Методическая статья

Токсикологический и экотоксикологический анализ на основе подвижности гемоцитов мидий (Mytilus galloprovincialis)

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67285

⸱

13 декабря 2024 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences and Technologies (DiSTeBA), University of Salento, 2NBFC, National Biodiversity Future Center

В этой статье

Краткое содержание

В статье предложен новый in vitro метод быстрой и чувствительной оценки токсичности и экотоксичности загрязняющих веществ, основанный на подвижности гемоцитов Mytilus galloprovincialis . Этот метод призван внести вклад в разработку более этичных и чувствительных токсикологических и экотоксикологических тестов на воздействие.

Аннотация

Гемоциты являются циркулирующими иммунокомпетентными клетками у двустворчатых моллюсков и играют ключевую роль в нескольких важных функциях клеточно-опосредованного врожденного иммунитета. На ранних стадиях иммунного ответа гемоциты активно мигрируют к месту заражения. Эта врожденная подвижность является фундаментальной характеристикой этих клеток. Он представляет собой ключевую клеточную функцию, которая объединяет множество процессов, таких как клеточная адгезия, клеточная сигнализация, динамика цитоскелета и изменения объема клеток. Таким образом, изменения в подвижности клеток после воздействия лекарств или загрязняющих веществ могут служить полезной токсикологической конечной точкой. Несмотря на фундаментальную роль подвижности клеток в клеточной физиологии, она слабо изучена с токсикологической точки зрения. В данной работе предлагается новый метод in vitro для быстрой и чувствительной оценки токсичности и экотоксичности загрязнителей, основанный на оценке подвижности гемоцитов Mytilus galloprovincialis. Мы разработали анализ подвижности клеток на гемоцитах, прилипших к дну 96-луночного полистирольного микропланшета. После воздействия возрастающих концентраций лекарств траектории и скорости клеток были количественно оценены путем отслеживания клеток с помощью покадровой микроскопии, что позволило нам измерить влияние на подвижность гемоцитов. В связи с простотой сбора гемоцитов у животных относительно неинвазивным способом, предложенный метод предлагает альтернативный тест для скрининга эффектов и механизмов действия загрязняющих веществ и лекарственных препаратов. Он соответствует критериям 3R (Замена, Сокращение и Уточнение), решая этические проблемы и способствуя сокращению количества позвоночных in vivo на животных.

Введение

Методы, основанные на воздействии, такие как биотесты in vitro и in vivo, представляют собой инновационные инструменты для обнаружения воздействия химических загрязнителей окружающей среды на живые организмы и для их использования в качестве инструментов мониторинга окружающей среды и оценки рисков 1,2,3,4. Они дополняют классический аналитический химический подход, преодолевая некоторые его ограничения. Например, методы, основанные на воздействии, могут оценить биодоступность загрязнителей, их влияние на здоровье организма и комбинированное токсикологическое воздействие смесей. Эти комбинированные эффекты могут быть непредсказуемы только на основе химического анализа5.

В последние годы экотоксикология загрязнителей, вызывающих новую озабоченность (новые загрязнители), представляет собой область, в которой методы, основанные на воздействии, могут быть полезными инструментами для обнаружения воздействия и оценки воздействия на биоту 1,5,6,7. В некоторых методах, основанных на эффектах, двустворчатые моллюски используются в качестве тестовых организмов при мониторинге и оценке окружающей среды 8,9. Некоторые характеристики делают эти организмы пригодными для экотоксикологических исследований, такие как их широкое распространение, их фильтрующая природа, их сидячий образ жизни, способность к биоаккумуляции широкого спектра загрязнителей окружающей среды и к разработке обнаруживаемых реакций на загрязнители, возможность работы с различными стадиями жизни, а также для поддержания в лабораторных условиях.. Они обладают высокой чувствительностью к воздействию загрязнения и проявляют различные реакции на токсичные загрязнители в зависимости от вида, стадии жизни и условий окружающей среды 8,9,10. Поэтому в некоторых экологических руководствах в качестве стандартизированных тестовых веществ используются двустворчатые моллюски10,11.

Среди двустворчатых моллюсков широко распространенный Mytilus galloprovincialis является одним из наиболее часто используемых видов в экотоксикологической области благодаря своей способности вырабатывать ранние обнаруживаемые реакции на воздействие химического загрязнения, включая индукцию металлотионеина, изменение антиоксидантных ферментов, дестабилизацию лизосомальной мембраны, перекисное окисление липидов, накопление липофуссцина, повышенную частоту микроядер, индукцию карбоангидразы 12,13,14, 15. Гемоциты, иммунокомпетентные гемолимфатические клетки, широко используются для изучения токсикологического воздействия загрязнителей окружающей среды на двустворчатых моллюсков 4,13,16,17. Эти клетки имеют решающее значение для иммунного ответа организма, выполняя несколько важных функций клеточно-опосредованного врожденного иммунитета. К ним относятся элиминация микробов путем фагоцитоза и различные цитотоксические реакции, такие как высвобождение лизосомальных ферментов, антимикробных пептидов и производство метаболитов кислорода во время дыхательного взрыва 18,19,20. Гемоциты по своей природе являются подвижными клетками 21,22,23, способными мигрировать к месту инфекции на ранней стадии иммунного ответа организма. В целом, подвижность является фундаментальным свойством, характеризующим все иммунные клетки, поскольку она позволяет осуществлять иммунонадзор за этими клетками длязащиты организма. Исследования различных видов моллюсков показывают, что подвижность гемоцитов является важнейшим компонентом их иммунного ответа, заживления ран и взаимодействия с патогенами. Эта подвижность регулируется специфическими молекулярными путями, что подчеркивает сложность и специализацию функций гемоцитов у моллюсков 21,25,26,27.

Несмотря на фундаментальное значение подвижности в физиологии гемоцитов, чувствительность подвижности гемоцитов к химическим загрязнителям окружающей среды изучалось в очень немногих исследованиях 23,28,29,30. Недавно наша группа охарактеризовала спонтанное движение гемоцитов Mytilus galloprovincialis в микропланшете из полистирола 96 лунок, обработанной культурой тканей, и изучила чувствительность подвижности гемоцитов к воздействию парацетамола23 in vitro. Гемоциты M. galloprovincialis продемонстрировали случайное движение клеток, основанное на ламеллиподиях и быстрых изменениях формы, как это ранее было обнаружено у другого вида мидий, Mytilus edulis 21,22,23,28, и уже описано в иммунных клетках человека31. Недавно было продемонстрировано, что подвижность гемоцитов чувствительна к химическим стрессорам23,28. Основываясь на этих предыдущих выводах, в данной работе предлагается новый метод in vitro для быстрой и чувствительной оценки токсичности и экотоксичности загрязнителей, основанный на оценке подвижности гемоцитов M. galloprovincialis и ее изменений посредством скоростного анализа подвижности клеток (количественная оценка средней скорости, мигрирующего расстояния, евклидова расстояния и прямоты). Метод дает возможность in vitro проводить скрининг токсичности нескольких веществ либо в краткосрочных анализах (продолжительностью 1-4 часа), либо в анализах длительного воздействия, продолжительностью 24-48 часов.

Протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с итальянским законодательством о защите животных (D.L.26/2014), которое имплементировало Директиву Совета Европейского комитета (2010/63 EEC). Mytilus galloprovincialis — двустворчатый моллюск, широко известный как средиземноморская мидия. Он произрастает в Средиземном море и на атлантическом побережье южной Европы. Он был интродуцирован и широко распространен в западной части Северной Америки, Азии и Южной Африке. Это важный коммерческий рыбный вид в нескольких частях мира. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Приготовление искусственной морской воды (ASTM) или отфильтрованной природной морской воды

  1. Для приготовления искусственной морской воды ASW в соответствии с ASTM D1141-98 (2021)32 растворить в дистиллированной воде (г на 1 л) следующие соли: 27,65 NaCl, 0,133 NaHCO3, 3,33 MgCl2· 6H2O, 2,66 Na2SO4, 0,733 CaCl2 · 2H2O, 0,466 KCl, 0,067 KBr, 0,02 H3BO3, 0,013 SrCl2·6H2O, 0,0019 NaF. Раствор ASW имеет pH 7,80.
  2. Для приготовления отфильтрованной природной морской воды (ССО) фильтруется природная морская вода 37 PSU, собранная с участка, не подверженного воздействию антропогенной деятельности, с помощью фильтров 0,2 мкм.

2. Акклиматизация животных

  1. Акклиматизируйте взрослые особи мидий (Mytilus galloprovincialis Lam.) в течение 24 часов в стационарных резервуарах (в условиях голодания), содержащих аэрированную ASW или FSW (1 л/животное) при 15 °C в термостатическом помещении перед экспериментальным использованием.

3. Реагентный препарат для оценки подвижности гемоцитов

  1. Приготовьте отфильтрованную морскую воду (FSW), как указано выше, или стандартный физиологический раствор (SPS). Растворите HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин-этансульфоновую кислоту) 4,77 г, NaCl 25,48 г, MgSO4 13,06 г, KCl 0,75 г, CaCl2 1,47 г примерно в 800 мл дистиллированной воды, затем доведите до 1 л путем добавления большего количества дистиллированной воды. Отрегулируйте pH до 7,36 с помощью 1 М NaOH.
  2. Приготовьте исходный раствор Neutral Red в концентрации 20 мг/мл в диметилсульфоксиде (ДМСО).
  3. Приготовьте раствор для окрашивания Neutral Red: Добавьте 5 μL стокового раствора Neutral Red к 995 μL FSW или SPS.
  4. Приготовьте FSW или SPS с добавлением 2 мМ L-глутамина, 40 МЕ/мл пенициллина G и 100 мкг/мл стрептомицина следующим образом: Добавьте 100 мкл 2 мМ L-глутамина и 100 мкл смеси пенициллин/стрептомицин к 10 мл FSW/SPS.
  5. Приготовьте 0,4% трипановый синий в FSW или SPS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нейтральный красный стоковый раствор был приготовлен в соответствии с Martínez-Gómez et al.33. Исходный раствор Neutral Red хранится около 2-3 недель при хранении при температуре 4 °C. Нейтральный красный красящий раствор и 0,4% трипановый синий следует готовить непосредственно перед анализом.

4. Забор гемолимфы

  1. Предварительно наполните шприц 0,5 мл отфильтрованной морской воды FSW или стандартным физиологическим раствором SPS (при 15 °C).
  2. Слегка и аккуратно раздвиньте створки по брюшной поверхности скальпелем. Удерживайте скальпель в нужном положении или используйте наконечник пипетки. Позвольте игле подкожного шприца войти в пространство между клапанами.
  3. Аккуратно соберите 0,5 мл гемолимфы из задней приводящей мышцы с помощью предварительно заполненного шприца в соответствии с UNEP/RAMOGE34.
  4. Извлеките иглу из шприца и перенесите содержимое шприца в микротрубку.
  5. Соберите гемолимфу из 3-4 мидий и объедините образцы гемолимфы в пробирке при температуре 15 °C, используя одинаковое соотношение между особями.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительное наполнение шприца используется для немедленного разбавления гемолимфы в соотношении 1:1 во время забора. Разведение гемолимфы с помощью FSW или SPS в соотношении 50:50 обычно используется для предотвращения агрегации гемоцитов, согласно Martínez-Gómez et al.33.

5. Гальванизация и бактериологическое исследование гемоцитов

  1. Посчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
  2. Разведите гемолимфу в концентрации 1 × 106 клеток/мл с помощью FSW или SPS.
  3. Оцените жизнеспособность гемоцитов в суспензии с помощью окрашивания трипановым синим: добавьте 100 мкл 0,4% растворенного в FSW или SPS трипанового синего в 100 мкл гемоцитарной суспензии. Выдерживать 5 минут при 15 °C.
  4. Далее добавьте каплю суспензии в гемоцитометр и подсчитайте неокрашенные (жизнеспособные) и окрашенные (нежизнеспособные) клетки под наблюдением микроскопии.
  5. Оценивают жизнеспособность гемоцитов как процент жизнеспособных клеток, рассчитанный на общее количество подсчитанных клеток35.
  6. Используйте следующую формулу для оценки жизнеспособности клеток35:
    Жизнеспособные клетки (%) = [количество жизнеспособных клеток/общее количество клеток (жизнеспособные + нежизнеспособные)] x 100
  7. Убедитесь, что жизнеспособность гемоцитов должна быть выше 95%, чтобы продолжить работу в протоколе.
  8. Добавьте 50 мкл разведенной гемолимфы в каждую лунку клеточной культуры 96-луночного микропланшета с плоским дном из полистирола, обработанного ТС. Накройте тарелку своей крышкой.
  9. Дайте гемоцитам прилипнуть к дну лунок в течение 30 минут при 15 °C для образования монослоя.
  10. Удалите излишки гемолимфы путем легкой аспирации с помощью микропипетки.

6. Краткосрочный анализ

  1. Для кратковременных анализов (в течение 1-4 ч) немедленно инкубируют клетки, прилипшие к дну лунок, со 100 мкл исследуемого вещества, растворенного в FSW или SPS в различных концентрациях при 15 °C. Используйте не менее трех лунок для трех повторных определений каждого экспериментального условия.
  2. После инкубации оцените подвижность клеток после шага 8.

7. Анализ при длительном воздействии

  1. Для длительной экспозиции, т.е. при проведении анализов экспозиции в течение 24-48 часов, культивируемые адгезивные клетки инкубируют с возрастающими концентрациями исследуемого вещества, растворенного в питательной среде (FSW или ASW) с добавлением 2 мМ L-глутамина (40 МЕ/мл пенициллина G и 100 мкг/мл стрептомицина) при 15°С. Используйте не менее трех лунок для трех повторных определений каждого экспериментального условия.
  2. После инкубации оцените подвижность клеток после шага 8.

8. Оценка подвижности клеток с помощью покадровой микроскопии

  1. Вставьте многолуночный планшет, содержащий адгезивные живые гемоциты, в многорежимный считыватель.
  2. Оцените подвижность адгезивных живых клеток с помощью визуализации в режиме реального времени на планшете с помощью покадровой микроскопии: сделайте снимки одной и той же области интереса (ROI) (размер используемого ROI: 720 мкм x 720 мкм) в каждой лунке со скоростью 1 изображение каждые 1 мин в течение 10 мин с помощью многорежимного ридера с 20-кратным увеличением и цветной визуализацией в светлом поле.
  3. Для лучшей визуализации гемоцитов окрашивайте клетки жизненно важным красителем Neutral Red непосредственно перед покадровой микроскопией следующим образом:
    1. Удалите инкубационную среду из каждой лунки.
    2. Добавьте 100 мкл окрашивающего раствора нейтрального красного, растворенного в стандартном физиологическом растворе, содержащем интересующее вещество, в лунки планшета, содержащего адгезивные клетки.
    3. Инкубируйте клетки при температуре 15 °C в течение 15 минут. Смойте излишки красителя.
    4. Добавьте 100 мкл интересующего вещества, растворенного в FSW или SPS. Визуализируйте клетки для оценки подвижности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование многорежимного считывателя позволяет одновременно получать изображения из большого числа скважин, что позволяет одновременно обнаруживать подвижность всех экспериментальных условий и реплик, содержащихся в скважине. Нейтральный красный краситель сохраняется внутри лизосом, которые проявляются в виде маленьких оранжевых пятен в цитоплазме, в то время как ядро выглядит как полупрозрачное отверстие, поскольку ацидофильный жизненно важный краситель не окрашивает его. Получение изображения проводилось в течение 10 мин при комнатной температуре 20 °C.

9. Отслеживание ячеек и расчет скоростных параметров

  1. Проанализируйте кадры одной и той же области интереса, полученные с помощью интервальной микроскопии с помощью Image J для каждой скважины.
  2. Сохраните изображения в папке без пробелов в имени. Изображения могут быть как в формате JPEG, так и в формате PNG.
  3. Откройте ImageJ. Нажмите « Файл» > «Импортировать > последовательность изображений».
  4. Выполняйте отслеживание отдельных ячеек с помощью подключаемого модуля ручного отслеживания ImageJ. Положения отдельных ячеек отмечаются на последовательных изображениях, что позволяет отслеживать изменения положения с течением времени.
  5. Анализируйте не менее 40 ячеек на лунку, исключая из анализа клетки, которые выходят за пределы записанного поля.
  6. Импортируйте наборы данных из подключаемого модуля ImageJ «Ручное отслеживание» в бесплатное программное обеспечение Chemotaxis and Migration Tool.
  7. Количественно оцените скоростные параметры, такие как средняя скорость, евклидово расстояние, мигрированное расстояние и прямота, используя программное обеспечение Chemotaxis and Migration Tool в соответствии с подробными инструкциями, приведенными в свободно доступном руководстве пользователя программного обеспечения36, или с помощью следующих шагов:
    1. Импортируйте наборы данных из подключаемого модуля ImageJ "Manual Tracking" в программное обеспечение Chemotaxis and Migration Tool.
    2. Выберите желаемое количество срезов (например, количество изображений, используемых для отслеживания).
    3. Откалибруйте программное обеспечение, установив размер пикселя x/y и временной интервал. Калибровка x/y показывает длину края пикселя в мкм, а временной интервал представляет собой продолжительность между каждым срезом.
    4. После настройки значений и параметров нажмите на кнопку «Применить настройки».
    5. Построение графиков траекторий и экспорт в виде изображения. Нажмите на кнопку «Измеренные значения », чтобы увидеть измеренные значения. Сохраните его.
    6. Нажмите на кнопку «Статистика » и сохраните скорость и прямоту серии треков.
  8. Сравните скоростные параметры, рассчитанные для контрольных клеток, с показателями гемоцитов, подвергшихся воздействию исследуемого вещества в различных концентрациях.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние миграции (измеряется в μм) относится к длине пути миграции в течение периода наблюдения (10 минут). Евклидово расстояние (также измеряемое в μм) представляет собой расстояние по прямой между начальной и конечной точками клетки. Средняя скорость (выраженная в мкм мин-1) рассчитывается как отношение перенесенного расстояния к длительности слежения за ячейкой для каждой ячейки. Прямота определяется как отношение евклидова расстояния к накопленному расстоянию для каждой траектории.

Результаты

В исследовании представлен новый метод in vitro для быстрой и чувствительной оценки токсичности и экотоксичности загрязнителей, использующий подвижность гемоцитов Mytilus galloprovincialis. На рисунке 1A-C показана репрезентативная покадровая визуализация гемоцитов после 30-минутного прикрепления к дну скважины. Клетки на рисунке были окрашены в нейтральный красный цвет непосредственно перед оценкой подвижности. Движения клеток контролировали с помощью оптической микроскопии со скоростью одно изображение в минуту в течение 10 мин при 20-кратном увеличении с помощью многорежимного считывателя. На рисунке 1A-C показаны три из 11 кадров, снятых из одной и той же области интереса (ROI) за 0 минут, 5 минут и 10 минут. Одни и те же клетки пронумерованы на всех трех рисунках, чтобы подчеркнуть их движение, и нумерация остается одинаковой на всех рисунках, чтобы четко проиллюстрировать их траектории.

Клетки демонстрируют одиночные движения на основе активности ламеллиподий и быстрых изменений формы. Клетки были помечены жизненно важным красителем Neutral red для улучшения их визуализации во время отслеживания. Нейтральный красный цвет является амфифильным и слабым катионным красителем, который может легко проникать через клеточную мембрану. Попадая внутрь клеток, краситель попадает в лизосомы из-за протонирования. Гемоциты мидий, особенно гранулоциты, демонстрируют хорошо развитую лизосомальную систему; поэтому они хорошо визуализируются с помощью окрашивания нейтральным красным цветом, при этом цитоплазма богата несколькими красными мечеными лизосомами, а ядро (не отмеченное красителем) выглядит как полупрозрачное отверстие.

Благодаря применению протокола можно наблюдать два основных морфотипа гемоцитов в соответствии с Udayan et al.23: (1) распространяющиеся клетки с биполярной формой бобов и иногда амебоидным контуром, а также меньшие клетки в форме круглых звезд (клетки n = 3 и 10). В обоих типах клеток движение характеризовалось непрерывными изменениями формы с продолжающимся расширением и втягиванием псевдоподий и филоподий.

Применение протокола позволяет успешно оценить подвижность гемоцитов путем построения графиков траекторий, как показано на рисунке 2, и расчета основных скоростных параметров, таких как средняя скорость и прямота. Они соответствовали соответственно 6,46 ± 0,2 мкм/мин и 0,56 ± 0,02 (среднее значение ± SEM) для спред-клеток и 5,18 ± 0,34 мкм/мин и 0,37 ± 0,03 для малых клеток, соответственно, в базальных физиологических условиях после 30 мин прикрепления к дну лунки. Таким образом, протокол позволяет классифицировать различные популяции гемоцитов на основе скоростных параметров.

Благодаря применению протокола могут быть обнаружены изменения скоростного параметра подвижности гемоцитов после воздействия лекарственных препаратов или загрязняющих веществ. На рисунке 3A-D представлены репрезентативные результаты in vitro воздействия гемоцитов мидий на парацетамол, который является одним из фармацевтических препаратов, выбрасываемых в окружающую среду (PiE) с самой высокой концентрацией и самой высокой частотой обнаружения в реках по всему миру31.

Согласно Udayan et al.23, в контрольных клетках значительное увеличение скорости с течением времени наблюдалось в обоих морфотипах клеток, что свидетельствует об активации гемоцитов в течение 24-часовой культуры, предположительно вызывающей воспалительную реакцию, экспериментально вызванную отменой и осаждением в культуральной среде. Когда клетки подвергались воздействию препарата, активация подвижности гемоцитов была значительно снижена в спредных клетках (рис. 3А) через 24 ч, но не в небольших круглых клетках (рис. 3В), характеризующихся более низкой средней базальной скоростью (по оценке в момент времени 0). Кроме того, протокол позволил обнаружить изменения траектории клеток после воздействия препарата, о чем свидетельствует значительное увеличение прямоты малых клеток через 24 ч и снижение прямоты после 1 ч экспозиции в распространяющихся клетках (рис. 3C, D).

figure-results-1
Рисунок 1: Репрезентативная покадровая съемка нейтральных красных гемоцитов после 30 минут прикрепления к дну скважины. Клетки окрашивали жизненно важным красителем Neutral Red непосредственно перед оценкой подвижности. Движения клеток контролировали с помощью оптической микроскопии со скоростью одно изображение каждую минуту в течение 10 минут при 20-кратном увеличении. Для краткости на панелях A, B и C отображаются три из 11 кадров, снятых из одной и той же области интереса (ROI) за 0 мин, 5 мин и 10 мин. На всех трех рисунках пронумерованы одни и те же клетки, чтобы проиллюстрировать их движение, а стрелками обозначены временные интервалы. Масштабные линейки представляют собой 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Репрезентативный график траектории гемоцитов M. galloprovincialis . Показанные траектории исходят из одной скважины. Показаны траектории 25 ячеек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Влияние воздействия парацетамола (24 ч) на скорость и прямоту распространяющихся клеток (A,B) и небольших круглых звездообразных клеток (C,D). Данные выражаются в виде среднего значения ± SEM. Статистическую значимость данных оценивали с помощью одностороннего ANOVA и пост-теста Тьюки. *p < 0.05 против. контроль (p < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Протокол, описанный в данной работе, представляет собой новый метод in vitro, подходящий для быстрой и чувствительной оценки токсичности лекарственных средств и загрязнителей на основе оценки подвижности гемоцитов M. galloprovincialis и ее изменений. Подвижность является специфическим аспектом иммунной функции этих клеток 21,22,23,37,38, поэтому любое изменение подвижности клеток может предвещать изменения в иммунной функции этих клеток. Подвижность является важной клеточной функцией, которая объединяет несколько клеточных процессов, таких как клеточная адгезия, клеточная сигнализация, активность цитоскелета, внутриклеточная сигнализация и регуляция клеточного объема, и требует интеграции и координации сложных биохимических и биомеханических сигналов 39,40,41. Каждый из этих процессов или компоненты каждого процесса могут быть потенциальными мишенями токсического действия лекарственных препаратов и загрязняющих веществ. Таким образом, изменения подвижности в скорости и/или траектории клетки представляют собой чувствительные конечные точки, интегрирующие эффекты на несколько клеточных мишеней.

Протокол подходит для оценки in vitro эффектов исследуемых веществ либо в краткосрочных анализах (продолжительностью 1-4 часа), либо в анализах длительного воздействия, продолжительностью 24-48 часов, что позволяет проводить быстрый скрининг загрязняющих веществ и лекарственных препаратов на предмет потенциальных токсических эффектов. Используя 96-луночный планшет, этот метод облегчает одновременное тестирование нескольких веществ или различных концентраций одного вещества, тем самым экономя время и реагенты. Кроме того, протокол также может быть адаптирован для использования с другим оборудованием, таким как фазово-контрастный микроскоп или флуоресцентный микроскоп. В этом случае клетки могут быть визуализированы без какого-либо окрашивания или с использованием флуоресцентных жизненно важных красителей.

Несмотря на то, что этот метод предлагает новые и чувствительные альтернативы для токсикологического скрининга, некоторые ограничения метода должны быть учтены для более широкого применения. Во-первых, важнейшим аспектом применения протокола является температура. Известно, что гемоциты мидий чувствительны к перепадам температуры. Воздействие температуры на гемоциты является сложным, при этом высокие и низкие температуры негативно влияют на их иммунные функции 42,43,44. Как было отмечено во время настройки метода, критической фазой, касающейся влияния температуры на подвижность клеток, является предварительная фаза сбора клеток, адгезии и культивирования на субстрате, которая должна следовать температуре акклиматизации организмов. Повышение температуры на несколько градусов во время этой первой фазы по сравнению с температурой акклиматизации может иметь решающее значение для приобретения формы и подвижности спредных клеток. Поэтому для культивирования гемоцитов рекомендуется температура 15 °C. Покадровое изображение для оценки моторики проводилось в течение 10 минут при комнатной температуре 20 °C. На основании предварительных наблюдений во время настройки метода можно сделать вывод, что экспозиция культивируемых клеток в течение этого интервала времени при 20 °C существенно не изменяет подвижность гемоцитов. Еще одним ограничением метода является ручное отслеживание гемоцитов, что может привести к вариабельности, зависящей от пользователя, и потребовать значительного времени и внимания к деталям. Тем не менее, использование жизненно важного красителя нейтрального красного цвета улучшает визуализацию клеток и, в свою очередь, отслеживание клеток за счет визуализации хорошо развитой лизосомальной системы. Ядро не окрашено красителем и выглядит как пустое отверстие, которое легко распознать и легко указать во время ручного отслеживания клеток. Еще одно ограничение метода связано с его природой in vitro. В то время как состояние in vitro обеспечивает контролируемую среду для оценки подвижности, оно может не полностью воспроизводить сложные взаимодействия и реакции, которые происходят in vivo, особенно в рамках иммунных реакций всего организма.

В последние годы в медико-биологической отрасли широко используются новые подходы и методологии, направленные на улучшение результатов и снижение зависимости от испытаний на животных45. Протокол предлагает альтернативный чувствительный тест для in vitro скрининга эффектов и механизмов действия загрязнителей и лекарственных препаратов с целью быстрого скрининга токсикологических эффектов химических загрязнителей, присутствующих в матрицах окружающей среды, как по отдельности, так и в смесях. Он фокусируется на новой конечной точке — подвижности клеток иммунной системы, которая может обеспечить комплексный ответ на токсикологическое воздействие, оказываемое лекарствами и загрязняющими веществами на различные клеточные мишени. В этом смысле он расширяет диапазон доступных в литературе тестов in vitro , в том числе с точки зрения интегрированного многопробирного подхода для применения в биомониторинге окружающей среды. Некоторые характеристики протокола согласовывают его с критериями 3R (Замена, Сокращение и Уточнение), способствуя сокращению количества позвоночных in vivo в испытаниях на животных и разработке более этичного и эффективного токсикологического и экотоксикологического анализа токсичности воздействия. Эти характеристики включают в себя легкое извлечение гемолимфы из мидий малоинвазивным способом, небольшое количество гемолимфы, необходимое для тестирования, и использование многолуночного планшета, который позволяет одновременно подвергать воздействию несколько концентраций токсикантов и повторять их, обеспечивая значительную экономию времени и реагентов.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование финансировалось проектом "Dipartimento di Eccellenza", предоставленным DiSTeBA Министерством университетов и исследований Италии, CUP: F85D18000130001, и NBFC (Национальный центр будущего биоразнообразия), финансируемым Европейским союзом NextGenerationEU, PNRR, проект No CN00000033. Мы также благодарим инфраструктуру BIOforIU на факультете биологических и экологических наук и технологий Университета Саленто.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 & микро; м фильтр (диаметр 25 мм)ABLUO лабораторная посуда
2,5 мл шприц для подкожных инъекций needdle 22GRays2522CM32лабораторная посуда
96-луночная плоскодонная полистирольная микропластина с обработкой TCCorning3916лабораторная посуда
CaCl2.2H2OMerk (Sigma - Aldrich) C3881-1KGПрограммное
хемотаксиса и миграции (Ibidi GmbH)программное обеспечение
Cytation 5 Оборудование Agilent BioTeckCytation 5: многорежимный считыватель
диметилсульфоксида (ДМСО) для визуализации клеток Мерк (Сигма - Олдрич) 472301Solvent
Falcon 15 мл Tube Conical BottomCorning352196лабораторная посуда
H3BO3Merk (Sigma - Aldrich) B0394Химический
гемоцитометр быстрого считывания 102BiosigmaBVS100лабораторный
HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин-этансульфоновая кислота)Merk (Sigma - Aldrich) H3375-500G
Chemical ImageJ программное обеспечениеNIH
KBrMerk (Sigma - Aldrich) P9881Chemical
KClMerk 104936Химический
L-глютаминMerk (Sigma - Aldrich)G7513Незаменимая аминокислота для среды клеточных культур
MgCl2· 6H2O Merk(Sigma - Aldrich) M2670Химический
MgSO4Merk (Sigma - Aldrich) M7506Химический
микроскоп Nikon Eclipse E600NikonОборудование: Визуализация клеток 
Na2SO4Riedel-de Haen31481Chemical
NaClMerk (Sigma - Aldrich) 31434-1KG-RХимический
NaFFluka71519 500гХимический
NaHCO3Merk (Sigma - Aldrich) S5761-1KGХимически
нейтральный красныйMerk (Sigma - Aldrich) N4638-1GЖизненно важный клеточный краситель
пенициллин/стрептомицинMerk (Sigma - Aldrich) P0781-100MLАнтибиотики для клеточных культур
SrCl2· 6H2O Merk(Sigma - Aldrich) 255521
Химический трипан синий Мерк (Сигма - Олдрич) T8154Клеточный краситель
обеспечение для химической

Ссылки

  1. Di Paolo, C., et al. Bioassay battery interlaboratory investigation of emerging contaminants in spiked water extracts - Towards the implementation of bioanalytical monitoring tools in water quality assessment and monitoring. Water Res. 104, 473-484 (2016).
  2. Brack, W., et al. Effect-based methods are key. The European Collaborative Project SOLUTIONS recommends integrating effect-based methods for diagnosis and monitoring of water quality. Environ Sci Eur. 31 (1), 10(2019).
  3. Lionetto, M. G., Caricato, R., Erroi, E., Giordano, M. E., Schettino, T. Potential application of carbonic anhydrase activity in bioassay and biomarker studies. Chem Ecol. 22 (sup1), S119-S125 (2006).
  4. Lionetto, M. G., Caricato, R., Giordano, M. E. Pollution biomarkers in the framework of marine biodiversity conservation: State of art and perspectives. Water. 13 (13), 1847(2021).
  5. Connon, R. E., Geist, J., Werner, I. Effect-based tools for monitoring and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic environment. Sensors. 12 (9), 12741-12771 (2012).
  6. Fabbri, E., Valbonesi, P., Moon, T. W. Pharmaceuticals in the marine environment: Occurrence, fate, and biological effects. Contaminants of Emerging Concern in the Marine Environment. León, V. M., Bellas, J. Chapter 2, Elsevier. Amsterdam. 11-71 (2023).
  7. Lionetto, F., et al. Autofluorescence of model polyethylene terephthalate nanoplastics for cell interaction studies. Nanomaterials. 12 (9), 1560(2022).
  8. Damiens, G., Gnassia-Barelli, M., Loquès, F., Roméo, M., Salbert, V. Integrated biomarker response index as a useful tool for environmental assessment evaluated using transplanted mussels. Chemosphere. 66 (3), 574-583 (2007).
  9. Ogidi, O. I., Onwuagba, C. G., Richard-Nwachukwu, N. Biomonitoring tools, techniques and approaches for environmental assessments. Biomonitoring of Pollutants in the Global South. Izah, S. C., Ogwu, M. C., Hamidifar, H. , Springer. Singapore. (2024).
  10. Rosner, A., et al. A broad-taxa approach as an important concept in ecotoxicological studies and pollution monitoring. Biol Rev. 99 (1), 131-176 (2024).
  11. Gagné, F., Burgeot, T. Bivalves in ecotoxicology. Encyclopedia of Aquatic Ecotoxicology. , 247-258 (2013).
  12. Caricato, R., et al. Carbonic anhydrase integrated into a multimarker approach for the detection of the stress status induced by pollution exposure in Mytilus galloprovincialis: A field case study. Sci Total Environ. 690, 140-150 (2019).
  13. Calisi, A., et al. Morphological and functional alterations in hemocytes of Mytilus galloprovincialis exposed in high-impact anthropogenic sites. Mar Environ Res. 188, 105988(2023).
  14. Viarengo, A., Burlando, B., Evangelisti, V., Mozzone, S., Dondero, F. Sensitivity and specificity of metallothionein as a biomarker for aquatic environment biomonitoring. Biomarkers in Marine Organisms. Garrigues, F., Barth, H., Walker, C. H., Narbonne, J. F. , Elsevier Science. Amsterdam. 29-43 (2001).
  15. Bocchetti, R., et al. Contaminant accumulation and biomarker responses in caged mussels, Mytilus galloprovincialis, to evaluate bioavailability and toxicological effects of remobilized chemicals during dredging and disposal operations in harbor areas. Aquat Toxicol. 89 (3), 257-266 (2008).
  16. Calisi, A., Lionetto, M. G., Caricato, R., Giordano, M. E., Schettino, T. Morphometric alterations in Mytilus galloprovincialis granulocytes: A new biomarker. Environ Toxicol Chem. 26 (6), 1435-1441 (2007).
  17. Burgos-Aceves, M. A., Faggio, C. An approach to the study of the immunity functions of bivalve haemocytes: Physiology and molecular aspects. Fish Shellfish Immunol. 67 (6), 513-517 (2017).
  18. Canesi, L., et al. Tyrosine kinase-mediated cell signaling in the activation of Mytilus hemocytes: Possible role of STAT-like proteins. Biol Cell. 95 (9), 603-613 (2003).
  19. Novas, A., Barcia, R., Ramos-Martínez, J. I. Nitric oxide production by hemocytes from Mytilus galloprovincialis shows seasonal variations. Fish Shellfish Immunol. 23 (4), 886-891 (2007).
  20. Pruzzo, C., Gallo, G., Canesi, L. Persistence of vibrios in marine bivalves: The role of interactions with hemolymph components. Environ Microbiol. 7 (5), 761-772 (2005).
  21. Le Foll, F., et al. Characterization of Mytilus edulis hemocyte subpopulations by single-cell time-lapse motility imaging. Fish Shellfish Immunol. 28 (2), 372-386 (2010).
  22. Rioult, D., Lebel, J. -M., Le Foll, F. Cell tracking and velocimetric parameters analysis as an approach to assess activity of mussel (Mytilus edulis) hemocytes in vitro. Cytotechnology. 65 (5), 749-758 (2013).
  23. Udayan, G., Giordano, M. E., Pagliara, P., Lionetto, M. G. Motility of Mytilus galloprovincialis hemocytes: Sensitivity to paracetamol in vitro exposure. Aquat Toxicol. 265, 106779(2023).
  24. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
  25. Ivanina, A., Falfushynska, H., Beniash, E., Piontkivska, H., Sokolova, I. Biomineralization-related specialization of hemocytes and mantle tissues of the Pacific oyster Crassostrea gigas. J Exp Biol. 220 (18), 3209-3221 (2017).
  26. Furukawa, F., et al. Hemocyte migration and expression of four Sox genes during wound healing in Pacific abalone, Haliotis discus hannai. Fish Shellfish Immunol. 117, 24-35 (2021).
  27. Lau, Y., Gambino, L., Santos, B., Espinosa, E., Allam, B. Regulation of oyster (Crassostrea virginica) hemocyte motility by the intracellular parasite Perkinsus marinus: A possible mechanism for host infection. Fish Shellfish Immunol. 78, 18-25 (2018).
  28. Gendre, H., et al. Modulation of hemocyte motility by chemical and biological stresses in Mytilus edulis and Dreissena polymorpha. Fish Shellfish Immunol. 139, 108919(2023).
  29. Kaloyianni, M., et al. Oxidative effects of inorganic and organic contaminants on haemolymph of mussels. Comp Biochem Physiol C: Toxicol Pharmacol. 149 (4), 631-639 (2009).
  30. Sendra, M., et al. Nanoplastics: From tissue accumulation to cell translocation into Mytilus galloprovincialis hemocytes. Resilience of immune cells exposed to nanoplastics and nanoplastics plus Vibrio splendidus combination. J Hazard Mater. 388, 121788(2020).
  31. Pizzagalli, D. U., Pulfer, A., Thelen, M., Krause, R., Gonzalez, S. F. In vivo motility patterns displayed by immune cells under inflammatory conditions. Front Immunol. 12, 804159(2021).
  32. ASTM D1141-98. Standard Practice for Preparation of Substitute Ocean Water. , (2021).
  33. Martínez-Gómez, C., Bignell, J., Lowe, D. Lysosomal membrane stability in mussels. ICES Techniques in Marine Environmental Sciences. 56, 1-41 (2015).
  34. UNEP/RAMOGE. Manual on the biomarkers recommended for the MED POL Biomonitoring Programme. UNEP. , Athens. (1999).
  35. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  36. Asano, Y., Horn, E. Instructions Chemotaxis and Migration Tool 2.0 Version 1.1. , (2013).
  37. Wilkinson, J. L., et al. Pharmaceutical pollution of the world's rivers. Proc Natl Acad Sci USA. 119 (8), e2113947119(2022).
  38. Parisi, M. G., Pirrera, J., La Corte, C. Effects of organic mercury on Mytilus galloprovincialis hemocyte function and morphology. J Comp Physiol B. 191 (1), 143-158 (2021).
  39. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  40. Bailly, M., Condeelis, J. Cell motility: Insights from the backstage. Nat Cell Biol. 4 (5), E292-E294 (2002).
  41. Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol Rev. 94 (1), 235-263 (2014).
  42. Mosca, F., et al. Effects of high temperature and exposure to air on mussel (Mytilus galloprovincialis, Lmk 1819) hemocyte phagocytosis: Modulation of spreading and oxidative response. Tissue Cell. 45 (3), 198-203 (2013).
  43. Beaudry, A., et al. Effect of temperature on immunocompetence of the blue mussel (Mytilus edulis). J Xenobiot. 6 (1), 5889(2016).
  44. Wu, F., et al. Combined effects of seawater acidification and high temperature on hemocyte parameters in the thick shell mussel Mytilus coruscus. Fish Shellfish Immunol. 56, 554-562 (2016).
  45. Schmeisser, S., et al. New approach methodologies in human regulatory toxicology - Not if, but how and when. Environ Int. 178, 108082(2023).

Перепечатки и разрешения

Теги

Подвижность гемоцитовгемоциты мидийанализ токсичностиэкотоксикологический анализтрекинг клетоктаймлапс-микроскопияэкологический биомониторингмиграция клетокиммунный ответ
Токсикологический и экотоксикологический анализ на основе подвижности гемоцитов мидий (Mytilus galloprovincialis)
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.