Идентификация и количественная оценка нарушенных метаболитов у пациентов в критическом состоянии с использованием метаболомики на основе ЯМР

Summary

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) используется для выявления нарушений регуляции метаболитов у пациентов с различными заболеваниями. Этот метод позволяет количественно оценить нарушенные метаболиты, раскрывая патофизиологические идеи. В данной статье мы описываем пошаговую процедуру применения подхода, основанного на ЯМР, для определения метаболических характеристик пациентов.

Abstract

Метаболомика становится важным подходом к отражению индивидуальной реакции на патофизиологические условия. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) стала инструментом для выявления метаболических нарушений у пациентов в критическом состоянии с такими состояниями, как острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС), тяжелый острый панкреатит (САП), острое повреждение почек (ОПП) и сепсис. Спектральные данные из образца сыворотки исследуемой и контрольной группы записываются с помощью ЯМР-спектрометра с частотой 800 МГц и обрабатываются с помощью средств обработки и анализа ЯМР. Кроме того, проводится строгий статистический анализ, такой как одномерные и многомерные тесты, чтобы точно определить значимые метаболиты, которые затем точно идентифицируются и количественно оцениваются с помощью программного обеспечения для количественного определения метаболитов ЯМР. Кроме того, анализ путей показывает нарушенные биохимические циклы, которые приводят к тяжести заболевания. С помощью этого комплексного подхода исследователи стремятся получить более глубокое представление о метаболических изменениях, связанных с этими критическими заболеваниями, потенциально прокладывая путь к лучшему пониманию болезни и улучшению диагностики и стратегий лечения.

Introduction

Несмотря на постоянные усилия по обеспечению эффективной диагностики заболеваний во всем мире, таргетная терапия до сих пор не достигла своего истинного потенциала. Различные подходы, такие как транскриптомика, протеомика и т.д., привели к идентификации нескольких биомаркеров, но они не имели достаточной клинической значимости из-за недостаточной чувствительности и специфичности ^1,2. Таргетная терапия является большой проблемой при некоторых мультифакториальных заболеваниях, что в конечном итоге приводит к более высокой смертности. Существует потребность в лучшем понимании основного механизма и патофизиологии сложных заболеваний, существующих с широкой гетерогенностью. Таким образом, в этом отношении развитие метаболомики произвело революцию в терапевтических разработках, что в конечном итоге может помочь в адаптации схем лечения различных критических заболеваний, таких как острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС), сепсис и тяжелый острый панкреатит (САП).

Метаболомика — это комплексный подход, направленный на идентификацию и количественное определение молекул с малой молекулярной массой (метаболитов, таких как аминокислоты, липиды, пептиды, органические кислоты и витамины) в различных биожидкостях, клетках или тканевых экстрактах. Эти метаболиты, которые обычно весят менее 1500 Да, играют активную роль в биохимических процессах, отражая прогрессивную схему биологического состояния организма. Они включают субстраты для ключевых ферментативных процессов, промежуточные продукты в биологических путях и побочные продукты клеточного метаболизма. Следовательно, метаболомика фиксирует подробный отпечаток влияния диеты, лекарственных взаимодействий и болезненных состояний. Метаболитные изменения являются высокочувствительными индикаторами метаболизма и биологических путей, что позволяет коррелировать с фенотипическими экспрессиями и возникающими патофизиологическими аномалиями ^3,4. Первоначальные вариации метаболитов могут служить ранними индикаторами тяжести заболевания, в то время как временные изменения могут помочь в мониторинге эффективности лечения, прогрессирования заболевания и клинических исходов ^5,6,7. Таким образом, метаболомика улучшает клинические анализы и различные другие омиксные подходы, переопределяя заболевания через клинические, физиологические и биохимические конечные точки 8,9,10,11,12,13. Аналитические возможности метаболомики используются для мониторинга и определения восприимчивости к заболеванию путем изменения концентраций метаболитов ^14,15.

В этом контексте масс-спектрометрия (МС) и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) стали основными аналитическими платформами для профилирования метаболитов в биологических образцах. Эти методы используются как для целенаправленной, так и для нецелевой идентификации и количественного определения метаболитов 16,17,18. Каждая платформа имеет свои преимущества и ограничения, но неразрушающий характер ЯМР делает ее предпочтительной в различных исследованиях in vivo и для характеристики структуры неизвестных соединений, особенно на начальных этапах исследований метаболомики. Фракционирование образца, дериватизация и ионизация, необходимые перед МС, могут привести к систематическим ошибкам и часто приводить к потере образца, влияя на динамические характеристики, которые может быть зафиксирована с помощью ЯМР-спектроскопии с минимальной подготовкой образца или без нее. Основным ограничением ЯМР является его более низкая чувствительность по сравнению с МС, который обеспечивает более низкий предел обнаружения, что затрудняет обнаружение менее распространенных^{метаболитов19}. Тем не менее, такие достижения, как сверхпроводящие магниты с высоким разрешением, криогенное охлаждение ЯМР-зондов и методы, повышающие чувствительность, смягчили это ограничение 20,21,22. В качестве дополнительного подхода к геномике и протеомике, метаболическое профилирование с использованием ЯМР-спектроскопии набирает обороты в качестве предпочтительного метода 23,24,25. Минимальная подготовка образцов, воспроизводимость и повторяемость ЯМР делают его ценным инструментом для улавливания присущих метаболитам динамических характеристик, несмотря на^{его проблемы с} чувствительностью.

Несколько исследовательских групп успешно провели метаболомику, точно определив нерегулируемый метаболический профиль пациентов при^{различных заболеваниях}, таких как ОРДС 28,29,30,31,32,33, пневмония ³⁴, сепсис⁷, камни в желчном пузыре³⁵ и панкреатит³⁶. Метаболомные исследования пациентов в критическом состоянии на основе ЯМР сыграли важную роль в отслеживании прогрессирования от синдрома системного воспалительного ответа (SIRS) до синдрома полиорганной дисфункции (MODS), который является основной причиной смертности и заболеваемости в отделениях интенсивной терапии (ОИТ)³⁷. В исследовании Stringer et al. образцы плазмы использовались для изучения метаболических изменений у пациентов с острым повреждением легких (ОПЛ), вызванным сепсисом, по сравнению с контрольной группой³⁸. Ключевые метаболиты, обнаруженные в этом пилотном исследовании, отражали задействованные метаболические пути и их связь с клиническими показателями. Это исследование было расширено до метаболомики сыворотки крови для дифференциации сепсиса от ранних стадий механизмов повреждения легких при ОРДС³². Кроме того, в другом исследовании, посвященном ОРДС, были выявлены мощные сывороточные биомаркеры, которые четко дифференцируют острое повреждение легких/ОРДС и здоровые контрольные группы, что дает представление о системных метаболических изменениях, соответствующих острому началу повреждения легких^39,40.

ЯМР-спектроскопия представляет собой высокопроизводительный и автоматизированный аналитический метод, который предоставляет надежную и непредвзятую информацию о метаболическом отпечатке, раскрывая лежащую в основе патофизиологию³⁸. Клиническое применение и биологическая интерпретация данных ЯМР зависят от получения высококачественных спектров, содержащих богатую информацию. Поэтому обеспечение точного, единообразного и хорошо сформулированного сбора, обработки и анализа данных имеет решающее значение. Таким образом, цель данного исследования состоит в том, чтобы использовать основные этапы метаболомики на основе ЯМР для идентификации и количественной оценки метаболитов. В этом исследовании выделены ключевые этапы протокола, необходимого для исследования клинической метаболомики (Рисунок 1), такие как выбор подходящих образцов, сбор и хранение, обработка и подготовка образцов, сбор и анализ данных, идентификация и количественная оценка интересующего метаболита и, в конечном итоге, интерпретация результатов в клиническом контексте для получения соответствующих выводов. Каждый из этих этапов имеет важное значение для использования ЯМР-спектроскопии в метаболомике для получения важных биологических и клинических знаний.

Protocol

Этическое одобрение (код IEC: 2022-71-PhD-126) было получено от IEC Института последипломного образования Санджая Ганди (SGPGIMS), Лакхнау. От пациентов или их родственников были получены письменные и информированные согласия на проведение исследования и публикацию данных в исследовательских целях. Более того, исследование проводилось в соответствии с институциональными рекомендациями.

1. Дизайн исследования и этическое обоснование

1. Определите размер выборки для каждой группы. Внимательно изучите и установите критерии отбора участников. Кроме того, если план исследования требует включения образцов человека или животных, то получите этическое разрешение от соответствующего институционального этического комитета (IEC) до начала сбора образцов.
2. Отдельные пациенты с ОРДС классифицируются как легкие, умеренные и тяжелые, на основе диагностических критериев Берлинского определения 2012 года, основанного на парциальном давлении кислорода в артериальной крови (PaO2) и фракции вдыхаемого кислорода (FiO2) (P/F). Пациенты с ОРДС с диапазоном P/F 300-200 оцениваются как легкие, 200-100 - как умеренные, а ниже 100 - как тяжелые³⁸. Здесь мы сосредоточились на двух группах: пациенты с легкой и умеренной степенью тяжести ОРДС (см. таблицу 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Исследование включает использование сыворотки, полученной из образцов крови, для проведения метаболомики на основе ЯМР. В этом исследовании средний возраст участников, включенных для справки, составлял 42 года (± 10,9 лет), с гендерным распределением 2 мужчин и 6 женщин.

Категория	Соотношение P/F
Легкая	300-200
Умеренный	200-100
Сильная	100-0

Таблица 1: Категоризация пациентов с ОРДС.

2. Отбор, сбор и обработка образцов

1. Выполните изоляцию сыворотки, выполнив описанные ниже действия.
   1. Для экспериментов соберите 2 мл образцов крови из артерий с помощью стерильной иглы в обычном (без добавок) и стерильном флаконе. Оставьте образец сворачиваться на 30 минут при комнатной температуре. Для данного исследования были отобраны 4 пациента с диагнозом ОРДС легкой степени тяжести и 4 пациента с умеренным ОРДС.
   2. Центрифугируйте образец при 3100 х г в течение 15 мин для отделения сыворотки²⁵. Переложите сыворотку в стерильные микроцентрифужные пробирки, сделав аликвоты меньшего объема (т. е. 400-500 мкл), нанесите на них соответствующую маркировку (имя пациента, номер CR, точка дня рождения и т. д.) и храните при температуре -80 °C для будущего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе эксперимент может быть приостановлен и возобновлен в удобное время.
2. Обработайте образец сыворотки перед экспериментами ЯМР, выполнив следующие действия.
   1. Разморозьте образец перед проведением ЯМР-экспериментов. Смешайте 250 мкл аликвоты сыворотки с 250 мкл буферного раствора солевого фосфата (содержащего 100% D₂O, 0,9% NaCl, 50 мМ буфера фосфата натрия, pH 7,4) для минимизации колебаний pH.
   2. Перемешайте смесь в течение нескольких секунд (~15 с), чтобы убедиться, что она однородно перемешана. Наконец, подготовленный образец переносят в чистую ЯМР-пробирку с коаксиальной вставкой, содержащей триметилсилилпропионат (ТСП) в концентрации 0,05 мМ, который служит внешним эталоном для калибровки и количественного определения⁴¹.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для справки используется инертное и нереакционноспособное соединение, которое не взаимодействует с аналитами. Другие широко используемые референтные соединения включают тетраметилсилан (ТМС) и триметилсилилпропансульфонат натрия (ДСС).

3. Эксперименты с ЯМР

ПРИМЕЧАНИЕ: Основное внимание уделяется идентификации малых молекул в образцах сыворотки, поэтому мы использовали последовательность импульсов Карра-Перселла-Мейбума-Гилла (CPMG), которая подавляет сигналы макромолекул. Все образцы сыворотки в этом исследовании были зарегистрированы с помощью ЯМР-спектрометра с частотой 800 МГц, оснащенного криогенной трехрезонансной головкой TCI 5 мм с широкополосным обратным зондом и экранированным z-градиентом.

1. Поместите образец в магнит. Напишите команду wrpa (укажите номер эксперимента) и нажмите enter, чтобы настроить протонный эксперимент с программой cpmg pulse. Укажите имя пациента и другие необходимые данные, нажав на опцию «Заголовок».
2. Заблокируйте магнитное поле, написав команду Lock, нажмите Enter и выберите вариант 90% H₂O и 10% D₂O. Настройте и согласуйте пробник вручную с помощью ATMM, чтобы оптимизировать эффективность радиочастотных импульсов и максимизировать чувствительность. Проведите 1D градиентный шимминг, кликнув по топшим.
3. Задайте следующие параметры сбора данных, в том числе задержку релаксации 5 с, ширину спектральной развертки 12 частей на миллион (ppm) и время эхо-сигнала 300 мкс. Все эти параметры можно легко изменить, выбрав опцию «Параметры захвата » на верхней панели.
4. Примените уширение линии на 0,3 Гц с помощью функции экспоненциального окна, собирая данные в 64 000 точек за 128 сканирований. Эти параметры можно аналогичным образом изменить, выбрав опцию Параметры сбора данных на верхней панели. При нажатии на «Параметры получения» появится список спецификаций, и упомянутые атрибуты, наряду с другими параметрами, могут быть изменены в ходе оптимизации.
5. Получение спектров ЯМР с помощью инструментов обработки и анализа ЯМР. Как только окончательные спектры будут получены, напишите команды apk и absn и нажмите Enter для выполнения фазовой коррекции и базовой коррекции соответственно. Нажмите на опцию «Калибровать ось» на верхней панели, а затем откалибруйте пик TSP до 0 ppm автоматически или вручную.
6. Передача полученных данных из системы на рабочую станцию, где производится дальнейшая обработка и анализ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальная фаза завершена и может быть приостановлена. Предварительная обработка, анализ и интерпретация данных могут быть удобно выполнены.

4. Предварительная обработка данных

1. Проведите предварительную обработку данных с помощью инструментов обработки и анализа ЯМР и программного обеспечения для количественного определения метаболитов ЯМР.
   1. Иногда одной автоматической коррекции недостаточно, и в этом случае необходима еще и ручная коррекция. Чтобы выполнить фазовую коррекцию вручную, нажмите на опцию «Процесс » в верхней строке меню инструментов обработки и анализа ЯМР. Затем нажмите на Настроить фазу, перетащите мышь и наблюдайте, пока спектры не будут скорректированы по фазе. После этого нажмите на опцию «Сохранить и вернуть » (представленную в виде значка), доступную в той же строке меню.
   2. Чтобы выполнить ручную коррекцию базовой линии (метод Уиттакера), откройте спектральный файл в процессорном модуле программного обеспечения для количественного определения метаболитов ЯМР. Выберите опцию Коррекция базовой линии. Затем выберите вариант Метод Уиттакера. Теперь поместите точки у основания пиков во всех спектрах (от 0,0 до 10 ppm, обычно в случае сыворотки или в зависимости от наличия метаболита в спектрах), чтобы отрегулировать основание. После того, как все спектральные файлы будут скорректированы на базовом уровне, сохраните их в одной папке. Дальнейшая обработка с использованием процессора или модуля профилирования программного обеспечения для количественного определения метаболитов ЯМР может быть выполнена с использованием того же файла, сохраненного в определенном формате.
   3. Выполните группирование с помощью модуля профилировщика того же программного обеспечения. Выберите опцию «Инструменты», затем «Пакетная обработка», а затем «Спектральное объединение».
2. Чтобы создать окончательный лист биннинга, который будет использоваться для статистического анализа, выберите папку, содержащую все спектральные файлы с базовой коррекцией, щелкнув Спектральное биннинг.
3. Разделите спектры на заданное количество ячеек одинакового размера с определенной шириной спектра, в диапазоне от 0,01 до 0,04 ppm (может быть оптимизировано в соответствии с исследованием). Этот процесс упрощает и систематизирует спектральные данные, способствуя более последовательному анализу. Укажите размер контейнера, а также начальное и конечное значения ppm и укажите папку, в которой будут сохраняться выходные листы группирования.
4. Исключите области химического сдвига, соответствующие воде и растворителю TSP (4,8-5,2 и 0,0-0,7 ppm) для предотвращения спектральной интерференции 42,43,44.
5. Эта таблица содержит названия образцов в одной строке и различные значения ячеек вместе с ppm в других строках. Прежде чем использовать этот лист для статистического анализа, измените его, организовав выборки в группы для анализа и сохранив его только в формате CSV.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Например, при сравнении легкой группы с умеренной группой пациентов с ОРДС мы расположили данные с метками легкой и умеренной степени тяжести, добавили серийный номер и сохранили файл в формате CSV.

5. Статистический анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Лист группирования, полученный на предыдущем этапе, служит входным файлом для статистического анализа. В данном исследовании был использован модуль статистического анализа (один фактор) программного обеспечения для статистического анализа метаболомики.

1. Перед статистическим анализом выполните шаг нормализации с использованием сумм, логарифма и Парето, но он может варьироваться в разных исследованиях⁴⁵.
2. Выполнение одномерного и многомерного анализа для различения различных групп и определения точности идентифицированных метаболитов.
   1. Выполните анализ главных компонент (PCA), частичный дискриминантный анализ по методу наименьших квадратов (PLS-DA) и ортогональный частичный дискриминантный анализ по методу наименьших квадратов (OPLS-DA) для наблюдения за дискриминацией между группами, что дает оценку переменной важности проекции (VIP) для каждого метаболита, ответственного за разницу в метаболическом профиле.
   2. Используйте одномерные методы, такие как t-критерий Стьюдента и ANOVA, для выявления значимых метаболитов на основе критериев наличия p-значения менее 0,05. Оба теста позволяют получить графики с ящичковыми усами, показывающие разницу в относительной концентрации метаболитов.
   3. Выполните анализ биомаркеров, который дает область под графиком кривой рабочих характеристик приемника (AUROC). Значение AUC (площадь под кривой) > 0,8 считается значимым⁴⁶.
   4. Выберите окончательный список значимых метаболитов с использованием критериев VIP score>1, скорректированного по Бонферрони p-значения<0,05⁴⁴ и AUC > 0,8⁴⁶.
3. Определите метаболиты, как описано ниже.
   1. Биннинг обеспечивает значительные метаболиты в виде значений ppm, а не названий. Определите метаболиты, соответствующие конкретным значениям ppm, с помощью баз данных, таких как Банк биологического магнитного резонанса (BMRB)⁴⁷и База данных метаболомов человека (HMDB).
   2. Кроме того, используйте ранее опубликованную литературу^42,44 для идентификации и валидации.
   3. Используйте модуль профилирования программного обеспечения для количественного определения метаболитов ЯМР для подтверждения идентифицированных метаболитов с их значениями ppm.

6. Количественная оценка метаболитов с помощью программного обеспечения для количественного определения метаболитов ЯМР

ПРИМЕЧАНИЕ: Модуль профилирования программного обеспечения широко используется для количественной оценки идентифицированных метаболитов.

1. Перед началом количественного анализа откалибруйте выбранное для исследования эталонное соединение (tsp, использованное в данном исследовании) с помощью процессорного модуля. Нажмите на опцию Calibrate CSI (индикатор химической формы). Укажите концентрацию эталонного соединения (0,05 мМ для данного исследования). Затем перетащите программный пик на спектральный опорный пик и правильно отрегулируйте его высоту и ширину. Как только спектральные опорные пики совпадут с пиками программного обеспечения, нажмите «Принять».
2. Откройте нужные спектры в модуле профилировщика и выберите подходящую библиотеку соединений для изучения.
3. В нижней части экрана отображается список метаболитов. Выберите интересующий метаболит из этого списка. После выбора возможные ppm выбранного метаболита появятся в верхнем углу спектров.
4. Выберите значение Ppm в верхнем углу и увеличьте спектр до конкретного масштаба метаболита.
5. На этом этапе на экране появятся два пика: один представляет записанные данные, а другой, отображаемый в виде пунктирной линии, представляет пик программного обеспечения. Совместите оба пика. Перетащите программный пик и отрегулируйте его высоту и положение в соответствии с пиком, присутствующим в образце.
6. После правильного выравнивания концентрация метаболита может быть получена из значения, отображаемого под заголовком «Концентрация в мМ» для этого метаболита (рис. 1).
7. Следуйте той же процедуре для всех метаболитов и образцов и экспортируйте количественные значения в электронную таблицу. Чтобы создать выходной файл, выберите параметр «Пакетные операции » в меню «Инструменты ». Укажите нужную папку для сохранения выходного файла.

7. Анализ путей

Значимые метаболиты, выявленные после анализа, используются для определения основных путей, непосредственно влияющих на исход в группах заболеваний. Для этой цели обычно используется модуль анализа путей программного обеспечения для статистического анализа метаболомики и база данных KEGG.

1. Введите полученный список значимых метаболитов в модуль. Будет сгенерирован список, содержащий названия путей.
2. Выберите окончательные пути на основе критерия наличия импакт-фактора больше 0,1. Значимые значения воздействия указывают на связанные с заболеванием пути³⁰.
3. Тщательно проанализируйте полученные пути, чтобы выяснить дисрегуляцию, связанную с тяжестью заболевания. Одним из недостатков этого метода является его неэффективность в выявлении нерегулируемых путей, когда значимые метаболиты меньше 3.
4. Чтобы справиться с тем же, идентифицированный метаболит и его корреляцию с тяжестью заболевания также можно определить, используя ранее опубликованную литературу. Проведите тщательный обзор литературы и посмотрите, следует ли идентифицированный метаболит той же тенденции, что и ваши интересы.

Рисунок 1: Фундаментальные шаги в метаболомике на основе ЯМР. На рисунке представлены ключевые этапы метаболомики на основе ЯМР: сбор и подготовка образцов, проведение ЯМР-спектроскопии, предварительная обработка данных, проведение статистического анализа, идентификация и количественное определение метаболитов, а также интерпретация биологической значимости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Results

Для проведения метаболомного исследования важно определить размер выборки и конкретные группы, которые будут анализироваться. Выбор адекватного размера выборки имеет важное значение для получения значимых результатов, которые точно коррелируют с тяжестью заболевания⁴⁸. Тем не менее, в этой конкретной работе мы использовали небольшой размер выборки, чтобы продемонстрировать шаги, связанные с идентификацией и количественной оценкой метаболитов с использованием метаболомики на основе ЯМР, которая предназначалась в первую очередь для справки. В этом исследовании мы изучили метаболические различия между пациентами на легкой и умеренной стадиях ОРДС в 1-й день их поступления в отделение интенсивной терапии, включая в общей сложности 8 субъектов. В соответствии с протоколом были получены и обработаны спектры ЯМР всех образцов, а в конечном итоге была создана таблица с результатами биннинга.

Затем мы провели тщательный статистический анализ, в котором листы группирования использовались в качестве входных файлов, нормализовав данные с помощью сумм, логарифма и Парето. Мы провели PCA (рисунок 2A) и OPLS-DA (рисунок 2B), где первый показал кластеризацию, а второй показал четкую дискриминацию между группами и выделил метаболические различия. Статистический анализ теста перестановок (20x) дал значения R2Y=0,99 и Q2=0,47. Впоследствии мы провели t-критерий Стьюдента (Рисунок 2C) и анализ биомаркеров (Рисунок 2D) для выявления нерегулируемых метаболитов. Следуя критериям, изложенным в разделе протокола, мы отфильтровали результаты по значимым метаболитам (Таблица 2).

Рисунок 2: Многомерный и одномерный анализ. (A) Анализ главных компонент (PCA) и (B) Ортогональный частичный дискриминантный анализ по методу наименьших квадратов (OPLS-DA) у пациентов с легкой формой ОРДС (представлен красным цветом) и пациентов с умеренным ОРДС (представлен зеленым цветом). (C) Графики «коробочка и усы» подчеркивают различия в относительных концентрациях метаболитов между пациентами с легкой и умеренной степенью тяжести ОРДС, обнаруженными с помощью спектроскопии протонного ядерного магнитного резонанса в образцах сыворотки крови. Ось x представляет исследуемые группы, а ось y показывает относительную концентрацию при сравнении пациентов с легкой формой ОРДС (выделены красным цветом) и умеренными пациентами с ОРДС (обозначены зеленым цветом) в 1-й день поступления в отделение интенсивной терапии. (D) График площади под кривой (AUC) значимых метаболитов, прогнозирующий тяжесть, полученный после проведения анализа биомаркеров при сравнении пациентов с легкой и умеренной степенью тяжести ОРДС в 1-й день госпитализации в отделение интенсивной терапии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

S.No.	Имя	Спектральная локация (ppm)	p-значение	ВИП	Значение AUC
1	Лактат	1.34	0.04	1.99	1
2	Изолейцин	1.42	0.03	2.01	0.875

Таблица 2: Список значимых метаболитов, полученных после сравнения пациентов с легкой и умеренной степенью тяжести ОРДС в 1-й день поступления в отделение интенсивной терапии.

Поскольку результаты были получены в значениях ppm, мы определили метаболиты, используя предыдущую литературу, и проверили их с помощью профилографа. После назначения были получены лактат и изолейцин в качестве значимых метаболитов, о которых также сообщалось в некоторых предыдущих исследованиях ОРДС^30,40. Мы обеспечили выбор хорошо различимых, не перекрывающихся пиков. После идентификации мы отфильтровали список значимых метаболитов по критериям, указанным в протоколе. Затем мы количественно оценили представляющие интерес метаболиты с помощью модуля профилирования, открыв спектры, выполнив поиск интересующего метаболита и подогнав программный пик к пику, полученному в спектрах. Это позволило получить количественные значения метаболитов в мМ. Для справки была создана электронная таблица, содержащая названия образцов, названия метаболитов и их концентрации. После количественной оценки с помощью программного обеспечения может быть выполнена валидация с помощью других подходов, таких как протеомика.

Кроме того, идентифицированные метаболиты тщательно анализируются для определения их корреляции с тяжестью заболевания и выявления биохимических путей, в которых эти метаболиты активно участвуют. Поскольку после использования критериев, упомянутых в разделе о материале и методе, были идентифицированы только два значимых метаболита, анализ путей с помощью программного обеспечения был невозможен. Поэтому был проведен тщательный обзор литературы, чтобы выявить нарушения метаболических циклов. Два метаболита, идентифицированные в этом исследовании, успешно коррелировали с тяжестью ОРДС. Повышенный лактат указывал на воспаление легких и анаэробное дыхание, в то время как повышенный изолейцин указывал на катаболизм белка, связанный с повреждением легких, инфекцией и энергетическим обменом⁴⁰. Понимание этих метаболических путей служит двойной цели. Во-первых, он раскрывает сложность заболевания, давая представление о его биологических механизмах. Во-вторых, это способствует терапевтическому прогрессу, помогая врачам адаптировать лечение для пациентов, что в конечном итоге улучшает клинические результаты.

Discussion

Метаболомика эффективно идентифицирует и количественно определяет метаболиты, нацеливаясь на метаболические циклы, которые нарушаются во время болезни. Качество результатов зависит от тщательного выполнения каждого этапа метаболомического подхода. Каждый этап, от отбора и сбора образцов до определения пути распространения, имеет решающее значение для точного определения основных факторов, способствующих заболеванию. Прежде чем проводить метаболомику, необходимо тщательно изучить литературу, и на каждом этапе необходимо уделить ему пристальное внимание.

При планировании метаболомного исследования выбор образца имеет решающее значение для извлечения важной информации и обеспечения идеальной подготовки образца, будь то для целенаправленного или нецелевого метаболического сканирования рассматриваемого клинического состояния. Надлежащая первоначальная обработка образцов имеет решающее значение, и протоколы должны последовательно соблюдаться для всех образцов на протяжении всего исследования⁴⁹. Особая осторожность необходима при работе с клиническими образцами. Обычно используемые образцы для метаболомики на основе ЯМР включают биожидкости, клеточные экстракты и тканевые экстракты ^50,51. Спинномозговая жидкость (СМЖ) и моча часто требуют минимальной предварительной обработки и часто изучаются в таких контекстах, как заболевания, связанные с почками, нейродегенеративные заболевания и токсичность лекарственных препаратов. Цельная кровь, плазма и сыворотка предоставляют исчерпывающую информацию о широком спектре критических заболеваний и являются предпочтительными из-за простоты сбора. Широкий спектр других биожидкостей, таких как семенная жидкость, слюна, желчь, диализная жидкость, амниотическая жидкость, конденсат выдыхаемого воздуха, легочные аспираты, синовиальная жидкость и мини-бронхоальвеолярный лаваж (mBALF), широко используется из-за их специфичности и точности с использованием ЯМР 52,53,54. Каждая биожидкость имеет свои преимущества и проблемы, связанные со сбором, доступностью и информативностью, в зависимости от исследования или плана эксперимента^. Для этого исследования мы сосредоточились на образцах сыворотки крови пациентов с ОРДС, поскольку образцы крови обычно содержат информацию на уровне всего тела и не подвержены значительному влиянию экстремальных ежедневных колебаний. С другой стороны, образцы мочи подвержены различным колебаниям и могут подвергаться влиянию диеты, образа жизни, лекарств^{и факторов окружающей} среды. Правильное хранение образцов также важно для предотвращения ферментативной активности или микробной деградации. Образцы обычно криоконсервируются при температуре -80 °C с минимальными циклами замораживания-оттаивания для предотвращения метаболического разрушения и поддержания стабильности образца. Образец можно хранить при температуре -80 °C в течение длительного времени, что позволяет удобно проводить эксперименты с ЯМР. Тем не менее, для достижения оптимальных результатов рекомендуется как можно скорее спланировать и провести эксперимент.

В этом исследовании мы использовали ЯМР-спектрометр с частотой 800 МГц для сбора данных, который обеспечивает получение спектральных данных с высоким разрешением. Для этого эксперимента мы придерживались тех же параметров захвата, о которых говорилось выше. Однако важно отметить, что те же параметры регистрации, описанные в этом протоколе, могут быть применены с помощью ЯМР-спектрометров, работающих при других напряженностях магнитного поля. Количество сканирований может быть увеличено при работе с более низким магнитным полем для повышения разрешения. В то время как более высокая напряженность поля может обеспечить повышенное разрешение, основные аспекты процесса регистрации, такие как последовательности импульсов, задержки релаксации и контроль температуры, остаются неизменными на разных приборах, обеспечивая воспроизводимость и надежность результатов.

Следование стандартизированной процедуре имеет важное значение для обеспечения воспроизводимости и беспристрастности, так как отклонения могут препятствовать последующему анализу и оценке данных. Каждый этап эксперимента с ЯМР должен быть выполнен скрупулезно, так как от них зависит качество спектров. Особое внимание следует уделить шиммингу, так как он определяет форму пика, а параметры сбора данных должны быть оптимизированы в соответствии с образцом и дизайном исследования. Для образцов с низкой метаболической концентрацией в образце количество сканирований может быть увеличено. Сбор данных в ЯМР включает в себя стандартную оптимизацию как 1D, так и 2D экспериментов с учетом выбора образца и конкретной требуемой информации. Различные эксперименты ЯМР были оптимизированы для получения высококачественных спектров из биожидкостей, сводя к минимуму воздействие нежелательных макромолекул. Последовательность импульсов⁵⁶ CPMG предпочтительна для таких образцов, как сыворотка, плазма или спинномозговая жидкость. Этот метод подавляет широкие сигналы от макромолекул, таких как липиды и белки, которые имеют длительное поперечное время релаксации и могут затемнять резонансы низкомолекулярных метаболитов.

Предварительная обработка данных включает в себя промежуточные методы, используемые для обеспечения единообразного и однородного анализа данных и их интерпретации. Этот процесс включает в себя избегание нежелательных сигналов или спектральных областей, подверженных несоответствиям, и коррекцию сдвигов пиков. В биожидкостях исключение нежелательных областей часто означает удаление сигналов, например, от воды, которые преобладают в диапазоне от 4,6 до 5 ppm. Пиковые сдвиги, вызванные изменениями pH, температуры, концентрации соли, коэффициентов разбавления и ионного состава, могут быть сведены к минимуму с помощью буферов с гомеостатическим pH. Кроме того, использование стандартных эталонных соединений, выравнивание пиков и биннинг могут помочь уменьшить сдвиги пиков. Выравнивание пиков имеет решающее значение для корреляции картин в различных спектрах, полученных в идентичных условиях.

Обработка спектров должна быть выполнена надлежащим образом, чтобы обеспечить точное биннинг на более поздних этапах анализа. Все спектры должны быть откалиброваны и выровнены равномерно, а коррекция основания и фазы может быть выполнена вручную или автоматически. Правильная коррекция фазы и основания, а также калибровка имеют решающее значение. Выполнение коррекции исходного уровня имеет важное значение для того, чтобы избежать искажений, которые могут повлиять на идентификацию и количественную оценку метаболитов⁵⁷. Фазовая коррекция необходима для того, чтобы искаженные или инвертированные пики не могли повлиять на интерпретацию результатов. Тщательно определитесь с критериями отбора значимых метаболитов и отфильтруйте результаты соответствующим образом. Поскольку биннинг предоставляет результаты в виде значений ppm, точно определите название метаболита, используя различные источники, упомянутые в протоколе. Если несколько метаболитов присутствуют при одинаковых значениях ppm, идентифицируйте их по форме пика.

Перед выполнением статистического анализа выполняется нормализация для уменьшения вариаций в наборе данных, вызванных или не индуцированных, из-за различий в величине и колебаний концентраций метаболитов. Этот процесс включает в себя различные методы центрирования, масштабирования и преобразования, выбираемые на основе распределения и изменчивости данных. Цель состоит в том, чтобы свести к минимуму нежелательную систематическую погрешность, сохраняя при этом интересующие биологические факторы. Многофакторные методы, включая PCA, PLS-DA и OPLS-DA, используются для установления дифференциальных метаболитов со значениями VIP больше 1. Предсказуемость модели и перекрестная проверка определяются с помощью значений R2 (доброта соответствия) и Q2 (достоверность прогноза), в то время как статистика теста перестановок проверяет модель. Тепловая карта на основе корреляции Пирсона оценивает надежность модели путем перечисления повышенных и пониженных метаболитов в субфенотипах и результирующих эндотипов.

Одномерные методы, такие как t-критерий Стьюдента и ANOVA, такие как коррекция Бонферрони или минимизация FDR (частоты ложных открытий) и Бенджамини-Хохберга, используются для снижения вероятности ложноположительных результатов. Эти методы обеспечивают грубую оценку потенциально важных особенностей, независимо от их корреляции внутри или между молекулами и другими искажающими факторами. Значимые метаболиты идентифицируются на основе p-значения менее 0,05, которые затем используются для обоснования метаболических эндотипов в подгруппах исхода⁴⁵.

Для оценки специфичности и чувствительности эндотипов в подгруппах исходов используются индивидуальные графики коробчатого уса и AUROC. Клиническая оценка объединяется с моделью в AUROC для проверки точности модели. Значение AUC > 0,8 считается значимым⁴⁶. Различные другие тесты доступны в Интернете для проверки точности различения и эффективности идентифицированных метаболитов. Некоторые из них – случайная классификация лесов, тепловая карта, корреляция и т.д.45.

Для количественной оценки значимых метаболитов используются различные подходы, в том числе пиковая интеграция, которая может быть сложной задачей для новичков из-за их продвинутой природы. Определите характерные пики для метаболитов, обратившись к отдельным химическим сдвигам для точной идентификации. Определите площадь этих характеристических пиков относительно площади опорного пика, TSP. Чтобы рассчитать абсолютную концентрацию метаболита (Cm), используйте следующее уравнение:

см = Im.nr.Cr/Ir.nm

Где Cr – концентрация референтного соединения (TSP) в растворе, Im и Ir – интегрированные пиковые площади (могут быть получены с помощью инструмента обработки и анализа ЯМР) метаболита и референтного соединения (TSP), соответственно, а nm и nr – количество протонов, представляющих метаболит и референтный пики, соответственно²⁴.

В качестве альтернативы используется автоматизированное программное обеспечение для количественного определения метаболитов ЯМР для получения концентраций метаболитов для одного или нескольких спектров на основе концентрации эталона TSP. Количественное определение с использованием программного обеспечения упрощает процесс и снижает вероятность ошибок по сравнению с другими методами. Несмотря на то, что в данной исследовательской работе освещается использование программного обеспечения для количественного определения метаболитов, могут возникнуть проблемы, если интересующий их метаболит отсутствует в библиотеке программного обеспечения. Кроме того, программное обеспечение является платным, поэтому использовать его могут только исследователи с авторизованной лицензией.

Метаболомика сыграла важную роль в разгадке сложностей различных заболеваний, выявляя нерегулируемые метаболические циклы, способствующие тяжести заболевания. Тем не менее, внедрение этих результатов в клиническую практику было сложной задачей. В настоящее время медицинское сообщество делает акцент на подходе персонализированной медицины для улучшения исходов заболевания. В то время как выявление нерегулируемых метаболитов ранее было достаточным, в настоящее время усилия сосредоточены на точной количественной оценке для определения диапазонов, специфичных для конкретного заболевания. Эта информация бесценна для клиницистов при разработке индивидуальных стратегий лечения. Достижения в области методов количественной оценки облегчили исследовательскую деятельность, и многочисленные исследовательские группы по всему миру успешно применяют эти подходы с использованием специализированного программного обеспечения.

Этот прогресс подчеркивает потенциал метаболомики для значительного влияния на персонализированную медицину и улучшения клинических результатов. Кроме того, интеграция данных метаболомики с другими омиксными данными, такими как геномика и протеомика, обещает обеспечить более полное понимание механизмов заболевания и дальнейшее совершенствование терапевтических вмешательств. По мере развития технологий ожидается, что точность и полезность метаболомики в клинических условиях будут возрастать, прокладывая путь к более эффективным и персонализированным решениям в области здравоохранения.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centirfuge	Sigma aldrich	3-18KS
Chenomx NMR suite	NMR Suite, v9, Chenomx Inc., Эдмонтон, Канада		программное обеспечение для количественного определения метаболитов ЯМР
Коаксиальная вставка	Sigma aldrich	Z278513
оксид дейтерима	Sigma aldrich	151882
трубки Eppendorf	Tarsons	500020
Метабоаналитик	Wishart Research Group		Программное обеспечение для статистического анализа метаболомики
ЯМР-трубка	Wilmad	Z412007	диаметром 5 мм
Пипетка	Eppendorf research plus 3123000039		0-100 l
Флаконы для сбора образцов	Tarsons криохлажденные флаконы	523194
азид натрия	Sigma aldrich	S2002
Кристалл хлорида натрия	Sigma aldrich	S9625
Фосфат натрия двухосновной	Sigma aldrich	567550
Фосфат натрия одноосновной	Sigma aldrich	S0751
Topspin 3.6.4	Инструмент обработки и анализа ЯМР	Bruker
Ч.л. соли	Sigma aldrich	269913