Method Article

Двухфотонная лазерная абляция остеобластов у развивающихся личинок данио-рерио

DOI:

10.3791/67279

⸱

September 6th, 2024

 , 
1CRTD - Center for Regenerative Therapies TU Dresden, 2Center for Healthy Aging, Faculty of Medicine, TU Dresden

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает подход к двухфотонной лазерной абляции, проведенный на личинках рыбок данио, который служит моделью для изучения регенерации костей и эффектов иммунного ответа на абляцию.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данио рерио (Danio rerio) обладают выдающейся способностью к регенерации различных органов и придатков. Регенерация костей у рыбок данио изучалась с использованием различных методов, таких как ампутация плавников, ощипывание чешуи, трепанация черепа и микроскопические подходы. С использованием конфокальной лазерной сканирующей установки, оснащенной двухфотонным лазером, был разработан метод лазерной абляции в качестве парадигмы поражения для абляции костеобразующих клеток (остеобластов) в развивающейся оперкуле личинок данио-рерио. Описанный здесь метод позволяет проводить точную абляцию клеток, так как площадь, форма и глубина могут быть точно отрегулированы. Кроме того, этот метод позволяет визуализировать область до и сразу после абляции, чтобы можно было проанализировать краткосрочные последствия травмы. В данной экспериментальной установке изучался иммунный ответ после абляции остеобластов в поврежденной области. После абляции наблюдалось увеличение рекрутирования макрофагов, что свидетельствует об актуальности их присутствия при регенерации кости.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рыбки данио регенерируют различные органы, такие как сетчатка, мозг, сердце и поджелудочная железа1. Кроме того, рыбки данио регенерируют скелетные элементы, поэтому их использовали для изучения регенерации плавников, чешуи и черепных крышек2. Для изучения регенерации тканей и костей использовались различные экспериментальные парадигмы, такие как резекция плавников (ампутация), перелом плавника, трепанация черепа 3,4, криотравма 5,6 или генетическая абляция 7,8,9. В последнее время подходы к лазерной абляции широко используются у рыбок данио для изучения реакции заживления и регенерации после травмы 10,11,12,13,14.

Лазерно-опосредованная абляция используется в различных областях биологических исследований, таких как механобиология, биология развития, исследования регенерации и хирургия опухолей 10,11,12,15,16,17,18,19. Существуют различные методики лазерной абляции, такие как использование YAG (иттрий-алюминиевый гранат), УФ (ультрафиолетовый) или 2p (двухфотонный)лазер20. Лазерная абляция позволяет удалять отдельные клетки или большие участки тканей очень точным образом, что позволяет изучать различные процессы, такие как реакция иммунной системы на абляцию опухоли21 или во время регенерации оперкул рыбок данио. В последнем примере абляция была подтверждена исчезновением ядерного и цитоплазматического сигнала флуорофора и окрашиванием некроза10,22.

Хорошо известно, что врожденный иммунный ответ и его регулируемая кинетика имеют важное значение для соответствующей регенерации тканей. Нейтрофилы и макрофаги являются первыми клетками, которые возвращаются в место повреждения, где они выполняют различные функции, такие как высвобождение цитокинов и факторов роста, удаление клеточного мусора иремоделирование внеклеточного матрикса. Этот рекрутинг и последующая функционализация макрофагов также наблюдались у ампутированных плавников данио-рерио24 и развивающейся оперкулы, которая была подвергнута лазерной «нанодиссекции», что привело к абляции остеобластов10. В последнем эксперименте наблюдалось восстановление числа остеобластов, нормальное развитие оперкул и рекрутирование клеток врожденного иммунитета (нейтрофилов, макрофагов и остеокластоподобных клеток) в поврежденную область после УФ-лазера и двухфотонной лазеропосредованной абляции10. Эксперименты на рыбках данио, в которых иммунная система была фармакологически подавлена с помощью глюкокортикоидов, показали нарушение регенерации при неправильно регулируемом иммунитете, что подтверждает функциональную роль иммунной системы в восстановлении тканей 3,10,25,26.

В данной работе описана двухфотонная лазерно-опосредованная методология абляции для изучения биологии регенерации костей развивающихся рыбок данио. В частности, эффект абляционного подхода остеобластов в оперкуле показан с точки зрения иммунного ответа, который исследуется путем мониторинга рекрутирования макрофагов в место абляции.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол исследования получил одобрение Земельного управления Саксонии, разрешения No 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. Используемые штаммы рыбок данио содержались в соответствии с национальным законодательством и в стандартизированных условиях, как описано ранее27,28. Подробная информация обо всех реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка материалов и растворов

  1. Храните эмбрионы в среде 1x E3. Приготовьте среду 1x E3, разбавив 170 мл бульона 60x E3 в 10 л деионизированной воды и добавив 2 мл 0,1% метиленового синего.
    1. Приготовьте 60-кратный питательный материал E3, смешав 17,2 г NaCl, 0,76 г KCl, 2,90 г CaCl2·2 H2O, 4,90 г MgSO4·7 H2O в 1 л деионизированной автоклавной воды.
  2. Для закладки личинок заранее приготовьте аликвоты с 1% низкой температурой плавления агарозы (LMA) и держите их при комнатной температуре.
    1. Для приготовления аликвот растворите LMA в 1x E3 среде, например, 500 мг LMA в 50 мл 1x E3 в колбе Эрленмейера, нагрейте раствор в микроволновой печи до полного растворения агарозы и распределите его по 1 мл аликвот в пробирках объемом 1,5 мл.

2. Разведение рыбок данио и сбор эмбрионов

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь были использованы двойные трансгенные личинки данио-рерио, сообщающие о присутствии коммитированных остеобластов [osterix:nGFP = Tg(Ola.Sp7:NLS-GFP)zf132]29 и макрофагов [mpeg:mCherry = Tg(mpeg:mCherry)gl23] (рис. 1A).

  1. Посадите родительских рыбок данио с желаемыми одиночными трансгенами в стандартные брачные клетки вечером накануне спаривания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартные брачные клетки позволяют икре переходить в более низкое отделение, где родительские данио-рерио не могут до них добраться.
    1. Держите самцов и самок отдельно до начала спаривания, используя разделитель в садке для спаривания. Уберите разделитель утром следующего дня, чтобы начать случку.
  2. Самое позднее в полдень извлеките родительских рыбок данио из аквариумов для разведения и соберите эмбрионы, процедив воду из брачной клетки через сито.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В случае, если точный возраст личинок имеет решающее значение, собирайте эмбрионы через равные промежутки времени примерно 30 минут. Маты сцепления следует использовать в экспериментах с различными экспериментальными группами.
  3. Поместите эмбрионы в чашку диаметром 100 мм, содержащую 1x среду E3, и держите их в инкубаторе при температуре 28 °C31.
  4. Удалите неоплодотворенные яйцеклетки и мертвые эмбрионы из чашки с помощью пластиковой пипетки с помощью стереомикроскопа и ежедневно меняйте 1x E3 среды.
  5. Перед экспериментом отсортируйте личинки, положительные на репортерные трансгены, с помощью флуоресцентного стереомикроскопа.

3. Встраивание личинок в легкоплавкую агарозу

  1. Растопите аликвоты LMA в термоблоке или водяной бане при температуре 65 °C. После того, как LMA расплавится, поддерживайте его при температуре 42 °C до заделки (Рисунок 1B). Добавьте 50 мкл 0,4% MS-222 к расплавленному 1 мл аликвоты LMA для достижения концентрации 0,02% MS-222 для анестезии.
  2. Обезболите 4 личинки dpf (через несколько дней после оплодотворения) (или более старые личинки) в среде MS-222 E3 0,02%.
  3. Перенесите личинок под наркозом в микролуночную чашку со стеклянным дном с помощью пластиковой пипетки Пастера объемом 3 мл и удалите излишки среды E3 той же пипеткой (рис. 1B). Не допускайте пересыхания личинок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В посуду одновременно может быть внедрено более одной личинки; Рекомендуется внедрить от 3 до 5 личинок, чтобы дать достаточно времени для размещения.
  4. Возьмите расплавленную агарозу LMA с водяной бани/термоблока и добавьте (охлаждающую) каплю LMA в блюдо, покрывая стеклянное дно, где располагались личинки. Обратите внимание, что LMA не слишком горячая, но все же жидкая.
  5. Затем поместите личинки в нужное боковое положение, прежде чем агароза застынет. В этом случае обеспечьте боковое положение, при котором оперкула находится как можно ближе к стеклянному дну чашки, чтобы подготовиться к установке инверсионного микроскопа (рис. 1B).
  6. Дайте агарозе застыть, а затем добавьте в форму среду E3 (содержащую максимум 0,02% MS-222), чтобы избежать высыхания агарозы (Рисунок 1B).

figure-protocol-1
Рисунок 1: Схематическое изображение процедуры встраивания. (A) Двойной трансгенный Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30 личинок данио-рерио с зелеными мечеными оперкулярными остеобластами и макрофагами, помеченными красным цветом. (B) Рабочий процесс процедуры внедрения, описанный на этапе 3 протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

4. Визуализация личинок in vivo и лазерная абляция

  1. Для лазерной абляции остеобластов в развивающейся оперкуле трансгенной рыбки данио-рерио Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30, используйте инвертированный двухфотонный лазерный сканирующий микроскоп с водяным объективом 25x/0.95 или эквивалентной установкой.
  2. Поместите чашку со внедренными личинками на микроскопический предметный столик в инвертированный микроскоп и расположите нужную область для абляции в центре поля зрения. Оперкулу можно легко идентифицировать с помощью флуоресцентного сигнала GFP.
  3. После того, как оперула сфокусирована и центрирована в поле зрения микроскопа, выберите настройки z-стека (часто используются z-интервалы 1-2 мкм) для получения изображения по всей ширине оперкулы. В то же время выберите область в конкретной z-плоскости, которую необходимо абляировать (обычно в задней зоне оперкулы). Двухфотонная лазерная абляция осуществляется только в этой плоскости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокое разрешение в измерении z приведет к увеличению времени визуализации, но позволит проводить объемный анализ полученных данных в дальнейшем.
  4. Сфотографируйте интересующую область оперкулы перед абляцией. Для обнаружения GFP используйте лазер белого света с длиной волны 488 нм и гибридный детектор с длиной волны от 495 нм до 550 нм или эквивалент. Визуализируйте макрофаги с помощью возбуждения с длиной волны 555 нм (лазер белого света) с диапазоном детектирования mCherry от 595 до 780 нм на гибридном детекторе (или аналогичном).
    1. Используйте формат изображения 512 x 512 для хорошего соотношения качество/время (можно использовать другие форматы, если требуется более высокое разрешение или более высокая скорость).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубатор с регулируемой температурой, установленный на микроскопе, может использоваться и регулироваться, например, до 28 °C.
  5. Нарисуйте круглую область диаметром 25 мкм (другие формы и размеры можно выбрать в зависимости от эксперимента) в выбранной 2D-плоскости, сфокусировав оперкулу с помощью инструмента ROI.
  6. Для проведения абляции необходимо применить мощность абляции (измеренную без объектива) на 450 мВт и подвергнуть выбранную область воздействию двухфотонного лазера со скоростью сканирования 400 Гц и общей продолжительностью 10 с. Во время абляции область может быть визуализирована с помощью гибридного детектора в диапазоне 401-443 нм или эквиваленте.
  7. После абляции подтвердите структурную абляцию, снова визуализировав тот же z-стек с теми же настройками, которые использовались до абляции. Абляционная область больше не содержит флуоресцентных клеток.

5. Восстановление личинок и визуализация для мониторинга набора иммунных клеток

  1. Если визуализация набора иммунных клеток должна быть выполнена с задержкой, восстановите личинки после визуализации и анестезии. Аккуратно извлеките личинки из ЛМА с помощью щипцов или иглы для вскрытия.
    1. Сначала снимают слой агарозы, покрывающий личинки. Во-вторых, удалите агарозу при непосредственном контакте с личинками. Пропустите этот шаг, если происходит немедленная визуализация рекрутинга иммунных клеток.
  2. Поместите личинок обратно в чашку с чистой средой E3 и проверьте их восстановление. Выздоровление проявляется по плаванию личинок.
  3. Через 4 или 6 hpl (через час после поражения) снова сфотографируйте оперкулу с использованием тех же настроек на том же микроскопе, чтобы проверить влияние абляции на рекрутирование макрофагов. Для этого повторите встраивание (шаг 3) и визуализацию, как и ранее (шаг 4).
  4. После визуализации удалите личинки из ЛМА. Жертвоприношение личинок может быть выполнено либо путем инкубации в ледяной воде, либо при передозировке MS-222 в Е3, в зависимости от требований законодательства. Затем образцы могут быть использованы для последующих исследований или утилизированы.

6. Анализ изображений и статистический анализ

  1. Обрабатывайте изображения с помощью программного обеспечения для обработки изображений, такого как Fiji32. В зависимости от z-разрешения полученных данных анализ может быть выполнен в 2D или 3D.
  2. Количественно оценивайте макрофаги вручную, включая клетки, которые четко отделены друг от друга, например, различая основные клеточные тела, или количественно оценивая клетки с помощью ядерной метки, или измеряя площадь в случае, если клетки перекрываются (следующий шаг).
  3. Для количественной оценки площади создайте маску, охватывающую макрофаги. Для этого используйте инструмент Image > Adjust > Threshold и создайте ROI (Analyze > Tools > ROI Manager > Add) на Фиджи. Исключите мелкие частицы на заднем плане для количественного определения.
    1. Затем измерьте площадь (Analyze > Measure). Подумайте, нужно ли включать в измерение области перекрывающейся клеточной флуоресценции.
      Примечание: В данном случае область круговой абляции была опущена из измерений площади, поскольку рекрутированные макрофаги не могут быть различимы в этой области.
  4. Создавайте графики с отображением результатов измерений с помощью подходящего программного обеспечения. Чтобы сравнить данные до и после абляции, проведите соответствующий статистический тест (здесь был проведен парный односторонний t-критерий ).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рисунки могут быть подготовлены с помощью программного обеспечения для редактирования фотографий и графического дизайна.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лазерная абляция была выполнена, как указано в протоколе выше. Сигнал GFP остеобластов в абляционной области мгновенно исчезал после абляции. Для изучения реакции абляции остеобластов с точки зрения иммунного ответа было визуализировано присутствие макрофагов в личинках 6 dpf до и при 6 hpl. До абляции в области оперкулы10 наблюдалось очень мало макрофагов (рис. 2). При 6 hpl было обнаружено сильное накопление макрофагов в абляционной области оперкулы и повышенное количество макрофагов в поле зрения, включая оперкулу и область вокруг оперкулы10 (рис. 2).

figure-results-1
Рисунок 2: Рекрутирование макрофагов при 6 hpl у личинок данио-рерио 6 dpf. Оперкля без абляции и при 6 л.с. Оперкулярные остеобласты обозначены зеленым цветом, макрофаги — пурпурным, а пунктирный круг указывает на область, подвергнутую лазерной абляции. Масштабная линейка: 50 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рекрутирование макрофагов также анализировалось у 4 личинок dpf с гораздо меньшими оперкулами на 4 hpl, наблюдая аналогичные результаты (рис. 3). Количественное определение числа макрофагов (за пределами сайта непосредственной лазерной абляции) показало увеличение в течение исследуемого периода времени (4,00 ± 2,37 макрофагов до абляции против 7,00 ± 2,76 макрофагов при 4 hpl ) (рис. 3B). Аналогичным образом, площадь макрофагов (измеренная вмкм2, 785,8мкм2 ± 723,1мкм2 до абляции по сравнению с 1553мкм2 ± 869,9мкм2 при 4 hpl) увеличилась (рис. 3C). Поскольку макрофаги иногда трудно отличить друг от друга, рекомендуется измерять площадь макрофагов, а не число макрофагов, как это было сделано здесь.

figure-results-2
Рисунок 3: Рекрутирование макрофагов при 4 hpl у личинок данио-рерио 4 dpf. (А) Оперкля без абляции и при 4 л.с. Оперкулярные остеобласты обозначены зеленым цветом, макрофаги — пурпурным, а пунктирный круг указывает на область, подвергнутую лазерной абляции. Масштабная линейка: 50 мкм. (B) Количественная оценка количества макрофагов в оперкульной области непосредственно до (0 hpl) и после абляции (4 hpl). (C) Количественная оценка площади макрофагов (за исключением участка лазерной абляции). Парные односторонние t-критерии. Каждая точка представляет данные одной личинки, а среднее значение ± SD показано, n = 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лазерная абляция применяется в различных дисциплинах биологических исследований. В частности, он был полезен в качестве метода для изучения регенерации тканей 10,11,12. Например, рекрутирование и фенотипические изменения клеток врожденного иммунитета были недавно проанализированы с течением времени с использованием УФ-лазера или двухфотонной лазерной абляции, наряду с восстановлением остеобластов в точке лазерной абляции10. Живая визуализация рекрутинга иммунных клеток проводилась в течение 12 ч после поражения (ВПЛ); Тем не менее, можно предусмотреть более длительные периоды визуализации при соответствующей корректировке анестезии и одобрении соответствующих органов. У Geurtzen et al. анализы были проведены в течение нескольких дней после лазерной абляции и помогли определить воспалительную среду в месте абляции, а также установить поддерживающую роль макрофагов в регенерации кости10. Возможны и многие другие приложения, такие как изучениероли высвобождения активных форм кислорода при гибели клеток в костной ткани.

Одним из преимуществ использования двухфотонной лазерно-опосредованной клеточной абляции является возможность ее сочетания с конфокальной визуализацией. Используемое здесь программное обеспечение (см. Таблицу материалов) можно настроить в режим (Live Data Mode), в котором визуализация и абляция происходят последовательно, что ускоряет процесс. Еще одним преимуществом технологии является точность абляции. Размер и форма абляции могут быть легко отрегулированы в программном обеспечении очень точным образом. В представленных здесь экспериментальных условиях для абляции была выбрана круглая область диаметром 25 мкм. Тем не менее, в других экспериментах по абляции у дрозофил использовали линейную абляцию с длиной 25 мкм для снижения напряжения тканей в эмбриональном эпителии путем разрезания соседних клеточных соединений34. Такая точность позволяет проводить абляцию определенного и контролируемого количества клеток, отдельных клеток или даже клеточных мембран.

Примечательно, что тип поражения, выполняемый с помощью двухфотонного лазера, не похож на естественные травмы и гибель клеток, которые необходимо иметь в виду не только в исследованиях регенерации, но и в других дисциплинах. В частности, лазерная абляция создает очень сфокусированные поражения путем полного разрушения (сжигания) клеток в интересующей области20 с минимальными повреждениями в окружающих тканях, в то время как механические или другие виды повреждений имеют тенденцию воздействовать на несколько типов тканей и слоев в более широком масштабе. Это может привести к различным последствиям, включающим различные типы клеточной гибели (например, некроз, апоптоз, аутофагию)35 и различные регенеративные исходы. Более того, реакции на лазерную абляцию могут различаться в клеточном и молекулярном плане. Например, было показано, что, хотя клетки, окружающие место лазерного поражения, могут терять целостность плазматической мембраны, они могут пережить повреждение ивосстановить целостность. Лазерная абляция также приводит к повреждению участков внеклеточного матрикса, что может быть результатом «тепловых взрывов» в самом центре приложенного лазерного луча, а также сильного теплового воздействия на непосредственно соседниеклетки. Тем не менее, клетки, окружающие сайты лазерной абляции, демонстрируют увеличенное количество апоптотических телец, как показано в случае лазерной абляции сердечной ткани38, и запускается иммунный ответ, как показано здесь. В дополнение к описанным различиям, еще одним ограничением лазерных абляционных анализов может быть глубина, на которой может быть выполнена травма, и ограниченный размер образцов. Структуры, скрытые в толстых образцах, могут быть неправильно удалены, и визуализация будет затруднена. Это, однако, будет во многом зависеть от используемого микроскопа и лазера, а также от объектива и встраиваемых систем.

Встраивание личинок таким образом, чтобы оперкула располагалась в непосредственной близости от стеклянного дна посуды, имеет важное значение в случае, если используется перевернутая установка, как в представленном протоколе. Кроме того, очень важно проверить температуру LMA перед его применением, чтобы покрыть личинки (шаг 3.4), так как горячая агароза может повредить личинки. Чтобы избежать этого, возьмите аликвоту LMA из термоблока заранее, например, удаляя остатки среды E3 из чашки со стеклянным дном, и проверьте температуру, например, на коже запястья. LMA должен быть теплым, но не горячим.

После того, как личинки будут покрыты LMA, важно быстро поместить их в правильное положение, прежде чем LMA начнет затвердевать. Боковое положение достигается проще всего; В представленном исследовании желаемое положение было боковым с небольшим наклоном в сторону вентральной. В случае, если LMA затвердевает до того, как личинки будут размещены правильно, можно удалить LMA (как в шаге 5.1) и повторить внедрение. Кроме того, важно, чтобы область, которая должна быть визуализирована (и удалена лазером), находилась как можно ближе к стеклянному дну чашки для достижения максимального качества изображения и клеточной абляции, хотя это также будет зависеть от рабочего расстояния объектива.

В одну и ту же посуду можно встроить более одной личинки для визуализации. Это сэкономит время и позволит лучше использовать LMA. Количество личинок, которые могут быть внедрены, будет зависеть от опыта экспериментатора, но рекомендуется 3-5 личинок.

Лазерная абляция также может быть выполнена с помощью вертикальных микроскопических установок с использованием наклонных линз. В этом случае важно внедрить личинки со слегка вентральным видом (сверху), чтобы обеспечить хорошее качество изображения и успешность лазерной абляции оперкулы. Кроме того, только тонкий слой LMA должен покрывать личинки, чтобы обеспечить хорошее возбуждение и обнаружение флуоресцентных сигналов.

В этом протоколе двухфотонная лазерно-опосредованная абляция остеобластов описывается как методология выполнения поражений в развивающихся костях, в частности, в оперкуле. Этот метод может быть адаптирован для абляции клеток в других костях развивающихся рыбок данио. Более того, это в целом полезный подход к изучению регенерации поврежденных тканей11,12. Легкость выполнения абляций и разрезов тканей разных размеров и форм позволяет использовать его в различных экспериментальных установках и областях исследований 15,17,18,19,21,34. В целом, двухфотонная лазерная абляция является очень адаптивным методом для различных тканей, организмов и даже условий in vitro и представляет собой важный инструмент в биологических исследованиях.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Немецким научно-исследовательским обществом (DFG) Transregio 67 (проект 387653785), DFG SPP 2084 μBone (проект KN 1102/2-1) до FK. Эта работа была поддержана Центром световой микроскопии (проект DFG 413875620), основным объектом технологической платформы CMCB в Техническом университете Дрездена. Работа в Техническом университете Дрездена софинансировалась за счет налоговых поступлений из бюджета, утвержденного Саксонским парламентом («Ландтаг»).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Дигидрат хлорида кальция, CaCl2· H2OCarl Roth5239.1
Чашка для клеточных культур, PS, 100/20 ммGreiner Bio-one664160
Dumont #55 FocepsFST11295-51Форма наконечника прямая, 11 см, 0,05 x 0,02 мм
Falcon 6-луночная пластинаCorning353502
Чашка для микролунок со стеклянным дномMatTekP35G-1,5-14-CЧашка 35 мм, покровное стекло No 1,5, диаметр стекла 14 мм,
многофотонный лазер без покрытия Insight X3Spectra-Physics
Leica Application SuiteLAS X, Leica Microsystems
Низкоплавкая агароза Biozyme840101Biozym Plaque Agarose
Magnesium sulfate гептагидрат, MgSO4· 7H2OSigma-AldrichM5921
Садкимногих сортов, например, Tecniplast
MethyleneblueCarlRoth A514.1
MS-222SIGMA AldrichA5040
Potassium Chloride, KClPanReac AppliChem131494
Sodium Chloride, NaClCarl Roth3957.1
SP8 СОКОЛ Leica MicrosystemsОснащена многофотонным лазером Insight X3 и программным обеспечением Leica Application Suite
Игла для препарирования нержавеющей сталиBochem12010140 мм
Стерео Микроскоп SZX16OlympusОборудована светодиодной подсветкой основания SZX2-ILLTQ
Термостатические шкафы TS - WTWxylemTS 608/2-iДля инкубации (эмбриона)
Перенос пипетка, 3,5 млSARSTEDT861171155 x 15 мм, LD-PE, прозрачная
Zeiss SteREO Discovery.V12 версия 4.7.1.0.Zeissоснащен камерой Axiocam MRm и программным обеспечением AxioVision
для спаривания

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marques, I. J., Lupi, E., Mercader, N. Model systems for regeneration: Zebrafish. Dev. 146 (18), dev167692(2019).
  2. Dietrich, K., Fiedler, I. A. K., Kurzyukova, A. Skeletal biology and disease modeling in zebrafish. J Bone Miner Res. 36 (3), 436-458 (2021).
  3. Geurtzen, K., Knopf, F. Adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue. J Vis Exp. (140), e58429(2018).
  4. Sousa, S., Valerio, F., Jacinto, A. A new zebrafish bone crush injury model. Biol Open. 1 (9), 915-921 (2012).
  5. González-Rosa, J. M., Mercader, N. Cryoinjury as a myocardial infarction model for the study of cardiac regeneration in the zebrafish. Nat Protoc. 7 (4), 782-788 (2012).
  6. Chassot, B., Pury, D., Jaźwińska, A. Zebrafish fin regeneration after cryoinjury-induced tissue damage. Biol Open. 5 (6), 819-828 (2016).
  7. Singh, S. P., Holdway, J. E., Poss, K. D. Regeneration of amputated zebrafish fin rays from de novo osteoblasts. Dev Cell. 22 (4), 879-886 (2012).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. Ando, K., Shibata, E., Hans, S., Brand, M., Kawakami, A. Osteoblast production by reserved progenitor cells in zebrafish bone regeneration and maintenance. Dev Cell. 43 (5), 643-650.e3 (2017).
  10. Geurtzen, K., López-Delgado, A. C., Duseja, A., Kurzyukova, A., Knopf, F. Laser-mediated osteoblast ablation triggers a pro-osteogenic inflammatory response regulated by reactive oxygen species and glucocorticoid signaling in zebrafish. Dev. 149 (8), 1998030(2022).
  11. Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. Confocal microscope-based laser ablation and regeneration assay in zebrafish interneuromast cells. J Vis Exp. (159), e60966(2020).
  12. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. (54), e2845(2011).
  13. Goldstein, A. M., Fishman, M. C. Notochord regulates cardiac lineage in zebrafish embryos. Dev Biol. 201 (2), 247-252 (1998).
  14. Zhang, J., Jeradi, S., Strähle, U., Akimenko, M. A. Laser ablation of the sonic hedgehog-a-expressing cells during fin regeneration affects ray branching morphogenesis. Dev Biol. 365 (2), 424-433 (2012).
  15. Marshall, A. R., et al. Two-photon cell and tissue level laser ablation methods to study morphogenetic biomechanics. Methods Mol Biol. 2438, 217-230 (2022).
  16. Angelo, J. R., Tremblay, K. D. Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development. Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).
  17. Lee, J., Lee, S., Truong, V. G., et al. Laser ablation of pancreatic cancer using a cylindrical light diffuser. Lasers Med Sci. 37 (6), 2615-2621 (2022).
  18. Luther, E., Mansour, S., Echeverry, N., et al. Laser ablation for cerebral metastases. Neurosurg Clin N Am. 31 (4), 537-547 (2020).
  19. Smutny, M., Behrndt, M., Campinho, P., Ruprecht, V., Heisenberg, C. -P. UV laser ablation to measure cell and tissue-generated forces in the zebrafish embryo in vivo and ex vivo. Methods Mol Biol. 1189, 219-235 (2015).
  20. Vogel, A., Venugopalan, V. Mechanisms of pulsed laser ablation of biological tissues. Chem Rev. 103 (2), 577-644 (2003).
  21. Wu, F. Heat-based tumor ablation: Role of the immune response. Adv Exp Med Biol. 880, 131-153 (2016).
  22. Renvoizé, C., Biola, A., Pallardy, M., Bréard, J. Apoptosis: Identification of dying cells. Cell Biol Toxicol. 14 (2), 111-120 (1998).
  23. Julier, Z., Park, A. J., Briquez, P. S., Martino, M. M. Promoting tissue regeneration by modulating the immune system. Acta Biomater. 53, 13-28 (2017).
  24. Petrie, T. A., Strand, N. S., Tsung-Yang, C., Rabinowitz, J. S., Moon, R. T. Macrophages modulate adult zebrafish tail fin regeneration. Dev. 141 (13), 2581-2591 (2014).
  25. Geurtzen, K., Vernet, A., Freidin, A. Immune suppressive and bone inhibitory effects of prednisolone in growing and regenerating zebrafish tissues. J Bone Miner Res. 32 (12), 2476-2488 (2017).
  26. Fleischhauer, L., López-Delgado, A. C., Geurtzen, K., Knopf, F. Glucocorticoid effects in the regenerating fin reflect tissue homeostasis disturbances in zebrafish by affecting Wnt signaling. Front Endocrinol. (Lausanne). 14, 1122351(2023).
  27. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. https://books.google.de/books?id=Iy8PngEACAAJ (2002).
  28. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
  29. Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Dev. 135 (22), 3765-3774 (2008).
  30. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  31. JoVE Science Education Database. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. , JoVE. Cambridge, MA. (2023).
  32. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
  34. Blanchard, G. B., Scarpa, E., Muresan, L., Sanson, B. Mechanical stress combines with planar polarised patterning during metaphase to orient embryonic epithelial cell divisions. Dev. 151 (10), dev202862(2024).
  35. Park, W., Wei, S., Kim, B. -S., et al. Diversity and complexity of cell death: A historical review. Exp Mol Med. 55 (8), 1573-1594 (2023).
  36. O'Connor, J., Akbar, F. B., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. Zones of cellular damage around pulsed-laser wounds. PLoS One. 16 (9), e0253032(2021).
  37. Griebel, M., Vasan, A., Chen, C., Eyckmans, J. Fibroblast clearance of damaged tissue following laser ablation in engineered microtissues. APL Bioeng. 7 (1), 16112(2023).
  38. Matrone, G., Taylor, J. M., Wilson, K. S. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Two Photon AblationOsteoblast AblationZebrafish LarvaeBone RegenerationConfocal MicroscopyMacrophage RecruitmentImmune ResponseOpercle ImagingLow Melting AgaroseTransgenic Zebrafish

Related Articles