В этом исследовании представлен новаторский метод количественного определения субпопуляций естественных клеток-киллеров матки в течение окна имплантации с использованием передовых методов мультиплексного флуоресцентного иммуногистохимического окрашивания.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Определение четырех подтипов NK-клеток матки с помощью мультиплексного флуоресцентного иммуногистохимического окрашивания у женщин с повторной неудачей имплантации
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Иммуногистохимия (ИГХ) играет решающую роль в биологических исследованиях и клинической диагностике, являясь наиболее часто используемым методом идентификации и визуализации тканевых антигенов. Однако традиционные методы окрашивания ИГХ имеют ограничения в различении различных подтипов иммунных клеток. Эта проблема подтолкнула ученых к изучению новых технологий и методологий для точной идентификации и дифференцировки подтипов иммунных клеток. В последние годы появилась мультиплексная ИГХ, позволяющая одновременно обнаруживать несколько антигенов и визуализировать их в одном образце ткани. Естественные киллеры матки (uNK) играют ключевую роль в процессах беременности на ранних сроках, включая децидуализацию, ремоделирование спиральных артерий матки и имплантацию эмбрионов. Различные подтипы uNK-клеток выполняют различные функции, что позволяет им координировать различные биологические события для успешного развития эмбриона и наступления беременности. Таким образом, углубленные исследования подтипов uNK-клеток имеют важное значение для выяснения механизмов иммунной регуляции во время беременности. Такие исследования дают ценную информацию и новые подходы к лечению связанных с этим состояний, таких как бесплодие и рецидивирующая репродуктивная недостаточность. В данной работе представлен подробный протокол мультиплексного окрашивания ИГХ для изучения плотности четырех подтипов uNK-клеток в образцах эндометрия в период окна имплантации (WOI). Протокол включает в себя пробоподготовку, оптимизацию маркеров подтипов, микроскопическую визуализацию и анализ данных. Этот протокол мультиплексного окрашивания ИГХ обеспечивает высокую специфичность и чувствительность, позволяя одновременно обнаруживать различные подтипы uNK-клеток, тем самым предоставляя исследователям мощный инструмент для изучения тонкостей и механизмов иммунной регуляции во время беременности.
Введение
Первое документально подтвержденное живорождение после экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов (ЭКО-ЭТ) было зарегистрировано в 1978 году. На протяжении последних 40 лет наблюдается высокий спрос на помощь ЭКО-ЭТ среди бесплодных пар1. В 2021 году в Соединенных Штатах 238 126 пациентов инициировали в общей сложности 413 776 циклов ЭКО. Это на 25% больше, чем за 2 года до этого, и на 135% больше, чем в 2012 году. Этот всплеск в основном связан с растущей распространенностью бесплодия и задержкой планирования беременности. Достижения в области методов культивирован....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Исследование было одобрено Объединенным комитетом по этике клинических исследований Китайского университета Гонконга и Новых территорий Восточного кластера (CREC No 2022.581). Женщины с РИФ были набраны из Центра вспомогательных репродуктивных технологий, больницы принца Уэльского Китайского университета Гонконга. РИФ определяли как неспособность достичь клинической беременности после переноса не менее 4 эмбрионов хорошего качества в минимум 3 свежих или замороженных циклах у женщины в возрасте до 40лет10. Перед забором биопсии эндометрия от участниц было получено информированное согласие.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для поддержания последовательности в сроках сбора образцов эндометрия у женщин, проходящих естественный цикл, был проведен анализ мочи для точного определения всплеска лютеинизирующего гормона (ЛГ), а биопсия эндометрия была проведена через 7 дней после всплеска ЛГ. Для женщин, проходящих циклы ЗГТ, образцы были назначены ровно через 5 дней после начала приема добавок прогестерона. Для количественного определения различных подтипов NK-клеток в эндометрии использовали окрашивание m-IHC. Схематическое описание эксперимента.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Имплантация эмбриона предполагает сложное взаимодействие между эмбрионом и эндометрием. Иммунологический статус гомеостаза эндометрия играет ключевую роль в определении рецептивности эндометрия. Во время WOI преобладающей популяцией лейкоцитов в эндометрии являются NK-клетки. Примерно 90% uNK-клеток демонстрируют высокую экспрессию CD56, но не имеют CD16. Тем не менее, незначительное подмножество uNK-клеток напоминает NK-клетки периферической крови, демонстрируя низкую экспрессию CD56, н.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет никаких конфликтов интересов, которые они могли бы раскрыть.
Благодарности
Настоящее исследование было поддержано Фондом здравоохранения и медицинских исследований (10210956).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| CD49a | Novus Biologicals | NBP2-76478 | Первичные антитела |
| CD56 | Leica | NCL-L-CD56-504 | Первичные антитела |
| CD16 | abcam | ab183354 | Первичные антитела |
| CXCR4 | R& D | MAB172 | Первичные антитела |
| Разбавитель амплификации | Akoya Biosciences | серии FP1498 | Буфер для разведения флуорофоров |
| Разбавители антител Разбавители антител | Akoya Biosciences | ARD1001EA | Разбавить антитело |
| Цитратный буферный раствор, pH 6,0 /9,0(10x) | Akoya Biosciences | A6001/A9001 | Раствор для извлечения антигена |
| inForm Программное обеспечение для расширенного анализа изображений | Akoya Biosciences | inForm 2.2.6 | Программное обеспечение для анализа данных |
| Mantra Рабочие станции | Akoya Biosciences | CLS140089 | Спектральная визуализация |
| СВЧ | инвертор | Akoya Biosciences | Микроволновая стриппинг |
| TSA 520 | Akoya Biosciences | FP1487001K | Подходящие флуоресцентные реагенты на основе тирамида |
| TSA 620 | Akoya Biosciences | FP1495001K | Подходящие флуоресцентные реактивы на основе тирамида |
| TSA 650 | Akoya Biosciences | FP1496001K | Подходящие флуоресцентные реактивы на основе тирамида |
| TSA 570 | Akoya Biosciences | FP1488001K | Подходящие флуоресцентные реактивы на основе тирамида |
| Слайды с покрытием из поли-L-лизина | Fisher Technologies | 120-550-15 | Слайды для рутинного гистологического использования |
| PolyHRP широкого спектра действия | Perkin Elmer | ARH1001EA | вторичные антитела |
| Invitrogen™ Фторостант-Г&трейд; Монтажная среда | ThemoFisher Science | 495802 | установка |
| Spectral DAPI | Akoya Biosciences | FP1490A | окрашивание нуклеиновых кислот |
Ссылки
- De Geyter, C. Assisted reproductive technology: Impact on society and need for surveillance. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 33 (1), 3-8 (2019).
- State-Specific Assisted Reproductive Technology Surveillance. CDC. , https://www.cdc.gov/art/state-specific-surveillance/2021/index.html (2024).
- Busnelli, A., ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
