Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Придаточные корни тополя, индуцированные возбудителями стеблевого рака: экспериментальная система для изучения биологии корней и процессов, связанных с реакцией на свет

755 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67304

⸱

11 октября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Institute of Ecological Conservation and Restoration, Chinese Academy of Forestry, 2Comprehensive Experimental Center in Yellow River Delta of Chinese Academy of Forestry, 3Beijing Haidian Kaiwen Academy High School, 4State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе мы представляем протокол индуцирования образования придаточных корней (АР) через путь инокуляции грибкового патогена флоэмы или эпидермиса, который подходит для изучения биологии корней и физиологических процессов, связанных со световой реакцией у тополя.

Аннотация

Valsa sordida и Botryosphaeria dothidea являются двумя важнейшими некротрофными грибковыми патогенами, которые повреждают многие растения-хозяева, особенно виды рода Populus. Эти два грибковых патогена встречаются в основном в ветвях, стеблях и ветвях тополя, вызывая классические симптомы, такие как поражения язвой, отмирание полога и увядание. Инокуляция патогенов является наиболее эффективным способом изучения механизма заболевания растений. Помимо повреждений язвой вокруг мест прививки на стеблях, у видов тополей наблюдался новый феномен развития - обильные придаточные корни (AR) ярко-красного цвета, после прививки стеблевого патогена. В этом исследовании мы описали метод индуцирования ARs с использованием грибковых патогенов у тополей. Решающим этапом этого метода является посев возбудителя после манипуляции (флоэмы или эпидермиса) с опоясыванием. Вторым важным этапом является нанесение увлажняющего материала. По сравнению с увлажняющей манипуляцией с помощью парапленки, обертывание инокулированных участков полиэтиленовой полиэтиленовой (ПЭ) полиэтиленовой пленкой может дать красочные, многочисленные и прочные АР через 20 дней после опоясывания-инокуляции. Наконец, белые AR прорастали из инокулированных колец в стеблях тополя после обработки затенением (обертывания стеблей алюминиевой фольгой). Этот метод представляет собой новую экспериментальную систему для изучения развития корней и морфогенеза, которая имеет решающее значение для понимания биологии развития корней, морфогенеза и реакции на стресс от болезни. Кроме того, в сочетании с лечением затенением, это исследование может обеспечить удобную экспериментальную систему для изучения процессов, связанных со световой реакцией, например, биосинтеза флавоноидов, антоцианов или других связанных метаболитов, а также генов или транскрипционных факторов, участвующих в этих процессах.

Введение

Рак стебля тополя, вызванный некротрофными грибковыми патогенами, Valsa sordida и Botryosphaeria dothidea, являются двумя важнейшими болезнями деревьев в Северном Китае, которые нанесли серьезный ущерб развитию экологических и экономических плантаций тополей. Болезни тополя при раке всегда возникают на коре стволов и ветвей, в то время как язвы являются их типичными симптомами. После начала болезней расширяющиеся поражения афтозным стоматином прогрессировали во флоэме, камбии и ксилеме хозяев. Далее они влияли на транспорт усваиваемых продуктов и воды по сосудистой системе. Тем не менее, каким образом патогены рака препятствуют транспортировке флоэмы и ксилемы, остается неясным.

Для выявления механизмов транспортировки углеводов и воды в тополях, инфицированных возбудителями рака, нами были предложены методы опоясывания флоэмой или эпидермиса 1,2, сочетающие в себе классические манипуляции с огородным поясом и метод инокуляции возбудителя (инокуляция с блокированием мицелия). Эти методы могут моделировать процесс заражения и закупорку воды и углеводов, вызванную патогенами афтозного стоматита.

Наше исследование показало, что грибковые патогены вызывают отмирание полога тополя, первоначально вызывая углеродное голодание, а не отказ гидравлики. Удивительно, но мы наблюдали особый ризогенез на стеблях тополя, который был связан с инокуляцией возбудителей стеблевого рака: обильные красные придаточные корни (ARs) растут из нижнего конца верхних стеблей (напротив верхнего края флоэмы или опоясывающих колец эпидермиса). Более того, наши эксперименты показали, что продукция АР является универсальной при взаимодействии патогенов тополя и рака. Они могут быть получены из видов тополей или клонов в разном возрасте (1, 2 или даже 6 лет) и могут быть индуцированы различными патогенами рака (V. sordida и B. dothidea) или их изолятами. Кроме того, мы изучили механизмы окраски тополиных ARs, и результаты показали, что он связан с биосинтезом флавоноидов и антоцианов, а также с регуляцией экспрессии генов, связанных со светом генов (или генных модулей) в условиях освещения6. Таким образом, эти АР тополя, индуцированные патогенами, могут быть использованы в качестве стабильной и идеальной экспериментальной системы для изучения взаимодействия растений и патогенов, биологии корней, а также функции и экспрессии генов, связанных со светом.

В этом исследовании мы представим и предоставим протокол для создания экспериментальной системы ARs тополя с помощью опоясывающего пути инокуляции; кроме того, мы указываем на важнейшие факторы, влияющие на образование АР, и подробно останавливаемся на потенциальном применении опоясывающей инокуляции в изучении биологии корней тополя и других физиологических процессов, связанных с реакцией на свет.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Индукция АР тополя путем опоясывающей инокуляции

  1. Культура возбудителя грибкового рака
    1. Растворите 6 г картофельного экстракта, 20 г декстрозы и 20 г агара в 1000 мл воды для приготовления среды картофельного агара декстрозы (PDA). Стерилизуйте среду при температуре 121,1 °C в течение 30 минут и разлейте среду в чашки Петри (диаметром 9 см), каждая чашка содержит около 20 мл среды PDA.
    2. Инокулируйте активированный куб мицелия гриба (~0,5 см) в центр чашки Петри PDA.
    3. Инкубируйте инокулированные планшеты PDA в темноте при температуре 28 °C в течение 7-10 дней.
    4. Инкубированную среду КПК с грибковым мицелием разрезать на ремни (1,2 см в ширину; около 3-6 см в длину).
  2. Заготовка материалов из тополя
    1. Выберите 1-2-летние, сильнорастущие саженцы тополя.
    2. Выбирайте зрелые стебли/ветви саженцев тополя (1-2 см в диаметре, без болезней и заражения вредителями).
    3. Промойте места прививки (около 30 см над землей или основанием ветвей) стеблей/ветвей тополя; Стерилизуйте стебли/ветви 75% спиртовым раствором.
  3. Индукция АР с помощью флоэмного опоясывания-инокуляции
    1. Тщательно опоясайте эпидермис и флоэму стерилизованных стеблей/ветвей тополя, удалите опоясанные кольца флоэмы (шириной 1 см, включая частичный камбий) и обнажите белые внутренние ткани камбия/ксилемы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 1.3.2-1.3.4 подробно описывают альтернативные методы инокуляции.
    2. Полностью покройте область опоясывания ремнями мицелия (шириной 1,2 см) в качестве флоэмного опоясывающего инокуляционного лечения (ОФ). Гифы гриба обращены к обнаженной ксилеме.
    3. Соскребите и повредите обнаженную внутреннюю ткань камбия стерилизованными ножами, а затем привите ремни PDA (шириной 1,2 см) на области опоясывания в качестве процедуры удаления камбия (GR).
    4. Опоясывайте участки непосредственно некультивированными лентами PDA среднего размера (шириной 1,2 см) в качестве контрольного опоясывающего материала (GC).
    5. Оберните привитые стебли/ветви эластичной, бесцветной и прозрачной прививочной лентой (или полиэтиленовой пленкой). Оберните 4 слоя, чтобы сохранить влагу.
    6. Привяжите привитые стебли/ветки (металлическими, пластиковыми или деревянными) палками (более 50 см), чтобы защитить их от бурелома.
    7. В ходе эксперимента культивируйте опоясанные тополиные материалы с регулярным поливом.
    8. Наблюдайте со стороны и фиксируйте образование тополиных AR через 14-30 дней после прививки.
  4. Индукция АР через эпидермис, опоясывание-инокуляция
    1. Выберите и подготовьте инокулированные материалы, как описано в шаге 1.2.
    2. Аккуратно опоясайте эпидермис стеблей/ветвей тополя.
    3. Удалите кольца эпидермиса (1,0 см в ширину) и обнажите зеленую ткань флоэмы.
    4. Слегка и вертикально соскребите ткань флоэмы четыре раза и обнажите внутреннюю структуру флоэмы.
    5. Прививайте опоясанную область эпидермиса с помощью мицелия гриба (eGP) и ремней PDA (eGC). Выполните инокуляционные манипуляции, аналогичные шагам 1.3.2-1.3.4.
    6. Оберните привитые стебли прививочной лентой (или полиэтиленовой пленкой), как описано в пункте 1.3.5.
    7. Управляйте тополями и наблюдайте за AR, как описано в шагах 1.3.6-1.3.8.

2. Создание экспериментальной системы для исследования световых генов методом опоясывающей инокуляции

  1. Индуцировать АР тополя с помощью метода опоясывания флоэмы (шаги 1.3.2-1.3.4).
  2. В качестве альтернативы можно индуцировать АР тополя, используя метод опоясывающей эпидермиса инокуляции, как описано в шаге 1.4.5.
  3. Оберните инокулированные патогенами участки стеблей/ветвей тополя (15 см в высоту) алюминиевой фольгой (обработка от затенения, S) или без пленки из алюминиевой фольги (световая обработка, L).
  4. Подвяжите стебли/ветви к палкам длиной >50 см, чтобы защитить их от буреломов. Регулярно выращивайте тополя и ухаживайте за ними, а также поддерживайте их в хорошем орошении во время эксперимента, как описано в шагах 1.3.6-1.3.7.
  5. Удалите алюминиевую фольгу со стеблей через ~20 дней после прививки.
  6. Немедленно осмотрите и сфотографируйте закрашенные (S) и незакрашенные тополя из алюминиевой фольги ARs (L).
  7. Выращивайте затененные тополя AR при солнечном свете или других искусственных источниках света/условиях.
  8. Снимите прививочные ленты (или полиэтиленовые пленки) и соберите АР тополя через 1-5 дней после воздействия света.
  9. Оберните все AR образцы алюминиевой фольгой. Для тополиных AR, подвергшихся обработке затенением, образцы собирают в темноте.
  10. Замочите образцы АР в жидком азоте и храните их при температуре -80 °C для дальнейшего исследования.
  11. Соберите освещенные или неэкспонированные АР тополя (проводимые в темноте) после обертывания их алюминиевой фольгой и храните при температуре 4 °C для морфологических и других анализов in situ .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 показан рабочий процесс возбудителей стеблевого рака, вызывающих придаточные корни с помощью опоясывающей инокуляции. Проведенные здесь эксперименты показали, что как возбудители стеблевого рака, V. sordida, B. dothidea, так и их изоляты (из разных хозяев, регионов или патогенности) могут индуцировать образование АР у видов тополей. В этом протоколе мы использовали изолят V. sordida CZC, CFCC86775, а B. dothidea изоляты SD50 и SD81 для получен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Виды тополей склонны производить AR или боковые корни (LR) из стеблевых черенков, что способствует их размножению и является моделью для изучения биологии корней у древесных растений 7,8. Более того, исследования показали, что инокуляция конкретных микроорганизмов, таких как полезные бактерии (Agrobacterium rhizogenes 9,10; Ризобактерии, способствующие росту раст...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было совместно профинансировано Центральным общественным научным учреждением «Фонд базальных исследований» Государственной ключевой лаборатории генетики и селекции деревьев (грант No CAFYBB2020ZY001-2) и Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 32171776) для Цзяпин Чжао.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АгарСоларбиоА8190   Обеспечьте питание для роста грибков
Алюминиевая фольгаБиошарпBS-QT-027BДля обеспечения затенения зараженного участка
Опоясывающий ножMoGong Фирмы по производству аппаратных инструментовОпоясать эпидермис стеблей/ветвей тополя
Прививочная лентаCAPI5смДля фиксации грибков на растениях
PD (Экстракция картофеля, Декстроза) СоларбиоП7360Обеспечьте питание для роста грибков
Полиэтиленовая пленкаМяоцзе413703Для фиксации грибков на растениях
Чашки ПетриBkman biological Co., Ltd 90 ммПодготовка среды PDA
Термостатический инкубаторШанхайская лаборатория Кунтянь Инструментарий Ко., ЛтдКТД-6000Обеспечьте среду для роста грибков

Ссылки

  1. Xing, J., et al. Fungal pathogens of canker disease trigger canopy dieback in poplar saplings by inducing functional failure of the phloem and cambium and carbon starvation in the xylem. Physiol Mol Plant Pathol. 101523, 112(2020).
  2. Xing, J., et al. Stem canker pathogen Botryosphaeria dothidea inhibits poplar leaf photosynthesis in the early stage of inoculation. Front Plant Sci. 13, 1008834(2022).
  3. Li, P., et al. Fungal canker pathogens trigger carbon starvation by inhibiting carbon metabolism in poplar stems. Sci Rep. 9, 10111(2019).
  4. Li, J., et al. Effects of Valsa sordida infection on photosynthetic characteristics and carbon-water metabolism in Populus alba var. Pyramidalis. For Res. 34 (05), 58-68 (2021).
  5. Xing, J., et al. Comparisons of photosythetic response and characteristics in leaves of Populus alba var. pyramidalis infected by the stem canker pathogen Valsa sordida and Botryosphaeria dothidea at Early Stage. Scientia Silvae Sinicae. 57 (09), 121-129 (2021).
  6. Li, M. Physiological and molecular mechanisms of adventitious root formation in poplar induced by stem canker pathogens [Master's Thesis]. , Chinese Academy of Forestry. (2023).
  7. Ahkami, A. H. Systems biology of root development in Populus: Review and perspectives. Plant Sci. 335, 111818(2023).
  8. Dickmann, D. I. Silviculture and biology of short-rotation woody crops in temperate regions: then and now. Biomass Bioenergy. 30, 696-705 (2006).
  9. De Almeida, M. R., et al. Environmental control of adventitious rooting in Eucalyptus and Populus cuttings. Trees. 31, 1377-1390 (2017).
  10. Zavattieri, M. A., Ragonezi, C., Klimaszewska, K. Adventitious rooting of conifers: influence of biological factors. Trees. 30, 1021-1032 (2016).
  11. Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World J Microbiol Biotechnol. 28, 1327-1350 (2012).
  12. Khan, Z., et al. Growth enhancement and drought tolerance of hybrid poplar upon inoculation with endophyte consortia. Curr Plant Biol. 6, 38-47 (2016).
  13. Paz, I. C., et al. Eucalyptus growth promotion by endophytic Bacillus spp. Genet Mol Res. 11, 3711-3720 (2012).
  14. Olah, B., Briere, C., Becard, G., Denarie, J., Gough, C. Nod factors and a diffusible factor from arbuscular mycorrhizal fungi stimulate lateral root formation in Medicago truncatula via the DMI1/DMI2 signalling pathway. Plant J. 44, 195-207 (2005).
  15. Maillet, F., et al. Fungal lipochitooligosaccharide symbiotic signals in arbuscular mycorrhiza. Nature. 469, 58-63 (2011).
  16. Felten, J., et al. The ectomycorrhizal fungus Laccaria bicolor stimulates lateral root formation in poplar and Arabidopsis through auxin transport and signaling. Plant Physiol. 151, 1991-2005 (1991).
  17. Splivallo, R., Fischer, U., Gobel, C., Feussner, I., Karlovsky, P. Truffles regulate plant root morphogenesis via the production of auxin and ethylene. Plant Physiol. 150, 2018-2029 (2009).
  18. Druege, U., et al. Molecular and physiological control of adventitious rooting in cuttings: phytohormone action meets resource allocation. Ann Bot. 123, 929-949 (2019).
  19. Steffens, B., Rasmussen, A. The physiology of adventitious roots. Plant Physiol. 170, 603-617 (2016).
  20. Bannoud, F., Bellini, C. Adventitious rooting in Populus species: update and perspectives. Front Plant Sci. 12, 668837(2021).
  21. Li, Y., et al. Signal communication during microbial modulation of root system architecture. J Exp Bot. 75 (2), 526-537 (2024).
  22. Pascale, A., Proietti, S., Pantelides, I. S., Stringlis, I. A. Modulation of the root microbiome by plant molecules: the basis for targeted disease suppression and plant growth promotion. Front Plant Sci. 10, 1741(2020).
  23. Zoratti, L., Karppinen, K., Luengo Escobar, A., Häggman, H., Jaakola, L. Light-controlled flavonoid biosynthesis in fruits. Front Plant Sci. 5, 534(2014).
  24. Bellini, C., Pacurar, D. I., Perrone, I. Adventitious roots and lateral roots: similarities and differences. Annu Rev Plant Biol. 65, 639-666 (2014).
  25. Sorin, C., et al. Auxin and light control of adventitious rooting in Arabidopsis require ARGONAUTE1. Plant Cell. 17 (5), 1343-1359 (2005).
  26. Jung, J. K., McCouch, S. Getting to the roots of it: Genetic and hormonal control of root architecture. Front Plant Sci. 4, 186(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Рак стебля тополяинокуляция патогеномразвитие корнейгрибковые патогеныморфогенез корнейвоздействие затенениябиосинтез флавоноидовбиосинтез антоцианов
Придаточные корни тополя, индуцированные возбудителями стеблевого рака: экспериментальная система для изучения биологии корней и процессов, связанных с реакцией на свет
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.