Методическая статья

Раскрытие гистоновых протеоформ с помощью гелевого электрофореза 2D-TAU

DOI:

10.3791/67321

⸱

18 октября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center on Advanced Biochemistry and Molecular Biology, Department of Experimental and Clinical Medicine, Magna Græcia University of Catanzaro, 2Department of Pharmacy, Health and Nutritional Sciences, University of Calabria

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод описывает простую и быструю стратегию определения характеристик и исследования протеоформы гистонов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гистоны подвергаются различным посттрансляционным модификациям (ПТМ), таким как метилирование, ацетилирование, фосфорилирование, ацилирование и убиквитинирование, которые контролируют динамику нуклеосом и определяют судьбу клетки. Нуклеосома, которая является функциональной единицей хроматина, состоит из ДНК, четырех пар гистонов (H3, H4, H2A и H2B), составляющих глобулярное ядро, и линкерного гистона H1, который стабилизирует структуру хроматина. Амино(N)-концевые хвосты гистонов выступают из доменов глобулярного ядра и подвергаются различным ПТМ, которые влияют на ландшафт хроматина. Некоторые данные свидетельствуют о том, что гомеостаз гистонов ПТМ имеет решающее значение для сохранения всей физиологической активности. Дерегуляция гистонных ПТМ является основной причиной аномальной клеточной пролиферации, инвазии и метастазирования. Поэтому разработка методов определения характеристик гистонов ПТМ имеет решающее значение. В этой статье мы описываем эффективный метод выделения и анализа изоформ гистонов. Метод, основанный на комбинации двух ортогональных разделений, позволяет проводить обогащение изоформ гистонов и последующую масс-спектрометрическую идентификацию. Метод, первоначально описанный Шехтером и др., сочетает в себе кислотно-мочевинные полиакриламидные гели (TAU-GEL), которые могут разделять основные гистоновые белки на основе размера и заряда, и додецилсульфат-полиакриламидные гели натрия (SDS-PAGE), которые могут разделять белки по молекулярной массе. Результатом является двумерная карта изоформ гистонов, пригодная для расщепления в геле с последующей идентификацией масс-спектрометрии и вестерн-блоттингом. В результате получается двумерная карта изоформ гистонов, пригодная как для расщепления в геле, так и для масс-спектрометрической идентификации и вестерн-блоттинга. Этот протеомный подход представляет собой надежный метод, который позволяет обогащать одну изоформу гистона и характеризовать новые гистонные ПТМ.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Возникновение, прогрессирование и химиорезистентность рака связаны с генетическими и эпигенетическими событиями, включая ПТМ гистонов. Гистоны подвергаются воздействию различных ПТМ, которые регулируют динамику хроматина и определяют судьбу клетки1.

Нуклеосома является функциональной единицей хроматина и представляет собой молекулярный комплекс ДНК и белков, который позволяет ДНК упаковываться в ядро. Он состоит из четырех пар гистонов (H3, H4, H2A и H2B), которые составляют ядро нуклеосомы, а также линкерного гистона H1, который помогает стабилизировать структуру хроматина. Амино(N)-концевые хвосты гистонов выступают из своих доменов глобулярного ядра и претерпевают специфические посттрансляционные модификации, которые влияют на ландшафт хроматина2.

На данный момент известно как минимум 23 класса гистонов ПТМ. Эти ПТМ представляют собой ковалентные модификации, которые в основном состоят из метилирования, ацетилирования, фосфорилирования, гликозилирования, убиквитилирования, SUMOylирования и АДФ-рибозилирования3. Кроме того, недавно была предложена тесная корреляция между гомеостазом эпигенома и метаболической перестройкой, что объясняет экспоненциальный рост возможного числа гистонов ПТМ 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Гистонные ПТМ, осаждения, стирания и трансдуцирования ферментами-модификаторами, называются соответственно записывающими, ластиками и считывающими. Они влияют на физические и химические свойства структуры хроматина, влияя на профиль экспрессии генов, в том числе на экспрессию генов-супрессоров опухолей и онкогенов 14,15,16.

Количество протеоформ гистонов увеличивается при включении в нуклеосому в виде вариантов гистонов. Эти варианты являются неаллельными изоформами канонических гистонов, и они добавляют сложности, изменяя химические и физические свойства хроматина. В отличие от канонических гистонов, варианты гистонов имеют функциональные домены, которые претерпевают уникальные посттрансляционные модификации или взаимодействуют со специфическими компонентами хроматина, влияя на динамику и стабильность нуклеосомы17.

В раковых клетках дерегуляция гистонов ПТМ и их вариантов влияет на профиль экспрессии генов, что приводит к аномальной клеточной пролиферации, инвазии, метастазированию и активации путей лекарственной устойчивости 3,18,19,20. Мутации в гистонах или комплексах ремоделирования хроматина могут изменять фенотип клеток, способствуя неопластической трансформации. Накопление эпигенетических изменений, таких как метилирование гистонов, является ключевым фактором в активации путей лекарственной устойчивости 21,22,23. Мутации в комплексе SWI/SNF, который состоит из 15 субъединиц, кодируемых 29 генами, влияют на более чем 20% раковых опухолей человека при многих типах опухолей. За последнее десятилетие были разработаны эпигенетические лекарственные стратегии (эпи-препараты), и многие препараты, нацеленные на рак с аномальными моделями модификации гистонов, были одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA)23.

Анализ белков гистонов является довольно сложной задачей, что делает его сложной областью исследований. В последнее время методы масс-спектрометрии стали предпочтительным способом определения характеристик и изучения протеоформ гистонов. Тем не менее, жесткие условия экстракции в сочетании с плохой растворимостью некоторых вариантов и высокой гомологией последовательностей затрудняют их анализ.

За последнее десятилетие было разработано несколько методов, основанных на масс-спектрометрии, для профилирования и исследования гистонов 24,25,26,27. В этом исследовании мы представляем экономически эффективный и надежный метод создания двумерной карты протеоформ гистонов, который может повысить шансы на обнаружение новых посттрансляционных модификаций.

Электрофорез 2D TAU сочетает в себе сепарацию в кислых условиях с SDS PAGE. В первом измерении кислотное состояние среды дает чистый положительный заряд основным белкам. Поскольку гистоны являются очень основными белками и имеют более высокую изоэлектрическую точку (pH) по сравнению со средой, они становятся положительно заряженными и мигрируют под действием электрического поля. Во втором измерении гистоны денатурируются с помощью SDS и разделяются на основе их молекулярной массы. Полученная 2D-карта может быть использована в качестве инструмента для обогащения специфических протеоформ с разрешением в одном пятне для масс-спектрометрического анализа и иммунологических исследований28,29. После электрофореза 2D пятна TAU могут быть очищены от пятен, расщеплены трипсином и проанализированы с помощью масс-спектрометрии. В качестве альтернативы, 2D карта TAU может быть нанесена на фильтр нитроцеллюлозы/PVDF и исследована путем иммуноокрашивания27.

В этом контексте методы могут быть стратегическими для улучшения идентификации и анализа новых посттрансляционных модификаций, коррелирующих с метаболической перестройкой30,31.

Мы еще больше улучшили оригинальный метод, включив в него этап ультразвуковой обработки, который полезен для деградации ДНК и улучшения растворимости белков. Кроме того, мы продлили стадию инкубации для экстракции гистонов, чтобы получить образец белка высокой чистоты. Более того, в нашем протоколе мы запускали первое измерение при низком напряжении в течение более длительного времени, чтобы достичь лучшего разрешения. Полученный гель был использован для исследования канонических гистонов ПТМ и характеристики новых модификаций, таких как гликация10,32.

В целом, мы разработали метод извлечения и очистки гистонов с последующим разрешением гистоновых протеоформ с помощью двумерной карты. Работа также включает в себя процедуру расщепления в геле для масс-спектрометрического анализа и этапы двумерного вестерн-блоттинга.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Экстракция гистонов

  1. Проводите экстракцию гистонов не менее чем из 1 x 106 клеток, которые на 80% сливаются. Для этого эксперимента мы использовали клеточные линии MCF-10A из ATCC. После нанесения покрытия промойте клетки трижды 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) 1x. Выполняйте все действия на льду.
  2. Приготовьте буфер для лизиса клеток, содержащий 10 мМ Tris-HCl pH 8,0, 1 мМ KCl и 1,5 мМ MgCl2. Добавьте 1 мМ дитиоэритритол и ингибиторы протеазы и фосфатазы непосредственно перед применением.
  3. Добавьте 800 мкл буфера для лизиса клеток в клетку, содержащую чашку Петри, соскребите и соберите клетки в пробирку объемом 1,5 мл, затем инкубируйте на ротаторе при 300 об/мин, 4 °C в течение 1 ч.
  4. Центрифугировать при 10 000 x g, 4 °C, в течение 10 мин в предварительно охлажденной микроцентрифуге с вращателем для пробирок объемом 1,5 мл.
  5. Промойте гранулу 400 μл буфера для лизиса клеток и центрифугируйте при 10 000 x g, 4 °C, в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость. Повторите шаг стирки 3 раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте предварительно охлаждаемую микроцентрифугу (4 °C) с вращателем для пробирок объемом 1,5 мл для всех этапов. Обращайтесь с гранулами осторожно, чтобы избежать потери материала.
  6. Повторно суспендируйте гранулу в 640 мкл 0,2 М Н2SO4 и инкубируйте на ротаторе при 300 об/мин, при 4 °С, в течение 16 ч.
    ВНИМАНИЕ: Серная кислота является опасным химическим веществом; Пожалуйста, используйте его под вытяжным шкафом для химикатов.
  7. Центрифуга при 16 000 x g, 4 °C, в течение 10 минут. Переложите надосадочную жидкость в свежую пробирку и храните ее до выполнения следующих действий. Выбросьте ядерный мусор.
  8. Осаждение гистонов путем добавления 212 мкл трихлоруксусной кислоты, капля за каплей (конечная концентрация ТСА составляет 33%). Перемешайте раствор, перевернув трубку в 10 раз. Инкубировать на льду, в темноте, в течение 16 ч.
    ВНИМАНИЕ: ТСА является опасным химическим веществом; Используйте под вытяжным шкафом для химикатов.
  9. Гранулы гистонов вращают в предварительно охлажденной центрифуге при 16 000 x g в течение 10 мин при 4 °C. Осторожно удалите надосадочную жидкость и промойте гранулу 3 раза 200 мкл холодного ацетона.
  10. Повторно суспендируйте гранулу холодным ацетоном, затем обработайте ультразвуком 2 раза с 3 циклами по 30 с, вкл/выкл, чередуя с 10-минутной паузой на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура проводилась с помощью ультразвукового аппарата. Этот шаг необходим для устранения ДНК, обернутой в гистону.
  11. Центрифугируйте при давлении 16 000 x g в течение 10 минут, выбросьте ацетон и повторно суспендируйте образец в 100 μл дважды дистиллированной воды. Определяют концентрацию белка с помощью метода анализа Брэдфорда, согласно инструкции производителя33.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования гранула иногда кажется белой или полупрозрачной. Белый и непрозрачный осадок может указывать на присутствие солевых загрязнителей, которые могут нарушить двухмерное разделение. Если это так, повторяйте шаги промывки ацетоном, пока гранула не станет прозрачной.
  12. Лиофилизируйте 70 μг гистонов, согласно инструкциям производителя. Установите лиофилизатор на 30 °C на 60 минут. Проверьте объем пробирки и повторите шаг при 30 °C до тех пор, пока образец полностью не лиофилизируется (как правило, для полной лиофилизации образца требуется 90 минут). Через 60 минут проверяйте объем каждые 10 минут, так как процесс зависит от образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если количество белков гистонов невелико, начните с 2 х 106 клеток. В этом случае используйте тот же объем реактивов, который используется для 1 х10 6 ячеек. Проверьте чистоту всех химических веществ, используемых во время процедуры; все реагенты должны быть класса ВЭЖХ.

2. Мини 2D гель тритон-кислота-мочевина (ТАУ) электрофорез

  1. Приготовьте мини-ТАУ-гель для мини-вертикальной системы электрофореза полиакриламидным гелем, как описано ниже.
    1. Приготовьте разделительный гель: 6 М мочевины, 15% акриламида/бисакриламида (29:1), 5% уксусной ледяной кислоты, 0,25% Triton X-100 (v/v), 0,4% TEMED (v/v), 0,1% APS (v/v). Для приготовления раствора мочевину растворить в акриламиде/бисе и 1 мл сверхчистой воды при щадящем перемешивании при комнатной температуре; Добавьте остальные компоненты и отрегулируйте громкость. Для геля mini-TAU приготовьте 10 мл раствора. Заполните раствором заранее установленные гелевые пластины, не допуская образования пузырьков воздуха всего в 1,5 см от верха. Залейте раствор 1 мл изопропанола, чтобы разровнять гель.
    2. Приготовьте стекирующий гель: 6 М мочевины, 6% акриламида/бисакриламида (29:1), 5% уксусной ледяной кислоты, 0,25% Triton X-100 (v/v), 0,4% TEMED (v/v), 0,1% APS (v/v). Для приготовления раствора растворить мочевину в акриламиде/бисе и 1 мл сверхчистой воды; Добавьте остальные компоненты и отрегулируйте громкость. Заполните гелевые пластины укладывающим раствором, поместите 10-луночный гелевый гребень между пластинами и вставляйте его до тех пор, пока гелевый раствор не достигнет половины зубьев гребня. Дайте гелю полимеризоваться 16 часов при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно вставьте гребень, чтобы обеспечить регулярное образование лунок.
  2. Приготовьте 100 мкл буфера для проб TAU, растворив 6 М мочевины, 5% уксусной ледяной кислоты и дважды дистиллированной водой. Приготовленный лиофилизированный образец растворить в 30 мкл буфера для образцов TAU.
  3. Заполните мини-кассету рабочим буфером TAU, конечная концентрация уксусной кислоты 5%. Промойте лунки ТАУ-геля шприцем, наполненным проточным буфером, и загрузите образец в лунку с помощью микропипетки.
  4. Подключите электрофоретическую камеру к источнику питания, положительным (красным) электродом расположите его внизу. Обратите внимание, когда IP > pH, белки заряжены положительно, поэтому миграция происходит с положительного на отрицательный электрод. Запустите гель сначала при напряжении 30 В в течение 70 мин, затем при постоянном напряжении 25 В в течение 17 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этого времени время от времени выключайте электропитание и промывайте гелевые лунки с помощью одноразового шприца. Обратите внимание на удаление любых пузырьков с нижней поверхности геля с помощью шприца, чтобы избежать потери образца и наличия смазывания в растворенных белках.
  5. Снимите гель с гелевых пластин и разрежьте интересующую линию чистым скальпелем. Обращайтесь с гелем осторожно, чтобы избежать его поломки. Поскольку интересующая линия бесцветна, загрузите образец в лунку No 1, чтобы точно определить и перерезать интересующую полосу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проверить разделение на геле mini-TAU, подготовьте и запустите образец в двух экземплярах. Один из таких гелей можно окрашивать с помощью Coomassie Brilliant Blue. Схема разделения представлена на рисунке 1А.
  6. Промойте дорожку 15 мл 0,5 М Tris-HCl pH 8,8 в течение 15 минут.
  7. Приготовьте 15 мл уравновешивающего буфера 1, используя 6 М мочевины, 0,5 М Tris-HCl, pH 6,8, 30% глицерина, 20% SDS и 2% дитиоэритритола. Приготовьте 15 мл уравновешивающего буфера 2, используя 6 М мочевины, 0,5 М Tris-HCl, pH 6,8, 30% глицерина, 20% SDS и 2% йодоацетамида. Подготовьте уравновешивающий буфер 1 и 2 непосредственно перед использованием; Храните буфер уравновешивания 2 в темноте.
  8. Инкубировать гелевую дорожку, при слабом перемешивании, в 10 мл уравновешивающего буфера 1 в течение 15 мин, затем сцедить. Инкубируйте гелевую дорожку, под легким перемешиванием, с 10 мл уравновешивающего буфера 2 в течение 15 минут в темноте, затем сцедите.
  9. Приготовьте растворяющий гель SDS 15% акриламид, следуя таблице 1. Установите гелевую пластину и заполните ее раствором разрешающего геля. Залейте раствор до тех пор, пока он не окажется в 1,5 см от конца длинной гелевой пластины. Нанесите 1 мл изопропанола на поверхность, чтобы разровнять гель и дать ему полимеризоваться.
  10. После полимеризации геля сцедите изопропанол и высушите лунку бумагой для хроматографии 3MM Chr Cellulos. Получившуюся дорожку из шага 8 вставьте в гелевую лунку.
  11. Запечатайте дорожку до разрешающего геля герметизирующим раствором 0,5% агарозы с низкой температурой плавления в 1x Трис/глицин/SDS буфере и 5 мкл 0,003% бромфенолового синего. Дайте агарозному гелю полимеризоваться в течение 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков воздуха во время запечатывания агарозой, чтобы предотвратить размазывание геля.
  12. Поместите гелевые пластины в кассету и заполните 1x Трис/глицин/SDS буфером. Запустите гель при напряжении 120 В, пока бромофенольный синий краситель не достигнет дна. Аккуратно снимите гель с пластин, выбросьте излишки агарозы, а серебро окрасьте гель с помощью процедуры, совместимой с масс-спектрометрией или блоттингом для иммунологического анализа.

3. Окрашивание серебром 32

  1. Приготовьте следующие реагенты - Фиксаторы: 50% метанола, 5% уксусной кислоты, 45% деионизированной воды; Промывочный раствор: 50% метанол, 50% деионизированная вода; Сенсибилизатор: 0,02% Na2S2O3 5H2O в деионизированной воде; Реагент серебра: 0,1% нитрата серебра в холодной (4°C) деионизированной воде; Проявитель: 0,04% формалина и 2% Na2CO3, формальдегида (37%) (добавить непосредственно перед использованием) 0,4 мл деионизированной воды и залить до 1000 мл; Стоп-реагент: 5% уксусной кислоты; Раствор для хранения геля: 1% уксусная кислота.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку химические вещества, используемые для окрашивания, опасны, выполняйте все действия под вытяжным шкафом для химикатов.
  2. Следуйте процедуре, приведенной в таблице 2 , с учетом следующего. Все инкубации выполняйте с легким перемешиванием. Приготовьте стоп-реагент перед началом этапа проявки; Это обеспечит развитие геля с нужной интенсивностью. На этапе развития пятна будут появляться в виде желтых сигналов, которые станут светло-коричневыми в конце инкубации. Интенсивность различных пятен будет зависеть от количества гистоновых протеоформ. Гель готов к точечному иссечению и расщеплению в геле (Рисунок 1B)

4. Пищеварение в геле

  1. Приготовьте следующие растворы: 50 мМ бикарбоната аммония (NH4HCO3)/50% (v/v) ацетонитрила; 10 мМ дитиотреитол (DTT) в 50 мМ NH4HCO3; 55 мМ йодоацетамид (IAA) в 50 мМ NH4HCO3; 0,1% TFA; 50 мМ NH4HCO3, pH 8; Ацетонитрил класса ВЭЖХ; 1 мл силиконовых трубок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать загрязнения кератином человека с волос или кожи, используйте чистые перчатки и работайте в чистом месте.
  2. Удалите интересующие гистоны из окрашенного геля с помощью чистого скальпеля и поместите их в свежую силиконовую пробирку (1,5 мл). Обязательно иссекайте одно пятно и поместите его в одну пробирку, чтобы избежать перекрестного загрязнения изоформом.
  3. Добавьте в каждое гелевое пятно 250 мкл 50 мМ NH4HCO3/50% ацетонитрила и инкубируйте при слабом перемешивании в термомиксере при комнатной температуре. Сцедите раствор и повторите этот шаг 3 раза. Кусочки геля будут казаться прозрачными.
  4. Обезвоживайте гелевые пятна путем добавления ацетонитрила (200 μл). На этом этапе кусочки геля приобретут непрозрачно-белый цвет.
  5. Сцедите ацетонитрил и дайте высохнуть на воздухе в течение 10 минут. Кусочек геля будет казаться высохшим в тюбике. Восстановление и алкилирование не являются существенными, поскольку белки гистонов восстанавливаются и алкилируются на этапе уравновешивания.
  6. Регидратируйте гелевые пятна в 20 мкл раствора трипсина (0,1 мМ HCl) или объеме, достаточном для покрытия кусочков геля. Поместите пробирки в термомиксер и инкубируйте при слабом перемешивании при температуре 37 °C в течение минимум 4-16 часов.
  7. Перенесите надосадочную жидкость, содержащую триптические пептиды, в свежую пробирку. Добавьте 50 μл экстракционного раствора (60% ацетонитрила, 1% TFA) к кусочкам геля и 2 раза обработайте ультразвуком на ультразвуковой водяной бане в течение 10 минут при 4 °C.
  8. Перенесите надосадочную жидкость, содержащую дополнительные триптические пептиды, в свежую трубку. Используйте лиофилизатор для сушки накопленных экстрагированных пептидов. Установите лиофилизатор на 30 °C и высушите раствор; В пробирке появится лиофилизированная гранула.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг зависит от объема; Как правило, достаточно 1 часа, но проверяйте объем каждые 10 минут, пока образец полностью не высохнет.
  9. Добавьте 15 мкл 0,1 % TFA в каждую пробирку и аккуратно инкубируйте в термомиксере при 25 °C. Перенесите надосадочную жидкость во флакон для анализа ЖХ-МС/МС.

5. 2DTAU вестерн-блот

  1. Приготовьте буфер для переноса, 250 мМ трис-основания, 92 мМ глицина и 10% метанола с помощью двойной дистиллированной воды.
  2. Обрежьте нитроцеллюлозную мембрану и фильтровальную бумагу по размерам геля.
  3. Уравновесьте гель и замочите мембрану, фильтровальную бумагу и фильтровальную бумагу в буфере для переноса на 15 минут. Используйте мембраны из нитроцеллюлозы или ПВДФ. При использовании мембран PVDF (поливинилидендифторид) активируйте их, замочив в 100% MetOH.
  4. Подготовьте гелевый бутерброд в кассете для полусухого переноса следующим образом: отрицательный электрод/фильтровальная бумага/гель/нитроцеллюлозная мембрана/фильтровальная бумага/положительный электрод. Удалите все пузырьки воздуха между гелем и мембраной, чтобы обеспечить хорошие результаты.
  5. Поместите кассету в полусухой блок и запустите блот при напряжении 25 В в течение 30 минут. В конце разберите промокательный бутерброд и сохраните мембрану для иммунологического анализа. Проверьте эффективность переноса с помощью окрашивания по Понсо. Отметьте мембрану знаком в правом верхнем углу, чтобы сохранить правильную ориентацию фильтра.
  6. Инкубируйте с первичными и вторичными антителами в зависимости от эксперимента (рис. 2).

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1А можно наблюдать, как белки гистонов мигрируют в одномерном геле. Это важный предварительный шаг для понимания времени работы первого измерения. После того, как правильное время разделения определено, запустите второе измерение. На 2D-карте протеоформ гистонов видна характерная топографическая картина (рис. 1B). Каждое пятно на рисунке 1B представляет определенный тип гистонов. Наблюдайте за точной областью геля, где можно найти каждый протеоформ гистона. Масс-спектрометрическая идентификация каждого протеоформа гистона описана в Perri et al.32. Поэтому каждое пятно в этом состоянии связано с определенным типом гистонов. Наличие дополнительных пятен, наряду с каноническими, может свидетельствовать о существовании новых модификаций. Изображения геля могут быть получены с помощью денситометрии, а полученное изображение может быть проанализировано с помощью программного обеспечения для анализа изображений.

Надежность карты 2D TAU зависит от круглости пятна. Если прогон был выполнен правильно, пятна будут отображаться как отчетливые сигналы, и горизонтальные и вертикальные полосы не будут видны. И наоборот, примеси в образце, растворах и агарозном слое могут вызвать появление полос и/или полос в геле. Качество геля будет влиять на оцифровку изображения и последующий количественный и качественный анализ. Более того, это может повлиять на успех анализа вестерн-блоттинга и исследований рассеянного склероза. Для проверки надежности метода мы зондировали нитроцеллюлозную мембрану разрешенных гистоновых протеоформ первичным антителом ацетилированным-лизином (Ac-K2-100) Rabbit mAb32 (рис. 2). Для обнаружения сигналов гистонов использовали вторичное антитело против HRP кролика. Как и ожидалось, с помощью денситометра можно количественно оценить специфическую посттрансляционную модификацию каждого варианта гистона, присутствующего в блоте.

figure-results-1
Рисунок 1: 1D и 2D TAUgel. (A) Репрезентативное изображение топографической картины гистонов, полученное с помощью 1D TAUgel. (B) Репрезентативное изображение топографической картины гистонов, полученное с помощью 2D TAUgel. Идентификация данных представлена Perri et al. 32. Как и ожидалось, каждое пятно представляет собой определенную протеоформу гистонов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Представитель 2DTAU Вестерн-блот. На изображении можно наблюдать уровень ацетилирования лизина в каждом протеоформе гистона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

РеагентовКонцентрация: 15%
40% Акриламид/Бис3.75
1,5 м Трис pH 8,82,5 мл
Вода MilliQ3,6 мл
10% паспорта безопасности100 мкл
10% APS50 μл
ТЕМЕД5 μл

Таблица 1: Растворяющий состав раствора геля.

ШагВремя
Фиксация 50% метанола / 5% уксусной кислоты1 ч
Стирать 30% этанол2 x 20 мин
Промывка деионизированной водой1 x 20 мин
Сенсибилизатор Тиосульфат реагент1 мин
Промывка деионизированной водой3 х 20 с
Серебро Нитрат серебра30 мин
Промывка деионизированной водой3 x 1 мин
Разработчик25-30 мин Примечание: Проявляйте гель до тех пор, пока не станут видны пятна (светло-коричневый)
Решение для остановки1 x 10 мин
Промывка деионизированной водой2 x 5 мин
Промывка деионизированной водой1 ч

Таблица 2: Метод окрашивания серебром.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

За последнее десятилетие в терапии онкологических пациентов произошла революция за счет выявления различных молекулярных изменений, которые стимулируют развитие и прогрессирование рака. Наиболее значительным достижением в современной онкологии является разработка терапии, основанной на комплексном молекулярном анализе. Технологические достижения в области геномики и протеомики сыграли решающую роль в профилировании конкретных биомаркеров для раннего обнаружения, эпиднадзора, прогнозирования и мониторинга лекарственных средств. Протеомика определяется как анализ полного белкового комплемента клетки, ткани или организма в определенных условиях, а также включает в себя изучение белковых взаимодействий, посттрансляционных модификаций илокализации. Специфической областью протеомики является эпипротеомика, которая включает в себя систематическое изучение посттрансляционных модификаций гистонов. Они были связаны с развитием и прогрессированием рака35. В статье описан метод идентификации специфических изоформ гистонов, которые вносят свой вклад в клеточный фенотип.

Критическим этапом метода является экстракция гистонов из-за их плохой растворимости и высокой основности. Его основными ограничениями являются сложность 2D-карты и малое количество вариантов, что может затруднить анализ MS/MS.

В целом, основное преимущество такого подхода заключается в том, что его можно проводить в любой лаборатории, а мини-гелевым аппаратом можно владеть с соответствующими мерами предосторожности. В этом контексте мы уверены, что этот метод может помочь большому числу ученых, например, тем, кто не может воспользоваться большим количеством возможностей в своем учреждении, в выявлении новых эпимаркеров, направленных на улучшение знаний об эпипротеоме. Кроме того, этот метод может быть объединен с масс-спектрометрией, которая может быть передана на аутсорсинг в качестве услуги, для обнаружения новых протеоформ. Он также может быть использован с иммунологическими анализами для подтверждения изменений в специфической посттрансляционной модификации, для которой доступно коммерческое антитело.

Этот метод был использован для изучения типичных изменений в модификациях гистонов, связанных с развитием рака молочной железы28и для изучения модификаций H1 в эмбриональных стволовых клетках мышей36. Кроме того, этот метод был успешно использован для измерения уровня карбонилирования гистонов37 в быстро растущих фибробластах и для изучения новых модификаций гистонов, таких как гликирование гистонов и марилирование гистонов38.

С нашей точки зрения, мы уверены, что этот метод может быть успешно применен для профилирования новых гистонов ПТМ, особенно тех, которые связаны с аномальной активацией специфических метаболических путей, таких как ацетилирование, малонилирование, метилирование, липидирование, лактилирование, бутилирование и другие. В конечном счете, этот метод может также служить микропрепаративным инструментом для выделения отдельных протеоформ и может облегчить анализ связанных с метаболизмом ПТМ, тем самым улучшая наше понимание этой важнейшей области исследований.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа была поддержана PRIN2022, DS, CF и AC были поддержаны PRIN2022, а MLC была поддержана программой PhD в области молекулярной онкологии, школой UMG PhD. Работа также прошла при поддержке проекта PNRR INSIDE CUP: B83C22003920001

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,4-дитиоэритритолСИГМА-ОЛДРИЧD8255 Реагент для поддержания &минус; группы SH в восстановленном состоянии; количественно снижает содержание дисульфидов.
1,5 М Трис-HCL буфер, pH 8,8BIO-RAD161-0798Разрешающий гелевый буфер
10x Трис/Глицин/SDS БИО-РАД 1610772Используйте этот предварительно смешанный 10x Трис/глицин/SDS беговой буфер для разделения образцов белка с помощью SDS-PAGE.
2-ПропанолSIGMA-ALDRICH335392-Пропанол (Изопропанол) является вторичным спиртом. Он был протестирован в качестве заменителя топлива для использования в различных топливных элементах. Порошок CuO, растворенный в 2-пропаноле, используется для синтеза коллоидов Cu с помощью лазерной абляции. Суспензия 2-пропанола с Zn(NO3)2 была использована для изготовления фотоанода из нержавеющей стали с покрытием из диоксида титана (P25-TiO2/SS), покрытого равномерно толстым слоем P25-TiO2. Этот фотоанод был использован для процесса электрохимического фотокаталитического разложения (ECPC).
30% раствор акриламида/биса BIO-RAD16101582,6% сшивающего агента. Реагент чистоты электрофореза 
Уксусная кислота ледянаяCarlo Erba Reagennts401392Уксусная кислота является важным химическим реагентом со многими промышленными применениями.
АцетонPanreac Апплимен211007.1214Ацетон  Это растворитель, известный своей универсальностью в различных лабораториях, производстве и очистке.
Ацетонитиловый83640320VWRдля ВЭЖХ    LC-MS марка
АгарозаИнвитроген15510-027Агароза  это а  гетерополисахарид  Часто используется в молекулярной биологии.
Бикарбонат аммонияSIGMA-ALDRICHA6141минимум 99,0%
персульфат аммонияSIGMA-ALDRICHA3678Для молекулярной биологии, для электрофореза, ≥ 98% 
Биоруптор плюсДиагенодB01020001 - B01020002- B01020003ультразвуковой аппарат
ДитиотреитолSIGMA-ALDRICHD9163-5GВосстановитель, используемый для уменьшения дисульфидных связей в белках.
Dodeca Набор для серебряных пятен BIO-RAD161-0480Набор для окрашивания серебра Dodeca прост в использовании для определения уровней нонаграмм белков в полиакриламидных гелях.
ГлицеринGE - Здравоохранение Медико-биологические науки171325010LГлицерин представляет собой простое соединение триола, он используется для помощи в литье градиентных гелей, стабилизатора белка и буферного компонента для хранения.
Остановка ингибитора фосфатазы Коктейль78428Thermo Scientific сохраняет состояние фосфорилирования белков во время и после лизиса клеток или экстракции белка из тканей  Одноразовый коктейль (100X).   
Остановить ингибитор протеазы Thermo SCIENTIFIC78430Thermo Scientific Halt Коктейль ингибиторов протеазы (100X) представляют собой готовые к использованию концентрированные исходные растворы ингибиторов протеазы для добавления в образцы с целью предотвращения протеолитической деградации во время лизиса клеток и экстракции белка. Одноразовый коктейль (100X).   
Соляная кислотаSIGMA-ALDRICHH1758BioReagent, для молекулярной биологии
IodoacetamideSIGMA-ALDRICHI6125≥ 99% (ЯМР), кристаллический
KClSIGMA-ALDRICHP9541Хлорид калия, KCl, is  Обычно используется в лабораторных процедурах. Его использование в качестве буфера для хранения pH-электродов и в качестве эталонного раствора для измерения проводимости хорошо известно.
Клеточная линия MCF10atccCRL-10317 эпителиальная клеточная линия, которая была выделена в 1984 году из молочной железы 36-летней женщины Уайт с фиброзно-кистозной грудью. Эта клеточная линия была депонирована Мичиганским фондом по борьбе с раком.
MgCl2SIGMA-ALDRICH208337Хлорид магния представляет собой бесцветное кристаллическое твердое вещество.
N,N,N',N'-Тетраметилэтилен-диаминSIGMA-ALDRICHT9281Для электрофореза, ок. 99%
Фосфатный солевой буфер 1XCorning153736311 X PBS (фосфатно-солевой буфер) буферизованный  Сбалансированный солевой раствор  Используется для различных биологических и клеточных культур, таких как промывка клеток перед диссоциацией, транспортировка клеток или тканей, разбавление клеток для подсчета и приготовление реагентов.
Гексацианоферрат калияSIGMA-ALDRICH60299Акцептор электронов, используемый в системах с переносом электронов,
SDS Solution 20% (w/v)  BIO-RAD161-0418Додецилсульфат натрия. Реагент чистоты электрофореза 
Тиосульфат натрия, Реагент Плюс 99%SIGMA-ALDRICH21,726-3Тиосульфат натрия, Реагент Плюс 99%
Серная кислотаSIGMA-ALDRICH339741Серная кислота, Реагент, ис Чрезвычайно коррозионная кислота, которая имеет форму желтоватой слегка вязкой жидкости. Она растворима в воде и является дипротонной кислотой. Он обладает очень сильными коррозионными, обезвоживающими и окислительными свойствами, а также гигроскопичен.
Трихлоруксусная кислотаSIGMA-ALDRICHT6399-5GТрихлоруксусная кислота (ТСА) используется в качестве реагента для осаждения белков1,2 и нуклеиновых кислот3. 
Трифторуксусная кислотаRiedel-de Haë n34957Трифторуксусная кислота
Triton X-100SIGMA-ALDRICHT9284-1LTriton X-100 представляет собой неионогенное полиоксиэтиленовое поверхностно-активное вещество, которое чаще всего используется для извлечения и солюбилизации белков.
Трипсин из поджелудочной железы свиньиSIGMA-ALDRICHT6567Proteomics Grade, биореагент, диметилированная
мочевинаSIGMA-ALDRICH33247мочевина является хаотропным агентом и используется для денатурации белков. Он нарушает водородные связи во вторичной, третичной и четвертичной структуре белков. Это также может нарушить водородные связи, присутствующие во вторичной структуре ДНК
ингибиторов фосфатазы Thermo SCIENTIFIC

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  2. Cutter, A. R., Hayes, J. J. A brief review of nucleosome structure. FEBS Lett. 589 (20 Pt A), 2914-2922 (2015).
  3. Millán-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).
  4. Sun, L., et al. Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer. Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).
  5. Kinnaird, A., et al. Metabolic control of epigenetics in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (11), 694-707 (2016).
  6. Díaz-Hirashi, Z., et al. Metabolic reprogramming and signaling to chromatin modifications in tumorigenesis. Adv Exp Med Biol. 1219, 225-241 (2020).
  7. Panatta, E., et al. Metabolic regulation by p53 prevents R-loop-associated genomic instability. Cell Rep. 41 (5), 111568(2022).
  8. Scumaci, D., Zheng, Q. Epigenetic meets metabolism: novel vulnerabilities to fight cancer. Cell Commun Signal. 21 (1), 249(2023).
  9. Chiaradonna, F., Scumaci, D. Cancer metabolism as a new real target in tumor therapy. Cells. 10 (6), 1393(2021).
  10. Scumaci, D., et al. DJ-1 proteoforms in breast cancer cells: The escape of metabolic epigenetic misregulation. Cells. 9 (9), 1968(2020).
  11. Olivo, E., et al. Moving beyond the tip of the iceberg: DJ-1 implications in cancer metabolism. Cells. 11 (9), 1432(2022).
  12. Zheng, Q., Maksimovic, I., Upad, A., David, Y. Non-enzymatic covalent modifications: a new link between metabolism and epigenetics. Protein Cell. 11 (6), 401-416 (2020).
  13. Maksimovic, I., David, Y. Non-enzymatic covalent modifications as a new chapter in the histone code. Trends Biochem Sci. 46 (9), 718-730 (2021).
  14. Lowe, B. R., et al. Histone H3 mutations: an updated view of their role in chromatin deregulation and cancer. Cancers. 11 (5), 660(2019).
  15. Karsli-Ceppioglu, S. The epigenetic landscape of promoter genome-wide analysis in breast cancer. Sci Rep. 7 (1), 6597(2017).
  16. Yang, C., et al. Histone methyltransferase and drug resistance in cancers. J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 173(2020).
  17. Vardabasso, C., et al. Histone variants: emerging players in cancer biology. Cell Mol Life Sci. 71 (3), 379-404 (2014).
  18. Ilango, S., Paital, B., Jayachandran, P., Padma, P. R., Nirmaladevi, R. Epigenetic alterations in cancer. Front Biosci. 25 (6), 1058-1109 (2020).
  19. Liu, Y., et al. Histone H2AX promotes metastatic progression by preserving glycolysis via hexokinase-2. Sci Rep. 12 (1), 3758(2022).
  20. Nowsheen, S., et al. ZNF506-dependent positive feedback loop regulates H2AX signaling after DNA damage. Nat Commun. 9 (1), 2736(2018).
  21. Ribeiro-Silva, C., Vermeulen, W., Lans, H. SWI/SNF: Complex complexes in genome stability and cancer. DNA Repair. 77, 87-95 (2019).
  22. Yang, Y., Wang, Y. Role of epigenetic regulation in plasticity of tumor immune microenvironment. Front Immunol. 12, 640369(2021).
  23. Miranda Furtado, C. L., et al. Epidrugs: targeting epigenetic marks in cancer treatment. Epigenetics. 14 (12), 1164-1176 (2019).
  24. Thomas, S. P., et al. A practical guide for analysis of histone post-translational modifications by mass spectrometry: best practices and pitfalls. Methods. 184, 53-60 (2020).
  25. Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges. FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).
  26. Kwak, H. G., Dohmae, N. Proteomic characterization of histone variants in the mouse testis by mass spectrometry-based top-down analysis. Biosci Trends. 10, 357-364 (2016).
  27. Sidoli, S., Simithy, J., Karch, K. R., Kulej, K., Garcia, B. A. Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-Orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications. Anal Chem. 87, 11448-11454 (2015).
  28. Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
  29. Basak, S. K., Ladisch, M. R. Correlation of electrophoretic mobilities of proteins and peptides with their physicochemical properties. Anal Biochem. 226 (1), 51-58 (1995).
  30. Nuccio, A. G., Bui, M., Dalal, Y., Nita-Lazar, A. Mass spectrometry-based methodology for identification of native histone variant modifications from mammalian tissues and solid tumors. Methods Enzymol. 586, 275-290 (2017).
  31. Zhang, S., Roche, K., Nasheuer, H. P., Lowndes, N. F. Modification of histones by sugar β-N-acetylglucosamine (GlcNAc) occurs on multiple residues, including histone H3 serine 10, and is cell cycle-regulated. J Biol Chem. 286 (43), 37483-37495 (2011).
  32. Perri, A. M., et al. Histone proteomics reveals novel post-translational modifications in breast cancer. Aging. 11, 11722-11755 (2019).
  33. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  34. Omenn, G. S., et al. Research on the human proteome reaches a major milestone: >90% of predicted human proteins now credibly detected, according to the HUPO human proteome project. J Proteome Res. 19 (12), 4735-4746 (2020).
  35. Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges. FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).
  36. Starkova, T. Y., et al. The profile of post-translational modifications of histone H1 in chromatin of mouse embryonic stem cells. Acta Naturae. 11 (2), 82-91 (2019).
  37. García-Giménez, J. L., et al. Histone carbonylation occurs in proliferating cells. Free Radic Biol Med. 52 (8), 1453-1464 (2012).
  38. García-Saura, A. G., Schüler, H. PARP10 multi-site auto- and histone MARylation visualized by acid-urea gel electrophoresis. Cells. 10, 654(2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Na

Похожие статьи