Протеиназы жизненно важны для бактериального патогенеза, обеспечивая инвазию и уклонение от иммунитета. Одноступенчатая экстракция цитоплазматических и мембранных белков бактерий в их активной форме является сложным процессом. В данной видеостатье демонстрируется экстракция цельных клеточных белков лептоспиры для проведения зимографического анализа с целью обнаружения и характеристики гелатиназ.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Одноэтапная экстракция и зимографический анализ бактериальных гелатиназ
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Протеиназы патогенных бактерий способствуют инвазии и патогенезу, активно разрушая компоненты внеклеточного матрикса (ВКМ) хозяина и клеточные барьеры, модифицируя иммунный ответ хозяина и деградируя защитную систему хозяина. Это делает протеиназы одними из самых вирулентных молекул, а их идентификация и характеристика имеют важное значение для профилактики и контроля заболеваний. Многие бактерии также обладают внешними мембраносвязанными протеиназами. Выделение и характеристика белков внешней мембраны в их активных формах представляет значительные трудности из-за их локализации внутри внешней мембраны. В этом исследовании мы демонстрируем одноэтапный метод экстракции как цитоплазматических, так и внешних мембран-ассоциированных гелатиназ из лептоспир и демонстрируем их ферментативную активность с помощью зимографии. В этом методе мы используем дезоксихолат натрия для разрушения клеточной мембраны и высвобождения связанных белков и 6-аминокапроновой кислоты для солюбилизации высвобожденного мембранного белка в его нативной форме. Далее мы показываем зимографический анализ лептоспиральных желатиназ. Этот подход обеспечивает универсальную основу для выделения, очистки и характеристики металлопротеиназ, коллагеназ и джелатиназ от различных бактериальных патогенов.
Введение
Большинство бактериальных патогенов должны сталкиваться с внеклеточным матриксом (ВКМ) хозяина во время инвазии и распространения в органы-мишени во время патогенеза. Коллаген является основным компонентом ВКМ тканей животных1. Желатиназы – это группа протеаз, которые действуют на коллаген и его гидролизованную форму, желатин. Деградация ВКМ в основном осуществляется группой протеаз, которая включает коллагеназы и джелатиназы 2,3. Бактериальные патогены используют коллагеназы и джелатиназы для ремоделирования или разрушения ВКМ хозяина для удобства при инвазии и патогенезе 4,5. Бактериальные ферменты, разрушающие ECM, являются потенциальными кандидатами для таргетирования вакцин и лекарств5.
Бактериальные протеазы обнаруживаются в секреторной и мембранно-связанной формах 6,7,8,9. Многие методы экстракции клеточными ферментами неэффективны для выделения мембраносвязанных бактериальных гелатиназ и коллагеназ, поскольку эти процедуры могут неэффективно сохранять нативную форму мембраносвязанных белков. Точно так же существуют мембраноспецифические методы, которые извлекают только мембраносвязанные протеазы и желатиназы. Традиционные методы экстракции общих белков, включая мембранные белки, часто включают в себя детергенты и хаотропные ионы, которые могут влиять на ферментативную активность. Процедура экстракции, которая поддерживает активность ферментов и растворимость, имеет важное значение для электрофоретического разделения и позволяет использовать зимографию для определения активности протеазы.
Дезоксихолат натрия, ионный детергент, который может лизировать клетки, разрушая клеточную мембрану, способствует высвобождению клеточного содержимого и мембранного белка. 6-аминокапроновая кислота может растворять высвобожденный мембранный белок в его нативной форме. Солюбилизация 6-аминокапроновой кислотой имеет то преимущество, что она не влияет на электрофорез. Здесь мы демонстрируем экстракцию клеточных и мембраносвязанных бактериальных протеиназ с использованием дезоксихолата натрия и 6-аминокапроновой кислоты, стабилизируя их в нативной растворимой форме 10,11,12. Этот метод эффективно растворяет белки из клетки и мембраны, которые могут быть использованы непосредственно без вмешательства электрофореза13,14. Различные ферментативные характеристики могут быть выполнены путем изменения ингибиторов протеазы и ионов металлов, используемых в активационном буфере, в зависимости от применения.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Экстракция бактериальных желатиназ
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовку реагентов и материалов см. в таблице 1 .
- Выращивайте организм в среде Ellinghausen McCullough Johnson Harris (EMJH), содержащей 10 мг/мл бычьего сывороточного альбумина при 30 °C. Для экстракции протеиназ13,14 берут 10 мл культуры Leptospira в средней логарифмической фазе роста, содержащей 3,5 ×10 8 клеток/мл. Используйте прямой микроскопический подсчет со счетной камерой Петроффа-Хауссера под микроскопом темного поля, чтобы наблюдать среднюю фазу роста в середине логарифма.
- Соберите клетки центрифугированием при 6000 × г в течение 10 мин и выбросьте надосадочную жидкость в контейнер для обеззараживания путем автоклавирования при 121 °C в течение 60 мин.
- Перенесите гранулу, суспензировав ее в 1 мл промывочного буфера, в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте при температуре 6 000 × г в течение 5 минут. Повторите эту стирку.
- Извлеките белок из гранулы, добавив 100 μL экстракционного буфера для гранулы Leptospira из 10 мл культуры и вортекса в течение 5 минут. Продолжайте экстракцию путем инкубации при 4 °C в течение 1 ч. Соберите экстрагированный белок центрифугированием при 15 000 × г при 4 °C в течение 10 минут и выбросьте гранулу в контейнер для обеззараживания путем автоклавирования при 121 °C в течение 60 минут.
- Используйте экстракт белка непосредственно для зимографии, добавив равный объем в 2 раза больше буфера для образца.
- Используйте метод оценки Брэдфорда для определения концентрации белка.
- Если концентрация белка низкая, осадите его ацетоном, смешав белок с 4-кратным объемом ацетона для осаждения, и инкубируйте его в течение ночи при -20 °C. На следующий день центрифугируйте образец при 10 000 × г в течение 10 минут, высушите полученную гранулу на воздухе и повторно суспендируйте в PBS или растворите в нужном буфере и храните при температуре -20 °C до 1 месяца. Используют лиофилизацию для длительного хранения или транспортировки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за активных протеаз в экстракте и отсутствия ингибиторов протеазы белки в образце могут разрушаться.
2. Зимография гелатиназ
- Приготовление желатинового сополимеризованного геля SDS PAGE
- Рассасывающий гель
- Сделайте растворяющую гелевую смесь, добавив компоненты в необходимых количествах для литья геля. К 3,86 мл воды в стакане объемом 50 мл добавить 2,5 мл Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 мл из 10% исходного раствора желатина, 3,34 мл раствора акриламида (ABA) акриламида-биса, 0,1 мл 10% SDS, 0,006 мл TEMED и 0,1 мл 10% персульфата аммония и хорошо перемешать без пенообразования и образования пузырьков. Упомянутая система (Regular Glass Plates; 18 x 8 см) требует 10 мл растворяющейся гелевой смеси.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если желатин получен из замороженной аликвоты, разморозьте его, пока он не растает, чтобы раствор не стал прозрачным без комочков. Добавляйте персульфат аммония непосредственно перед заливкой, потому что полимеризация начнется сразу после добавления персульфата аммония. - Растворяющую гелевую смесь залить в литейную камеру до ~3-5 мм ниже разметки для дна лунок. Избегайте образования пузырьков воздуха.
- Медленно налейте немного воды до получения ровного слоя толщиной 1 мм поверх геля и удалите пузырьки. Дайте гелю застыть в течение 1 часа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образование геля может быть подтверждено путем поиска разделения фаз между слоем воды и гелем; Гель нельзя выливать, даже если гелевая кассета наклонена.
- Сделайте растворяющую гелевую смесь, добавив компоненты в необходимых количествах для литья геля. К 3,86 мл воды в стакане объемом 50 мл добавить 2,5 мл Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 мл из 10% исходного раствора желатина, 3,34 мл раствора акриламида (ABA) акриламида-биса, 0,1 мл 10% SDS, 0,006 мл TEMED и 0,1 мл 10% персульфата аммония и хорошо перемешать без пенообразования и образования пузырьков. Упомянутая система (Regular Glass Plates; 18 x 8 см) требует 10 мл растворяющейся гелевой смеси.
- Укладка геля
- Приготовьте гель для укладки, смешав следующие компоненты. К 1,84 мл воды в стакане объемом 10 мл добавьте 2,5 мл Tris-Cl (pH 6,6), 0,35 мл ABA, 0,03 мл 10% SDS и 0,006 мл TEMED. Для системы 8 x 10 см толщиной 1 мм требуется 3 мл растворяющейся гелевой смеси.
- Из гелевой кассеты сцедите воду, образовавшуюся в верхней части геля, наклонив гелевую установку в одну сторону и промокнув собранную воду из угла с помощью узкой полоски фильтровальной бумаги.
- Добавьте 0,03 мл 10% APS в смесь, указанную в пункте 2.1.2.1, и перемешайте, не образуя пузырьков.
- Налейте укладывающий гель на разрешающий гель и сразу же установите расческу на место, не образуя пузырьков воздуха под зубьями расчески, оставляя толщину 3-5 мм укладывающего геля между разрешающим гелем и нижней частью зубьев расчески. Подождите не менее 3 ч для полной полимеризации и сшивания желатина.
- Выньте нижнюю распорку и зафиксируйте гель на аппарате для электрофореза.
- Медленно поместите гель в резервуар, содержащий 1x электродный буфер, следя за тем, чтобы на дне геля не было захваченного воздуха.
- Рассасывающий гель
- Подготовка образца
- Добавьте к экстракту равный объем буфера для образца и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут, чтобы SDS смог соединиться с белком. В качестве положительного контроля используйте образец, содержащий 2 мкл сыворотки крови человека с равным объемом буфера для пробы.
- Загрузка образца
- Осторожно загрузите образец в лунки с помощью пипетки с узким наконечником или шприца Гамильтона (0,5-1 мл). Постепенно добавляйте электродный буфер, чтобы заполнить оставшиеся части лунок, верхнюю часть геля и верхний резервуар блока электрофореза, не нарушая загруженные образцы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шприц Hamilton следует тщательно промывать между образцами, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
- Осторожно загрузите образец в лунки с помощью пипетки с узким наконечником или шприца Гамильтона (0,5-1 мл). Постепенно добавляйте электродный буфер, чтобы заполнить оставшиеся части лунок, верхнюю часть геля и верхний резервуар блока электрофореза, не нарушая загруженные образцы.
- Беговой электрофорез
- Начните электрофорез с 6 мА на гель и продолжайте до тех пор, пока фронт красителя не войдет в разрешающий гель. Затем увеличьте ток до 12 мА на гель и продолжайте до тех пор, пока фронт красителя не достигнет 1 см над дном геля.
Примечание: Время работы может меняться в зависимости от используемой концентрации АБК и размера целевого белка.
- Начните электрофорез с 6 мА на гель и продолжайте до тех пор, пока фронт красителя не войдет в разрешающий гель. Затем увеличьте ток до 12 мА на гель и продолжайте до тех пор, пока фронт красителя не достигнет 1 см над дном геля.
- Маркировка ориентации полос стандарта
- После завершения электрофореза осторожно демонтируйте стеклянные пластины с помощью инструмента для разделения пластин или пластикового шпателя и отметьте ориентацию загрузки образца, вырезав правый нижний угол геля, и отметьте предварительно окрашенные маркерные полосы, пробивая отверстия рядом или сканируя гель.
- Ренатурация растворившихся ферментов
- Погрузить гель в ренатурирующий раствор, содержащий Тритон Х-100, в гелевый лоток и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре, не встряхивая.
ПРИМЕЧАНИЕ: Triton X-100 ренатурирует белки, так как гель для зимограммы, содержащий разрешенные белки, может денатурироваться и терять активность в присутствии SDS.
- Погрузить гель в ренатурирующий раствор, содержащий Тритон Х-100, в гелевый лоток и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре, не встряхивая.
- Инкубация для протеазной активности
- Замените ренатурирующий раствор активационным буфером, который полностью погружает гель, и инкубируйте при температуре 37 °C в течение 18 часов в инкубаторе.
Примечание: Модифицируйте активационный буфер путем добавления ингибиторов или активаторов интересующих вас протеиназ для характеристики активности протеиназы по мере необходимости.
- Замените ренатурирующий раствор активационным буфером, который полностью погружает гель, и инкубируйте при температуре 37 °C в течение 18 часов в инкубаторе.
- Окрашивание зимограммы
- После инкубации удалите активационный буфер и кратковременно промойте гель водой в течение 1 минуты, чтобы удалить остатки Triton X-100 и предотвратить пенообразование во время встряхивания.
- Добавьте раствор для окрашивания в лоток, убедившись, что гель полностью погружен в воду. Осторожно встряхните гель на низкой скорости, чтобы не повредить его. Продолжайте окрашивание до тех пор, пока гель полностью не посинеет.
- Удалите излишки пятна с поверхности геля, промыв его водой в течение 1 минуты. Добавьте раствор для удаления жидкости в противень и осторожно встряхните. Замените раствор для удаления жидкости свежим раствором несколько раз, пока не будет достигнут желаемый контраст полосы на синем фоне.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время проведения дезикапирования постоянно контролируйте гель, чтобы убедиться, что он не полностью обесцвечивается, что позволяет наблюдать и записывать протеолитические полосы. - Отсканируйте гель в системе документирования геля или сканере документов и определите молекулярную массу белковых полос, сравнив их со стандартами белка.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Результат показывает зимограмму лептоспирального белка и желатиназ из сыворотки крови человека. Результаты, показанные на рисунке 1, представляют протеазы в виде белых прозрачных полос на синем фоне. Полосы представляют собой участки, где сополимеризованный желатин разлагается и, следовательно, не окрашивается, в то время как другие участки всего геля окрашиваются в синий цвет из-за присутствия желатина. Кроме того, это показывает, что, несмотря на то, что желатин также является белком, он н...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Во время приготовления акриламидного геля желатин сополимеризуется с матрицей акриламидного полимера. Следовательно, сополимеризованный желатин остается обездвиженным внутри геля и не мигрирует во время электрофореза, даже несмотря на то, что он является белком. После электрофореза нативные белки, экстрагированные с помощью дезоксихолата и буфера 6-аминокапроновой кислоты, разделяются в соответствии с их массой и зарядом. После удаления SDS эти белки ренатурируются в присутствии Triton X...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.
Благодарности
Авторы выражают свою благодарность Отделу SERB, Департамент науки и технологий, Нью-Дели, за поддержку в виде грантовых No.SR/S0/HS/0108/2012, MGM
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 6-Аминокапроевая кислота | Мерк | А2504 | |
| Уксусная кислота | Сигма | 695092 | |
| Ацетон | Сигма | 32201 | |
| Акриламид | Сигма | А-3553 | |
| Персульфат аммония | Сигма | А-3678 | |
| Бис Акриламид | Сигма | М7279 | |
| Фракция V сывороточного альбумина крупного рогатого скота (BSA) | Сигма | А-8022 | |
| Бромфенол синий | Сигма | Б-8026 | |
| CaCl2 | Мерк | С4901 | |
| Кумасси блестящий синий | Сигма | 1.12553 | |
| Дезоксихолат | Сигма-Олдрич | Д6750 | |
| Эллингхаузен– Маккалоу&ндаш; Джонсон– Harris (EMJH) средний, Difco | Дифко | 279410 | |
| Желатин | Мерк | Г9382 | |
| Глицерин | Мерк | Г5516 | |
| Глицин G8790 | Сигма | Г-8898 | |
| Leptospira interrogans serovar Copenhageni штамм Fiocruz L1-130 (ATCC BAA-1198) , хранящийся в биорепозитории ICMR-RMRC Portblair | Хранится в биорепозитории ICMR-RMRC в Порт-Блэре | Оптимальная температура роста 30 °°; C | |
| Хлорид магния M8266 | Сигма | М8266 | |
| Метанол | Сигма | 17995-7 | |
| Фосфатно-солевой буфер | Сигма | P4417 | |
| Инструмент для разделения пластин | Чудо-ведьма | ||
| Ротор | Теплонаучные | FIBERLite F15 8x50 cy | |
| Додецилсульфат натрия (SDS) | Сигма | Л-4396 | |
| ТЕМЕД | Сигма | Т-9281 | |
| Тритон Х-100 | Сигма-Олдрич | Т8787 | |
| База Тризма (ТРИС) | Сигма | Т6066 |
Ссылки
- Yue, B. Biology of the extracellular matrix. J Glaucoma. 23 (8 Suppl 1), S20-S23 (2014).
- Cabral-Pacheco, G. A., et al. The roles of matrix metalloproteinases and their inhibitors in human diseases. Int J Mol Sci. 21 (24), 1-53 (2020).
- Ambili, M., Jayasree, K., Sudhakaran, P. R. 60K gelatinase involved in mammary gland involution is regulated by β-oestradiol. Biochim Biophys Acta. 1403 (3), 219-231 (1998).
- Zhang, Y. -Z., Ran, L. -Y., Li, C. -Y., Chen, X. -L. Diversity, structures, and collagen-degrading mechanisms of bacterial collagenolytic proteases. Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6098-6107 (2015).
- Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Crit Rev Microbiol. 42 (1), 106-126 (2016).
- Madathiparambil, M. G., Cattavarayane, S., Perumana, S. R., Manickam, G. D., Sehgal, S. C. Presence of 46 kDa gelatinase on the outer membrane of Leptospira. Curr Microbiol. 62 (5), 1478-1482 (2011).
- Kramer, R. A., Zandwijken, D., Egmond, M. R., Dekker, N. In vitro folding, purification and characterization of Escherichia coli outer membrane protease OmpT. Eur J Biochem. 267 (3), 885-893 (2000).
- Kum, S. L., Ho, J. C. S., Parikh, A. N., Liedberg, B. Amphiphilic membrane environments regulate enzymatic behaviors of Salmonella outer membrane protease. ACS Bio Med Chem Au. 2 (1), 73-83 (2022).
- Sarma, A., et al. Extracellular proteome analysis shows the abundance of histidine kinase sensor protein, DNA helicase, putative lipoprotein containing peptidase M75 domain and peptidase C39 domain protein in Leptospira interrogans grown in EMJH medium. Pathogens. 10 (7), 852(2021).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Levy, D., Gulik, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. Phospholipid vesicle solubilization and reconstitution by detergents. Symmetrical analysis of the two processes using octaethylene glycol mono-n-dodecyl ether. Biochemistry. 29 (40), 9480-9488 (1990).
- Lichtenberg, D., Ahyayauch, H., Alonso, A., Goñi, F. M. Detergent solubilization of lipid bilayers: a balance of driving forces. Trends Biochem Sci. 38 (2), 85-93 (2013).
- Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).
- Zeug, A., et al. Current microscopic methods for the neural ECM analysis. Prog Brain Res. 214, 287-312 (2014).
- Madathiparambil, M. G., et al. A zymography analysis of proteinase activity present in Leptospira. Curr Microbiol. 62 (3), 917-922 (2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
