Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Обогащение субклеточных белков лептоспир с использованием подхода фракционирования на основе Triton X-114

1.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67298

⸱

8 августа 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, ICMR - Regional Medical Research Centre, 2Department of Chemistry & Molecular Biology, University of Gothenburg

В этой статье

Краткое содержание

Хотя у прокариот отсутствует органеллярная система, существуют субклеточные области с локализованными белками. Количественный и качественный анализ ферментов и белков в субклеточных областях важен для разработки мишеней для лекарств и вакцин. Здесь мы проиллюстрируем субклеточное фракционирование лептоспиральных белков с помощью Triton X-114 и его анализа.

Аннотация

У прокариот отсутствуют точные субклеточные органеллы, но есть отдельные области, такие как цитоплазма, внутренняя мембрана, периплазма и внешняя мембрана, где организовано большинство биохимических и физиологических функций. Таким образом, понимание функциональных характеристик белков требует выяснения их субклеточной локализации. Тем не менее, извлечение субклеточных белков из грамотрицательных бактерий представляет собой проблему из-за их сложного фосфолипидного бислоя. Несмотря на то, что Triton X-114 показал многообещающие результаты в экстракции белков внешней мембраны (OMP), краткий протокол остается неуловимым. Этот протокол демонстрирует пошаговый рабочий процесс извлечения субклеточных белков с использованием спирохеты Leptospira в качестве модели. Этот метод, включающий субклеточное фракционирование и разделение фаз, позволяет получить отдельные фракции для белков цитоплазмы, наружной и внутренней мембраны. Моющее средство Triton X-114 хорошо подходит для разделения фаз благодаря оптимальной температуре помутнения (~22 °C) и низкой критической концентрации мицелл (CMC), что позволяет эффективно экстракционировать и очищать нативные белки с минимальной денатурацией. Примечательно, что анализ показал эффективность в различении белков от внутренней и внешней мембран, отличных от цитоплазмы.

Введение

Субклеточный протеомный анализ (SCP) играет ключевую роль в выяснении бактериального патогенеза, анализируя протеом в определенных субклеточных компартментах бактериальных клеток. Этот подход к субклеточной протеомике характеризует бактериальные белки в отдельных компартментах, снижая сложность за счет исключения высокораспространенных белков и обеспечивая понимание их организации и пропорционального изобилия 1,2. Например, используя методы субклеточного фракционирования и LC-MS/MS, исследование Shewanella oneidensis раскрыло значительную часть ее протеома, предоставив важные детали относительно компартментной архитектуры клеток и изобилия белков. Это исследование служит основой для последующих исследований субклеточной организации в грамотрицательных бактериях3. В области бактериального патогенеза определение бактериального протеома во время инфекции in vivo является обязательным условием для понимания механизмов, управляющих патогенностью4. Исследование протеома внутриклеточной сальмонеллы в эпителиальных клетках на различных стадиях инфекции сыграло важную роль в раскрытии адаптивных стратегий, используемых бактериальными патогенами в их внутриклеточной среде 4,5. Стратегии SCP позволяют получить всестороннее представление о клеточной динамике путем оценки численности белка и его транслокации в различных клеточных компартментах. Этот метод облегчает обширную идентификацию белков из различных бактериальных компартментов, улучшая тщательный анализ бактериальных протеомов 6,7.

Субклеточное распределение белков не только определяет их функциональную активность, но и усиливает их функциональноеразнообразие8. Например, ферменты демонстрируют различные регуляторные механизмы и уровни активности в зависимости от их субклеточной локализации. Трансглютаминазы (ТГазы), например, демонстрируют различные роли или регуляторные механизмы в различных субклеточных компартментах пыльцевых трубок: цитоплазматические ТГазы включают первичные амины в цитозольные белки (например, актин и тубулин) Са(2+)-зависимым образом, взаимодействуя с цитоскелетом; мембранные ТГазы связаны с мембранами Гольджи и плазматическими мембранами, что предполагает их роль в доставке экзоцитозов; а ТГазы, ассоциированные с клеточной стенкой, регулируют апикальный рост путем колокализации с маркерами клеточной стенки. Эти функциональные различия опосредованы специфичными для компартмента ролями9. Кроме того, репарация окисленных белков в бактериальной оболочке подчеркивает критическую роль ферментных систем в определенных клеточных компартментах, подвергшихся воздействию активных форм кислорода10. Рассмотрим эндотелиальную синтазу оксида азота (eNOS), субклеточная локализация которой модулируется модификациями липидов, влияя на ее взаимодействие с различными клеточными мембранами11. Ферментативная компартментализация поддерживает различные среды, способствующие взаимодействию между ферментами и субстратами, тем самым способствуя метаболическимпроцессам, специфичным для компартментов.

Бактерии и другие прокариоты не имеют четких субклеточных органелл; Существуют отдельные области, включая цитоплазму, внутреннюю мембрану, периплазму и внешнюю мембрану. Большая часть биохимических и физиологических функций в организме организована в различных подподcellar компартментах13. Таким образом, субклеточная локализация белков важна для прогнозирования их функциональных характеристик. Тем не менее, извлечение субклеточных белков из грамотрицательных бактерий сопряжено с трудностями из-за их сложного двухмембранного фосфолипидного бислоя. Традиционные методы экстракции с использованием детергентов, таких как додецилсульфат натрия (SDS), и добавок, таких как мочевина, часто нарушают целостность мембранного белка, влияя на последующие анализы14,15. Кроме того, липидный состав играет значительную роль в формировании конформационных изменений мембранных белков. Успех солюбилизации зависит от таких факторов, как соотношение детергента, липидов и белка, поскольку этот процесс включает в себя введение детергента в липидный бислой с последующей солюбилизацией белка16. Выбор моющего средства имеет решающее значение для эффективной солюбилизации мембранных белков, учитывая такие факторы, как температура помутненияи время инкубации. Липидная среда может влиять на конформационные изменения мембранных белков18,19.

Детергенты необходимы для извлечения мембранных белков из биологических мембран и обеспечения их растворимости в водных растворах, что является предпосылкой для последующей очистки белков. Тем не менее, очистка мембранных белков часто бывает сложной задачей, потому что они удаляются из своей родной среды липидной мембраны и помещаются в буфер для детергента, который лишь частично воспроизводит физические и химические свойства мембраны20. После экстракции мембранные белки обычно очищаются в последующих процессах с использованием диализа, осаждения белков и некоторых методов хроматографии в качестве растворимых белков20,21. Фазовое разделение представляет собой мощную альтернативу или дополнение к протоколам очистки, основанным на хроматографии, и может применяться непосредственно к солюбилизированным белкам. В основном, разделение фаз позволяет интегральным мембранным белкам разделяться на фазу, обогащенную детергентом, и цитозольные белки в водной фазе, обедненной детергентом20,22. В более ранних исследованиях было описано несколько детергентов как используемые для солюбилизации мембранных белков20. К ним относятся семейство Triton (Triton X-100 и Triton X-114), семейство Tween (Tween-20 и -80), анионные моющие средства, катионные детергенты, моноэфирные моющие средства на основе полиоксиэтиленгликоля и т. д., но у них есть плюсы и минусы с точки зрения структуры и функции белков20. Физико-химические свойства этих детергентов сильно влияют на фазовое разделение и солюбилизацию мембранных белков20. Детергенты представляют собой амфипатические молекулы с полярной головной группой и гидрофобной углеводородной цепью. В низких концентрациях они существуют в воде в виде мономеров. Выше критической концентрации мицелл (CMC) они образуют мицеллы, размер которых зависит от типа детергента, а число агрегации указывает на количество молекул в мицелле (также называемое молекулярной массой мицелл). Другим важным фактором является «точка помутнения», которая может быть достигнута путем изменения температуры водного раствора мицеллярного моющего средства, который становится мутным и в конечном итоге образует две отдельные фазы. Этот процесс известен как разделение фаз или экстракция точки помутнения. Высокое содержание КМЦ может привести к образованию большего количества мембранных белков, соответствующих высоким концентрациям детергента с более слабым связыванием, которые могут быть диализованы против буфера с определенной концентрацией детергента20. Тем не менее, для достижения высокой КМЦ в большинстве моющих средств требуется высокая температура помутнения, которая может повлиять на структуру и функцию экстрагированного белка, а также повлиять на последующие процессы. Даже высокая концентрация моющего средства на этой фазе может быть вредной для белка и создавать проблемы при работе с жидкостью для пипетирования точного объема из-за высокой вязкости. Например, тритон Х-100 имеет высокий выход мембранных белков в мицелле детергента выше температуры помутнения 64-65 °С. Для поддержания рабочей температуры 9%-23% (NH4)2ТАК4 или добавление 16%-25% NaCl может быть снижено до комнатной температуры (RT), что приводит к высокой концентрации детергента, что, вероятно, влияет на стабильность белка. Аналогичным образом, при экстракции на основе твинов используется высокая температура помутнения (76 °C для подросткового процесса 20 и 93 °C для подросткового процесса 80). Анионное моющее средство SDS часто используется в белковых приложениях, но обычно денатурирует белки20. Исследователи, стремясь эффективно экстрагировать мембранные белки, определили Triton X-114 как классическое моющее средство из-за его оптимальной температуры помутнения около 22 °C, что идеально подходит для исследований мембранных белков. Впервые представленный компанией Bordier в 1981 году, Triton X-114 с тех пор широко используется для экстракции и очистки мембранных белков из различных источников, включая ткани животных и растений, а также микроорганизмы20,22. Низкий уровень КМС Triton X-114 предотвращает его удаление диализом; Тем не менее, его мягкая природа сводит к минимуму денатурацию мембранных белков в фазе, обогащенной детергентом. Кроме того, Triton X-114 образует меньшие мицеллы (n = 7-8) по сравнению с Triton X-10020. В протоколе исследования Джеймса Г. Прайда использовался Triton X-114 для экстракции мембранного белка из культивируемых клеток млекопитающих. При использовании температуры помутнения выше 20 °C (инкубация при 30 °C в течение 3 мин) интегральные мембранные белки разделились на обогащенную детергентом фазу, в то время как периферические и цитозольные белки были восстановлены из обедненной детергентом водной фазы22. Кроме того, Дэвид А. Хааке и др. использовали Triton X-114 для извлечения белков внешней мембраны (OMP) из Leptospira interrogans, с CaCl и без него2 в качестве добавки23,24. Более поздние исследования подтвердили, что Triton X-114 эффективно извлекает ОМП из субклеточных компартментов без добавок, таких как глицерин или CaCl225,26. Однако включение солей может увеличить концентрацию детергента, что может повлиять на крупномасштабные исследования протеома с использованием высокопроизводительной масс-спектрометрии20. В нашей работе по анализу субклеточного протеома мы использовали Triton X-114 в сочетании с тандемной масс-спектрометрией, достигнув значительного обогащения всех субклеточных компартментов, включая цитоплазматические, внутренние мембранные и внешние мембранные белки25,26. Основной целью данного протокола является эффективное обогащение субклеточных компартментов типичной грамотрицательной бактериальной клетки при минимизации проблем в последующих процессах. Кроме того, протокол разработан таким образом, чтобы быть экономичным и эффективным по времени. В этой статье мы подробно рассмотрим разработанный в лаборатории оптимизированный протокол выделения субклеточных белков и обсудим каждое узкое место, возникшее в процессе экстракции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: В этом протоколе используется Leptospira interrogans для эксперимента по экстракции субклеточного белка. Хотя этот протокол может быть адаптирован для использования с другими грамотрицательными бактериями, может потребоваться оптимизация в зависимости от конкретных целей исследования. В Таблице материалов и Таблице 1 представлен перечень химических веществ и оборудования, а также составы буферов и растворов реагентов соответственно, в то время как в Таблице 2 представлены лабораторные объекты.

1. Штамм лептоспир и условия культивирования

  1. Получить L. interrogans серогруппы Icterohaemorrhagiae serovar Copenhageni штамма Fiocruz L1-130.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот штамм был получен от Индийского совета медицинских исследований - Регионального медицинского исследовательского центра в Порт-Блэре, Индия, сотрудничающего центра ВОЗ, специализирующегося на диагностике, справке, исследованиях и обучении лептоспироза.
  2. Выращивайте Leptospira (посевной материал, содержащий ~1 × 106 клеток/мл) в 50 мл среды Ellinghausen McCullough Johnson Harris (EMJH) с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA).
  3. Инкубировать при 30 °C до тех пор, пока культура не достигнет фазы роста в середине журнала (3,5 × 108 клеток/мл). Протестируйте аликвоты культивируемой среды на питательных агаровых пластинах, чтобы убедиться, что среда остается незагрязненной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте микроскопию темного поля и счетную камеру Петрова-Хауссера для подсчета клеток. Подробнее см. ранее опубликованную статью27.

2. Забор клеток

  1. После 7-дневного инкубационного периода перенесите три биологические реплики культуры L. interrogans в центрифужные пробирки в равных объемах (по 25 мл каждая).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Культуру лептоспир обрабатывали внутри ламинарного колпака в лабораторном помещении BSL-2 во время переноса.
  2. Центрифугируйте все пробирки при 2500 × г в течение 45 мин при 4 °C. Осторожно сцедите надосадочную жидкость в стакан с дезинфицирующим средством и выбросьте его. Используйте клеточную гранулу для следующего шага.
  3. Промойте гранулы клеток три раза фосфатно-соевым буфером (1 мл каждый раз) с добавлением 5 мМ MgCl2, центрифугируя при 10 000 × г в течение 10 минут при 4 °C после каждой промывки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе нежелательный BSA, присутствующий в среде EMJH, будет удален с поверхности клеточной гранулы.

3. Субклеточная экстракция белка

  1. Экстракция Triton X-114
    1. Обработайте гранулу клетки лептоспиры , полученную после сбора, экстракционным буфером, содержащим 10 мМ Tris-Cl (pH 8), 1% Triton X-114 и 150 мМ NaCl из расчета 1 мл на собранную гранулу (Таблица 1) (Опционально - коктейль ингибиторов протеазы можно добавить в зависимости от экспериментальной цели).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура включает в себя простое воздействие на бактерии раствора детергента путем добавления экстракционного буфера для извлечения мембранных белков.
    2. Осторожно перемешайте экстракционный буфер с гранулой с помощью микропипетки при температуре ниже 25 °C до тех пор, пока раствор не станет визуально мутным.
    3. Выдержать смесь в течение ночи при температуре 4 °C.
    4. Полученный экстракт снова перемешайте с помощью микропипетки и центрифугируйте при 15 000 × г в течение 30 мин при 4 °C.
    5. Сцедите надосадочную жидкость в другой флакон и сохраните клеточную гранулу для последующих процессов экстракции.
      Примечание: Этот надосадочный продукт содержит смесь гидрофильных и гидрофобных белков в изобилии из цитоплазмы и внешней мембраны и используется для разделения фаз.
    6. Добавьте в клеточную гранулу 50 мкл буфера, содержащего 10 мМ Tris-Cl (pH 8), 8 М мочевину, коктейль ингибиторов протеазы и 1% додецилсульфата натрия (SDS).
    7. После добавления экстракционного буфера смесь непрерывно перебрасывают в течение 5 минут, затем инкубируют при температуре 4 °C еще 5 минут.
    8. Снова центрифугируйте смесь при 15 000 × г в течение 30 мин при 4 °C и обозначьте полученную надосадочную жидкость как фракцию гранул (P).
      Примечание: Было обнаружено, что гранулированная фракция содержит большое количество белков внутренней мембраны в Leptospira25,26.
  2. Фазовое разделение
    1. Отрегулируйте концентрацию надосадочной жидкости Triton X-114, полученной в результате экстракции, до 2%. Например, если объем надосадочной жидкости составляет 900 мкл, добавьте 9 мкл моющего средства Triton X-114 для достижения желаемой концентрации.
    2. Смесь выдерживают при 37 °C в течение 1 ч, затем центрифугируют при 2000 × г в течение 5 мин при 30 °C. Это низкоскоростное центрифугирование может ускорить разделение фаз.
    3. Дайте смеси разделиться на две отдельные фазы: водную и моющую. Обеспечьте надлежащее центрифугирование на низкой скорости для достижения видимого разделения. При необходимости дайте ему постоять в течение 1 минуты перед изоляцией. Если отделение не происходит, при необходимости повторите шаг 3.2.2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разделение фаз можно наблюдать визуально, путем измерения мутности с помощью спектрофотометра или через статическое рассеяние света. Для повышения точности определения температуры помутнения добавьте в раствор гидрофобный краситель (5-гексадеканоил-аминоэозин) с концентрацией 500 нМ и проанализируйте его с помощью ультрафиолетовой спектроскопии видимого диапазона (UV-VIS).
    4. Изолируйте верхнюю водную фазу, проколов границу раздела стерильным шприцем и перенеся его в отдельный флакон. Изолируйте нижнюю фазу моющего средства с помощью микропипетки и храните ее в отдельном флаконе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно обращайтесь с флаконом, содержащим обе фазы, в процессе разделения. Перед тем, как проколоть флакон шприцем, откройте его крышку, чтобы предотвратить поломку иглы или затруднение извлечения верхней водной фазы. Использование шприца обеспечивает более точное измерение объема каждой фазы после разделения и сводит к минимуму перекрестное загрязнение белка между фазами.
    5. Пометьте фазы как водные (A) и моющие (D) и храните их при температуре -20 °C для использования в будущем.

4. Оценка белка

  1. Оцените концентрацию белка каждой фракции Triton X-114 (водной, моющей и пеллетированной) с помощью бицинхонового анализа28 или любого другого подходящего метода.

5. Электрофорез в геле додецилсульфат-полиакриламид натрия (SDS-PAGE) гель-электрофорез

ПРИМЕЧАНИЕ: Белки из каждой фракции (водной, моющей, пеллетной) должны быть обработаны бета-меркаптоэтанолом для их восстановления, а затем разделены с помощью 10% SDS-PAGE (три биологических репликации). Рецепт 10% SDS-PAGE можно найти в Таблице 1. Для таргетирования образцов белка любой анализ активности фермента должен быть выполнен в нативной форме, которая может быть разрешена в нативной PAGE.

  1. Повторно суспендируйте образец белка в ледяном ацетоне, используя в четыре раза больший объем образца. Инкубируйте смесь при температуре -20 °C в течение минимум 2 часов, затем центрифугируйте при 14 000 × г в течение 10 минут. Кроме того, ресуспендируйте фракцию гранул в 80% ледяном ацетоне, затем инкубируйте в течение 5 минут при 4 °C. Центрифугируйте при 14 000 × г в течение 10 мин для удаления избытка кристаллов соли мочевины.
  2. После центрифугирования осторожно удалите надосадочную жидкость и поместите белковую гранулу в сухую ванну до тех пор, пока весь остаточный ацетон не испарится из флаконов.
  3. Образцы белка инкубируют в буфере для образцов объемом 20 мкл, содержащем бета-меркаптоэтанол, затем нагревают их при 95 °C в течение 10 минут на водяной бане или сухой бане.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данном случае образцы белков представляют собой водную (A)-фракцию, содержащую цитоплазматические белки, детергентную фракцию (D), содержащую белки внешней мембраны, и фракцию гранул (P), содержащую белки внутренней мембраны.
  4. Загрузите образцы, содержащие A, D и P, в каждую лунку 10% геля SDS-PAGE вместе с предварительно окрашенным белковым маркером (M) и общим белком (T).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий белок можно получить, собрав все три фракции вместе в одном флаконе с использованием 20 мкл буфера для образца.
  5. Используйте 1x электродный буфер в аппарате для электрофореза (Таблица 1). Установите рабочие параметры геля на 6 мА для стекирующего геля и 12 мА для разрешающего геля. Запустите электрофорез в режиме РТ.
  6. Окрасьте гель с помощью Coomassie Brilliant Blue G или других белковых красителей, доступных в лаборатории.

6. Иммуноблоттинг

  1. После отделения геля неокрашенный гель инкубировать в трансферном буфере (25 мМ трис-основания, 190 мМ глицина, 20% метанола) в течение 5 минут.
  2. Инкубируйте промокательную бумагу подходящего размера в буфере для переноса иммуноблоттинга в течение 5 минут, затем соберите их в качестве нижнего слоя бутерброда.
  3. Используйте мембраны из поливинилиденфторида (PVDF) или мембраны из нитроцеллюлозы для переноса белков из неокрашенных гелей. Начните с погружения мембраны PVDF в абсолютный метанол на 30 с, после чего последует 5-минутное замачивание в буфере для переноса иммуноблота. Впоследствии интегрируйте его в промокательный бутерброд.
  4. Теперь поместите неокрашенный гель, который был удален из буфера для переноса, и используйте его в бутерброде для блоттинга.
  5. Наконец, накройте бутерброд, положив его поверх другой промокательной бумаги, выпустите все захваченные пузырьки воздуха с помощью валика для кляксы и запустите перенос методом полусухого переноса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие подходы, включая сухой и мокрый перенос, могут быть использованы в зависимости от лабораторных условий.
  6. Погрузите мембрану в блокирующий буфер (8% обезжиренного молока в TBS-0,1% Tween 20 [TBS-T]) на 2 ч с последующей ночной инкубацией при 4 °C с моноспецифической антисывороткой*, нацеленной на липопротеин Leptospira LipL41 (1:5000), или жгутиковую нить с ядром белка 35 кДа (FlaB) (1:4000) (*специальное антитело). Промойте мембрану три раза с помощью TBS-T, позволяя каждому полосканию продолжаться в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте любые антитела, представляющие интерес. Коэффициент разведения антител может варьироваться.
  7. Инкубировать мембрану с мышиным вторичным антителом против кролика, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) IgG (разведение 1:20000) в течение 2 ч в режиме ЛТ.
  8. Подвергните мембрану воздействию реагента с электрохемилюминесценцией (ECL) для визуализации белковых полос.
  9. Поместите мембрану под синюю чувствительную рентгеновскую пленку в темной комнате.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно использовать любые другие методы разработки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом эксперименте мы использовали спирохету Leptospira в качестве модельного организма для извлечения субклеточных компартментов. Мы использовали стратегическую методологию, основанную на температуре помутнения и критической концентрации мицелия (CMC), используя эффективность Triton X-114, неионогенного детергента (Рисунок 1). Прежде чем продолжить, была проведена оценка белка для оценки концентрации в каждой фракции для одной биологической репликации. Мы наблюдали соотношение кон...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Методы субклеточного фракционирования играют ключевую роль в выделении дискретных клеточных составляющих для последующего анализа. Triton X-114, неионогенное моющее средство, обычно используется в этих методах из-за его способности разделять образцы на отдельные фазы, что позволяет разделять различные клеточные компоненты32. Triton X-114 был особенно полезен для извлечения мембранных белков (в нативной форме) из различных источников, включая внеклеточные везикулы ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявили, что у них нет конфликта финансовых интересов.

Благодарности

Авторы выражают искреннюю благодарность Индийскому совету медицинских исследований, Нью-Дели, Индия, за финансовую поддержку, оказанную в рамках гранта No. Leptos/22/2013-ECD-I-2012-2400 и Департамент науки и технологий, Совет по научным и инженерным исследованиям, Нью-Дели, Индия, за их финансовую поддержку в виде гранта No. SR/SO/HS/0108/2012 M.G.M. Кроме того, авторы выражают свою признательность Индийскому совету медицинских исследований, Нью-Дели, Индия, за присуждение стипендии старшего научного руководителя в рамках гранта No. ICMR-SRF 2020-0756/PROTEOMICS- BMS, Fellowship/131/2022-ECD-II-2021-8230 для H.P и AS соответственно и Департамент науки и технологий, Совет по науке и инженерным исследованиям, Нью-Дели, Индия, грант No. PDF/2017/000343 в S.A.D.C.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Уксусная кислота  Сигма  695092
Ацетон    Сигма  32201
Акриламид    Сигма  А-3553
Персульфат аммония    Сигма  А-3678
Равновесие  ШИМАДУЗ  Z741079
Бис Акриламид    Сигма  М7279
Фракция V сывороточного альбумина крупного рогатого скота (BSA)  Сигма  А-8022
Бромфенол синий    Сигма  Б-8026
Пробирка для центрифуги (50 мл)Тарсонс500020
Коническая колба с крышкой (150 мл)Тарсонс431030
Охлаждающая центрифуга  Эппендорф  5355316200
Кумасси блестящий синий    Сигма1.12553
Темнопольный микроскоп  ЦЕЙСС  ГМБ37081
Деликатные салфетки для задачНаука Kimtech34155
Сухая ванна  Эппендорф  535531620
Эллингхаузен– Маккалоу&ндаш; Джонсон– Harris (EMJH) средний, Difco  Дифко  279410
Гелевые капы: Гелевые капы должны быть не менее чем на 2 см шире по размеру и иметь гладкую и плоскую поверхность с крышкой.  Хофер  Не применимо
Стеклянный стакан (150 мл)Тарсонс421030
Глицин G8790    Сигма  Г-8898
Фильтровальная бумага Immobilon BlottingМногородностьIBFP0813C
Иммуноблоттинг полусухой  АТТА  АЕ-6675
Инкубатор - Для инкубации гелевых лотков в течение 18 часов при температуре 37°С.  ЭЙЕЛА  СЛИ-700
Ламинарный поток воздуха  Не применимо  Не применимо
Люминол  Сигма  09253
Хлорид магния M8266  Сигма  М8266
Магнитная мешалка  ТАРСОНЫ  6040
Метанол    Сигма  17995-7
Наконечники для микропипеток (10 &; Л&ндаш; 10 мл)АксигенТ-10, Т-200-С, Т-1000-С, Т-10МЛ-С
Микропипетки  Эппендорф  EP2231300010
Микропробирки (1,5 мл Safe-Lock)ЭппендорфEP022363212
Мини спин  Генакси  ПОКОЛЕНИЕ-МИНИ-6К
Многорежимный считывательBMG LABTECH  Номер по каталогу 413-3877
Обезжиренное сухое молоко, бычьеСигма-ОлдричМ7409
-кумаровая кислота    Сигма  С9008
Фосфатно-солевой буфер    СигмаP4417 
Холодильник  ЛГ  ГК-B217BLJ2
Rocker - качающийся или роторный шейкер с низкой скоростью для окрашивания геля.  ТАРСОНЫ  4080
SDS-PAGE SETUP- Аппарат для электрофореза  Hoefer, Inc.  СЭ300-10А-1.0  Модель Hoefer ' miniVE' который может отливать гель размером 10 см х 8 см толщиной 1 мм.
Хлорид натрия      Сигма  5886
Додецилсульфат натрия (SDS)    Сигма  Л-4396
ТЕМЕД    Сигма  Т-9281
Тритон Х-114    Сигма648468
База Тризма (TRIS) T6066    Сигма  Т6066
Вихрь  ТАРСОНЫ  3020

Ссылки

  1. Curreem, S. O. T., Watt, R. M., Lau, S. K. P., Woo, P. C. Y. Two-dimensional gel electrophoresis in bacterial proteomics. Protein Cell. 3 (5), 346-363 (2012).
  2. King, B. R., Latham, L., Guda, C. Estimation of subcellular proteomes in bacterial species. Open Appl Informatics J. 3 (1), 1-11 (2009).
  3. Brown, R. N., Romine, M. F., Schepmoes, A. A., Smith, R. D., Lipton, M. S. Mapping the subcellular proteome of Shewanella oneidensis MR-1 using Sarkosyl-based fractionation and LC−MS/MS protein identification. J Proteome Res. 9 (9), 4454-4463 (2010).
  4. Cash, P. Investigating pathogen biology at the level of the proteome. Proteomics. 11 (15), 3190-3202 (2011).
  5. Liu, Y., et al. Temporal regulation of a Salmonella Typhimurium virulence factor by the transcriptional regulator YdcR. Mol Cell Proteomics. 16 (9), 1683-1693 (2017).
  6. Rey, S., Gardy, J. L., Brinkman, F. S. Assessing the precision of high-throughput computational and laboratory approaches for the genome-wide identification of protein subcellular localization in bacteria. BMC Genomics. 6 (1), 162(2005).
  7. Lietzén, N., et al. Quantitative subcellular proteome and secretome profiling of influenza A virus-infected human primary macrophages. PLoS Pathog. 7 (5), e1001340(2011).
  8. Arioka, Y., Watanabe, A., Saito, K., Yamada, Y. Activation-induced cytidine deaminase alters the subcellular localization of Tet family proteins. PLoS One. 7 (9), e45031(2012).
  9. Del Duca, S., Faleri, C., Iorio, R. A., Cresti, M., Serafini-Fracassini, D., Cai, G. Distribution of transglutaminase in pear pollen tubes in relation to cytoskeleton and membrane dynamics. Plant Physiol. 161 (4), 1706-1721 (2013).
  10. Gennaris, A., et al. Repairing oxidized proteins in the bacterial envelope using respiratory chain electrons. Nature. 528 (7582), 409-412 (2015).
  11. Schilling, K., et al. Translocation of endothelial nitric-oxide synthase involves a ternary complex with caveolin-1 and NOSTRIN. Mol Biol Cell. 17 (9), 3870-3880 (2006).
  12. Mintz-Oron, S., Aharoni, A., Ruppin, E., Shlomi, T. Network-based prediction of metabolic enzymes' subcellular localization. Bioinformatics. 25 (12), i247-i252 (2009).
  13. Phukan, H., Sarma, A., Rex, D. A. B., Rai, A. B., Prasad, T. S. K., Madanan, M. G. Unique posttranslational modification sites of acetylation, citrullination, glutarylation, and phosphorylation are found to be specific to the proteins partitioned in the Triton X-114 fractions of Leptospira. ACS Omega. 7 (22), 18569-18576 (2022).
  14. Tinrat, S. Preliminary phytochemical analysis, antibacterial and anti-biofilm activities of Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe extracts. Malaysian J Microbiol. 18 (4), 344-353 (2022).
  15. Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), a000414-a000414 (2010).
  16. Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Curr Protoc Protein Sci. 53 (1), ps0408s53(2008).
  17. Santos, H. deL., Ciancaglini, P. A practical approach to the choice of a suitable detergent and optimal conditions for solubilizing a membrane protein. Biochem Educ. 28 (3), 178-182 (2000).
  18. Picard, M., Duval-Terrié, C., Dé, E., Champeil, P. Stabilization of membranes upon interaction of amphipathic polymers with membrane proteins. Protein Sci. 13 (11), 3056-3058 (2004).
  19. Rice, A. J., Alvarez, F. J., Davidson, A. L., Pinkett, H. W. Effects of lipid environment on the conformational changes of an ABC importer. Channels. 8 (4), 327-333 (2014).
  20. Arnold, T., Linke, D. Phase separation in the isolation and purification of membrane proteins. BioTechniques. 43 (4), 427-440 (2007).
  21. Fricke, B. Phase separation of nonionic detergents by salt addition and its application to membrane proteins. Anal Biochem. 212 (1), 154-159 (1993).
  22. Pryde, J. G. Partitioning of proteins in Triton X-114. In: Methods in Molecular Biology. , Humana Press. Totowa. (2000).
  23. Haake, D. A., Walker, E. M., Blanco, D. R., Bolin, C. A., Miller, J. N., Lovett, M. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59 (3), 1131-1140 (1991).
  24. Haake, D. A., et al. The leptospiral major outer membrane protein LipL32 is a lipoprotein expressed during mammalian infection. Infect Immun. 68 (4), 2276-2285 (2000).
  25. Thoduvayil, S., et al. Triton X-114 fractionated subcellular proteome of Leptospira interrogans shows selective enrichment of pathogenic and outer membrane proteins in the detergent fraction. Proteomics. 20 (19-20), (2020).
  26. Phukan, H., et al. Physiological temperature and osmotic changes drive dynamic proteome alterations in the leptospiral outer membrane and enhance protein export systems. J Proteome Res. 22 (11), 3447-3463 (2023).
  27. Murray, G. L., King, A. M., Srikram, A., Sermswan, R. W., Adler, B. Use of luminescent Leptospira interrogans for enumeration in biological assays. J Clin Microbiol. 48 (6), 2037-2042 (2010).
  28. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  29. Shang, E. S., Summers, T. A., Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding LipL41, a surface-exposed lipoprotein of pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 64 (6), 2322-2330 (1996).
  30. Evangelista, K. V., Hahn, B., Wunder, E. A. Jr, Ko, A. I., Haake, D. A., Coburn, J. Identification of cell-binding adhesins of Leptospira interrogans. PLoS Negl Trop Dis. 8 (10), e0003215(2014).
  31. Picardeau, M. Virulence of the zoonotic agent of leptospirosis: still terra incognita. Nat Rev Microbiol. 15 (5), 297-307 (2017).
  32. Hu, S., et al. Purification and identification of membrane proteins from urinary extracellular vesicles using Triton X-114 phase partitioning. J Proteome Res. 17 (1), 86-96 (2018).
  33. Radolf, J. D., Chamberlain, N. R., Clausell, A., Norgard, M. V. Identification and localization of integral membrane proteins of virulent Treponema pallidum subsp. pallidum by phase partitioning with the nonionic detergent Triton X-114. Infect Immun. 56 (2), 490-498 (1988).
  34. Nally, J. E., Whitelegge, J. P., Bassilian, S., Blanco, D. R., Lovett, M. A. Characterization of the outer membrane proteome of Leptospira interrogans expressed during acute lethal infection. Infect Immun. 75 (2), 766-773 (2007).
  35. Crother, T. R., Nally, J. E. Analysis of bacterial membrane proteins produced during mammalian infection using hydrophobic antigen tissue Triton extraction (HATTREX). Curr Protoc Microbiol. 9 (1), mc1201s9(2008).
  36. Casey, T. M., Meade, J. L., Hewitt, E. W. Organelle proteomics. Mol Cell Proteomics. 6 (5), 767-780 (2007).
  37. Bell, A. W., et al. Proteomics characterization of abundant Golgi membrane proteins. J Biol Chem. 276 (7), 5152-5165 (2001).
  38. Boonciew, P., et al. Improved antibody detection for canine leptospirosis: ELISAs modified using local leptospiral serovar isolates from asymptomatic dogs. Animals. 14 (6), (2024).
  39. Nogueira, S. V., et al. Leptospira interrogans enolase is secreted extracellularly and interacts with plasminogen. PLoS One. 8 (10), e0078150(2013).
  40. Riazi, M., Zainul, F. Z., Bahaman, A. R., Amran, F., Khalilpour, A. Role of 72 kDa protein of Leptospira interrogans. as a diagnostic marker in acute leptospirosis. Indian J Med Res. 139 (2), 308-313 (2014).
  41. Domingos, R. F., et al. Features of two proteins of Leptospira interrogans with potential role in host-pathogen interactions. BMC Microbiol. 12, 50(2012).
  42. Dhandapani, G., et al. Proteomic approach and expression analysis revealed the differential expression of predicted leptospiral proteases capable of ECM degradation. Biochim Biophys Acta Proteins Proteomics. 1866 (5-6), 712-721 (2018).
  43. Matsunaga, J., Werneid, K., Zuerner, R. L., Frank, A., Haake, D. A. LipL46 is a novel surface-exposed lipoprotein expressed during leptospiral dissemination in the mammalian host. Microbiology. 152 (12), 3777-3786 (2006).
  44. Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4 (6), e6071(2009).
  45. Madathiparambil, M. G., Cattavarayane, S., Perumana, S. R., Manickam, G. D., Sehgal, S. C. Presence of 46 kDa gelatinase on the outer membrane of Leptospira. Curr Microbiol. 62 (5), 1478-1482 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Triton X 114LeptospiraSDS PAGE
Обогащение субклеточных белков лептоспир с использованием подхода фракционирования на основе Triton X-114
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.