Методическая статья

CRISPR-Cas9 опосредует делецию генов в плюрипотентных стволовых клетках человека, культивируемых в условиях отсутствия фидеров

1.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67296

⸱

1 ноября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine and Health Sciences, United Arab Emirates University, 2Columbia Stem Cell Initiative, Stem Cell Core, Columbia University Irving Medical Center, 3Department of Anatomy, College of Medicine and Health Sciences, United Arab Emirates University, 4Zayed Center for Health Sciences, United Arab Emirates University, 5ASPIRE Precision Medicine Research Institute Abu Dhabi (PMRI-AD), United Arab Emirates University

В этой статье

Краткое содержание

Представленный метод описывает генерацию CRISPR-опосредованного нокаута гена в линии H9 эмбриональных стволовых клеток человека (hESC), которая стабильно экспрессирует sgРНК, нацеленные на ген L2HGDH, с помощью высокоэффективной лентивирально-опосредованной системы доставки генов.

Аннотация

Система редактирования генома CRISPR-Cas9 произвела революцию в исследованиях функций генов в клетках млекопитающих, включая стволовые клетки. Тем не менее, практическое применение этого метода, особенно в плюрипотентных стволовых клетках, сопряжено с определенными проблемами, такими как трудоемкость и времяпреемственность, а также низкая эффективность редактирования. В данной работе мы описываем генерацию CRISPR-опосредованного нокаута гена в линии эмбриональных стволовых клеток человека (hESC), стабильно экспрессирующих sgРНК для гена L2HGDH, с использованием высокоэффективной и стабильной лентивирально-опосредованной системы доставки генов. ГРНК, нацеленные на экзон 1 гена L2HGDH, были химически синтезированы и клонированы в вектор lentiCRISPR v2-puro, который сочетает конститутивную экспрессию sgРНК с Cas9 в высокоэффективной одновекторной системе для достижения более высоких титров лентивирусов для инфекции hESC и стабильной селекции с использованием пуромицина. Клетки, отобранные пуромицином, были дополнительно расширены, а одноклеточные клоны были получены с использованием метода ограниченного разведения. Одиночные клоны были расширены, и было получено несколько гомозиготных нокаутных клонов гена L2HGDH, что подтверждено 100% снижением экспрессии L2HGDH с помощью вестерн-блоттинга. Кроме того, с помощью MSBSP-ПЦР сайт мутации CRISPR был картирован перед последовательностью узнавания PAM Cas9 в выбранных гомозиготных клонах. Для анализа точных вставок/делеций было проведено секвенирование по Сэнгеру, а также проведена функциональная характеристика клонов. Этот метод дал значительно более высокий процент гомозиготных делеций по сравнению с ранее известными невирусными методами доставки генов. Несмотря на то, что в этом отчете основное внимание уделяется гену L2HGDH, этот надежный и экономически эффективный подход может быть использован для создания гомозиготных нокаутов для других генов в плюрипотентных стволовых клетках для исследований функции генов.

Введение

Человеческие эмбриональные стволовые клетки (hESCs) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) являются стволовыми клетками, обладающими потенциалом к дифференцировке во все типы клеток организма. Эти клетки служат ценными инструментами для изучения развития человека, а также для понимания основных механизмов различных заболеваний, тем самым открывая огромные перспективы для регенеративной медицины, моделирования болезней и открытия лекарств. Такие исследования включают изучение того, как конкретные гены способствуют развитию, функционированию и регуляции организмов 1,2.

Для расшифровки функции генов используются различные методы и подходы, включая генетические манипуляции, такие как нокаут или сверхэкспрессия генов, а также редактирование генома. Среди них технология CRISPR-Cas9 оказалась наиболее эффективным подходом к исследованиям нокаута генов и редактирования генов 1,2,3. Система CRISPR-Cas9 работает с использованием одной молекулы направляющей РНК (sgRNA), специально разработанной для идентификации и связывания с определенной последовательностью ДНК, представляющей интерес. Действуя как молекулярный проводник, sgRNA направляет фермент Cas9 к точному месту в геноме, которое требует модификации. После связывания Cas9 инициирует двухцепочечный разрыв в ДНК в указанном месте. После расщепления ДНК активируются внутренние механизмы восстановления клетки. К ним относятся два основных пути репарации: негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологически направленное репарирование (HDR). NHEJ часто приводит к вставке или делеции (инделам) в месте разрыва, что приводит к нарушению или инактивации генов. С другой стороны, HDR позволяет вставлять новые последовательности ДНК в место разрыва, способствуя внедрению целевых генетических изменений4.

Учитывая важность делеций генов в плюрипотентных стволовых клетках, было опубликовано несколько протоколов по CRISPR-Cas9-опосредованным нокаутам генов в hESCs/iPSCs. Тем не менее, многие из этих протоколов сталкиваются со значительными ограничениями, такими как чрезвычайно трудоемкие и неэффективные протоколы из-за использования невирусныхметодов доставки генов. Эти проблемы еще более выражены у hESCs/iPSCs, поскольку известно, что эти клетки имеют более низкую эффективность редактирования по сравнению с другими типами клеток5. Некоторые из этих ограничений могут быть устранены путем повышения эффективности доставки плазмид, содержащих Cas9 и sgРНК. Это может быть успешно достигнуто с помощью лентивирусной векторной системы, которая может значительно улучшить результаты редактирования генов. Протоколы упаковки лентивирусов хорошо зарекомендовали себя и просты, что позволяет легко применять их в лабораториях даже исследователям с ограниченным опытом. Лентивирусы демонстрируют высокую инфекционную эффективность в различных типах клеток, включая hESCs и iPSCs. Таким образом, использование лентивирусной системы для экспрессии Cas9-sgРНК идеально подходит для рутинных экспериментов по редактированию генов в hESCs/iPSCs для изучения функции генов.

Здесь мы предлагаем простой и понятный метод высокоэффективного делеции генов на основе CRISPR-Cas9 в hESCs за сравнительно более короткий промежуток времени, чем при использовании обычных протоколов (рис. 1). Несмотря на то, что был использован лентивирусный вектор с конститутивной экспрессией Cas9 и sgRNA, его можно легко заменить на индуцируемую лекарственными препаратами экспрессию Cas9 для контролируемой экспрессии Cas9.

Протокол

Подробная информация о последовательностях генов, реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Проектирование одной направляющей РНК (sgRNA), клонирование и производство лентивирусного вектора

Примечание: Используются две различные последовательности sgРНК, нацеленные на экзон 1 гена L2HGDH , обе адаптированные от Qiu et al.6с сайтами PAM AGG и TGG для последовательностей 1 и 2 соответственно. Обе гРНК имели длину 20.н., и концы были модифицированы для добавления линкерных последовательностей для фермента рестрикции Bsmb1, который должен быть клонирован в векторе-мишени (LentiCRISPRv2), как описано в предыдущем отчете6. Линкерные последовательности были добавлены в ходе проектирования sgРНК для целей клонирования.

  1. Отжиг химически синтезировал sgРНК6 и клонировал в односрезной лентивирусный вектор Bsmb1, LentiCRISPRv2, используя оптимизированный протокол,как сообщалось ранее 7.
  2. Приступайте к упаковке и концентрированию лентивируса с использованием стандартизированного и оптимизированного протокола7.
  3. Для получения лентивируса семена HEK293T клетки (1 × 105 клеток/см2) с использованием DMEM, 10% FBS и 1x пенициллин/стрептомицин (P/S) и инкубируют в течение ночи в инкубаторе для тканевых культур при 37 °C в атмосфере 5%CO2 во влажных условиях.
  4. При слиянии на 90% со-трансфектируйте HEK293T клетки с входным вектором (пустой остов или плазмидами, экспрессирующими sgРНК) и упаковывайте плазмиды с использованием недорогого катионного полимера PEI, как описано ранее7.
  5. Соберите кондиционированную среду, содержащую частицы лентивирусной надосадочной жидкости (ЛЖ), через 48 ч и 72 ч после трансфекции и проведите ультрацентрифугирование с использованием сахарозной подушки и вращайте пробирки при давлении 1,25,000 х г в течение 2 ч при 4°С.
  6. Продолжайте использовать концентрацию частиц LVS по крайней мере в 200 раз выше исходного объема в PBS, аликвоте, и хранить при температуре -80 °C до использования.
  7. Определите титр лентивирусных частиц с помощью набора для титров лентивирусов для количественной ПЦР, следуя инструкциям производителя (см. Таблицу материалов).

2. Лентивирусные инфекции и одноклеточное клональное размножение

  1. При инфекциях, вызванных частицами ЛЖ, суспензию клеток hESC (H9) семян с 1 ×10 5 клеток/0,5 мл питательных сред hESC (базальная среда + P/S + 10 мкМ ингибитора породы) на полном Матригеле (1:50) покрывают луночные планшеты P24 в 500 мкл среды и инкубируют в течение ночи, чтобы дать возможность клеткам прикрепиться. Засейте дополнительные лунки, которые не будут заражены LVS, но обработаны пуромицином, чтобы они служили неинфицированным контролем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчет клеток может быть выполнен с помощью ручного гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
  2. На следующий день инфицируйте клетки при кратности инфекции (MOI) 10 вместе с 8 мкг/мл полибрена и инкубируйте при 37 °C в течение 8 ч с последующей заменой среды на свежую среду hESC + P/S без ингибитора горных пород и продолжайте культивирование до тех пор, пока клетки не станут слитыми на 90%.
  3. Начните отбор пуромицина, добавив в среду 0,8 мкг/мл пуромицина, когда клетки достигнут 90% конфлюенции, что обычно происходит через 48-72 ч после заражения, и продолжайте отбор до тех пор, пока все клетки не погибнут в неинфицированных клетках (контрольная группа).
  4. После завершения отбора (обычно 4-6 дней) разделяют стабильные клетки (1:4) и расширяют для криоконсервации и дальнейшего анализа.
  5. Выполнение селекции одиночных клеток и клональной экспансии с использованием клеток, экспрессирующих L2HGDH-sgRNA-16.
  6. Для этой цели готовят клеточную суспензию, эквивалентную 500 клеток/10 мл полной питательной среды, и засевают 100 мкл этой суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета.
  7. Оставьте клетки в покое на 3 дня, а затем наблюдайте.
  8. Отметьте лунки, в которых получаются одиночные клоны, и меняйте среду через день до тех пор, пока не будет достигнут достаточный размер для дальнейшего расширения колоний (обычно 2 недели) для дальнейшего расширения, криоконсервации и анализа.

3. Экстракция гДНК, ПЦР MS-BSP и секвенирование по Сэнгеру

  1. Выделите гДНК из клеток с помощью набора для выделения геномной ДНК в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
  2. Продолжите картирование сайтов мутаций перед последовательностями узнавания PAM с использованием анализа специфических праймеров на основе сайтов мутаций (MS-BSP)8.
  3. Для этого предназначен несмещенный правый праймер L2H-UMSBSP-R1, который амплифицирует область за пределами экзона1 для усиления любых мишеней.
  4. Разработать смещенный левый праймер L2H-BMSBSP-F1 с идентичной последовательности sgРНК для амплификации последовательности-мишени, близкой к последовательностям узнавания PAM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При очень высоких строгих условиях ПЦР продукт будет наблюдаться на геле в немутировавших клонах. В клонах с нокаутом CRISPR не будет наблюдаться никакого продукта, демонстрирующего мутации, близкие к предшествующим последовательностям узнавания PAM.
  5. Чтобы картировать мутации одной пары оснований, ПЦР амплифицируют последовательность 468.о., охватывающую весь экзон 1 L2HGDH и подвергающуюся секвенированию по Сэнгеру с последующим анализом множественного выравнивания последовательностей с использованием clustalw8.

4. Анализ hESC-дифференцировки и образования эмбриоидных тел (БЭ)

  1. Продолжайте направленную дифференцировку контрольных и различных клонов CRISPR hESCs (H9) в направлении нейроэктодермы в соответствии с установленными протоколами, как описано ранее, с использованием метода двойного ингибирования smad 9,10,11.
  2. При 90% конфлюенции обрабатывайте клетки LDN193189 (200 нМ) и SB431542 (10 мкМ) в течение первых 24 ч в 100% среде KSR с последующим добавлением XAV939 (2 мкМ) в течение дополнительных 2 дней.
  3. Через 3 дня уменьшите процентное содержание сред KSR (Knockout DMEM с добавлением 15% (v/v) KSR, 1% (v/v) L-глутамина, 1% (v/v) P/S, 1% (v/v) 10 mM MEM и 0,1% (v/v) 2-меркаптоэтанола (75%, 50%, 25%) в сочетании с N2 средами (DMEM/F12 с добавлением 1x N2 добавки, 1x P/S, ) до 100% носителей N2 в течение 8 дней.
  4. В начале 12-го дня зафиксируйте клетки для иммуноокрашивания, используя PAX6 в качестве маркера нейроэктодермы.
  5. Для исследований определения мезодермы и эндодермальной судьбы используйте подход, основанный на малых молекулах CHIR99021, описанный в предыдущих публикациях12,13.
  6. Для этого, когда клетки достигают 70% конфлюенции, обрабатывают 3 мкМ CHIR99021 в среде Definitive Endoderm (DE) в течение 24 ч с последующей фиксацией для иммуноокрашивания с использованием Brachuary в качестве мезодерм-специфичного маркера.
  7. Для эндодермальной стадии культивируют клетки в течение дополнительных 24 ч только в среде ДЭ без добавления CHIR99021 перед фиксацией для иммуноокрашивания с помощью FOXA2.
  8. Для анализа образования БЭ посев клеток на клеточных поверхностях с низким прикреплением без использования Матригеля для культивирования клеток в условиях суспензии в течение 24 ч перед получением микрофотографий.

5. Вестерн-блоттинг

  1. Дважды промойте клетки с помощью PBS и лизиса с использованием 1x буфера RIPA, содержащего 1% SDS и 1x коктейля из протеазы и ингибитора фосфатазы.
  2. Очистите лизаты центрифугированием при 16 000 x g в течение 10 минут при 4 °C с последующим сбором надосадочной жидкости.
  3. Количественное определение общего клеточного белка с помощью набора для анализа белка BCA в соответствии с инструкциями производителя. Отрегулируйте образцы до 2 мкг/мкл с помощью буфера для образцов с загрузкой 4× красителя.
  4. Денатурируйте образцы белка при 70 °C в течение 10 мин, загрузите равное количество каждого образца и растворите с помощью гелей SDS-PAGE7 с градиентом 4%-12% с последующим переносом на мембрану PVDF при постоянном напряжении 100 В в течение 1 ч при 4 °C.
  5. Заблокируйте мембраны с помощью 5% обезжиренного молока и инкубируйте в первичных разведениях антител при 4 °C в течение ночи с вращением.
  6. Затем промывайте мембраны 5 раз с помощью PBST буфера и инкубируйте в HRP-конъюгированных соответствующих вторичных антителах в течение 1 ч при комнатной температуре.
  7. Мембраны снова промойте PBST 5x, инкубируйте с хемилюминесцентным субстратом и проявите с помощью рентгеновских пленок.

6. Иммуноокрашивание

  1. Засейте клетки на луночных планшетах P4 и инкубируйте не менее 24 ч перед фиксацией, чтобы обеспечить правильное прикрепление клеток к поверхностям.
  2. Промойте клетки 3 раза PBS, чтобы удалить все омертвевшие клетки, а также компоненты среды, с последующей фиксацией с помощью 4% PFA в течение 15 минут при комнатной температуре.
  3. Пермеабилизируйте клетки с помощью 0,3% тритона X-100 с последующим блокированием для неспецифического связывания с использованием 2% BSA в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
  4. Инкубируют образцы с первичными антителами (OCT4, NANOG, SOX2, KI67, PAX6, Brachuary, FOXA2), разведенными в 1% BSA, в течение ночи при 4 °C.
  5. Промойте клетки 3 раза PBS и инкубируйте с соответствующими вторичными антителами (Козий против мыши 488, Козий против кролика 488, Козий против мыши 546, Козий против кролика 546), разведенными в 1% БСА в течение 1 ч при комнатной температуре.
  6. Наконец, промойте образцы PBS 3x и закрасьте их DAPI и получите изображение с помощью флуоресцентного микроскопа.

Результаты

Клонирование sgРНК L2HGDH в lentiCRISPRv2 puro
Вектор lentiCRISPRv2 puro был коммерчески получен (см. Таблицу материалов) и расщеплен с BsmB1, в результате чего был выделен фрагмент наполнителя размером 1,8 Кб. Как показано на рисунке 2А, наблюдалось полное переваривание вектора. Для каждой конструкции шесть клонов были проверены на наличие или отсутствие вставки с использованием обратной последовательности sgRNA в качестве праймера и прямого праймера (U6-459F) из векторной последовательности. При использовании этого подхода только те клоны, у которых была вставка, давали продукт ПЦР в размере 288.н., а отрицательные клоны, которые не содержали обратной последовательности sgRNA, не давали продукта ПЦР, как показано на рисунке 2B.

H9-инфекции, стабильные выделения и вестерн-блоттинг
ЭСК были инфицированы лентивирусными частицами, экспрессирующими две разные sgРНК, нацеленными на экзон 1 гена L2HGDH и отобранными с помощью пуромицина. Вестерн-блоттинг был проведен из гетерогенных популяций стабильно коэкспрессирующих sgRNA и клеток Cas9, чтобы установить, какая из двух используемых sgRNA была более эффективной в индуцировании делеции генов. Как показано на рисунке 3A, L2HGDH-sgRNA-1 была более эффективной, чем другая последовательность, в снижении экспрессии L2HGDH в гетерогенных клеточных популяциях.

Клональный отбор, экспансия и анализ белков
Отбор одиночных клеток и клональная экспансия были проведены для клеток, экспрессирующих L2HGDH-sgRNA-1. Лунки, в которых появлялись отдельные клоны, маркировались и выращивались до тех пор, пока не достигался достаточный размер колоний (обычно 2 недели) для дальнейшего расширения, криоконсервации и анализа (рис. 3B). В общей сложности 22 клона были проанализированы с помощью вестерн-блоттинга, который дал пять гомозиготных нокаутов (23%) для L2HGDH. Этот результат демонстрирует высокую эффективность нокаута генов с использованием лентивирально-опосредованной доставки генов для стабильной коэкспрессии как sgRNA, так и Cas9 из одной кассеты. На рисунке 4 показан вестерн-блоттинг пяти гомозиготных нокаутных клонов вместе с контрольными клетками, показывающий 100% сниженную экспрессию по сравнению с контролем в выбранных клонах.

Анализ на уровне ДНК
Для того, чтобы картировать сайт мутации CRISPR перед последовательностью распознавания PAM Cas9, была проведена полимеразная цепная реакция на основе сайтов мутаций на основе специфических праймеров (MS-BSP PCR) с использованием геномной ДНК контрольных клеток и пяти различных клонов. Как показано на рисунке 5, два клона (A5 и B4) имеют мутации, непосредственно близкие к последовательности распознавания PAM, в то время как три других клона (A1, A9 и B12) показали, что мутация может быть не очень близко к сайту PAM и находится дальше вверх по течению от последовательности sgRNA 20.о. в экзоне 1 гена L2HGDH .

Чтобы найти точные мутации в ДНК, очищенные продукты ПЦР из контрольных клеток (инфицированных только вектором H9), а также трех различных клонов CRISPR, A5, A1 и B4, были подвергнуты секвенированию по Сэнгеру, а сайты мутаций были картированы с помощью инструмента множественного выравнивания clustalw перед сайтом PAM8. Результаты выявили делеционную мутацию в клоне А5 выше сайта PAM. Два других клона, A1 и B4, показали инсерционную мутацию выше по течению от сайта PAM, как показано на рисунке 6.

Функциональный анализ клонов
После создания нокаутных клеточных линий CRISPR в hESCs следующим шагом является подтверждение их плюрипотентности и дифференцировочного потенциала. С этой целью мы протестировали различные маркеры плюрипотентности для трех разных клонов: А1, А5 и В4, и сравнили результаты с контрольными клетками (инфицированными только вектором H9). Результаты показали отсутствие изменений в плюрипотентном потенциале нокаутных клеточных линий, определенных с помощью иммуноокрашивания на маркеры OCT4, NANOG и SOX2. Затем контрольные и нокаутные клеточные линии также окрашивали на маркер пролиферации клеток, KI67, который также не показал изменений в нокаутных клеточных линиях по сравнению с контролем. Эти результаты показывают, что нокаут CRISPR не повлиял на свойства самообновления этих клеток. Кроме того, БЭ и образование колоний также не были затронуты (Рисунок 7). С помощью методик in vitro , разработанных в нашей лаборатории, все клоны были успешно дифференцированы в три клетки зародышевого слоя, что подтверждено иммуноокрашиванием на PAX6 (нейроэктодермальный маркер), Brachyury (мезодермальный маркер) и FOXA2 (энтодермальный маркер). Не наблюдалось изменений в потенциале дифференцировки нокаутных клеточных линий по сравнению с контрольными клетками, что показало, что нокаутные клетки сохраняют свой потенциал дифференцировки (рис. 8).

figure-results-1
Рисунок 1: Принципиальная схема, показывающая план исследования в 5 этапов. Шаг 1: Проектирование и клонирование sgРНК в вектор V2 CRISPR, расщепленный Bsmb1. Шаг 2: Генерация лентивирусных частиц с использованием входного вектора, несущего sgРНК, вместе с упаковкой плазмид путем котрансфекции HEK293T клеток с использованием полифекций и концентрации вируса с помощью ультрацентрифугирования. Шаг 3: Инфицирование hESCs с помощью лентивирусных частиц при MOI 10-20 и стабильная клеточная селекция с использованием пуромицина с последующим анализом гетерогенных клеточных популяций для оценки эффективности sgРНК. Шаг 4: Клонирование одиночных клеток методом предельного разведения из клеток, которые показали максимальный нокдаун в гетерогенных популяциях, и отбор одиночных клонов. Шаг 5: Экспансия одиночных клонов и анализ на уровне ДНК, белка и функционального анализа клонов на предмет стволовости и потенциала дифференцировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Клонирование sgРНК в векторе lentiCRISPR V2.puro. (A) Расщепление вектора lentiCRISPR V2.puro с ферментом рестрикции BsmB1. Стрелкой указан фрагмент наполнителя размером 1,8 Кб, высвобождающийся при расщеплении вектора. (B) ПЦР-анализ колоний для различных клонов конструкций 1 и 2 sgRNA L2HGDH. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Вестерн-блоттинг и клональное размножение с использованием одноклеточного отбора. (A) Вестерн-блоттинг двух различных биологических репликатов (S1 и S2) гетерогенных популяций стабильно коэкспрессирующих sgRNA (L2H-1 и L2H-2) и Cas9 вместе с контрольными (C) H9 hESCs. (B) Отбор одиночных клеток и клональная экспансия клеток H9, стабильно экспрессирующих L2HGDH-sgRNA-1. Стрелками обозначены лунки из 96 луночных пластин, показывающие только одиночные клоны. Масштабная линейка = 100 μM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Вестерн-блоттинг из разных клонов H9. (A-C) Вестерн-блоттинг из общих клеточных лизатов 22 клонов дал пять гомозиготных нокаутов (23%) для L2HGDH. (D) Подтверждение нокаутов L2HGDH из другого эксперимента по биологической репликации с использованием вестерн-блоттинга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: ПЦР-анализ различных клонов H9 методом MSBSP. (A) Анализ последовательности экзона L2HGDH 1, используемого для ПЦР-анализа MSBSP. (B) Оптимизация температуры отжига для ПЦР-анализа MSBSP с использованием контроля и H9 V2 L2HGDH KO Clone B4. На 96,8 элемент управления показывает полосу, а B4 не показывает полосу, как показано стрелками. (C) Анализ всех гомозиготных клонов KO привел к приведенному ниже картированию сайта мутации в экзоне 1. A1 = In/Del не находится рядом с сайтом PAM; A5 = В/Дель Близко к сайту PAM; A9 = В/Дель Довольно близко к сайту PAM; B4 = In/Del Очень близко к сайту PAM B12 = In/Del не близко к сайту PAM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Согласование секвенированных ПЦР-продуктов по Сэнгеру с эталонной последовательностью L2HGDH экзона 1. Многократное выравнивание секвенированных по Сэнгеру продуктов ПЦР из A1, A5 и B4, а также контрольных клеток проводили вместе с референсной последовательностью в пределах первого экзона L2HGDH из базы данных NCBI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-7
Рисунок 7: Функциональная характеристика нокаутных клеточных линий CRISPR. (A) Клетки подвергались иммуноокрашиванию по маркерам плюрипотентности (OCT4, NANOG, SOX2), самообновлению (KI67), БЭ и образованию колоний по отношению к контрольным инфицированным H9 hESCs. Масштабные линейки: 100 мкМ. (B) Процент положительно (+ve) экспрессирующих клеток рассчитывали относительно окрашивания DAPI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-8
Рисунок 8: Потенциал дифференцировки нокаутных клеточных линий CRISPR. Функциональная характеристика нокаутных клеточных линий CRISPR с точки зрения их дифференцировочного потенциала с использованием маркеров PAX6 (нейроэктодерма), Brachyury (мезодерма) и FOXA2 (энтодерма) по отношению к контрольным инфицированным клеткам H9. Масштабные линейки: 100 μM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Шаг протоколаНеобходимое время
Клонирование sgРНК в LentiCRISPRv24 дня
Производство лентивирусов и определение титра5 дней
Инфекции hESC, отбор стабильных клеток и экспансия2 недели
Селекция и экспансия клональных клеток2 недели
Функциональный анализ клонов2 недели

Таблица 1: График выполнения протокольных шагов и предполагаемое необходимое время.

Обсуждение

В этом исследовании был стандартизирован метод, который позволяет проводить высокоэффективные и экономичные делеции генов в ЭСК с помощью технологии CRISPR-Cas9. С помощью этого метода была успешно достигнута гомозиготная делеция гена L2HGDH в ЭСК в течение 3-4 недель, начиная с инфицирования hESC и заканчивая клональным отбором и размножением одиночных клеток (табл. 1). Хотя манипуляции с генами, опосредованные CRISPR-Cas9, могут быть достигнуты путем транзиторной трансфекции в большинстве клеток, это становится сложной задачей в стволовых клетках из-за низкой эффективности трансфекции и высокой клеточной токсичности. Различные исследования показали, что до 10% восстановленных клонов демонстрируют делеции. Например, Mali et al. сообщили об эффективности редактирования генома от 2% до 4% в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека после нацеливания на локус AAVS13. В другом исследовании сообщалось об эффективности редактирования на уровне 1,3%-8,4% у наивных hESCs для нацеливания на TUNA, длинную некодирующую РНК, участвующую в плюрипотентности и нейронной дифференцировке. Сообщалось о повышении эффективности до 10% после нацеливания на ген CFTR в плюрипотентных стволовых клетках человека Ocana et al.15Таким образом, для достижения эффективного редактирования генов требуется эффективный метод доставки Cas9-гРНК, и это особенно верно для стволовых клеток, поскольку эти клетки демонстрируют повышенный уровень чувствительности и устойчивости к переходным методам доставки по сравнению с типичными соматическими клетками и иммортализированными клеточными линиями.

В настоящем исследовании сообщается об высокоэффективном способе получения гомозиготных нокаутных клеточных линий CRISPR с использованием лентивирус-опосредованной доставки sgРНК в hESCs. Использование лентивирусных векторов для доставки CRISPR-Cas9 в hESCs оказалось гораздо более эффективным и менее трудоемким для достижения делеции генов, чем использование трансфекций невирусных векторов химическими или механическими способами (данные не показаны). Это привело к значительно более высокой эффективности редактирования генома (~23%) после клонального отбора и размножения отдельных клонов. Таким образом, сочетая лентивирусную опосредованную доставку sgРНК и Cas9 в hESCs, а также экономически эффективный подход к производству лентивируса, настоящий метод является не только высокоэффективным и менее трудоемким, но и экономически эффективным.

Вот некоторые из рекомендаций для успешного подхода: (1) Использование одной лентивирусной векторной системы, экспрессирующей как Cas9, так и sgРНК. (2) Наличие маркера выбора антибиотика, такого как пуромицин, на той же плазмиде, которая экспрессирует Cas9 и sgRNA, гарантирует, что почти 100% клеток являются положительными на экспрессию Cas9-sgRNA. Это значительно повышает вероятность успешных событий редактирования генов. (3) Для того, чтобы быть полезным при инфекциях в hESCs, необходимо концентрировать лентивирусные векторы с получением высоких титров вирусов. Среди различных используемых методик наиболее экономичным является использование больших объемов НЖ и их концентрация в 100-500 раз от исходного объема для достижения титров в диапазоне от 107 до 108 МЕ/мл. (4) Для экономически эффективного и действенного способа трансфекции клеток HEK293T плазмидами, использование PEI (полиэтиленимина) для трансфекции лентивирусного вектора для упаковки вируса является столь же эффективным и, следовательно, экономически выгодным по сравнению с обычно используемым реагентом для трансфекции липофектамином7. (5) Средние титры лентивирусов должны находиться в диапазоне от 5 ×10 до 7 МЕ/мл. (6) Клональное размножение путем отбора одиночных клеток требуется для достижения гомозиготных делеций интересующего гена в этих клетках. (7) Хотя предыдущие исследования показали, что опосредованное CRISPR-Cas9 редактирование генов в плюрипотентных стволовых клетках человека приводит к очень небольшому количеству нецелевых мутаций, все же целесообразно проверять наличие нецелевых сайтов. Это может быть достигнуто с помощью эффективных инструментов конструирования гРНК для минимизации побочных эффектов и полногеномного секвенирования отредактированных клеточных линий18, особенно для экспериментов клинического значения. (8) Наконец, нормальный кариотип выбранных клонов должен быть проверен с использованием таких методов, как G-полосы и анализ с высоким разрешением, чтобы гарантировать отсутствие крупномасштабных геномных изменений. Анализ микроядер также может быть выполнен для оценки частоты образования микроядер, что может указывать на нестабильность генома.

Одним из основных ограничений этого метода является использование лентивирусной векторной системы, что привело к стабильной геномной интеграции Cas9 и sgРНК, что привело к их конститутивной экспрессии после редактирования, что нежелательно. В будущем этот метод может быть усовершенствован путем замены конститутивных промоторов на лекарственно-индуцируемый промотор, управляющий экспрессией гена Cas9, такой как система Tet-on с лечением доксициклином для контролируемой экспрессии Cas9.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана исследовательскими грантами от Университета Объединенных Арабских Эмиратов (UAEU) - грант #12M105, грант #12R167 (Центр медицинских наук Зайеда), 21R105 (Благотворительный и гуманитарный фонд Заида бин Султана (ZCHF)) и ASPIRE, компонент управления технологическими программами Совета по передовым технологиям Абу-Даби (ATRC), через грант Исследовательского института точной медицины ASPIRE Абу-Даби (ASPIREPMRIAD) номер гранта VRI-20-10.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-МЕРКАПТОЭТАНОЛ Invitrogen31350010
38,5 мл, стерильный + сертифицированный бесплатный открытый верх
тонкостенные ультрапрозрачные пробирки		Beckman Coulterc14292
AccutaseStem Cell technologies7920
bFGF Рекомбинантный человеческийинвитрогенPHG0261
Brachyury Rabbit mAbAbclonalA5078
BsmBI-v2NEBR0739S
chir99021Tocris4423/10
Матрица базальной мембраны Corning Matrigel, технологииCorning354234
циклопаминовыхстволовых клеток72074
DMEM mediaInvitrogen11995073
DMEM ПИТАТЕЛЬНАЯ СМЕСЬ F12 Инвитроген11320033
DPBS без: Ca и MgPAN BiotechP04-36500
Фетальная сывороткаInvitrogen10270106
FoxA2/HNF3β  CST8186
GAPDH (14C10) Антитело к mAbCST2118S
Реагент для диссоциации клеток Технологиистволовых клеток7174
HyClone Незаменимые аминокислоты (NEAA) 100x SolutionGE healthcareSH30238.01
Ki-67 (D3B5) Rabbit mAbCST9129
Заменасыворотки KnockOutИнвитроген10828028
л ГЛУТАМИН, 100xИнвитроген2924190090
L2H-BMSBSP-F1макрогенCGTGCGGGTTCGCGTGGG
L2HGDH Поликлональное антителоProteintech15707-1-AP
L2HGDH-SgRNA1-FмакрогенCACCGCGTGCGG
GTTCGCGTCTGGG
L2HGDH-SgRNA1-RмакрогенAAACCCCAGACGC
GAACCCGCACGC
L2HGDH-SgRNA2-FмакрогенCACCGCCCGC
GCTTTTCGCCGG
L2HGDH-SgRNA2-RмакрогенAAACCCGGCGAA
AAGCCCGCGGC
L2H-SeqF1макрогенGCTAAAGAGCGC
GGGTCCTCGG
L2H-SeqR1макрогенGTGGACGGGTTG
TTCAAAGCCAGAG
L2H-UMSBSP-R1макрогенGTGGACGGGTTG
TTCAAAGCCAGAG
LentiCRISPRv2Addgene52961
mTesR1 полная средаТехнологии стволовых клеток85850
Наног антителоCST3580
НЕЙРОБАЗАЛЬНАЯ СРЕДА 1x CTSInvitrogenA1371201
Neuropan 2 Добавка 100xPAN BiotechP07-11050
Neuropan 27 Добавка 50xPAN BiotechP07-07200
Oct-4 АнтителоCST2750
Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAbCST60433
ПЕНИЦИЛЛИН СТРЕПТОМИЦИН СОЛInvitrogen15140122
pMD2.GAddgene12259
Полибреновый реагент инфекцииSigmaTR1003-G Полиэтиленимин
, разветвленныйSigma408727
psPAX2.0Addgene12260
PuromycinInvitrogenA1113802
qPCR Lentivirus Titer KitAbmLV900
Rock inhibitor Y-27632
дигидрохлорид 		Tocris1254
SB 431542Tocris1614/10
Sox2 АнтителоCST2748
СахарозаSigma57-50-1
ТРИПСИН .05% ЭДТА Invitrogen25300062
U6-459FMacrogenGAGGGCCTATT
TCCCATGATTC
Wizard Набор для очистки геномной ДНК PromegaA1120
XAV 939Tocris3748/10
без LDEV кролика

Ссылки

  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  2. Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 structures and mechanisms. Annu Rev Biophys. 46 (1), 505-529 (2017).
  3. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  4. Xue, C., Greene, E. C. DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editing. Trends Genet. 37 (7), 639-656 (2021).
  5. Zhang, Z., et al. CRISPR/Cas9 genome-editing system in human stem cells: Current status and future prospects. Mol Ther Nucleic Acids. 9, 230-241 (2017).
  6. Qiu, Z., et al. MYC regulation of D2HGDH and L2HGDH influences the epigenome and epitranscriptome. Cell Chem Biol. 27 (5), 538-550.e537 (2020).
  7. Sheikh, M. A., Ansari, S. A. Lentiviral mediated delivery of shRNAs to hESCs and NPCs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (PEI). J Vis Exp. (183), e63953(2022).
  8. Guo, J., et al. A simple and cost-effective method for screening of CRISPR/Cas9-induced homozygous/biallelic mutants. Plant Methods. 14 (1), 40(2018).
  9. Ardah, M. T., Parween, S., Varghese, D. S., Emerald, B. S., Ansari, S. A. Saturated fatty acid alters embryonic cortical neurogenesis through modulation of gene expression in neural stem cells. J Nutr Biochem. 62, 230-246 (2018).
  10. Parween, S., et al. Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation. Front Cell Neurosci. 11, 415(2017).
  11. Parween, S., et al. Nutrient-sensitive protein O-GlcNAcylation modulates the transcriptome through epigenetic mechanisms during embryonic neurogenesis. Life Sci Alliance. 5 (8), e202201385(2022).
  12. Varghese, D. S., et al. Developmental modeling of hepatogenesis using obese iPSCs-hepatocyte differentiation uncovers pathological features. Cell Death Dis. 13 (7), 670(2022).
  13. Varghese, D. S., Alawathugoda, T. T., Ansari, S. A. Fine-tuning of hepatocyte differentiation from human embryonic stem cells: Growth factor. Stem Cells Int. 2019 (5), 5968236(2019).
  14. Jacobs, E. Z., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in naïve human embryonic stem cells. Sci Rep. 7 (1), 16650(2017).
  15. Cuevas-Ocaña, S., et al. A cell-based optimized approach for rapid and efficient gene editing of human pluripotent stem cells. Int J Mol Sci. 24 (3), 12345(2023).
  16. Veres, A., et al. Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN-targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing. Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).
  17. Smith, C., Gore, A., Yan, W., Abalde-Atristain, L., Li, Z., He, C. Whole-genome sequencing analysis reveals high specificity of CRISPR/Cas9 and TALEN-based genome editing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 15 (1), 12-13 (2014).
  18. Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Mol Ther Nucleic Acids. 4 (7), e264(2015).

Перепечатки и разрешения

Теги

CRISPR Cas9
CRISPR-Cas9 опосредует делецию генов в плюрипотентных стволовых клетках человека, культивируемых в условиях отсутствия фидеров
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.