Протокол демонстрирует новую экспериментальную модель in vitro , которая может резюмировать биологию двух видов адгезивных клеточных линий с помощью трехмерного (3D) печатного каркаса. Описывается построение этой модели и операционные процедуры, от подготовки клеток и культивирования клеток до анализа и оценки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Модель ко-культивирования с использованием двух типов адгезивных клеточных линий
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
На имплантацию эмбриона влияют взаимодействия между различными типами клеток в интерфейсе мать-эмбрион. Прямые и косвенные связи между различными типами клеток в децидуальной кости имеют решающее значение для регуляции рецептивности эндометрия; Однако молекулярные механизмы, опосредующие это взаимодействие, до сих пор неясны. В связи с этим необходима модель для изучения процесса имплантации для создания комплексной модели in vitro , которая может резюмировать биологию взаимодействия эпителия эндометрия и стромы. Эта модель состоит из обычных пластин для клеточных культур и соответствующего каркаса, который создается с помощью трехмерной (3D) печати из недорогих материалов. В этой статье мы подробно описываем набор протоколов для построения модели, подготовки клеток, посева клеток, культивирования клеток, наблюдения и оценки. Кроме того, мы включили репрезентативные результаты с клетками, демонстрирующими хорошие условия роста под микроскопом. Это исследование было направлено на разработку моделей in vitro , которые имитировали бы взаимодействие между стромальными клетками эндометрия и эпителиальными клетками, а также между клетками трофобласта и клетками эндометрия.
Введение
Несмотря на обширные исследования беременности у человека, молекулярные механизмы на границе между матерью и плодом во время имплантации и ранней беременности остаютсяплохо изученными. Эндометрий человека в основном состоит из двух типов клеток: эпителиальных клеток эндометрия (ЭЭК) и стромальных клеток эндометрия (ЭСК). Имплантация проходит через три этапа: аппозиция, прикрепление и инвазия, которые приводят к развитию компетентного эмбриона и рецептивного эндометрия2. Учитывая этические ограничения исследований in vivo на людях, а также трудности в полном моделировании человеческого состояния у животных, построение моделей культуры эндометрия человека in vitro стало эффективным средством воспроизведенияпроцессов имплантации и ранней беременности. Эти модели ценны для исследования как нормальной, так и патологической беременности и обеспечивают основополагающую платформу для предварительного тестирования и валидации терапевтических вмешательств в трансляционной медицине.
Коммерческие камеры широко используются в клеточных биологических исследованиях. Эти камеры дают ценную информацию о миграции клеток и перекрестных помехах между различными типами клеток. Тем не менее, коммерческие камеры, как правило, являются одноразовыми и могут быть дорогостоящими4.
Большое количество моделей культуры человека in vitro, состоящих из эндометрия и бластоцисты, или суррогатов бластоцисты, было разработано для лучшего понимания подробного процесса имплантации. Эти модели, однако, все еще находятся на начальной стадии применения, поскольку 3D-структура представляет собой очень сложную экспериментальную установку, а некоторые специфические среды для дифференцировкистоят дорого.
Использование доступного оборудования для 3D-печати и относительно короткие сроки изготовления позволяют подгонять конструкции под различные экспериментальные цели. Методы 3D-печати помогают сократить временные затраты и позволяют создавать сложные конструкции по индивидуальному заказу. Эта технология значительно ускоряет разработку и итерацию прототипов, что делает ее ценным инструментом для исследователей в различных областях, позволяя им выполнять свою работу более эффективно 8,9,10.
Здесь мы представляем осуществимый и экономичный экспериментальный протокол для создания 3D-структуры и ее использования в качестве системы клеточной культуры, которая может моделировать взаимодействие между стромальными и эпителиальными клетками эндометрия для исследования рецептивности эндометрия во время имплантации эмбриона. Это обеспечивает настраиваемую и недорогую альтернативу коммерческим одноразовым материалам.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты, используемые в этом протоколе, можно найти в Таблице материалов. Если не указано иное, перед использованием все среды были предварительно отбалансированы до 37 °C.
1. 3D печать строительных лесов и макета конструкции
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги здесь были выполнены в соответствии с инструкцией по эксплуатации коммерческой машины для 3D-печати металлом. Эти шаги кратко описаны ниже (Дополнительный файл 1).
- Выравнивание печатной платформы
- Нажмите на значок меню на панели управления и перейдите в раздел «Утилиты». Выберите Bed Level (Уровень кровати ), чтобы начать процедуру выравнивания.
- Извлеките лист для печати со стола для печати и нажмите кнопку Готово. Печатная платформа поднимется на максимальную высоту для подготовки к выравниванию. Как только индикатор выполнения достигнет 100%, нажмите «Старт».
- Если принтер Metal X ранее не был выровнен, выберите «Сброс». Если это так, выберите «Пропустить » и перейдите непосредственно к шагу 1.1.5 (сканирование по 16 точкам).
- С помощью шестигранного ключа 2,5 мм поверните все выравнивающие винты с тремя станинами по часовой стрелке до упора. Затем ослабьте их, повернув против часовой стрелки на два полных оборота, чтобы установить их на средней высоте. Нажмите «Готово », чтобы продолжить.
- Принтер будет сканировать кровать в 16 обозначенных точках. Воздержитесь от прикосновений к кровати или каркасу во время этого процесса. Как только прогресс достигнет 100%, нажмите Далее.
- Печать листового приложения
- Удалите остатки металла или мусор опоры. Переведите ползунок «Вакуум» в положение «Вкл.».
- Дайте кровати опуститься и нагреться, затем нажмите Далее. Поместите лист для печати на вакуумную сетку и нажмите кнопку «Далее».
- Расположите листовую печатную машину над листом печати, совместив его с Z-образными рельсами в задней части камеры.
- Подождите, пока вакуум войдет в срабатывание и создаст прочное уплотнение. Как только вакуум будет включен, нажмите кнопку «Готово».
- Загрузка металлической нити накала
- Вручную расположите печатающую головку в центре области печати. Снимите крышку печатающей головки, сдвинув ее вверх и сняв с крепежных винтов.
- Коснитесь значка меню на доске параметров. Выберите Материалы из предложенных вариантов.
- Выберите Load Metal, чтобы начать процедуру загрузки. Выберите «Быстрая загрузка».
- Выберите конкретный тип металлического материала для загрузки (например, алюминий 6061-T6 | 3.3211 | 65028 | AlMg1SiCu).
- Наденьте катушку на держатель и нажмите кнопку «Далее». Закройте дверцу и дайте катушкам прогреться, затем нажмите «Далее».
- Вставьте материал в переднее входное отверстие печатающей головки (с маркировкой M) до тех пор, пока экструдер не начнет протягивать его.
- Печать металлических деталей
- На панели «Параметры печати» нажмите кнопку «Экспортировать устройство». Сохраните файл на USB-накопителе, отформатированном в FAT32, и вставьте его в принтер.
- Выберите значок меню на доске. Перейдите в раздел «Хранилище» и выберите «Печать из хранилища». Выберите файл детали, чтобы начать печать.
- Удаление металлической части
- Осторожно сдвиньте лист для печати и отпечатанные детали с печатной платформы. Аккуратно отсоедините детали от листа печати. Гибкий лист должен легко отслаиваться.
2. Подготовка к кокультуре клеток в 3D-модели
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать устойчивые к высоким температурам материалы в качестве расходных материалов для 3D-печати опор каркаса покровного стекла для 3D-печати, чтобы облегчить стерилизацию в автоклаве перед каждым использованием в экспериментах с клеточными культурами. В этом исследовании были использованы иммортализованные стромальные клетки эндометрия человека (HESC) и эпителиальные клетки эндометрия человека (Исикава). Ранее сообщалось о характеристике этих клеточных линий 5,6.
- Культивирование клеток и пассирование
- Приготовьте 50 мл комплементарной среды для hESC, добавив среду DMEM/F12 + 2 мМ L-глютамина + 10% сыворотку плода крупного рогатого скота (FBS) + 1% раствор пенициллина/стрептомицина.
- Приготовьте 50 мл дополнительной среды для Исикавы, добавив модифицированную среду Dulbecco Modified Eagle + 10% FBS + 1% раствор пенициллина/стрептомицина.
- Размораживание клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Купленная клеточная линия была отгружена на сухом льду в замороженном состоянии. Его следует хранить в паровой фазе жидкого азота или при температуре ниже -130 °C.- Подготовьте все необходимое стерилизованное оборудование и фермент диссоциации, а также подогрейте дополнительную среду до 37 °C.
- Быстро разморозьте клетки на водяной бане при температуре 37 °C с редкими легкими покачиваниями. Перенесите клеточную суспензию в пробирку, содержащую 5 мл базальной питательной среды, и центрифугируйте при 200 x g в течение 5 минут.
- Осторожно удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 5 мл приготовленной полной питательной среды и распределите ее по двум колбам для культур Т25. Культивируйте клетки в инкубаторе при 37 °C и 5%CO2.
- Подготовка клеток с покровным стеклом
- Используйте квадратный покровный лист толщиной 18 мм в качестве поверхности клеточной культуры; Убедитесь, что покровное стекло чистое и стерильное.
- Покройте покровное стекло на дно 12-луночного планшета 200 мкл внеклеточного матрикса (ВКМ) в концентрации 200-300 мкг/мл. Держите тарелку при температуре 37 °C в течение 1 часа.
- Снимите ЭБУ с пластины. Осмотрите клетки на предмет соответствующей конфлюенции и убедитесь, что плотность обеих клеточных линий составляет около 70%-80%
- Удалите отработанную среду и промойте клетки 3 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) 2x.
- Добавьте 2 мл фермента диссоциации и культивируйте клетки при температуре 37 °C в течение 2 минут, чтобы отделить их.
- Нейтрализовать полной питательной средой и создать одноклеточную суспензию путем пипетирования вверх и вниз.
- Возьмите 100 мкл клеточной суспензии и смешайте с трипановым синим (коэффициент разбавления =2).
- Наденьте покровное стекло на камеру гемоцитометра. Заполните обе боковые камеры клеточной суспензией, содержащей трипановый синий.
- Посчитайте количество клеток в квадратах с обеих сторон под 20-кратным микроскопом и рассчитайте плотность клеток.
- Перенесите клетки в подготовленную тарелку со свежей средой и инкубируйте при 37 °C с 5%CO2. Засейте hESC в лунку в концентрации 1 x 105 клеток/мл в течение 24 ч.
- Для клеточной линии Исикавы на следующий день засейте ячейку в лунку без покровного стекла.
3. Сборка модели совместной культуры
- Тщательно замочите каркасы этиловым спиртом и двойной дистиллированной водой (ДДВ) на 2 суток. Подмостки простерилизовать автоклавом при температуре 121 °C и высушить.
- Добавьте около 2 мл комплементарной среды для клеточной линии Исикавы в лунку для культивирования Исикавы, следя за тем, чтобы уровень жидкости покрывал покровное стекло.
- Перенесите защитное покрытие с hESC на строительные леса и держите боковую сторону ячейкой вниз. Вставьте строительные леса в хорошо возделываемую Исикаву. Для второго комплекта переверните эту схему, перенеся крышку покровного стекла с помощью Исикавы на строительные леса и вставив подмостки в хорошо культивируемый hESC. Используйте ячейки без каркаса для анализа роста клеток независимо друг от друга.
- Инкубируйте систему совместного выращивания при 37 °C, 5%CO2. Период сокультуры может варьироваться в зависимости от плана эксперимента, но обычно колеблется от 24 до 72 часов.
4. Получение изображения
- Осторожно удалите питательную среду и осторожно промойте клетки стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS).
- Удалите покровные листы с прикрепленными клетками с посуды для культур с помощью тонких щипцов или пинцета. По желанию поместите покровные листы в новую посуду с PBS, чтобы предотвратить высыхание во время переноса.
- Возьмите чистое предметное стекло микроскопа и поместите каплю PBS. Аккуратно перенесите покровное стекло, содержащее ячейки, на каплю монтажной среды, расположив ячейки лицевой стороной вниз на предметном стекле.
- Поместите подготовленное предметное стекло на предметный столик инвертированного микроскопа. Выберите подходящий объектив (например, 10x, 20x) и отрегулируйте фокусировку с помощью ручек грубой и тонкой фокусировки.
- Установите параметры микроскопа, такие как интенсивность освещения и настройки камеры. С помощью программного обеспечения микроскопа можно получить изображения клеток с желаемым увеличением и полем зрения. Отрегулируйте время экспозиции и другие параметры изображения для оптимизации качества изображения.
5. Обработка изображений
- Нажмите кнопку Открыть , чтобы открыть изображение, нажмите Обработка > Фильтры > Улучшение, чтобы > выбрать локальную коррекцию, и нажмите кнопку Применить.
- Нажмите кнопку Редактировать > > Преобразовать в Шкалу Серого 8. Нажмите «Улучшить», выберите «Применить контраст».
- Нажмите Подсчитывать и измерять объекты. Нажмите Вручную, выберите диапазон и настройте гистограмму, чтобы убедиться, что все ячейки покрыты.
- Нажмите «Применить маску», закройте текущее окно, нажмите «Автоматические яркие объекты > измерения», выберите «Измерение» и выберите «Эра», «Дендрик», «Плотность» и «Размер».
- Нажмите «Автоматические яркие объекты», затем нажмите «Подсчет». Нажмите «Экспортировать данные », чтобы экспортировать данные измерений в таблицу.
6. Забор клеток
- Снимите покровные стекла со предметного стекла микроскопа и переложите их в чистую и сухую лунку.
- Соберите клетку Исикавы с помощью реагента для выделения РНК для транскриптомного исследования или реагента для лизиса Ripa для протеомных исследований.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для hESC метод посева покровного стекла был более эффективным для получения изображений после иммунного окрашивания. В качестве альтернативы, hESC может быть собран с помощью реагента для выделения РНК или реагента для лизиса Ripa. Клеточные линии, культивируемые на покровном листе или поверхности пластины, могут быть заменены; Тем не менее, мы рекомендуем засевать клетки, подготовленные для визуализационного анализа, на покровном листе.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На рисунке 1 показан самодельный каркас для клеточных стекол, используемый в этом процессе, который включает в себя верхнее опорное кольцо, предназначенное для крепления к стандартным 12-луночным планшетам для клеточных культур, дополненное держателем предметного стекла базальных клеток с четырьмя L-образными стержневыми структурами.
Согласно рисунку 2, плотность обоих типов клеток в условиях кокультуры (рисунок 2...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Описан упрощенный и экономически эффективный протокол для непрямого кокультивирования стромальных и эпителиальных клеток эндометрия. В этом методе используется самодельный каркас для клеточных стекол, который состоит из верхнего опорного кольца, предназначенного для крепления к стандартным 12-луночным планшетам для клеточных культур, дополненного держателем предметного стекла базальных клеток с четырьмя L-образными стержневыми структурами. Такая установка облегчает разделение стромальных...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Благодарности
Мы хотим поблагодарить всех участников, участвующих в этом исследовании. Мы также высоко ценим помощь в области визуализации со стороны компании Light Innovation Technology Ltd, Шэньчжэнь. Данное исследование было поддержано Фондом естественных наук Китая (грант No 82201851), Шэньчжэньской научно-технической программой (грант No. JCYJ20210324141403009, RCYX20210609104608036), Шэньчжэньский фонд строительства ключевых медицинских дисциплин (грант No. SZXK028) и Шэньчжэньской женской и детской больнице Баоань (грант No. БАФИ 2023003).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 10x Hanks′ Сбалансированный солевой раствор | Solarbio | H1046 | 1/10 |
| 12-луночный прозрачный TC-обработанный планшет | Corning | 3513-25 | |
| см² Колба для клеточных культур | Corning | ||
| 430639-алюминий | марккованый | 6061-T6-DMEM | |
| /F12 | Sigma-aldrich | D2906-Dulbecco | |
| ' s Модифицированный Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| FBS | Gibco | 10099141C | 1/10 |
| Фетальная бычья сыворотка | Gibco | 10099141C | |
| ITS Премикс | Biocoat | 354350 | 1/100 |
| Matrigel Matrix | Corning | 354248 | ECM |
| Metal X | Markforged | M F-PR-5000-Пенициллин-стрептомицин | |
| Gibco | 15140122 | 1/100 | |
| Круглый покровный стекло | Biosharp | BS-18-RC-TrypLE | |
| Select (10X) | Gibco | A1217701 | фермент диссоциации |
Ссылки
- Iske, J., Elkhal, A., Tullius, S. G. The fetal-maternal immune interface in uterus transplantation. Trend Immunol. 41 (3), 213-224 (2020).
- Dey, S. K., et al. Molecular cues to implantation. Endocrine Rev. 25 (3), 341-373 (2004).
- Li, X., et al. Three-dimensional culture models of human endometrium for studying trophoblast-endometrium interaction during implantation. Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 120(2022).
- Goss, S., et al. Mod3d: A low-cost, flexible modular system of live-cell microscopy chambers and holders. PLoS One. 17 (6), e0269345(2021).
- Zheng, J., Liu, L., Wang, S., Huang, X. Sumo-1 promotes Ishikawa cell proliferation and apoptosis in endometrial cancer by increasing sumoylation of histone h4. Int J Gynecol Cancer. 25 (8), 1364-1368 (2015).
- Damdimopoulou, P., et al. Human embryonic stem cells. Best Pract Res Clin Obst Gynaecol. 31, 2-12 (2016).
- Gargett, C. E., Schwab, K. E., Deane, J. A. Endometrial stem/progenitor cells: The first 10 years. Hum Reprod Update. 22 (2), 137-163 (2015).
- Lerman, M. J., Lembong, J., Gillen, G., Fisher, J. P. 3d printing in cell culture systems and medical applications. Appl Phys Rev. 5 (4), 041109(2018).
- Palmara, G., Frascella, F., Roppolo, I., Chiappone, A., Chiadò, A. Functional 3d printing: Approaches and bioapplications. Biosens Bioelectron. 175, 112849(2021).
- Li, S., et al. Multiscale architecture design of 3d printed biodegradable zn-based porous scaffolds for immunomodulatory osteogenesis. Nat Comm. 15 (1), 3131(2024).
- Arnold, J. T., Lessey, B. A., Seppälä, M., Kaufman, D. G. Effect of normal endometrial stroma on growth and differentiation in Ishikawa endometrial adenocarcinoma cells1. Cancer Res. 62 (1), 79-88 (2002).
- Casper, R. F., Yanushpolsky, E. H. Optimal endometrial preparation for frozen embryo transfer cycles: Window of implantation and progesterone support. Fertil Steril. 105 (4), 867-872 (2016).
- Cooke, P. S., et al. Stromal estrogen receptors mediate mitogenic effects of estradiol on uterine epithelium. Proc Natl Acad Sci U S Am. 94 (12), 6535-6540 (1997).
- Owusu-Akyaw, A., Krishnamoorthy, K., Goldsmith, L. T., Morelli, S. S. The role of mesenchymal-epithelial transition in endometrial function. Hum Reprod Update. 25 (1), 114-133 (2019).
- Evans, J., Hutchison, J., Salamonsen, L. A., Azlan, A. Endometrial inflammasome activation accompanies menstruation and may have implications for systemic inflammatory events of the menstrual cycle. Hum Reprod. 35 (6), 1363-1376 (2020).
- Gołąbek-Grenda, A., Olejnik, A. In vitro modeling of endometriosis and endometriotic microenvironment - challenges and recent advances. Cellular Signal. 97, 110375(2022).
- Berger, C., Boggavarapu, N. R., Menezes, J., Lalitkumar, P. G. L., Gemzell-Danielsson, K. Effects of ulipristal acetate on human embryo attachment and endometrial cell gene expression in an in vitro co-culture system. Hum Reprod. 30 (4), 800-811 (2015).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
