Определение четырех подтипов NK-клеток матки с помощью мультиплексного флуоресцентного иммуногистохимического окрашивания у женщин с повторной неудачей имплантации

Краткое содержание

В этом исследовании представлен новаторский метод количественного определения субпопуляций естественных клеток-киллеров матки в течение окна имплантации с использованием передовых методов мультиплексного флуоресцентного иммуногистохимического окрашивания.

Аннотация

Иммуногистохимия (ИГХ) играет решающую роль в биологических исследованиях и клинической диагностике, являясь наиболее часто используемым методом идентификации и визуализации тканевых антигенов. Однако традиционные методы окрашивания ИГХ имеют ограничения в различении различных подтипов иммунных клеток. Эта проблема подтолкнула ученых к изучению новых технологий и методологий для точной идентификации и дифференцировки подтипов иммунных клеток. В последние годы появилась мультиплексная ИГХ, позволяющая одновременно обнаруживать несколько антигенов и визуализировать их в одном образце ткани. Естественные киллеры матки (uNK) играют ключевую роль в процессах беременности на ранних сроках, включая децидуализацию, ремоделирование спиральных артерий матки и имплантацию эмбрионов. Различные подтипы uNK-клеток выполняют различные функции, что позволяет им координировать различные биологические события для успешного развития эмбриона и наступления беременности. Таким образом, углубленные исследования подтипов uNK-клеток имеют важное значение для выяснения механизмов иммунной регуляции во время беременности. Такие исследования дают ценную информацию и новые подходы к лечению связанных с этим состояний, таких как бесплодие и рецидивирующая репродуктивная недостаточность. В данной работе представлен подробный протокол мультиплексного окрашивания ИГХ для изучения плотности четырех подтипов uNK-клеток в образцах эндометрия в период окна имплантации (WOI). Протокол включает в себя пробоподготовку, оптимизацию маркеров подтипов, микроскопическую визуализацию и анализ данных. Этот протокол мультиплексного окрашивания ИГХ обеспечивает высокую специфичность и чувствительность, позволяя одновременно обнаруживать различные подтипы uNK-клеток, тем самым предоставляя исследователям мощный инструмент для изучения тонкостей и механизмов иммунной регуляции во время беременности.

Введение

Первое документально подтвержденное живорождение после экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов (ЭКО-ЭТ) было зарегистрировано в 1978 году. На протяжении последних 40 лет наблюдается высокий спрос на помощь ЭКО-ЭТ среди бесплодных пар¹. В 2021 году в Соединенных Штатах 238 126 пациентов инициировали в общей сложности 413 776 циклов ЭКО. Это на 25% больше, чем за 2 года до этого, и на 135% больше, чем в 2012 году^. Этот всплеск в основном связан с растущей распространенностью бесплодия и задержкой планирования беременности. Достижения в области методов культивирования эмбрионов и протоколов суперовуляции привели к увеличению частоты живорождения за цикл ЭТ, достигая 30-50% у женщин моложе 40 лет и менее 30% у женщин старше 40 лет^. Однако, несмотря на эти достижения, более половины перенесенных эмбрионов до сих пор не имплантируются. Повторная неудачная имплантация (РИФ), обычно определяемая как неудача после трех или более последовательных попыток переноса высококачественных эмбрионов, затрагивает 15% женщин, которые проходят ЭКО-ЭТ³. Пары с РИФ чрезвычайно уязвимы и более склонны к дорогостоящим и ненужным процедурам, которые могут подвергнуть их неоправданному риску⁴. Таким образом, понимание причин РИФ и улучшение имплантации эмбрионов имеет решающее значение для повышения успеха ЭКО-ЭТ, особенно для женщин с РИФ. Подготовка эндометрия имеет решающее значение для успешной имплантации эмбриона. Этот процесс характеризуется значительным накоплением естественных киллерных клеток матки (uNK), которые переходят от 30% от общего количества лимфоцитов в эндометрии в середине секреторной фазы к 70%-80% в децидуальной клетке на ранних сроках беременности⁵. Примечательно, что uNK-клетки отличаются от периферических NK-клеток, которые представляют собой цитотоксические лимфоциты, критически важные для врожденной иммунной системы, вызывающие гибель инфицированных клеток посредством лизиса или апоптоза. Хотя точные функции uNK-клеток еще не до конца изучены, несколько линий данных свидетельствуют о том, что они участвуют в ремоделировании ангиогенеза, инвазии трофобласта^{и развитии} плода. Связь между процентным соотношением uNK-клеток над стромальными клетками и RIF привлекла большое внимание за последние 20 лет. Недавний метаанализ, который включал 8 исследований с участием 604 женщин, показал, что плотность клеток CD56+uNK во время среднелютеиновой фазы значительно увеличивается у женщин с РИФ по сравнению^{с фертильной} контрольной группой. Однако важно отметить, что характеристики uNK-клеток в среднелютеиновой фазе значительно отличаются от характеристик децидуальных NK-клеток (dNK). Хотя uNK-клетки могут в дальнейшем дифференцироваться в различные подмножества dNK-клеток после беременности, измерение uNK-клеток само по себе не дает точного^{представления} dNK-клеток8. Клетки uNK подвергаются динамической дифференцировке и играют различные роли в менструальном цикле и процессах децидуализации, что делает их более сложными, чем можно идентифицировать только по CD56. Для достижения всестороннего понимания поведения uNK-клеток во время подготовки эндометрия требуется несколько маркеров. В нашем недавнем исследовании использовалось секвенирование РНК одиночных клеток для определения разнообразия uNK-клеток на протяжении менструальных циклов. Результаты, подтвержденные с помощью проточной цитометрии, показали наличие четырех различных подтипов uNK-клеток, каждый из которых демонстрирует динамические изменения в течение менструального^цикла. Анализ обогащения генов и функциональное обогащение онтологии генов показывают, что эти подмножества uNK выполняют различные функции на разных этапах менструации. Тем не менее, проточная цитометрия не всегда доступна в клинических лабораториях, а немедленная обработка свежей ткани эндометрия для ферментного расщепления делает невозможным повторение экспериментальных этапов при ошибках.

Таким образом, целью данного исследования было изучение измерения этих четырех субпопуляций NK-клеток с использованием мультиплексного анализа окрашивания, который обеспечивает более практичный диагностический подход. При множественном окрашивании различные специфические антитела против каждой мишени связаны с различными флуорофорными метками, которые излучают свет с разной длиной волны при возбуждении определенной длиной волны света. По сравнению с традиционным методом окрашивания ИГХ, этот метод позволяет количественно сравнивать относительную распространенность и распределение нескольких мишеней в образце и предоставлять информацию о взаимодействии и колокализации различных мишеней, что позволяет нам идентифицировать различные подтипы uNK-клеток. Этот подход не только углубит наше понимание взаимосвязи между uNK-клетками и RIF, но и даст представление об исследовании других субпопуляций иммунных клеток при заболеваниях, связанных с эндометрием.

Протокол

Исследование было одобрено Объединенным комитетом по этике клинических исследований Китайского университета Гонконга и Новых территорий Восточного кластера (CREC No 2022.581). Женщины с РИФ были набраны из Центра вспомогательных репродуктивных технологий, больницы принца Уэльского Китайского университета Гонконга. РИФ определяли как неспособность достичь клинической беременности после переноса не менее 4 эмбрионов хорошего качества в минимум 3 свежих или замороженных циклах у женщины в возрасте до 40^лет10. Перед забором биопсии эндометрия от участниц было получено информированное согласие.

1. Получение и обработка образцов эндометрия

1. Сроки забора образцов эндометрия
   1. Соберите образцы эндометрия в соответствии со строгим протоколом, чтобы обеспечить согласованность среди участников исследования. Пациенткам с естественным циклом следует проводить анализ мочи с^9-го дня менструального цикла и проводить биопсию эндометрия на^7-й день после всплеска ЛГ (ЛГ+7)¹¹ . Пациенткам, проходящим циклы заместительной гормональной терапии (ЗГТ), назначать 6 мг эстрадиола валерата перорально ежедневно, начиная со 2-го дня менструального цикла.
   2. Оценивают толщину эндометрия с помощью УЗИ на 13 день менструального цикла. Когда толщина эндометрия достигает или превышает 8 мм, ввести прогестерон трансвагинально и провести биопсию эндометрия через 5 дней после введения прогестерона¹².
2. Забор и фиксация образца эндометрия: введение пробоотборника пипетки в полость матки, продвигая его к области дна; Применяют отсасывание, потянув вниз внутренний поршень, одновременно соскабливая поверхность эндометрия посредством вращательных и вертикальных движений внутри полости матки. Собранные экземпляры промыть обычным физиологическим раствором для устранения цервикальных и маточных выделений. Измерьте образцы и оцените размер. Образцы размером 3 мм х 15-25 мм немедленно погрузить в 10 мл 10% нейтрального буферизованного формалина и зафиксировать при комнатной температуре на 24-48 ч.
3. Обезвоживание: После завершения фиксации образцы подвергаются последовательности обезвоживания, предназначенной для замены воды этанолом. Для этого погружают ткани в ванны с содержанием этанола на 70%, 80%, 90% и 100% для обеспечения полного обезвоживания. После окончательной ванны с этанолом очистите образцы в ксилоле, чтобы удалить остатки спирта и подготовить их к инфильтрации парафина.
4. Закладка: После помещения ткани на дно формы расплавьте парафин и осторожно добавьте его к образцам, чтобы убедиться, что ткань эндометрия полностью инкапсулирована в парафиновую матрицу. Заполнив формы парафином, охладите их на морозильном столе, чтобы способствовать застыванию парафина. Как только парафиновые блоки затвердеют, хранить при комнатной температуре до тех пор, пока не потребуется дальнейшая обработка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые формы были специально подобраны с учетом размера полученных образцов эндометрия, чтобы ткань эндометрия могла лежать ровно на дне без сгибания, обеспечивая тем самым оптимальную ориентацию для последующего секционирования и не создавая ненужных излишеств.
5. Секционирование: Для подготовки к секционированию парафиновые блоки охлаждают при температуре 4 °C в течение 2 часов. Нарежьте образцы на срезы размером 4 мкм с помощью микротома, затем расплющите срезы на поверхности дистиллированной воды, нагретой до 42 °C, и закрепите их на клейких стеклянных предметных стеклах. Поместите ломтики в сушилку на ночь и храните при комнатной температуре перед использованием.

2. Оптимизация мультиплексных иммуногистохимических условий

1. Валидация ИГХ: Для валидации параметров окрашивания ИГХ используйте систематический подход к точной настройке условий для извлечения антигена, концентрации антител и времени инкубации.
   1. В пределах рекомендованных производителем диапазонов разведения протестируйте 2-3 концентрации для каждого антитела. Оптимизируйте извлечение антигенов путем сравнения буферов при pH 6 и pH 9, а также оцените протоколы инкубации при комнатной температуре в течение 1,5 ч и в течение ночи при 4 °C.
   2. Тщательно оценивайте каждое состояние, уделяя особое внимание интенсивности окрашивания, специфичности и фоновому шуму. Выберите оптимальную комбинацию, которая обеспечит наиболее прозрачное, специфичное окрашивание с минимальным неспецифическим связыванием. Такая тщательная валидация обеспечила высочайшую точность и воспроизводимость протокола IHC.
2. Моноплексное окрашивание с помощью усиления тирамидного сигнала (TSA): После определения оптимальных параметров окрашивания для отдельных антител оптимизируйте спаривание антител с различными красителями TSA. Сочетайте маркер с более высокой экспрессией с красителем с более низким уровнем интенсивности флуоресценции, или наоборот. Во время этой фазы внесите коррективы в концентрацию антител и время инкубации в соответствии с наблюдаемой силой сигнала флуоресценции. Если наблюдается значительное фоновое или неспецифическое окрашивание, смените парный краситель¹³.
3. Мультиплексное окрашивание TSA: Для протокола мультиплексной иммуногистохимии (m-IHC) последовательный порядок окрашивания был тщательно определен в соответствии с установленными принципами. Чтобы процесс мультиплексирования отражал чувствительность и специфичность окрашивания по одной метке, в начале окрашиваемой последовательности отдают предпочтение антителам с более низкими уровнями экспрессии. Поместите антитела, требующие восстановления основания для извлечения антигена, в конце последовательности окрашивания, поскольку восстановление основания является надежным по сравнению с методами на основе кислот, которые в некоторых случаях могут усиливать неспецифические артефакты окрашивания.
4. Используя результаты этапов 2.1 и 2.2, примите решение о том, какие антитела будут использоваться и на каком этапе, исходя из их потребностей в извлечении антигена и плотности экспрессии. Например, антитело CXCR4, которое требует восстановления основания для извлечения антигена, находится на заключительных стадиях окрашивания. И наоборот, антителу CD49a, которое характеризуется более низкой плотностью экспрессии, было отведено первое место в окрашивающей последовательности. Увеличьте шансы на успешное обнаружение и сведите к минимуму любые эффекты маскирования, которые могут возникнуть на более поздних этапах процедуры мультиплексирования.
5. Для остальных антител протестируйте различные комбинации на этапе оптимизации, чтобы определить наиболее эффективную последовательность, которая уравновешивает как чувствительность, так и специфичность. Результаты этого сравнительного анализа будут определять окончательный состав мультиплексной панели, как подробно описано в таблице 1, гарантируя, что выбранная панель обеспечивает оптимальную производительность при минимизации фона.

3. Процесс m-IHC

1. Депарафинизация, гидратация и фиксация: выпекать срезы тканей при температуре 60 °C в течение 2 ч, после чего следует последовательное погружение в ксилол I (10 мин), ксилол II (10 мин), 100% этанол (5 мин), 95% этанол (5 мин), 80% этанол (5 мин), 75% этанол (5 мин), ddH₂O (2 мин в 3 раза), 10% нейтральный буферизованный формалин (не менее 20 мин), и ddH₂O (2 минуты для 3x).
2. Извлечение антигена: Добавьте 200 мл соответствующего буфера AR6 или AR9, как указано в таблице 1 для каждого антитела, в термостойкую кассету для извлечения антигена. Поместите срезы в соответствующий буфер для извлечения антигена и нагрейте в микроволновой печи на высокой мощности в течение примерно 2 минут до закипания. Затем плотно накройте кассету, нагрейте на низкой мощности в течение 15 минут и охладите до комнатной температуры. Промойте секции с помощью ddH,₂O и PBST.
3. Рисование гидрофобного барьера: После удаления излишков раствора с помощью абсорбирующей бумаги нарисуйте полный круг вокруг ткани с помощью гидрофобной барьерной ручки.
4. Инактивация активности эндогенных ферментов: Срезы обработать 3% перекисью водорода и инкубировать в течение 8 мин при комнатной температуре. Постирайте с PBST 3 раза по 2 минуты каждый.
5. Блокирование неспецифических участков: После сушки абсорбирующей бумагой нанесите блокирующий раствор (1x Разбавитель антител/блок) и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре.
6. Инкубация с первичным антителом: После удаления блокирующего раствора нанесите 150 мкл первого первичного антитела, CD49a, на каждое предметное стекло в разведении 1:1000 в 1x Разбавитель антител. Инкубируйте в соответствии с предыдущей оптимизацией, приведенной в разделе 2. После инкубации промойте предметные стекла PBST 3x в течение 2 минут каждое. Для остальных антител см. Таблицу 1 для конкретных коэффициентов разведения.
7. Инкубация с вторичным антителом: перед применением вторичного антитела используйте абсорбирующую бумагу для удаления лишней влаги, чтобы предотвратить разведение реагента. Добавьте 4-5 капель (примерно 150 мкл) вторичного антитела 1x Anti-Ms + Rb HRP на каждое предметное стекло, после чего проведите 10-минутную инкубацию при комнатной температуре. Выполните три промывки PBST в течение 2 минут после каждой после инкубации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, что вторичное антитело 1x Anti-Ms + Rb HRP специфично для первичных антител кроликов и мышей.
8. Усиление сигнала с помощью красителя TSA: После промокания избытка влаги разведите краситель TSA в соотношении 1:100 в разбавителе для усиления. Добавьте 150 мкл этого разбавленного раствора красителя TSA в каждое предметное стекло. Выдерживать 10 минут при комнатной температуре. Постирайте с PBST 3 раза по 2 минуты каждый.
9. Повторите шаги 3.2 и 3.5-3.8 для процедуры TSA с использованием соответствующих антител и красителя.
10. Окрашивание ядер: После окрашивания последнего антитела удалить несвязанные флуорофоры путем разогревания в микроволновой печи в 200 мл буфера AR6 в термостойкой кассете, кипячения в течение 2 мин, затем нагревания низкой мощности в течение 15 мин. Охладите образцы до комнатной температуры и промойте ddH,₂O и PBST. Добавьте 150 μL рабочего раствора DAPI, разведенного в PBST (1:10) по каплям, инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре и промойте 2 раза ddH₂O.
11. Монтаж: После полного высыхания секций на воздухе в темном месте в течение примерно 30 минут нанесите одну каплю (около 30 мкл) флуоресцентного монтажника с защитой от гашения и установите покровные стекла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Защищайте все операции от света после первого нанесения красителя TSA. Оперативное наблюдение и получение изображений были необходимы для предотвращения гашения флуоресценции после окрашивания.

4. Получение и анализ изображений

1. Время экспозиции: Захватывайте изображения с помощью тепловизора, который наследует длины волн возбуждения и излучения, соответствующие флуорофорам. При настройке времени экспозиции проверяйте слайды с широким диапазоном выражений маркеров, чтобы обеспечить точность. Для каждой комбинации маркера/фильтра вручную сфокусируйтесь на разных областях слайда. Используйте функцию «Автоматическая экспозиция», чтобы установить время экспозиции.
2. Выберите фильтры в соответствии с красителями TSA и изучите несколько слайдов, чтобы определить оптимальное время экспозиции для каждого канала. Применяйте эти настройки последовательно ко всем последующим снимкам, чтобы обеспечить сопоставимость на протяжении всего процесса создания изображений.
3. Выбор областей захвата: Для обеспечения несмещенного отбора проб по срезам ткани и последовательного включения люминального эпителия в каждое анализируемое поле, случайным образом выбирают исходную область для получения изображения, при этом критическим критерием является наличие границы люминального эпителия.
4. После захвата этого начального поля систематически выделяйте последующие области, перемещая одно поле влево или вправо от начальной точки (опуская одно поле между каждым захваченным изображением), сохраняя при этом границу люминального эпителия в кадре. Повторите этот процесс, чтобы захватить по крайней мере пять различных областей, каждая из которых содержит по меньшей мере часть люминального эпителия, чтобы поддерживать постоянную глубину анализа на протяжении¹⁴ часов. Этот подход был направлен на то, чтобы включить минимум около 10 000 стромальных клеток на всех захваченных полях для обеспечения всестороннего и репрезентативного сбора данных.
5. Анализ изображений
   1. Подготовка изображения: Чтобы импортировать и проанализировать мультиспектральные изображения, сначала перейдите в раздел «Файл» > «Открыть изображение » в интерфейсе программного обеспечения, чтобы загрузить файлы и слайд автофлуоресценции (АФ). После загрузки изображений перейдите к восстановлению флуорофоров, нажав кнопку «Выбрать флуоры » и выбрав соответствующую спектральную библиотеку. После того, как все флуорофоры выбраны, нажмите OK , чтобы подтвердить выбор. Чтобы изолировать спектр АФ, используйте пипетку АФ для выборки репрезентативной области ткани из изображения АФ, стараясь исключить все пиксели, не относящиеся к тканям. После выборки нажмите «Подготовить изображение » или «Подготовить все » в левом нижнем углу интерфейса¹⁵.
   2. Сегментация тканей: Начните процесс сегментации путем ручного определения базовой линии из 3-5 областей для каждого типа ткани на изображении, включая эпителиальные области, содержащие эпителиальные клетки, стромальные области, содержащие стромальные клетки, и пустые области без клеточного содержимого. Если первоначальные результаты сегментации неудовлетворительны, вручную аннотируйте дополнительные области, чтобы улучшить обучающий набор данных, тем самым повысив точность и надежность последующих анализов. Такая динамическая настройка областей и параметров гарантирует, что программное обеспечение может автоматически идентифицировать похожие структуры на текущих и других импортированных изображениях с повышенной точностью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальная аннотация служит набором данных для обучения программного обеспечения для изучения характеристик каждого компонента ткани. Затем возможности сегментации программного обеспечения итеративно уточняются в зависимости от сложности и изменчивости ткани.
   3. Сегментация ячеек: Нажмите кнопку Сегментировать ячейки, чтобы начать сегментацию ячеек. В параметре «Сегментация клеток» выберите «Ядра и мембрана». Выберите DAPI для идентификации ядра клеток и отрегулируйте настройку интенсивности, чтобы обнаруживать все ядра клеток без фонового шума. Выберите сигналы CD16, CD49a и CD56, чтобы найти мембрану и использовать этот сигнал для помощи в расщеплении ядра. Используйте функцию расщепления ядерных компонентов, чтобы различать близко расположенные ядра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: DAPI выделяет внутреннюю часть клеток. Функция расщепления ядерных компонентов помогает различать ядра клеток, когда они находятся близко друг к другу или выглядят слившимися. Этот шаг важен для получения надежного подсчета клеток и поддержания целостности анализа.
   4. Фенотипирование клеток: Используйте четыре различных маркера клеточной поверхности, включая CD56, CD49a, CXCR4 и CD16, для дифференцировки различных подтипов NK-клеток. В схеме фенотипирования обозначьте эти четыре маркера как фенотипы, которые необходимо продолжить. В разделе Представление ассоциаций назначьте определенные цвета каждому из фенотипов для идентификации. С помощью кнопки «Добавить» классифицируйте ячейки как положительно или отрицательно выражающие маркеры; Например, в фенотипе CD56 клетки могут быть помечены как CD56+ или CD56-. Вручную помечайте не менее пяти клеток для каждого фенотипа в процессе обучения. Выполните дополнительную ручную маркировку, если первоначальное обучение не дало эффективных результатов.
   5. После того, как конфигурация фенотипирования клеток задана, каждая клетка на изображении будет указывать, являются ли четыре поверхностных маркера положительно или отрицательно выраженными. Экспортируйте полученные данные в таблицу для дальнейшего анализа.
   6. Обработка данных: Импортируйте данные, полученные из всех изображений, в электронную таблицу для обработки. Вычислите проценты всех подтипов клеток uNK относительно общего количества клеток на изображении. Итоговое количество клеток представляет собой среднее количество клеток на нескольких изображениях, обеспечивая всесторонний обзор популяции различных подтипов uNK-клеток в выборке.

Результаты

Для поддержания последовательности в сроках сбора образцов эндометрия у женщин, проходящих естественный цикл, был проведен анализ мочи для точного определения всплеска лютеинизирующего гормона (ЛГ), а биопсия эндометрия была проведена через 7 дней после всплеска ЛГ. Для женщин, проходящих циклы ЗГТ, образцы были назначены ровно через 5 дней после начала приема добавок прогестерона. Для количественного определения различных подтипов NK-клеток в эндометрии использовали окрашивание m-IHC. Схематическое описание экспериментальной процедуры изображено на рисунке 1.

Оптимизация экспериментальной процедуры имеет решающее значение для получения высококачественных результатов окрашивания m-IHC для обеспечения точности и согласованности результатов эксперимента. Первоначально ИГХ использовали для определения подходящей концентрации антител с подбором растворов для извлечения антигена AR6 или AR9. Для антител, таких как CD56, CD16 и CD49, рекомендуется использовать раствор для извлечения антигена с pH 6, в то время как для антитела CXCR4 превосходные результаты окрашивания были достигнуты с использованием раствора для репарации антигена с pH 9 по сравнению с буфером pH 6. После определения параметров, включая коэффициент разведения антител, время инкубации и условия извлечения антигена, можно выбрать наиболее подходящий краситель TSA на основе аффинности антитела. Следует выбирать краситель со слабой яркостью флуоресценции, чтобы дополнить высокое сродство антитела. Справочные данные о силе сигнала красителей TSA можно найти в таблице 2. После завершения анализа моноплекса TSA можно определить порядок мультиплекса TSA. Учитывая, что четыре антитела предназначены для идентификации различных подтипов uNK-клеток, колокализация между антителами неизбежна. Для минимизации спектрального перекрытия и предотвращения интерференции между флуоресцентными группами была использована следующая стратегия: выбор флуоресцентных фрагментов с максимально удаленными друг от друга длинами волн, сравнение положения и количества положительных сигналов мультиплекса АСП с таковыми моноплекса АСП для обеспечения их идентичности (рис. 2) и обеспечение четкого фона (рис. 3)¹⁶.

После оптимизации и завершения процедур окрашивания m-IHC для получения изображений была использована рабочая станция визуализации, а для углубленного анализа изображений было применено программное обеспечение для анализа изображений (Рисунок 4). Для классификации uNK-клеток использовались как традиционные, так и инновационные методы. Традиционная классификация делит NK-клетки на две категории: CD56+CD16- и CD56+CD16+¹⁷, в зависимости от уровня экспрессии CD16. Опираясь на эту основу, мы попытались дополнительно очертить гетерогенность NK-клеток, используя новую стратегию классификации. Используя секвенирование РНК одиночных клеток (scRNA-seq) из нашего предыдущего исследования, мы выделили отдельные NK-клетки с помощью флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS) и выполнили секвенирование РНК для захвата транскриптомных профилей каждой клетки. Наш анализ выявил четыре различных подтипа NK-клеток: NK1 (CD56+CD49a+CXCR4-), NK2 (CD56+CD49a+CXCR4+), NK3 (CD56+CD49a-CXCR4-) и NK4 (CD56+CD49a-CXCR4+). Эти подтипы характеризовались дифференциальной экспрессией CD49a и CXCR4, при этом CD56 служил универсальным маркером для всех NK-клеток. CD49a был специфически обнаружен в подтипах NK1 и NK2, тогда как CXCR4 присутствовал в подтипах NK2 и NK4. Чтобы подтвердить эту классификацию, мы провели анализ проточной цитометрии, чтобы убедиться в точности нашего метода подтипирования (Рисунок 5)⁹. Доля каждого подтипа uNK-клеток представлена в процентах относительно общего числа стромальных клеток.

Рисунок 1: Схема рабочего процесса анализа NK-клеток эндометрия. Основные этапы включают в себя сбор и забор эндометрия, оптимизацию панели m-IHC, окрашивание эндометрия m-IHC, а также получение и анализ изображения. Создано с BioRender.com Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигурки.

Рисунок 2: Репрезентативные изображения для количественного определения биомаркеров с помощью DAB, моноплекса TSA и мультиплексного окрашивания TSA. Репрезентативные изображения для каждого из антител, окрашенных DAB (левые панели), моноплексного ИГХ TSA (средние панели) и мультиплексного ИГХ TSA (правые панели), продемонстрировали минимальное отклонение при развитии m-ИГХ. Смоделированные ниже изображения IHC, смоделированные TSA, в значительной степени имитируют соответствующие изображения яркого поля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Экспериментальные результаты после окрашивания эндометрия m-IHC. (A) Несмешанное изображение было получено с помощью тепловизора при 200-кратном увеличении. (B) Дальнейшее увеличение этого несмешанного изображения. (К-Ж) Изображения наблюдались в каналах красителя TSA 570 (CD16), красителя TSA 650 (CD56), красителя TSA 620 (CXCR4) и красителя TSA 520 (CD49a) после расмешивания с помощью программного обеспечения для визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Анализ окрашенных изображений m-IHC. Изображения были проанализированы с использованием функций (А) сегментации тканей, (В) сегментации клеток и (С) функций клеточного фенотипа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Анализ подтипов NK-клеток эндометрия. (А) Обычные NK-клетки эндометрия могут быть классифицированы на CD56+CD16-NK-клетки и CD56+CD16+NK-клетки на основе экспрессии CD16. (B) Инновационный метод анализа подтипов классифицировал NK-клетки эндометрия на четыре категории: NK1 (CD56+CD49a+CXCR4-), NK2 (CD56+CD49a+CXCR4+), NK3 (CD56+CD49a-CXCR4-) и NK4 (CD56+CD49a-CXCR4+). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Цикл окрашивания	Маркер	Клон	Компания	Продукт	Разведение антител	Буфер AR	Флуорофор
1	CD49a	КЛ7207	Novus Biologicals	НБП2-76478	1:1000	ДО6	АСП 520
2	КД56	КД564	Лейка	НКЛ-Л-КД56-504	1:100	ДО6	TSA 650
3	СД16	СП175	АБКАМ	АБ183354	1:100	ДО6	TSA 570
4	КХКР4	44716	НИОКР	МАБ172	1:100	ДО9	АСП 620

Таблица 1: Перечень концентраций антител и красителя TSA, используемых в m-IHC.

Флуорофор	Мантра
Краситель TSA 520	Высокий
Краситель TSA 540	Терпимая
Краситель TSA 570	Терпимая
Краситель TSA 620	Терпимая
Краситель TSA 650	Высокий
Краситель TSA 690	Низкий

Таблица 2: Красители TSA и соответствующая интенсивность флуоресценции.

Обсуждение

Имплантация эмбриона предполагает сложное взаимодействие между эмбрионом и эндометрием. Иммунологический статус гомеостаза эндометрия играет ключевую роль в определении рецептивности эндометрия. Во время WOI преобладающей популяцией лейкоцитов в эндометрии являются NK-клетки. Примерно 90% uNK-клеток демонстрируют высокую экспрессию CD56, но не имеют CD16. Тем не менее, незначительное подмножество uNK-клеток напоминает NK-клетки периферической крови, демонстрируя низкую экспрессию CD56, но положительную экспрессию^{CD16 18}. Эти два подтипа uNK-клеток демонстрируют различные функции. Подтип CD56+CD16- в первую очередь способствует выработке цитокинов, ремоделированию сосудов и взаимодействию с клетками трофобласта, которые имеют решающее значение для установления и поддержания беременности. Напротив, подтип CD56+CD16+ проявляет более высокую цитотоксичность. Используя секвенирование РНК одиночных клеток, наше недавнее исследование далее классифицировало uNK-клетки на четыре подмножества, далее подгруппировав CD56+CD16-регуляторные NK-клетки в три субпопуляции на основе их конкретных фенотипов^{и функций.} Субпопуляция NK1, характеризующаяся CD56+CD49a+CXCR4-, участвует в ремоделировании тканей. Субпопуляция NK2, идентифицированная как CD56+CD49a+CXCR4+, регулирует иммунный ответ. Субпопуляция NK3, обозначенная как CD56+CD49a-CXCR4-, взаимодействует с трофобластами. Субпопуляция NK4, проявляющая CD56+CD49a-CXCR4+, имеет сходство с CD56+CD16+ NK-клетками, проявляющими цитотоксические функции⁹. В настоящем исследовании мы впервые успешно разработали протокол для идентификации этих четырех различных субпопуляций NK-клеток с использованием окрашивания m-IHC.

Обычное окрашивание ИГХ и проточная цитометрия являются наиболее часто используемыми методами идентификации иммунных клеток, каждый из которых имеет свои сильные стороны и ограничения¹⁹. В то время как обычная ИГХ широко используется в клинических условиях благодаря своей легкодоступности, она сталкивается с проблемами одновременного обнаружения нескольких антигенов и количественной оценки положительных сигналов. Это представляет собой значительное препятствие для точной характеристики фенотипов иммунных клеток, что часто требует использования нескольких маркеров для точного измерения. С другой стороны, проточная цитометрия способна одновременно обнаруживать несколько клеточных маркеров, но она требует большого объема свежих образцов и не дает пространственной информации о расположении клеток в ткани. Примечательно, что иммунные клетки эндометрия неравномерно распределены по всей ткани эндометрия; Например, клетки uNK более плотно агрегируются вблизи базального слоя эндометрия по сравнению с областями вблизи просветной полости²⁰. Эти ограничения традиционной ИГХ и проточной цитометрии могут быть устранены с помощью m-IHC и платформы анализа изображений, сопряженной с алгоритмами машинного обучения, для достижения сегментации тканей, сегментации клеток и идентификации положительных клеток. Такой подход повышает эффективность за счет анализа десятков тысяч клеток в течение нескольких минут, сводит к минимуму смещение наблюдателя за счет автоматического выявления положительных клеток и обеспечивает более точный анализ с использованием нескольких маркеров. Кроме того, это устраняет необходимость в свежих образцах и позволяет проводить периодические эксперименты или повторные анализы, когда это необходимо.

Проведение комплексной оценки фенотипов uNK-клеток с использованием методики m-IHC может обеспечить более глубокое понимание корреляции между клетками uNK и имплантацией эмбрионов, а также их изменений у женщин с РИФ. Помимо uNK-клеток, другие иммунные клетки эндометрия также вносят свой вклад в местный иммунный гомеостаз. Например, регуляторные Т-лимфоциты (Treg-клетки) поддерживают иммунную толерантность, высвобождая ингибирующие факторы, такие как IL-10 и TGF-β, которые подавляют активность клеток Th1 и Th2²¹. Дифференцировка М2-макрофагов, регулируемая стероидами и Th2-цитокинами, способствует иммунотолерантному статусу за счет повышения активности аргиназы и ингибирования продукции оксида азота²². Кроме того, дендритные клетки (ДК) дифференцируются в зрелые толерогенные клетки в матке, высвобождая такие факторы, как sFLT1 и TGF-β1, которые регулируют сосудистый неогенез и ингибируют функцию CD8+ Т-клеток, тем самым поддерживая иммунный гомеостаз и поддерживая^{развитие} эмбриона. Подобно клеткам uNK, эти иммунные клетки также неоднородны, и один маркер не может точно идентифицировать их фенотипы. Применение m-IHC для оценки субпопуляций uNK-клеток иллюстрирует потенциал идентификации субпопуляций этих иммунных клеток эндометрия.

Помимо эндометрия, этот метод может применяться к различным тканям для выявления фенотипов иммунных клеток. При нанесении его на другие ткани необходимы лишь незначительные корректировки для обеспечения оптимального окрашивания. Кроме того, если исследователи намерены заменить определенные маркеры, оригинальная панель может быть модифицирована в соответствии с конкретными экспериментальными требованиями. Универсальность и гибкость этой панели делают ее адаптируемым инструментом для изучения различных тканей или различных подмножеств клеток.

Эта технология не только облегчает понимание детальных изменений в иммунных клетках эндометрия для анализа основного механизма невосприимчивости эндометрия, но и обеспечивает потенциал для разработки диагностических тестов. Относительная простота получения и сохранения парафиновых блоков и профилей открыла путь к широкому использованию этого метода. Благодаря стандартизированным панелям для окрашивания больницы могут использовать технологию автоматизированного окрашивания в сочетании со сложными программными алгоритмами для значительного повышения эффективности своих аналитических процедур. Преимущества технологии m-IHC делают ее жизнеспособным вариантом для клинической практики.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
CD49a	Novus Biologicals	NBP2-76478	Первичные антитела
CD56	Leica	NCL-L-CD56-504	Первичные антитела
CD16	abcam	ab183354	Первичные антитела
CXCR4	R& D	MAB172	Первичные антитела
Разбавитель амплификации	Akoya Biosciences	серии FP1498	Буфер для разведения флуорофоров
Разбавители антител Разбавители антител	Akoya Biosciences	ARD1001EA	Разбавить антитело
Цитратный буферный раствор, pH 6,0 /9,0(10x)	Akoya Biosciences	A6001/A9001	Раствор для извлечения антигена
inForm Программное обеспечение для расширенного анализа изображений	Akoya Biosciences	inForm 2.2.6	Программное обеспечение для анализа данных
Mantra Рабочие станции	Akoya Biosciences	CLS140089	Спектральная визуализация
СВЧ	инвертор	Akoya Biosciences	Микроволновая стриппинг
TSA 520	Akoya Biosciences	FP1487001K	Подходящие флуоресцентные реагенты на основе тирамида
TSA 620	Akoya Biosciences	FP1495001K	Подходящие флуоресцентные реактивы на основе тирамида
TSA 650	Akoya Biosciences	FP1496001K	Подходящие флуоресцентные реактивы на основе тирамида
TSA 570	Akoya Biosciences	FP1488001K	Подходящие флуоресцентные реактивы на основе тирамида
Слайды с покрытием из поли-L-лизина	Fisher Technologies	120-550-15	Слайды для рутинного гистологического использования
PolyHRP широкого спектра действия	Perkin Elmer	ARH1001EA	вторичные антитела
Invitrogen™   Фторостант-Г&трейд; Монтажная среда	ThemoFisher Science	495802	установка
Spectral DAPI	Akoya Biosciences	FP1490A	окрашивание нуклеиновых кислот