Представленный метод описывает генерацию CRISPR-опосредованного нокаута гена в линии H9 эмбриональных стволовых клеток человека (hESC), которая стабильно экспрессирует sgРНК, нацеленные на ген L2HGDH, с помощью высокоэффективной лентивирально-опосредованной системы доставки генов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
CRISPR-Cas9 опосредует делецию генов в плюрипотентных стволовых клетках человека, культивируемых в условиях отсутствия фидеров
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Система редактирования генома CRISPR-Cas9 произвела революцию в исследованиях функций генов в клетках млекопитающих, включая стволовые клетки. Тем не менее, практическое применение этого метода, особенно в плюрипотентных стволовых клетках, сопряжено с определенными проблемами, такими как трудоемкость и времяпреемственность, а также низкая эффективность редактирования. В данной работе мы описываем генерацию CRISPR-опосредованного нокаута гена в линии эмбриональных стволовых клеток человека (hESC), стабильно экспрессирующих sgРНК для гена L2HGDH, с использованием высокоэффективной и стабильной лентивирально-опосредованной системы доставки генов. ГРНК, нацеленные на экзон 1 гена L2HGDH, были химически синтезированы и клонированы в вектор lentiCRISPR v2-puro, который сочетает конститутивную экспрессию sgРНК с Cas9 в высокоэффективной одновекторной системе для достижения более высоких титров лентивирусов для инфекции hESC и стабильной селекции с использованием пуромицина. Клетки, отобранные пуромицином, были дополнительно расширены, а одноклеточные клоны были получены с использованием метода ограниченного разведения. Одиночные клоны были расширены, и было получено несколько гомозиготных нокаутных клонов гена L2HGDH, что подтверждено 100% снижением экспрессии L2HGDH с помощью вестерн-блоттинга. Кроме того, с помощью MSBSP-ПЦР сайт мутации CRISPR был картирован перед последовательностью узнавания PAM Cas9 в выбранных гомозиготных клонах. Для анализа точных вставок/делеций было проведено секвенирование по Сэнгеру, а также проведена функциональная характеристика клонов. Этот метод дал значительно более высокий процент гомозиготных делеций по сравнению с ранее известными невирусными методами доставки генов. Несмотря на то, что в этом отчете основное внимание уделяется гену L2HGDH, этот надежный и экономически эффективный подход может быть использован для создания гомозиготных нокаутов для других генов в плюрипотентных стволовых клетках для исследований функции генов.
Введение
Человеческие эмбриональные стволовые клетки (hESCs) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) являются стволовыми клетками, обладающими потенциалом к дифференцировке во все типы клеток организма. Эти клетки служат ценными инструментами для изучения развития человека, а также для понимания основных механизмов различных заболеваний, тем самым открывая огромные перспективы для регенеративной медицины, моделирования болезней и открытия лекарств. Такие исследования включают изучение того, как конкретные гены способствуют развитию, функционированию и регуляции организмов 1,2.
Для расшифровки функции генов используются различные методы и подходы, включая генетические манипуляции, такие как нокаут или сверхэкспрессия генов, а также редактирование генома. Среди них технология CRISPR-Cas9 оказалась наиболее эффективным подходом к исследованиям нокаута генов и редактирования генов 1,2,3. Система CRISPR-Cas9 работает с использованием одной молекулы направляющей РНК (sgRNA), специально разработанной для идентификации и связывания с определенной последовательностью ДНК, представляющей интерес. Действуя как молекулярный проводник, sgRNA направляет фермент Cas9 к точному месту в геноме, которое требует модификации. После связывания Cas9 инициирует двухцепочечный разрыв в ДНК в указанном месте. После расщепления ДНК активируются внутренние механизмы восстановления клетки. К ним относятся два основных пути репарации: негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологически направленное репарирование (HDR). NHEJ часто приводит к вставке или делеции (инделам) в месте разрыва, что приводит к нарушению или инактивации генов. С другой стороны, HDR позволяет вставлять новые последовательности ДНК в место разрыва, способствуя внедрению целевых генетических изменений4.
Учитывая важность делеций генов в плюрипотентных стволовых клетках, было опубликовано несколько протоколов по CRISPR-Cas9-опосредованным нокаутам генов в hESCs/iPSCs. Тем не менее, многие из этих протоколов сталкиваются со значительными ограничениями, такими как чрезвычайно трудоемкие и неэффективные протоколы из-за использования невирусныхметодов доставки генов. Эти проблемы еще более выражены у hESCs/iPSCs, поскольку известно, что эти клетки имеют более низкую эффективность редактирования по сравнению с другими типами клеток5. Некоторые из этих ограничений могут быть устранены путем повышения эффективности доставки плазмид, содержащих Cas9 и sgРНК. Это может быть успешно достигнуто с помощью лентивирусной векторной системы, которая может значительно улучшить результаты редактирования генов. Протоколы упаковки лентивирусов хорошо зарекомендовали себя и просты, что позволяет легко применять их в лабораториях даже исследователям с ограниченным опытом. Лентивирусы демонстрируют высокую инфекционную эффективность в различных типах клеток, включая hESCs и iPSCs. Таким образом, использование лентивирусной системы для экспрессии Cas9-sgРНК идеально подходит для рутинных экспериментов по редактированию генов в hESCs/iPSCs для изучения функции генов.
Здесь мы предлагаем простой и понятный метод высокоэффективного делеции генов на основе CRISPR-Cas9 в hESCs за сравнительно более короткий промежуток времени, чем при использовании обычных протоколов (рис. 1). Несмотря на то, что был использован лентивирусный вектор с конститутивной экспрессией Cas9 и sgRNA, его можно легко заменить на индуцируемую лекарственными препаратами экспрессию Cas9 для контролируемой экспрессии Cas9.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Подробная информация о последовательностях генов, реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.
1. Проектирование одной направляющей РНК (sgRNA), клонирование и производство лентивирусного вектора
Примечание: Используются две различные последовательности sgРНК, нацеленные на экзон 1 гена L2HGDH , обе адаптированные от Qiu et al.6с сайтами PAM AGG и TGG для последовательностей 1 и 2 соответственно. Обе гРНК имели длину 20.н., и концы были модифицированы для добавления линкерных последовательностей для фермента рестрикции Bsmb1, который должен быть клонирован в векторе-мишени (LentiCRISPRv2), как описано в предыдущем отчете6. Линкерные последовательности были добавлены в ходе проектирования sgРНК для целей клонирования.
- Отжиг химически синтезировал sgРНК6 и клонировал в односрезной лентивирусный вектор Bsmb1, LentiCRISPRv2, используя оптимизированный протокол,как сообщалось ранее 7.
- Приступайте к упаковке и концентрированию лентивируса с использованием стандартизированного и оптимизированного протокола7.
- Для получения лентивируса семена HEK293T клетки (1 × 105 клеток/см2) с использованием DMEM, 10% FBS и 1x пенициллин/стрептомицин (P/S) и инкубируют в течение ночи в инкубаторе для тканевых культур при 37 °C в атмосфере 5%CO2 во влажных условиях.
- При слиянии на 90% со-трансфектируйте HEK293T клетки с входным вектором (пустой остов или плазмидами, экспрессирующими sgРНК) и упаковывайте плазмиды с использованием недорогого катионного полимера PEI, как описано ранее7.
- Соберите кондиционированную среду, содержащую частицы лентивирусной надосадочной жидкости (ЛЖ), через 48 ч и 72 ч после трансфекции и проведите ультрацентрифугирование с использованием сахарозной подушки и вращайте пробирки при давлении 1,25,000 х г в течение 2 ч при 4°С.
- Продолжайте использовать концентрацию частиц LVS по крайней мере в 200 раз выше исходного объема в PBS, аликвоте, и хранить при температуре -80 °C до использования.
- Определите титр лентивирусных частиц с помощью набора для титров лентивирусов для количественной ПЦР, следуя инструкциям производителя (см. Таблицу материалов).
2. Лентивирусные инфекции и одноклеточное клональное размножение
- При инфекциях, вызванных частицами ЛЖ, суспензию клеток hESC (H9) семян с 1 ×10 5 клеток/0,5 мл питательных сред hESC (базальная среда + P/S + 10 мкМ ингибитора породы) на полном Матригеле (1:50) покрывают луночные планшеты P24 в 500 мкл среды и инкубируют в течение ночи, чтобы дать возможность клеткам прикрепиться. Засейте дополнительные лунки, которые не будут заражены LVS, но обработаны пуромицином, чтобы они служили неинфицированным контролем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчет клеток может быть выполнен с помощью ручного гемоцитометра или автоматического счетчика клеток. - На следующий день инфицируйте клетки при кратности инфекции (MOI) 10 вместе с 8 мкг/мл полибрена и инкубируйте при 37 °C в течение 8 ч с последующей заменой среды на свежую среду hESC + P/S без ингибитора горных пород и продолжайте культивирование до тех пор, пока клетки не станут слитыми на 90%.
- Начните отбор пуромицина, добавив в среду 0,8 мкг/мл пуромицина, когда клетки достигнут 90% конфлюенции, что обычно происходит через 48-72 ч после заражения, и продолжайте отбор до тех пор, пока все клетки не погибнут в неинфицированных клетках (контрольная группа).
- После завершения отбора (обычно 4-6 дней) разделяют стабильные клетки (1:4) и расширяют для криоконсервации и дальнейшего анализа.
- Выполнение селекции одиночных клеток и клональной экспансии с использованием клеток, экспрессирующих L2HGDH-sgRNA-16.
- Для этой цели готовят клеточную суспензию, эквивалентную 500 клеток/10 мл полной питательной среды, и засевают 100 мкл этой суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета.
- Оставьте клетки в покое на 3 дня, а затем наблюдайте.
- Отметьте лунки, в которых получаются одиночные клоны, и меняйте среду через день до тех пор, пока не будет достигнут достаточный размер для дальнейшего расширения колоний (обычно 2 недели) для дальнейшего расширения, криоконсервации и анализа.
3. Экстракция гДНК, ПЦР MS-BSP и секвенирование по Сэнгеру
- Выделите гДНК из клеток с помощью набора для выделения геномной ДНК в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
- Продолжите картирование сайтов мутаций перед последовательностями узнавания PAM с использованием анализа специфических праймеров на основе сайтов мутаций (MS-BSP)8.
- Для этого предназначен несмещенный правый праймер L2H-UMSBSP-R1, который амплифицирует область за пределами экзона1 для усиления любых мишеней.
- Разработать смещенный левый праймер L2H-BMSBSP-F1 с идентичной последовательности sgРНК для амплификации последовательности-мишени, близкой к последовательностям узнавания PAM.
ПРИМЕЧАНИЕ: При очень высоких строгих условиях ПЦР продукт будет наблюдаться на геле в немутировавших клонах. В клонах с нокаутом CRISPR не будет наблюдаться никакого продукта, демонстрирующего мутации, близкие к предшествующим последовательностям узнавания PAM. - Чтобы картировать мутации одной пары оснований, ПЦР амплифицируют последовательность 468.о., охватывающую весь экзон 1 L2HGDH и подвергающуюся секвенированию по Сэнгеру с последующим анализом множественного выравнивания последовательностей с использованием clustalw8.
4. Анализ hESC-дифференцировки и образования эмбриоидных тел (БЭ)
- Продолжайте направленную дифференцировку контрольных и различных клонов CRISPR hESCs (H9) в направлении нейроэктодермы в соответствии с установленными протоколами, как описано ранее, с использованием метода двойного ингибирования smad 9,10,11.
- При 90% конфлюенции обрабатывайте клетки LDN193189 (200 нМ) и SB431542 (10 мкМ) в течение первых 24 ч в 100% среде KSR с последующим добавлением XAV939 (2 мкМ) в течение дополнительных 2 дней.
- Через 3 дня уменьшите процентное содержание сред KSR (Knockout DMEM с добавлением 15% (v/v) KSR, 1% (v/v) L-глутамина, 1% (v/v) P/S, 1% (v/v) 10 mM MEM и 0,1% (v/v) 2-меркаптоэтанола (75%, 50%, 25%) в сочетании с N2 средами (DMEM/F12 с добавлением 1x N2 добавки, 1x P/S, ) до 100% носителей N2 в течение 8 дней.
- В начале 12-го дня зафиксируйте клетки для иммуноокрашивания, используя PAX6 в качестве маркера нейроэктодермы.
- Для исследований определения мезодермы и эндодермальной судьбы используйте подход, основанный на малых молекулах CHIR99021, описанный в предыдущих публикациях12,13.
- Для этого, когда клетки достигают 70% конфлюенции, обрабатывают 3 мкМ CHIR99021 в среде Definitive Endoderm (DE) в течение 24 ч с последующей фиксацией для иммуноокрашивания с использованием Brachuary в качестве мезодерм-специфичного маркера.
- Для эндодермальной стадии культивируют клетки в течение дополнительных 24 ч только в среде ДЭ без добавления CHIR99021 перед фиксацией для иммуноокрашивания с помощью FOXA2.
- Для анализа образования БЭ посев клеток на клеточных поверхностях с низким прикреплением без использования Матригеля для культивирования клеток в условиях суспензии в течение 24 ч перед получением микрофотографий.
5. Вестерн-блоттинг
- Дважды промойте клетки с помощью PBS и лизиса с использованием 1x буфера RIPA, содержащего 1% SDS и 1x коктейля из протеазы и ингибитора фосфатазы.
- Очистите лизаты центрифугированием при 16 000 x g в течение 10 минут при 4 °C с последующим сбором надосадочной жидкости.
- Количественное определение общего клеточного белка с помощью набора для анализа белка BCA в соответствии с инструкциями производителя. Отрегулируйте образцы до 2 мкг/мкл с помощью буфера для образцов с загрузкой 4× красителя.
- Денатурируйте образцы белка при 70 °C в течение 10 мин, загрузите равное количество каждого образца и растворите с помощью гелей SDS-PAGE7 с градиентом 4%-12% с последующим переносом на мембрану PVDF при постоянном напряжении 100 В в течение 1 ч при 4 °C.
- Заблокируйте мембраны с помощью 5% обезжиренного молока и инкубируйте в первичных разведениях антител при 4 °C в течение ночи с вращением.
- Затем промывайте мембраны 5 раз с помощью PBST буфера и инкубируйте в HRP-конъюгированных соответствующих вторичных антителах в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Мембраны снова промойте PBST 5x, инкубируйте с хемилюминесцентным субстратом и проявите с помощью рентгеновских пленок.
6. Иммуноокрашивание
- Засейте клетки на луночных планшетах P4 и инкубируйте не менее 24 ч перед фиксацией, чтобы обеспечить правильное прикрепление клеток к поверхностям.
- Промойте клетки 3 раза PBS, чтобы удалить все омертвевшие клетки, а также компоненты среды, с последующей фиксацией с помощью 4% PFA в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Пермеабилизируйте клетки с помощью 0,3% тритона X-100 с последующим блокированием для неспецифического связывания с использованием 2% BSA в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Инкубируют образцы с первичными антителами (OCT4, NANOG, SOX2, KI67, PAX6, Brachuary, FOXA2), разведенными в 1% BSA, в течение ночи при 4 °C.
- Промойте клетки 3 раза PBS и инкубируйте с соответствующими вторичными антителами (Козий против мыши 488, Козий против кролика 488, Козий против мыши 546, Козий против кролика 546), разведенными в 1% БСА в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Наконец, промойте образцы PBS 3x и закрасьте их DAPI и получите изображение с помощью флуоресцентного микроскопа.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Клонирование sgРНК L2HGDH в lentiCRISPRv2 puro
Вектор lentiCRISPRv2 puro был коммерчески получен (см. Таблицу материалов) и расщеплен с BsmB1, в результате чего был выделен фрагмент наполнителя размером 1,8 Кб. Как показано на рисунке 2А, наблюдалось полное переваривание вектора. Для каждой конструкции шесть клонов были проверены на наличие или отсутствие вставки с использованием обратной последовательности sgRNA в качестве праймера и прямого праймера (U6...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом исследовании был стандартизирован метод, который позволяет проводить высокоэффективные и экономичные делеции генов в ЭСК с помощью технологии CRISPR-Cas9. С помощью этого метода была успешно достигнута гомозиготная делеция гена L2HGDH в ЭСК в течение 3-4 недель, начиная с инфицирования hESC и заканчивая клональным отбором и размножением одиночных клеток (табл. 1). Хотя манипуляции с генами, опосредованные CRISPR-Cas9, могут быть достигнуты путем транзиторной транс...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана исследовательскими грантами от Университета Объединенных Арабских Эмиратов (UAEU) - грант #12M105, грант #12R167 (Центр медицинских наук Зайеда), 21R105 (Благотворительный и гуманитарный фонд Заида бин Султана (ZCHF)) и ASPIRE, компонент управления технологическими программами Совета по передовым технологиям Абу-Даби (ATRC), через грант Исследовательского института точной медицины ASPIRE Абу-Даби (ASPIREPMRIAD) номер гранта VRI-20-10.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2-МЕРКАПТОЭТАНОЛ | Invitrogen | 31350010 | |
| 38,5 мл, стерильный + сертифицированный бесплатный открытый верх тонкостенные ультрапрозрачные пробирки | Beckman Coulter | c14292 | |
| Accutase | Stem Cell technologies | 7920 | |
| bFGF Рекомбинантный человеческий | инвитроген | PHG0261 | |
| Brachyury Rabbit mAb | Abclonal | A5078 | |
| BsmBI-v2 | NEB | R0739S | |
| chir99021 | Tocris | 4423/10 | |
| Матрица базальной мембраны Corning Matrigel, технологии | Corning | 354234 | |
| циклопаминовых | стволовых клеток | 72074 | |
| DMEM media | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM ПИТАТЕЛЬНАЯ СМЕСЬ F12 | Инвитроген | 11320033 | |
| DPBS без: Ca и Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Фетальная сыворотка | Invitrogen | 10270106 | |
| FoxA2/HNF3β | CST | 8186 | |
| GAPDH (14C10) Антитело к mAb | CST | 2118S | |
| Реагент для диссоциации клеток Технологии | стволовых клеток | 7174 | |
| HyClone Незаменимые аминокислоты (NEAA) 100x Solution | GE healthcare | SH30238.01 | |
| Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb | CST | 9129 | |
| Замена | сыворотки KnockOutИнвитроген | 10828028 | |
| л ГЛУТАМИН, 100x | Инвитроген | 2924190090 | |
| L2H-BMSBSP-F1 | макроген | CGTGCGGGTTCGCGTGGG | |
| L2HGDH Поликлональное антитело | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH-SgRNA1-F | макроген | CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG | |
| L2HGDH-SgRNA1-R | макроген | AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC | |
| L2HGDH-SgRNA2-F | макроген | CACCGCCCGC GCTTTTCGCCGG | |
| L2HGDH-SgRNA2-R | макроген | AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGC | |
| L2H-SeqF1 | макроген | GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG | |
| L2H-SeqR1 | макроген | GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG | |
| L2H-UMSBSP-R1 | макроген | GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG | |
| LentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| mTesR1 полная среда | Технологии стволовых клеток | 85850 | |
| Наног антитело | CST | 3580 | |
| НЕЙРОБАЗАЛЬНАЯ СРЕДА 1x CTS | Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 Добавка 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 Добавка 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Oct-4 Антитело | CST | 2750 | |
| Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAb | CST | 60433 | |
| ПЕНИЦИЛЛИН СТРЕПТОМИЦИН СОЛ | Invitrogen | 15140122 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Полибреновый реагент инфекции | Sigma | TR1003-G Полиэтиленимин | |
| , разветвленный | Sigma | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| qPCR Lentivirus Titer Kit | Abm | LV900 | |
| Rock inhibitor Y-27632 дигидрохлорид | Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| Sox2 Антитело | CST | 2748 | |
| Сахароза | Sigma | 57-50-1 | |
| ТРИПСИН .05% ЭДТА | Invitrogen | 25300062 | |
| U6-459F | Macrogen | GAGGGCCTATT TCCCATGATTC | |
| Wizard Набор для очистки геномной ДНК | Promega | A1120 | |
| XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
Ссылки
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 structures and mechanisms. Annu Rev Biophys. 46 (1), 505-529 (2017).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Xue, C., Greene, E. C. DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editing. Trends Genet. 37 (7), 639-656 (2021).
- Zhang, Z., et al. CRISPR/Cas9 genome-editing system in human stem cells: Current status and future prospects. Mol Ther Nucleic Acids. 9, 230-241 (2017).
- Qiu, Z., et al. MYC regulation of D2HGDH and L2HGDH influences the epigenome and epitranscriptome. Cell Chem Biol. 27 (5), 538-550.e537 (2020).
- Sheikh, M. A., Ansari, S. A. Lentiviral mediated delivery of shRNAs to hESCs and NPCs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (PEI). J Vis Exp. (183), e63953(2022).
- Guo, J., et al. A simple and cost-effective method for screening of CRISPR/Cas9-induced homozygous/biallelic mutants. Plant Methods. 14 (1), 40(2018).
- Ardah, M. T., Parween, S., Varghese, D. S., Emerald, B. S., Ansari, S. A. Saturated fatty acid alters embryonic cortical neurogenesis through modulation of gene expression in neural stem cells. J Nutr Biochem. 62, 230-246 (2018).
- Parween, S., et al. Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation. Front Cell Neurosci. 11, 415(2017).
- Parween, S., et al. Nutrient-sensitive protein O-GlcNAcylation modulates the transcriptome through epigenetic mechanisms during embryonic neurogenesis. Life Sci Alliance. 5 (8), e202201385(2022).
- Varghese, D. S., et al. Developmental modeling of hepatogenesis using obese iPSCs-hepatocyte differentiation uncovers pathological features. Cell Death Dis. 13 (7), 670(2022).
- Varghese, D. S., Alawathugoda, T. T., Ansari, S. A. Fine-tuning of hepatocyte differentiation from human embryonic stem cells: Growth factor. Stem Cells Int. 2019 (5), 5968236(2019).
- Jacobs, E. Z., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in naïve human embryonic stem cells. Sci Rep. 7 (1), 16650(2017).
- Cuevas-Ocaña, S., et al. A cell-based optimized approach for rapid and efficient gene editing of human pluripotent stem cells. Int J Mol Sci. 24 (3), 12345(2023).
- Veres, A., et al. Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN-targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing. Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).
- Smith, C., Gore, A., Yan, W., Abalde-Atristain, L., Li, Z., He, C. Whole-genome sequencing analysis reveals high specificity of CRISPR/Cas9 and TALEN-based genome editing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 15 (1), 12-13 (2014).
- Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Mol Ther Nucleic Acids. 4 (7), e264(2015).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
