомики как у вирулентных, так и у аттенуированных штаммов M. tuberculosis (ссылка23и неопубликованные данные). Таким образом, следование флуоресценции F420 является доступным способом мониторинга и верификации биологических Zn2+-ограничивающих состояний у M. tuberculosis. Важно отметить, что механизм, приводящий к снижению флуоресценции F420 во время Zn2+-ограничивающих условий, остается неразгаданным, как и различие между тем, вызвана ли сниженная флуоресценция уменьшением содержания коферментного пула в целом или сдвигом в его окислительно-восстановительном состоянии, поскольку только окисленная форма испускает флуоресценцию29.

Как показано здесь, приготовление Zn2+-ограничивающей среды имеет свои нюансы, и существует множество факторов, которые могут влиять на эффективную концентрацию ионов Zn2+ в среде даже при следовании одному и тому же протоколу и использовании одних и тех же реагентов. Следы Zn2+ в ZLM обеспечивают достаточный рост и экспрессию Zn2+-ограничивающего фенотипа. Это постепенное снижение Zn2+ для достижения предела похоже на модель гипоксии Уэйна, при которой кислород постепенно потребляется бактериями, выращенными в закрытой колбе30. Поскольку как гипоксия, так и Zn2+ ограниченные фенотипы зависят от роста бактерий, то при недостатке кислорода или, в данной модели, Zn2+ в посевном материале или среде, бактерии прекратят рост до того, как они смогут пройти соответствующую морфогенную программу. Таким образом, в то время как загрязнение Zn2+ является более очевидной проблемой при достижении ограничения Zn2+ , истощение Zn2+ также может представлять проблему из-за нарушения роста и пропуска Zn2+-зависимого триггера во время активного роста. Кроме того, использование монохроматора или считывателя пластин на основе фильтра с режимами чтения сверху или снизу для интенсивности флуоресценции незначительно влияет на рассчитанный процент F375/420 . Поэтому значения из каждой лаборатории могут быть не совсем сопоставимы с представленными здесь, но они должны быть схожими и следовать одним и тем же тенденциям. Таким образом, методы и процедуры получения ZLM, дающего Zn2+-ограничивающий рост, должны быть оптимизированы для каждой лаборатории и системы сверхчистой воды, а представленные здесь биоиндикаторные фенотипы должны использоваться в качестве стандарта для определения Zn2+-ограничивающих условий.

Из-за трудностей в стандартизации и воспроизведении условий роста, ограниченных Zn2+, доступным подходом к обходу загрязнения Zn2+ является добавление хелатирующего агента в среды, приготовленные без добавления Zn2+. Тем не менее, этот подход искажает истинную биологическую реакцию на ограничение Zn2+, часто создавая среду, испытывающую недостаток Zn2+ и других микроэлементов. Показано, что даже Zn2+-специфичные хелатирующие агенты активируют реакцию на железосодержащее голодание, в дополнение к Zn2+-зависимому транскрипционному ответу у M. tuberculosis23. Кроме того, использование хелатирующих агентов требует тщательного титрования и выбора времени, чтобы избежать крайне недостаточного содержания Zn2+ среды, которая не отражает биологическую реакцию при переходе от изобилия Zn2+ к условиям, ограниченным Zn2+, или при длительном росте в средах с ограниченной доступной свободой Zn2+. Наконец, добавление хелатирующих агентов может быть несовместимо с последующими применениями (например, при макрофагах или инфекциях животных). Принципиально иные выводы сделаны о форме и функции Alt-рибосом, полученных с хелатирующими агентами, в сравнении с постепенным истощением Zn2+ в активно растущих культурах17,24. Здесь выделены различные фенотипы, возникающие в результате относительно незначительных различий в чистоте воды в разных партиях сред, даже при правильном выполнении процедуры. Представленная здесь количественная, воспроизводимая и биологически значимая система генерации альтернативных рибосом, т.е. в культурах дикого типа с ограниченным Zn2+ без добавления хелаторов, предлагает стандартизированный метод, который будет иметь первостепенное значение для объединения вкладов в этой области в сторону лучшего понимания альтернативной биологии рибосом.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование финансировалось Национальным научным фондом (NSF) CAREER Award 1844854, Американской ассоциацией легких Innovation Award IA -937538 и Национальным институтом здравоохранения (NIH) NIAID R21 AI109293 to S.P. Текущий адрес Allexa D. Burger - Тихоокеанский исследовательский центр биологических наук, Гавайский университет в Маноа, Гонолулу, Гавайи, США.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Системы вакуумной фильтрации объемом 1000 мл, стандартная линейкаVWR10040-440
125 мл колбы шейкераGreiner Bio-One679501
14 мл пробирки для культивирования, пластиковые, с двухпозиционными колпачкамиVWR60818-725
250 мл колбы шейкера ErlenmeyerGreiner Bio-One679502
40X-1000X Лабораторный бинокулярный биологический состав МикроскопOmaxM82EZ
50 мл Биореакционные пробирки, стерильныеVWR76211-286
50 мл Высокопроизводительные центрифуги с флажкамиVWR89039-656
Alcojet Низкопенящееся порошковое моющее средствоAlconox1404
Аммоний-железо (III) цитрат, коричневыйThermo ScientificAAA1119930 MW: 265 г/моль, для 1М раствора добавить 1,325 г на 5 мл ультрачистой воды; хранить в защищенном от света месте при температуре 4 °C
Бычий сывороточный альбуминThermo ScientificJ10857-A1
Кальций D-пантотенатThermo ScientificAC243300050
КаталазаSigma-AldrichC1345-10G
Лимонная кислота безводная, кристаллическаяFisher ScientificBP339-500
Декстроза безводнаяFisher ScientificD14-500
Difco Middlebrook 7H9 BrothBD Diagnostics271310
DiluPhotometer OD600 для определения плотности клеток и анализов БрэдфордаImplenOD600-10
GENios FL Считыватель микропланшетовTecanснят с производства
ГлицеринFisher ScientificG33-4
Infinite M200 PRO Многомодовый микропланшетный ридерTecanLGE140213-20BL
L-аспарагинThermo ScientificAAB2147336 
L-LeucineThermo ScientificA1231122
Macrofire SP CCD камераОптроникаДля использования с микроскопом Olympus
Сульфат магния гептагидратVWR97062-134
Milli-Q Direct 8 Система очистки водыMilliporeC85358
Moticam X3MoticСнят с производства, заменен на Moticam X5 Plus; для использования с составным микроскопом
Олеиновая кислотаThermo Scientific031997-14
Olympus BX51 вертикальный микроскопOlympusСнят с производства, заменен на BX53M
Фосфат калия, одноосновнойFisher ScientificBP362-500
Полумикро двухсторонние одноразовые пластиковые кюветыVWR97000-590
Хлорид натрия, кристаллVWRVW1494-01
гидроксид натрияFisher ScientificS318-500 
Tween 80MP Biomedicals103170
Гептагидрат сульфида цинка, кристаллический/ACSMP Biomedicals219145290

Ссылки

  1. Alloway, B. Soil factors associated with zinc deficiency in crops and humans. Environ Geochem Health. 31 (5), 537-548 (2009).
  2. Middag, R., de Baar, H. J. W., Bruland, K. W. The relationships between dissolved zinc and major nutrients phosphate and silicate along the GEOTRACES GA02 transect in the west Atlantic ocean. Global Biogeochem Cycles. 33 (1), 63-84 (2019).
  3. Corbin, B. D., et al. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science. 319 (5865), 962-965 (2008).
  4. Panina, E. M., Mironov, A. A., Gelfand, M. S. Comparative genomics of bacterial zinc regulons: Enhanced ion transport, pathogenesis, and rearrangement of ribosomal proteins. Proc Natl Acad Sci. 100 (17), 9912-9917 (2003).
  5. Outten, C. E., O’Halloran, T. V. Femtomolar sensitivity of metalloregulatory proteins controlling zinc homeostasis. Science. 292 (5526), 2488-2492 (2001).
  6. Merchant, S. S., Helmann, J. D. Elemental economy: microbial strategies for optimizing growth in the face of nutrient limitation. Adv Micro Physiol. 60, 91-210 (2012).
  7. Makarova, K. S., Ponomarev, V. A., Koonin, E. V. Two C or not two C: recurrent disruption of Zn-ribbons, gene duplication, lineage-specific gene loss, and horizontal gene transfer in evolution of bacterial ribosomal proteins. Genom Biol. 2 (9), RESEARCH 0033(2001).
  8. Yutin, N., Puigbò, P., Koonin, E. V., Wolf, Y. I. Phylogenomics of prokaryotic ribosomal proteins. PLoS One. 7 (5), e36972(2012).
  9. Prisic, S., et al. Zinc regulates a switch between primary and alternative S18 ribosomal proteins in Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 97 (2), 263-280 (2015).
  10. Dow, A., Prisic, S. Alternative ribosomal proteins are required for growth and morphogenesis of Mycobacterium smegmatis under zinc limiting conditions. PLoS One. 13 (4), e0196300(2018).
  11. Chen, Y. X., et al. Selective translation by alternative bacterial ribosomes. Proc Natl Acad Sci. 117 (32), 19487-19496 (2020).
  12. Natori, Y., et al. A fail-safe system for the ribosome under zinc-limiting conditions in Bacillus subtilis. Mol Microbiol. 63 (1), 294-307 (2007).
  13. Gabriel, S. E., Helmann, J. D. Contributions of Zur-controlled ribosomal proteins to growth under zinc starvation conditions. J Bacteriol. 191 (19), 6116-6122 (2009).
  14. Wolf, Y. I., Rogozin, I. B., Kondrashov, A. S., Koonin, E. V. Genome alignment, evolution of prokaryotic genome organization, and prediction of gene function using genomic context. Genom Res. 11 (3), 356-372 (2001).
  15. Akanuma, G., et al. Evolution of ribosomal protein S14 demonstrated by the reconstruction of chimeric ribosomes in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 203 (10), e00599(2021).
  16. Owen, G. A., Pascoe, B., Kallifidas, D., Paget, M. S. B. Zinc-responsive regulation of alternative ribosomal protein genes in Streptomyces coelicolor involves Zur and σR. J Bacteriol. 189 (11), 4078-4086 (2007).
  17. Li, Y., et al. Zinc depletion induces ribosome hibernation in mycobacteria. Proc Natl Acad Sci. 115 (32), 8191-8196 (2018).
  18. Li, Y., Corro, J. H., Palmer, C. D., Ojha, A. K. Progression from remodeling to hibernation of ribosomes in zinc-starved mycobacteria. Proc Natl Acad Sci. 117 (32), 19528-19537 (2020).
  19. Graham, A. I., et al. Severe zinc depletion of Escherichia coli. J Biol Chem. 284 (27), 18377-18389 (2009).
  20. Greening, C., et al. Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (2), 451-493 (2016).
  21. Gurumurthy, M., et al. A novel F 420 -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents. Mol Microbiol. 87 (4), 744-755 (2013).
  22. Patino, S., et al. Autofluorescence of mycobacteria as a tool for detection of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 46 (10), 3296-3302 (2008).
  23. Dow, A., et al. Zinc limitation triggers anticipatory adaptations in Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathogens. 17 (5), e1009570(2021).
  24. Tobiasson, V., Dow, A., Prisic, S., Amunts, A. Zinc depletion does not necessarily induce ribosome hibernation in mycobacteria. Proc Natl Acad Sci. 116 (7), 2395-2397 (2019).
  25. Dow, A., Burger, A., Marcantonio, E., Prisic, S. Multi-omics profiling specifies involvement of alternative ribosomal proteins in response to zinc limitation in Mycobacterium smegmatis. Front Microbiol. 13, 811774(2022).
  26. Singh, A. K., Reyrat, J. Laboratory maintenance of Mycobacterium smegmatis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 10, Unit10C.1(2009).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double Leucine and Pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in Guinea pigs. Infect Immunity. 72 (5), 3031-3037 (2004).
  29. Cheeseman, P., Toms-Wood, A., Wolfe, R. S. Isolation and properties of a fluorescent compound factor420, from Methanobacterium strain M.o.H. J Bacteriol. 112 (1), 527-531 (1972).
  30. Wayne, L. G., Hayes, L. G. An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence. Infect Immunity. 64 (6), 2062-2069 (1996).

Перепечатки и разрешения

Теги

F420Mycobacterium tuberculosis
Использование Mycobacterium smegmatis в качестве биоиндикатора условий роста, ограниченных цинком у микобактерий
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.