Протеиназы жизненно важны для бактериального патогенеза, обеспечивая инвазию и уклонение от иммунитета. Одноступенчатая экстракция цитоплазматических и мембранных белков бактерий в их активной форме является сложным процессом. В данной видеостатье демонстрируется экстракция цельных клеточных белков лептоспиры для проведения зимографического анализа с целью обнаружения и характеристики гелатиназ.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Одноэтапная экстракция и зимографический анализ бактериальных гелатиназ
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Протеиназы патогенных бактерий способствуют инвазии и патогенезу, активно разрушая компоненты внеклеточного матрикса (ВКМ) хозяина и клеточные барьеры, модифицируя иммунный ответ хозяина и деградируя защитную систему хозяина. Это делает протеиназы одними из самых вирулентных молекул, а их идентификация и характеристика имеют важное значение для профилактики и контроля заболеваний. Многие бактерии также обладают внешними мембраносвязанными протеиназами. Выделение и характеристика белков внешней мембраны в их активных формах представляет значительные трудности из-за их локализации внутри внешней мембраны. В этом исследовании мы демонстрируем одноэтапный метод экстракции как цитоплазматических, так и внешних мембран-ассоциированных гелатиназ из лептоспир и демонстрируем их ферментативную активность с помощью зимографии. В этом методе мы используем дезоксихолат натрия для разрушения клеточной мембраны и высвобождения связанных белков и 6-аминокапроновой кислоты для солюбилизации высвобожденного мембранного белка в его нативной форме. Далее мы показываем зимографический анализ лептоспиральных желатиназ. Этот подход обеспечивает универсальную основу для выделения, очистки и характеристики металлопротеиназ, коллагеназ и джелатиназ от различных бактериальных патогенов.
Введение
Большинство бактериальных патогенов должны сталкиваться с внеклеточным матриксом (ВКМ) хозяина во время инвазии и распространения в органы-мишени во время патогенеза. Коллаген является основным компонентом ВКМ тканей животных1. Желатиназы – это группа протеаз, которые действуют на коллаген и его гидролизованную форму, желатин. Деградация ВКМ в основном осуществляется группой протеаз, которая включает коллагеназы и джелатиназы 2,3. Бактериальные патогены используют коллагеназы и джелатиназы для ремоделирования или разрушения ВКМ хозяина для удобства при ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Экстракция бактериальных желатиназ
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовку реагентов и материалов см. в таблице 1 .
- Выращивайте организм в среде Ellinghausen McCullough Johnson Harris (EMJH), содержащей 10 мг/мл бычьего сывороточного альбумина при 30 °C. Для экстракции протеиназ13,14 берут 10 мл культуры Leptospira в средней логарифмической фазе роста, содержащей 3,5 ×10 8 клеток/мл. Используйте прямой микроскопический подсчет со счетной камерой Петроффа-Хауссера под микроскопом темного поля, чтоб....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Результат показывает зимограмму лептоспирального белка и желатиназ из сыворотки крови человека. Результаты, показанные на рисунке 1, представляют протеазы в виде белых прозрачных полос на синем фоне. Полосы представляют собой участки, где сополимеризованный желатин разлагается и, следовательно, не окрашивается, в то время как другие участки всего геля окрашиваются в синий цвет из-за присутствия желатина. Кроме того, это показывает, что, несмотря на то, что желатин также является белком, он н.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Во время приготовления акриламидного геля желатин сополимеризуется с матрицей акриламидного полимера. Следовательно, сополимеризованный желатин остается обездвиженным внутри геля и не мигрирует во время электрофореза, даже несмотря на то, что он является белком. После электрофореза нативные белки, экстрагированные с помощью дезоксихолата и буфера 6-аминокапроновой кислоты, разделяются в соответствии с их массой и зарядом. После удаления SDS эти белки ренатурируются в присутствии Triton X.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.
Благодарности
Авторы выражают свою благодарность Отделу SERB, Департамент науки и технологий, Нью-Дели, за поддержку в виде грантовых No.SR/S0/HS/0108/2012, MGM
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 6-Аминокапроевая кислота | Мерк | А2504 | |
| Уксусная кислота | Сигма | 695092 | |
| Ацетон | Сигма | 32201 | |
| Акриламид | Сигма | А-3553 | |
| Персульфат аммония | Сигма | А-3678 | |
| Бис Акриламид | Сигма | М7279 | |
| Фракция V сывороточного альбумина крупного рогатого скота (BSA) | Сигма | А-8022 | |
| Бромфенол синий | Сигма | Б-8026 | |
| CaCl2 | Мерк | С4901 | |
| Кумасси блестящий синий | Сигма | 1.12553 | |
| Дезоксихолат | Сигма-Олдрич | Д6750 | |
| Эллингхаузен– Маккалоу&ндаш; Джонсон– Harris (EMJH) средний, Difco | Дифко | 279410 | |
| Желатин | Мерк | Г9382 | |
| Глицерин | Мерк | Г5516 | |
| Глицин G8790 | Сигма | Г-8898 | |
| Leptospira interrogans serovar Copenhageni штамм Fiocruz L1-130 (ATCC BAA-1198) , хранящийся в биорепозитории ICMR-RMRC Portblair | Хранится в биорепозитории ICMR-RMRC в Порт-Блэре | Оптимальная температура роста 30 °°; C | |
| Хлорид магния M8266 | Сигма | М8266 | |
| Метанол | Сигма | 17995-7 | |
| Фосфатно-солевой буфер | Сигма | P4417 | |
| Инструмент для разделения пластин | Чудо-ведьма | ||
| Ротор | Теплонаучные | FIBERLite F15 8x50 cy | |
| Додецилсульфат натрия (SDS) | Сигма | Л-4396 | |
| ТЕМЕД | Сигма | Т-9281 | |
| Тритон Х-100 | Сигма-Олдрич | Т8787 | |
| База Тризма (ТРИС) | Сигма | Т6066 |
Ссылки
- Yue, B. Biology of the extracellular matrix. J Glaucoma. 23 (8 Suppl 1), S20-S23 (2014).
- Cabral-Pacheco, G. A., et al. The roles of matrix metalloproteinases and their inhibitors in human diseases. Int J Mol Sci. 21 (24), 1-53 (2020).
- Ambili, M., Jayasree, K....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
