Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Создание модели тяжелого воспаления роговицы у крыс на основе кюретажа эпителия роговицы в сочетании с роговичными швами

1.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67305

⸱

22 ноября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, 2School of Clinical Medicine, Guizhou Medical University, 3The Second People's Hospital of Guiyang City, 4Department of Biomedical Sciences, School of Infection, Inflammation and Immunology, College of Medicine and Health, University of Birmingham

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы разработали модель тяжелого воспаления роговицы на крысах с помощью кюретажа эпителия роговицы в сочетании с наложением роговичных швов. В исследовании оценивались паттерны воспаления роговицы, пролиферация эпителия и изменения в лимбальных стволовых клетках в условиях воспаления.

Аннотация

Воспаление роговицы, особенно тяжелое воспаление роговицы, играет значительную роль в развитии дисфункции лимбальных стволовых клеток роговицы. Построение соответствующих животных моделей может помочь нам сосредоточиться на влиянии тяжелого воспаления на лимбальные стволовые клетки роговицы. Средство для удаления ржавчины диаметром 2 мм было использовано для удаления центрального эпителия роговицы крыс Sprague Dawley (SD) для создания травмы. Затем центральная строма роговицы была сшита нейлоновыми швами, чтобы вызвать стойкое воспаление. Таким образом, была построена модель воспаления роговицы с истиранием центрального эпителия роговицы и наложением швов на центральную строму, что вызвало тяжелое воспаление роговицы. Наблюдались изменения воспаления роговицы и состояния лимбальных стволовых клеток через 1, 3 и 7 суток после моделирования. На3-е сутки после моделирования лимб роговицы крыс был сильно отечен, с выраженной неоваскуляризацией и локальной гиперплазией, которые являются типичными признаками дефицита лимбальных стволовых клеток. К7-м суткам отек роговицы постепенно усиливался, а неоваскуляризация продолжала нарастать. С помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР) и иммунофлуоресцентного окрашивания мы обнаружили, что воспалительные факторы эпителия роговицы были значительно повышены, дифференцировка эпителия роговицы была аномальной, эпителиальные стволовые клетки роговицы были значительно снижены, а пролиферация и стволовость клеток также уменьшились. Таким образом, эта модель демонстрирует, что тяжелое воспаление может вызвать повреждение лимбальных стволовых клеток без прямого повреждения лимбальных стволовых клеток. Эта модель полезна для наблюдения за влиянием тяжелого воспаления на биологические механизмы стволовых клеток и обеспечивает идеальную платформу для изучения механизмов дисфункции эпителиальных стволовых клеток роговицы, вызванной воспалением.

Введение

Дисфункция лимбальных стволовых клеток (ЛСКД) характеризуется стойкими дефектами эпителия, васкуляризацией роговицы, хроническим воспалением, рубцеванием и конъюнктивизацией роговицы 1,2. Он может возникнуть из-за истощения или дисфункции лимбальных стволовых клеток после тяжелых заболеваний глазной поверхности, таких как химические ожоги, термические ожоги, синдром Стивенса-Джонсона и ятрогенные повреждения, вызванные глазными операциями 2,3,4. Патогенетические механизмы ЛСКД в основном связаны с изменениями в стволовых клетках и нарушениями в микроокружении стволовых клеток 5,6, что влияет на гомеостаз эпителия роговицы 2,7. Существует два основных типа изменений судьбы лимбальных стволовых клеток при ЛСКД: 1) Потенциал направленной дифференцировки эпителиальных стволовых клеток роговицы становится аномальным, что приводит к их дифференцировке в эпителиальные клетки кожи. Об этом свидетельствует снижение экспрессии специфического для эпителиальных клеток роговицы фактора транскрипции Pax6 и роговичных кератинов Krt12 и Krt3, наряду со значительным увеличением экспрессии маркеров плоскоклеточной метаплазии, связанных с кожей, Krt10, Krt1 и Sprr1b8; 2) Повреждение поверхности глаза напрямую разрушает лимбальные стволовые клетки роговицы, что приводит к некрозу или апоптозу, и впоследствии вызывает пролиферацию конъюнктивальной ткани, покрывающей роговицу9. Сообщалось, что во время развития ЛСКД воспалительные клетки, такие как макрофаги, нейтрофилы и дендритные клетки, значительно увеличиваются в микроокружении эпителиальных стволовых клеток роговицы. Соответственно, такие цитокины, как интерферон-гамма (ИФН)-γ, фактор некроза опухоли (TNF)-α, интерлейкин (IL)-1β и воспалительные белки макрофагов (MIP)-1α/β также демонстрируют значительное повышение10.

Были созданы различные модели ЛСКД, в том числе индуцированные швами, химическими повреждениями и пятнистостью хлорида бензалкония11. Каждая из этих моделей имеет свои преимущества и недостатки. Химические повреждения могут повредить всю поверхность глаза и непосредственно разрушить лимбальные стволовые клетки12. Хлорид бензалкония действует аналогично химическим повреждениям, но обладает относительно медленнымдействием13. Модель роговичного шва может вызвать стабильную и долгосрочную воспалительную реакцию, но воспалительная реакция относительно слабая и не может вызвать ЛСКД.

Для изучения роли и механизмов воспаления в развитии ЛСКД роговицы была создана животная модель, сочетающая кюретаж центрального эпителия роговицы с наложением роговичных швов. Эта модель вызывает стойкое воспаление эпителия роговицы без прямого повреждения лимбальных стволовых клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры соответствовали рекомендациям ARVO по использованию животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения и были одобрены Комитетом по этике животных Медицинского университета Гуйчжоу (одобрение No 2305192). Крысы были размещены в Центре животных Медицинского университета Гуйчжоу, соблюдая соответствующие правила обращения с животными.

1. Отбор животных

  1. Используйте самок крыс Sprague-Dawley (SD) в возрасте 7-8 недель. Убедитесь в отсутствии поражений глазной поверхности при исследовании с помощью щелевой лампы.
  2. Простерилизуйте инструменты с помощью быстрого стерилизатора. Необходимые инструменты включают средство для удаления ржавчины роговицы, маркер для взятия проб кожи размером 2 мм, иглодержатели, ножи для пластинчатого слоя, офтальмологические хирургические ножницы и щипцы.
  3. Обезболивают крыс 1,25% трибромэтанолом путем внутрибрюшинного введения в дозе 0,3 мл на 100 г массы тела. Оцените глубину анестезии по щипцу пальца ноги. Закапывайте одну каплю глазных капель тропикамид для расширения зрачков. Нанесите глазные капли бупивакаина гидрохлорида на глаз. Используйте мазь-смазку для глаз на контралатеральный глаз для поддержания влажности.
  4. Продезинфицируйте кожу и волосы вокруг глаз йодофором.
  5. Установите модель воспаления.
    1. Поместите крысу в положение бокового пролежня. Подставьте глазное яблоко под операционный микроскоп.
    2. Центральную роговицу помечали с помощью маркера для отбора проб кожи размером 2 мм, а помеченный центральный эпителий роговицы соскабливали с помощью средства для удаления ржавчины роговицы.
    3. Наложите три 120° роговичных швов с помощью нейлоновой проволоки 10-0, иглодержателя, а также офтальмологических хирургических ножниц и щипцов примерно в 3 мм от лимба, не проникайте в роговицу14,15.
  6. Нанесите глазную мазь Офлоксацин в конце процедуры, чтобы предотвратить инфицирование.
  7. Наблюдайте и фотографируйте роговицу на1-й,3-й и7-й день после операции с помощью линзы с 10-кратным увеличением щелевой лампы. Запишите такие симптомы, как заживление эпителия роговицы, гиперемия конъюнктивы, отек роговицы, лимбальная гиперемия и неоваскуляризация роговицы.

2. Расчет воспалительного индекса

  1. Рассчитайте индекс воспаления поверхности глаза после установления животной модели.
    1. Оцените застой цилиарного тела следующим образом: нет застойных явлений (0 баллов); наличие заложенности менее 1 мм (1 балл); гиперемия от 1 мм до 2 мм (2 балла); гиперемия от 1 мм до 2 мм (3 балла).
    2. Оценка центрального отека роговицы следующая: отека нет (0 баллов); отек с четкой видимостью радужной оболочки глаза (1 балл); отек с неясной видимостью радужной оболочки глаза (2 балла); отек с не видимой радужной оболочкой (3 балла).
    3. Оценка парацентрального отека роговицы следующая: отека нет (0 баллов); отек с четкой видимостью радужной оболочки глаза (1 балл); отек с неясной видимостью радужной оболочки глаза (2 балла); отек с не видимой радужной оболочкой (3 балла).
    4. Рассчитайте индекс воспаления, сложив все баллы и разделив его на 9.

3. Оценка неоваскуляризации роговицы

  1. Наблюдайте за неоваскуляризацией роговицы с помощью щелевой лампы.
    1. Анализ и обработка изображений с помощью программного обеспечения для обработки изображений с щелевой лампой16.
    2. Регистрируйте рост неоваскуляризации роговицы в каждый момент времени, измеряя самую длинную неоваскуляризацию роговицы по направлению к центральной роговице с минимальной кривизной.
    3. Оцените их следующим образом: Класс 0: Аваскулярный; Класс 1: Микро (<1 мм); Степень 2: Мягкая (от 1 мм до 1,5 мм); Степень 3: Умеренная (>1,5 мм до 2 мм); Степень 4: Тяжелая (>2 мм).

4. Анализ биологии модели

  1. Подготовьте замороженные образцы глаз.
    1. Обезболить крысу 4-5% изофлураном и усыпить ее путем вывиха шейки матки.
    2. В положении бокового пролежня поднимите глазное яблоко крысы микропинцетом наружу и разрежьте конъюнктиву вдоль верхнего и нижнего купола глаза с помощью глазных ножниц.
    3. Перережьте зрительный нерв, уделяя внимание сохранению целостности эпителия роговицы.
    4. Высушите пятна крови и воду на поверхности глазного яблока фильтровальной бумагой и поместите их в закладную коробку с оптимальной температурой резки (ОКТ) для встраивания.
    5. Удалите пузырьки в закладной коробке с помощью пипетки объемом 200 μл, заморозьте ее с помощью жидкого азота, а затем сохраните внедренные образцы в холодильнике при сверхнизких температурах.
  2. Подготовьте замороженные срезы глазных яблок.
    1. Перед приготовлением замороженного среза необходимо предварительно охладить криостат примерно до -28 °C, а держатель образца - до -26 °C.
    2. Достаньте замороженные образцы из холодной морозильной камеры и поместите их в криотом примерно на 1 час.
    3. Предварительно охладите замороженный образец в криотоме в течение 10 минут. Отметьте образец карандашом, закрепите его на площадке для образцов с помощью OCT, а после охлаждения зафиксируйте их вместе на решетке для разделки.
    4. Отрегулируйте положение и направление замороженного образца и зафиксируйте его. Сначала разрежьте участки размером 20 мкм, пока не будет видна центральная роговица. Затем получить срезы размером 6 мкм путем непрерывной нарезки и собрать срезы на заранее подготовленных адгезионных стеклах.
    5. Отметьте на предметном стекле название, материал, время разреза, название и номер ткани. Поместите его при комнатной температуре (RT) примерно на 30 минут.
    6. После сушки секций сложите их в коробку и храните в холодильнике при сверхнизкой температуре для резерва.
  3. Проводят окрашивание гематоксилином и эозином.
    1. Достаньте заранее подготовленные замороженные срезы из холодильника при сверхнизкой температуре и поместите их в вытяжной шкаф при RT для сушки.
    2. Зафиксируйте срезы с помощью 4% параформальдегида в течение 15 мин. Промойте образцы 1x PBS в течение 5 мин.
    3. Поместите срезы образцов со предметными стеклами на держатель предметных колец и погрузите их в цилиндр с красителем с раствором красителя гематоксилина при температуре RT на 5 минут.
    4. Медленно промойте образец, содержащий предметные стекла, водой из-под крана, чтобы смыть плавающий краситель, поместите их в емкость с красителем с 0,1% спиртом соляной кислоты и быстро удалите через 1-2 с.
    5. Медленно промойте образец водой из-под крана в течение 15 минут.
    6. Извлеките образец из воды и погрузите предметные стекла в резервуар с эозиновым красителем; оставить на RT на 3 мин.
    7. Медленно промойте образец водопроводной водой, смойте излишки красителя и выполните градиентное обезвоживание спирта с использованием 75% спирта, 80% спирта, 95% спирта, 100% спирта (один) и 100% спирта (два). Взбейте срезы в каждой концентрации в течение 2 мин.
    8. Сделайте образцы прозрачными в течение 2 мин в ксилоле (1) и ксилоле (2) соответственно.
    9. Высушите образец в вытяжном шкафу, загерметизируйте срезы с помощью герметика и будьте осторожны, чтобы не образовались пузырьки.
    10. Поместите слайды в слайд-бокс на RT. Сфотографируйте срезы с помощью микроскопа.
  4. Проводят иммунофлюоресцентное окрашивание.
    1. Извлеките замороженные срезы и поместите их в коробку при температуре RT в вытяжном шкафу для просушки.
    2. Отметьте название окрашиваемого антитела на бланке предметного стекла замороженного образца.
    3. Зафиксируйте образцы с 4% параформальдегидом в RT на 15 минут. В коробку добавляли небольшое количество водопроводной воды, чтобы предотвратить высыхание образца.
    4. Удалите фиксатор параформальдегида и промойте образец три раза с 1x PBS буфером. Будьте осторожны, чтобы не смыть экземпляр.
    5. Высушите жидкость вокруг участка ткани, накройте образец раствором клеточной мембраны (0,2% TritonX-100) и инкубируйте при лучевой терапии в течение 20 минут.
    6. Удалите раствор клеточной мембраны и промойте срезы три раза по 5 минут каждый с 1x PBS буфером.
    7. Высушите срезы тканей, накройте образец раствором, блокирующим иммунофлюоресценцию (2% БСА), и инкубируйте при ЛТ в течение 1 ч.
    8. Приготовьте первичное антитело и разбавитель (1% BSA) во время инкубации в соответствии с инструкциями производителя.
    9. Удалите блокирующую жидкость и высушите образец с помощью всасывающего насоса. Добавьте подготовленное первичное антитело, накройте коробку крышкой и инкубируйте его в холодильнике при температуре 4 °C в течение ночи (инкубировать около 12-16 часов) вдали от света.
    10. Выбросьте первичное антитело и промойте образец четыре раза по 10 минут каждый в PBS.
    11. На этапе очистки приготовьте вторичное разведение антител в соответствии с инструкциями производителя.
    12. Удалите PBS, высушите образец и добавьте к нему подготовленное вторичное антитело. Накройте образец крышкой и инкубируйте при RT в течение 1 часа вдали от света.
    13. Удалите вторичное антитело, промойте образец 4 раза 1x PBS буфером в течение 10 минут каждый и покройте все предметное стекло 1x PBS буфером.
    14. Снимите PBS, высушите образец и загерметизируйте секции монтажной средой, содержащей DAPI, чтобы убедиться в отсутствии пузырьков воздуха. Заверните горки в оловянную фольгу и держите их на расстоянии 4 °C от света.
    15. Делайте фотографии с помощью системы лазерного конфокального микроскопа или с помощью вертикальной системы флуоресцентных камер (скорость сканирования: 4 μс/пиксель, разрешение сканирования: 1024 x 1024).
  5. Одноклеточный суспензионный препарат эпителия роговицы крысы
    1. После эвтаназии удалите глазные яблоки пинцетом, смоченным в 75% спирте, и поместите их в 1x сбалансированный раствор соли Хэнкса (HBSS), содержащий 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 10% пенициллин-стрептомицин, приготовленный заранее.
    2. Очистите глазные яблоки и используйте 1x HBBS, содержащий 10% FBS и 10% пенициллин-стрептомицин, дважды по 5 минут каждый.
    3. Удалите конъюнктиву по склеральному краю; Оставьте склеральный край на расстоянии около 1 мм. Снова дважды промойте ткань роговицы 1x HBBS, содержащим 10% FBS и 10% пенициллин-стрептомицина.
    4. Перенесите чистую ткань роговицы в дополненную гормональную эпидермальную среду (SHEM), содержащую 2 Ед/мл Dispase II. Закройте пломбу и поместите ее при температуре 4°C на 14-16 часов.
    5. Подготовьте пинцет, беззубый пинцет, устройство для восстановления радужной оболочки глаза и хирургический стерилизатор.
    6. Под операционным микроскопом аккуратно отделите эпителий роговицы по краю роговицы.
    7. Промойте эпителий роговицы 1x HBSS, содержащим 10% пенициллин-стрептомицин, в течение 5 минут.
    8. Перенесите эпителиальную ткань роговицы в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 200 мл трипсина, и инкубируйте в инкубаторе с 5% содержаниемCO2, 37 °C. Каждые 5 минут трижды встряхивайте пробирку центрифуги, чтобы переварить эпителиальный лист роговицы в одноклеточную суспензию.
    9. Добавьте равное количество среды ШЕМ, чтобы остановить действие раствора для расщепления трипсина, и поместите его в режим лучевой терапии.
  6. Клонирование эпителиальных клеток роговицы
    1. Подготовьте клетки трофобласта.
      1. Когда плотность роста клеток мыши NIH 3T3 достигнет 80-90%, отбраковывают клеточную культуральную среду. Добавьте предварительно подготовленную питательную среду митомицина 10 мг/мл NIH 3T3 и инкубируйте при 37 °C в течение 2,5 ч.
      2. Удалите среду, промойте клетки 1x HBSS, замените новой клеточной средой NIH 3T3 и продолжайте инкубацию в инкубаторе сCO2 (5%CO2, 37 °C).
    2. Приготовьте суспензию эпителиальных клеток роговицы и подсчитайте клетки в соответствии с необходимым соотношением.
    3. Во время приготовления суспензии эпителиальных клеток роговицы обрабатывают клетки NIH 3T3, обработанные митомицином.
      1. Выбросьте надосадочную жидкость, промойте клетки 1x HBSS, добавьте 1 мл раствора трипсина-ЭДТА и инкубируйте при RT в течение 2-3 минут.
      2. Добавьте равное количество дополнительной гормональной эпителиальной среды (среда SEM: DMEM/F12, 10 нг/мл эпидермального фактора роста мыши [EGF], 10 мкг/мл инсулин-трансферрин-селена [ITS], 5% FBS, 1% пенициллин-стрептомицин, 0,5% диметилсульфоксид [DMSO], 0,5 мг/мл гидрокортизона), аккуратно пипеткуйте, чтобы получить клеточную суспензию, и подсчитайте клетки.
    4. Используйте планшет на 12 лунок и добавьте 0,5 мл среды SHEM в каждую лунку.
    5. Смешайте эпителиальные клетки роговицы с клетками NIH 3T3 с плотностью 500 эпителиальных клеток роговицы/см2 и 5 x 105 NIH 3T3 клеток/см2. Добавьте по 1 мл среды SHEM в каждую лунку.
    6. Добавьте 1 мл клеточной смеси в каждую лунку и аккуратно пипеткой, чтобы равномерно распределить клетки.
    7. Инкубировать в инкубаторе (5%СО2, 37 °С), меняя среду каждые 2-3 дня. Выращивание в течение 12-14 дней.
  7. Окрашивание в кристально-фиолетовый цвет
    1. Примерно через 12 дней, когда эпителиальные клоны роговицы вот-вот сольются, удалите питательную среду и добавьте по 1 мл 4% раствора параформальдегида в каждую лунку, покрывая клетки полностью. Зафиксируйте ячейки на 15 минут в режиме RT.
    2. Удалите 4% параформальдегид и промойте лунки три раза 1x PBS в течение 5 минут каждая.
    3. Удалите 1x PBS буфер и добавьте 0,4% раствор кристаллического фиолетового красителя в каждую лунку. Окрашивать в течение 30 минут на RT.
    4. Удалите или утилизируйте раствор кристаллического фиолетового красителя и промойте его три раза 1x PBS в течение 10 минут каждый.
    5. Высушите лунки на воздухе по RT до полного высыхания.
    6. Используйте обычную вертикальную систему для фотосъемки под микроскопом (скорость сканирования: 4 μс/пиксель, разрешение сканирования: 1024 x 1024).
  8. Экстракция мРНК роговицы
    1. Возьмите офтальмологические ножницы, роговичные ножницы, зубчатые щипцы, электрический скребок для эпителия роговицы, тризол, центрифужные пробирки объемом 1,5 мл без РНКазы, а также холодильник.
    2. Приобретение эпителия
      1. Обезболить крысу 4-5% изофлураном и усыпить ее после вывиха шейки матки. Поместите животное в боковое положение. Подстригите усы мыши ножницами для глаз, чтобы не загораживать обзор.
      2. Поместите крысу под хирургический микроскоп и отрегулируйте его на соответствующую высоту, чтобы сфокусироваться на глазном яблоке. Используйте зубчатые щипцы, чтобы мягко надавить и обнажить глазное яблоко. Приподнимите конъюнктиву крысы и с помощью чистого электрического эпителиального скребка роговицы соскоб центральную область эпителия роговицы размером 2 мм.
      3. Соскобленный эпителий роговицы соберите чистыми зубчатыми щипцами, сбрызгенными спиртом. Поместите собранную ткань в центрифужную пробирку, содержащую 1 мл тризола.
      4. Работайте как можно быстрее, чтобы промыть собранную ткань в центрифужной пробирке объемом 50 мл, содержащей дважды деионизированную воду. Впитайте лишнюю воду фильтровальной бумагой. Опрыскайте 75% спиртом и приступайте к следующему этапу.
      5. Снова поднимите конъюнктиву крысы с помощью зубчатых щипцов. С помощью роговичных ножниц вогнутой стороной вверх разрежьте конъюнктиву вдоль лимба, оставив около 0,5 мм белой конъюнктивы.
      6. Соскоблите эпителий роговицы в радиусе 2 мм на лимбе роговицы с помощью электрического скребка. Соберите ткань, как описано выше. Соберите центральный эпителий роговицы из трех глазных яблок и лимбальный эпителий из трех глазных яблок.
      7. Собранные ткани поместите в отдельные пробирки с реагентом для экстракции РНК тризола объемом 1 мл. Выполняйте всю операцию на льду, чтобы сохранить целостность РНК. Немедленно приступайте к следующим действиям или храните образцы в морозильной камере при сверхнизкой температуре при температуре -80 °C для последующего использования.
    3. Разморозьте образец на льду, используйте ультразвуковой гомогенизатор тканей для лизирования клеток. Установите мощность ультразвукового гомогенизатора на 25%, время на 2 с на всплеск, время интервала на 5 с, общее время на 2 мин. Дайте постоять на льду 10 минут.
    4. Добавьте хлороформ (1/5 от общего объема, примерно 200 мкл) в каждый образец, тщательно перемешайте путем переворачивания в течение 30 с и центрифугируйте при 400 х г в течение 10 мин при 4 °С.
    5. Осаждение РНК
      1. После центрифугирования жидкость внутри центрифужной пробирки разбивается на три части. Верхний прозрачный слой — это РНК, средний белый мутный слой — ДНК и белки, а нижний слой — тризол. Осторожно нанесите пипеткой около 500 мкл верхнего прозрачного слоя в новую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл, стараясь не допустить аспирации белого осадка в среднем слое. При случайной аспирации повторите центрифугирование, чтобы снова собрать прозрачный слой.
      2. Добавьте равное количество предварительно охлажденного изопропанола в пробирку центрифуги, содержащую прозрачный слой, примерно 500 μл, переверните пробирку несколько раз для тщательного перемешивания, затем немедленно поместите ее в морозильную камеру при температуре -80 °C на 20-30 минут. Этот шаг направлен на ускорение осаждения РНК.
    6. Извлеките образец и немедленно центрифугируйте при 400 x g в течение 10 минут при 4 °C. На дне пробирки центрифуги видно небольшое количество белого хлопьевидного осадка; Выбросьте надосадочную жидкость.
    7. Добавьте в каждую трубку заранее подготовленный и охлажденный льдом 70% этанол. Немедленно центрифугировать при 4°С в охлаждаемой центрифуге при 400 x g в течение примерно 10 мин; Повторите вышеуказанные действия один раз, чтобы тщательно смыть осадок. На этом этапе предварительно простерилизуйте вытяжной шкаф ультрафиолетовым светом в течение 15 минут.
    8. После извлечения пробирок центрифуги и удаления надосадочной жидкости снова центрифугируйте при температуре 4 °C при температуре приблизительно 250 x g в течение 2 минут. С помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл осторожно отсосите излишки спирта со стороны, противоположной осадку, и как можно тщательнее высушите. Поместите в предварительно стерилизованный УФ-вытяжной шкаф для просушки, высушите осадок на воздухе в течение примерно 15 минут.
    9. Приготовьте раствор, добавив 1 мл ингибитора РНКазы в 40 мл воды с диэтилпирокарбонатом (ДЭПК). Добавьте соответствующее количество смеси ингибитора воды/РНКазы DEPC, около 20-30 мкл, чтобы растворить образец. Если осадка много, добавьте 30-50 μл. Сразу приступайте к ПЦР с обратной транскрипцией.
  9. ПЦР с обратной транскрипцией
    1. Убедитесь в наличии следующих предметов: ПЦР-аппарат, центрифужные пробирки объемом 1,5 мл без РНКазы, ПЦР-пробирки объемом 0,2 мл, ледяная баня или холодильник, пипетка и наконечники без РНКазы.
    2. Измерьте концентрацию РНК с помощью микрообъемного спектрофотометра. Для каждого образца убедитесь, что в реакционную систему добавлен 1 г РНК.
    3. Система обратной транскрипции имеет общий объем 20 μл. Рассчитайте общее количество необходимых реагентов исходя из количества образцов. Перемешиваем в соответствии с соотношением, указанным в инструкции.
    4. Подготовьте реакционную систему на льду, сделайте ее вихревой и кратковременно центрифугируйте. Инкубировать при 42 °C в течение 15 мин и при 90 °C в течение 30 с.
    5. Используйте кДНК, полученную в процессе обратной транскрипции, либо непосредственно для количественного анализа ПЦР в режиме реального времени, либо храните в холодильнике при температуре -80 °C.
  10. Количественная реакция ПЦР в реальном времени
    1. Используйте набор количественных реагентов для ПЦР17 в реальном времени с реакционной системой объемом 10 μл. Используйте последовательности праймеров, показанные в таблице 1.
    2. Добавьте описанную выше реакционную систему в 96-луночный планшет или восьмиполосную пробирку специально для ОТ-ПЦР. Убедитесь, что образцы хорошо перемешаны. Проверьте наличие пузырьков в пробирках перед тем, как поместить их на ПЦР-машину.
    3. Амплифицируйте ген с помощью цикла ПЦР (95 °C в течение 5 мин), 40 циклов (95 °C в течение 10 с, 60 °C в течение 30 с) и завершите сбор данных для расчета значения 2-ΔΔ Ct. Обрабатывайте, анализируйте и отображайте данные с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Как показано на рисунке 1А, при наблюдении с помощью щелевой лампы мы обнаружили, что заживление эпителия роговицы нарушено. В нормальных условиях центральный эпителий роговицы полностью заживал в течение 24-48 ч после удаления, но при иссечении центрального эпителия роговицы в сочетании с моделью шва новые кровеносные сосуды продолжали существовать. На третий день после создания модели наблюдался значительный отек лимбальной роговицы и неоваскуляризация, при этом местно проявлялись типичные...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Воспаление играет ключевую роль в развитии дефицита лимбальных стволовыхклеток18, но его специфические механизмы и эффекты требуют дальнейшего изучения. Чтобы решить эту проблему, мы индуцировали ЛСКД путем соскабливания центрального эпителия роговицы и наложения швов на центральную строму роговицы, чтобы вызвать тяжелое воспаление роговицы. Мы наблюдали за развитием воспаления роговицы и состоянием лимбальных стволовых клеток на 1, 3 и 7 день после моделирования....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было частично поддержано Научно-техническими проектами провинции Гуйчжоу (QKHJC-ZK[2024]ZD043), Научным фондом провинции Фуцзянь для выдающихся молодых ученых (2023J06053 [to S.O]); Фонд естественных наук Китая (No.82101084 [to S.O.] и China Scholarship Council (CSC, 202306310049 [to Y.W.]).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10-0 шовная линияAlcon, Inc., США8065698001
2 мм роговичного трепинаSuzhou XVI Vision Company, Китайhttp://www.66vision.com/
20 μ L, 100 μ L, 1 мл головки для пипеток, планшеты для культивирования клеточных культур, центрифужные пробиркиGuangzhou Jiete Biological Co., Ltd., Китайhttps://www.jetbiofil.com/index.html-20
/-80 ° C холодильникQingdao Haier Company, Китайhttps://www.haier.com/cn/
А 10-мл шприц&nbsp; Zhejiang Condelai Medical Device Co., Ltd., Китайhttps://en.kdlchina.com/zhejiang/25.html
придерживаться слайдаShiTai Company188105
амиленового спиртаШанхай. Macklin Biochemical, Китайhttp://www.macklin.cn/products/
АнтицитокертинAbcam, Великобританияab76318
Антитело против кератина 12 EPR17882Abcam, Великобританияab185627
Антитело против PAX6Abcam, Великобританияab195045
Противозачистные слайды, защитные стеклаJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd. , Китайhttps://cn.citotest.com/
АвтоклавХираяма, Японияhttps://hirayama.com.cn/about/
AvertinShanghai Aladdin Biochemical Technology, Китайhttps://www.aladdin-e.com/zh_cn/A111225.html
ChloroformShanghai Biological Engineering Co., Ltd., Китайhttps://www.siobp.com/web
CO2 Oven incubator, ультразвуковая дробилка, центрифугаThermo Fisher Technologies Inc., СШАhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
Конфокальный микроскопShanghai Qinxiang Scientific Instrument Co., Ltd., Китайhttps://www.clinx.cn/about
Эпителиальные щипцы роговицыSuzhou XVI Vision Company, Китай53418D
DAPIVector. Inc., СШАH-1000
DEPC вода  Shanghai Biological Engineering Co., Ltd., Китайhttps://www.siobp.com/web
крем для глаз Dicuro (крем для глаз офлоксацин)Santian Pharmaceutical Corporation, Японияhttps://www.santen.com/asia
D-KSFM, питательная среда, двойное антитело, и PBSThermo Fisher Scientific, Inc., СШАhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
ED1AbD Serote c, Великобритания 
Электронные весыShanghai Ohaus Biotechnology Company, Китайhttp://shbio.com/company
Корпус мембраныParafilm, Inc., США https://www.sigmaaldrich.cn
тест-полоска с флуоресцеином натрия использовалась в офтальмологииTianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd., Китайhttps://www.eworldtrade.com/c/jingmingtechnological/
Флуоресцентная инвертированная фазово-контрастная микрографическая системаTE-2000U, Nikon, Японияhttps://www.microscopyu.com/museum/eclipse-te2000-inverted-microscope
Замороженная настольная центрифугаEppendorf, Германияhttps://www.eppendorf.sh.cn 
Рама из стеклянного листаXiamen Tianjing Biotechnology Co., Ltd., Китайhttp://www.tagene.net/
H-1200 с герметиком DAPIXiamen Juin Biotechnology Co., Ltd., Китайhttps://www.bosonbio.com.cn/
набор для окрашиванияAuragene, Китайhttp://jushengwu.com/a048/
набор для раствора гематоксилин-эозина красителяAURAGEN, СШАP032IH
Высокоточные и низкоточные электронные весыSdolis, Германияhttps://www.solisinverters.com/global
изопропанолShanghai Sinopharm Chemical Reagents Co., Ltd., Китайhttps://en.reagent.com.cn/
антитело Ki-67Abcam, Великобританияab16667
жидкий азотXiamen Yidong Gas Co., Ltd., Китайhttps://www.china.tdk.com.cn/tdk_chn_en/tdk_xiamen/
Держатель для микрорукSuzhou XVI Vision Company, Китайhttp://www.66vision.com/
Порошок мультиформальдегидаSigm, Америкаhttps://www.sigmaaldrich.cn
Центрифуга для нормальной температуры 46Eppendorf, Германияhttps://www.thermofisher.cn
OCTShanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd., Китай4583
Обычная биологическая микрографическая системаEclipse 50i, Nikon, Японияhttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/zh_CN/products/upright-microscopes/eclipse-ni-series
PBSShanghai Anjin Biotechnology Co., Ltd, КитайSH30256.01
ПЦР, и реакторный аппаратBiometra Thermocycler, Германияhttps://www.analytik-jena.com/products/life-science/pcr-qpcr-thermal-cycler/thermal-cycler-pcr/biometra-tone-series/
Пипетки различных спецификацийEppendorf Company, Германияhttps://www.eppendorf.com/cn-zh/
Праймеры для Rt-PCRShanghai Bio-Tech Co., Ltd.
Промеаина гидрохлорид 0,5% глазные каплиAlcon, Inc., СШАhttps://www.alcon.com/about-us
антитела к ПМН крысыFitzgerald, США20R-PR020
Флуоресцентная количественная ПЦР в реальном времениПрикладные биосистемы,  СШАhttps://www.thermofisher.cn
Набор для обратной транскрипцииTAKARA, Японияhttps://www.takarabiomed.com.cn/
Щелевая лампаTOPCON, Японияhttps://topconchina.cn/
Гладкие щипцыSuzhou XVI Vision Company, Китайhttp://www.66vision.com/
Specimen-boxLambolid (Fuzhou) Biotechnology Co., Ltd., Китайhttp://chuangdianbio.com/
New Plus Pi Art High Technology Company Limited, Сингапурhttps://www.hi-p.com/
Зубчатые щипцыSuzhou XVI Vision Company, Китайhttp://www.66vision.com/
Глазные капли топпикамид (Medol)Alcon, Inc., СШАhttps://www.alcon.com/about-us
белка следовых нуклеиновых кислот тестер концентрацииThermo Fisher Technologies Inc., СШАhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
TrizolInvitrogen СШАhttps://www.fishersci.com/us/en/brands/IIAM0WMR/invitrogen.html
Zeiss, с хирургическим микроскопомCarl ZEIS, Германияhttps://www.zeiss.com/corporate/en/about-zeiss.html
MCA341GA Скамейка Superclean

Ссылки

  1. Ang, L. P., Tan, D. T. Ocular surface stem cells and disease: Current concepts and clinical applications. Ann Acad Med Singap. 33 (5), 576-580 (2004).
  2. Mao, Y., et al. Downregulation of p38 MAPK signaling pathway ameliorates tissue-engineered corneal epithelium. Tissue Eng Part A. 28 (23-24), 977-989 (2022).
  3. Sprogyte, L., Park, M., Di Girolamo, N. Pathogenesis of alkali injury-induced limbal stem cell deficiency: A literature survey of animal models. Cells. 12 (9), 1294(2023).
  4. He, X., et al. Lacrimal gland microenvironment changes after obstruction of lacrimal gland ducts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 63 (3), 15(2022).
  5. Le, Q., Chauhan, T., Deng, S. X. Diagnostic criteria for limbal stem cell deficiency before surgical intervention- A systematic literature review and analysis. Surv Ophthalmol. 65 (1), 32-40 (2020).
  6. Li, W., Hayashida, Y., Chen, Y. T., Tseng, S. C. Niche regulation of corneal epithelial stem cells at the limbus. Cell Res. 17 (1), 26-36 (2007).
  7. Ou, S. K., et al. The role of ectodysplasin a on the ocular surface homeostasis. Int J Mol Sci. 23 (24), 12(2022).
  8. Lin, S., et al. Limbal stem cell dysfunction induced by severe dry eye via activation of the p38 MAPK signaling pathway. Am J Pathol. 193 (11), 1863-1878 (2023).
  9. Jiang, G. J., Li, B. B., Fan, T. J. Timolol induces necroptosis, apoptosis and senescence concentration-dependently in rabbit limbal stem cells in vitro. Life Sci. 277, 119453(2021).
  10. Castro-Munozledo, F. Review: Corneal epithelial stem cells, their niche and wound healing. Mol Vis. 19, 1600-1613 (2013).
  11. Atalay, E., et al. Animal models for limbal stem cell deficiency: A critical narrative literature review. Ophthalmol Ther. 13 (3), 671-696 (2024).
  12. Delic, N. C., Cai, J. R., Watson, S. L., Downie, L. E., Di Girolamo, N. Evaluating the clinical translational relevance of animal models for limbal stem cell deficiency: A systematic review. Ocul Surf. 23, 169-183 (2022).
  13. Lin, Z., et al. A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).
  14. Ye, J., et al. Biomimetic nanocomplex based corneal neovascularization theranostics. J Control Release. 374, 50-60 (2024).
  15. Zhu, H. M., et al. A synergistic therapy with antioxidant and anti-VEGF: Toward its safe and effective elimination for corneal neovascularization. Adv Healthc Mater. 13 (5), 10(2024).
  16. Yu, J. W., et al. In vivo assembly drug delivery strategy based on ultra-small nanoparticles: Toward high drug permeation and accumulation for CNV treatment. Chem Eng J. 450, 137968(2022).
  17. Wu, H., et al. A SU6668 pure nanoparticle-based eyedrops: Toward its high drug accumulation and long-time treatment for corneal neovascularization. J Nanobiotechnol. 22 (1), 290(2024).
  18. Long, Q., et al. A novel tissue-engineered corneal epithelium based on ultra-thin amniotic membrane and mesenchymal stem cells. Sci Rep. 14 (1), 17407(2024).
  19. Giroux, V., Rustgi, A. K. Metaplasia: Tissue injury adaptation and a precursor to the dysplasia-cancer sequence. Nat Rev Cancer. 17 (10), 594-604 (2017).
  20. Herfs, M., Hubert, P., Delvenne, P. Epithelial metaplasia: Adult stem cell reprogramming and (pre)neoplastic transformation mediated by inflammation. Trends Mol Med. 15 (6), 245-253 (2009).
  21. Slack, J. M. Metaplasia and transdifferentiation: From pure biology to the clinic. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 369-378 (2007).
  22. Slack, J. M., Tosh, D. Transdifferentiation and metaplasia--switching cell types. Curr Opin Genet Dev. 11 (5), 581-586 (2001).
  23. Wang, S., et al. Impact of chronic smoking on meibomian gland dysfunction. PLoS One. 11 (12), e0168763(2016).
  24. Wu, Y., et al. Evolution of therapeutic strategy based on oxidant-antioxidant balance for fuchs endothelial corneal dystrophy. Ocul Surf. 34, 247-261 (2024).
  25. Li, Y., et al. Meibomian gland alteration in patients with systemic lupus erythematosus. Lupus. 31 (4), 407-414 (2022).
  26. Zhang, Y., et al. Histopathology-based diagnosis of Mooren's ulcer concealed beneath the pterygium on eye. J Histotechnol. 45 (4), 195-201 (2022).
  27. Tseng, S. C., Hatchell, D., Tierney, N., Huang, A. J., Sun, T. T. Expression of specific keratin markers by rabbit corneal, conjunctival, and esophageal epithelia during vitamin A deficiency. J Cell Biol. 99 (6), 2279-2286 (1984).
  28. Espana, E. M., et al. Characterization of corneal pannus removed from patients with total limbal stem cell deficiency. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (9), 2961-2966 (2004).
  29. Li, W., et al. Air exposure induced squamous metaplasia of human limbal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (1), 154-162 (2008).
  30. Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Exp Eye Res. 161, 101-105 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Лимбальные стволовые клеткинеоваскуляризация роговицымодель роговицы крысыиммунофлуоресцентное окрашиваниеанализ RT-qPCRотек роговицыдисфункция стволовых клеток
Создание модели тяжелого воспаления роговицы у крыс на основе кюретажа эпителия роговицы в сочетании с роговичными швами
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.