Method Article

Высокопроизводительный скрининговый подход для оценки аффинности связывания загрязнителей окружающей среды с ядерными рецепторами

DOI:

10.3791/67327

⸱

September 20th, 2024

 , 
1School of Public Health, Qingdao University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описывается высокопроизводительная система скрининга, которая использует флуоресцентную поляризацию специфического флуоресцентного зонда, связывающегося с ядерным рецептором, в качестве считывания для скрининга загрязнителей окружающей среды.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В окружающей среде было обнаружено повышение уровня соединений, вызывающих широкомасштабное загрязнение и представляющих опасность для здоровья человека. Однако, несмотря на их высокую распространенность в окружающей среде, имеется очень ограниченная информация об их токсикологическом воздействии. Необходимо в срочном порядке разработать методы высокопроизводительного скрининга (ВТСП) для руководства токсикологическими исследованиями. В этом исследовании был разработан анализ связывания рецептор-лиганд с использованием системы HTS для определения связывающей активности загрязнителей окружающей среды на ядерных рецепторах. Испытание проводится с помощью считывателя микропланшетов (т.е. 96-луночного планшета, содержащего различные химические вещества) путем измерения поляризации флуоресценции (ФП) конкретного флуоресцентного зонда. Этот анализ состоит из четырех частей: построение и трансформация рекомбинантных векторов, экспрессия и очистка рецепторного белка (лиганд-связывающего домена), связывание рецептор-зонд и конкурентное связывание химических веществ с рецептором. Для иллюстрации процедуры анализа была определена связывающая способность двух загрязнителей окружающей среды, перфтороктансульфоновой кислоты (ПФОС) и трифенилфосфата (ТФГ), с гамма-рецептором, активируемым пролифератором пероксисом (PPARγ). Наконец, были также обсуждены преимущества и недостатки этого метода и его потенциальные применения.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Большое количество химических веществ было широко обнаружено в окружающей среде и организме человека, что вызывает серьезную обеспокоенность по поводу их воздействия на экологическую среду и здоровье человека 1,2,3. Несмотря на их высокую распространенность в окружающей среде, информация об их токсикологическом воздействии скудна. В связи с этим необходимо срочно разработать методы высокопроизводительного скрининга (ВТСП) для облегчения оценки химической токсичности.

Сообщалось о нескольких высокопроизводительных методах скрининга (HTS) для оценки химической токсичности, таких как биотесты HTS, используемые в программах Tox21 и ToxCast 4,5. Эти методы позволяют быстро выявлять потенциальные токсиканты и получать ценную информацию о механизмах химической токсичности. Тем не менее, эти биотесты HTS в основном основаны на клеточных системах, которые могут быть сложными и дорогими. Кроме того, для оценки химической токсичности также используются методы высокопроизводительного секвенирования, но достижение высокопроизводительной оценки химических веществ остается сложной задачей6. В предыдущих исследованиях были разработаны анализы конкурентного связывания рецептор-лиганд на основе флуоресцентной поляризации (FP) для определения связывающей активности нескольких загрязнителей окружающей среды, включая пер- и полифторалкильные вещества (PFAS)7,8,9, бисфенол А (BPA)10,11 и твердые частицы (PM)12, с ядерными рецепторами, такими как рецептор, активируемый пролифератором пероксисом (PPAR)7, 8,9,10,13, фарнезоидный X-рецептор (FXR)11,12 и рецептор щитовидной железы (TR)14,15. Такой подход является эффективным, экономичным и позволяет получить механистическую информацию.

В данном исследовании протокол анализа связывания рецептор-лиганд описан на основе детектирования флуоресцентной поляризации (ФП) малого флуоресцентного зонда. Принцип анализа связывания рецептор-лиганд на основе FP проиллюстрирован на рисунке 1. Когда маленькая флуоресцентная молекула возбуждается плоскополяризованным светом, излучаемый свет становится сильно деполяризованным из-за быстрого вращения молекул. Однако, когда индикатор связывается с более крупным рецептором, его вращение замедляется. Высокое значение FP обнаруживается, когда индикатор связан с большим рецептором, в то время как низкое значение FP наблюдается, когда индикатор свободен. Рецептор гамма, активируемый пролифератором пероксисом (PPARγ), очищали для связывания зонда с рецептором. Росиглитазон (РОЗИ), перфтороктансульфоновая кислота (ПФОС) и трифенилфосфат (ТФГ) использовались для борьбы за связывание зонда с рецептором. Rosi, специфический агонист PPARγ, использовался в качестве положительного контроля в анализах конкурентного связывания рецепторов. Кроме того, в предыдущих исследованиях ПФОС и ТФГ были ранее идентифицированы как слабые агонисты PPARγ 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Кроме того, они принадлежат к различным структурным категориям соединений, известных своим воздействием на окружающую среду, и отличаются относительно высокими показателями обнаружения в человеческих популяциях. Эти соединения были использованы для дальнейшей проверки широкой применимости анализа связывания с конкуренцией. Процедура состоит из четырех этапов: построение и трансформация рекомбинантных векторов, экспрессия и очистка рецепторного белка (лиганд-связывающего домена), связывание рецептор-зонд и конкурентное связывание химических веществ с рецептором.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подробная информация о реагентах и оборудовании указана в Таблице материалов.

1. Построение и преобразование рекомбинантных векторов

PPARγ является лиганд-зависимым транскрипционным фактором с классической структурой ядерного рецептора, включающим ДНК-связывающий домен, регулирующий гены-мишени, и лиганд-связывающий домен, активируемый лигандами. При активации лиганда PPARγ образует гетеродимер с другим ядерным рецептором, ретиноидным X-рецептором (RXR), и связывается с ответными элементами PPARγ, тем самым регулируя транскрипцию нижестоящих генов-мишеней 9,16.

  1. Спроектируйте праймеры для PPARγ-LBD (см. Таблицу 1) и амплифицируйте сегмент ДНК PPARγ-LBD (см. Таблицу 2 и Таблицу 3).
  2. Линеаризовать меченный His×6 вектор pET28a путем его расщепления эндонуклеазами рестрикции XhoI и BamHI18.
  3. Клонируйте сегмент ДНК PPARγ-LBD в меченый His×6 вектор pET28a с использованием коммерчески доступного набора для клонирования, в результате чего получится рекомбинантная плазмида pET28a-PPARγ-LBD-6×His18.
  4. Трансфектировать рекомбинантную экспрессию плазмиды pET28a-PPARγ-LBD-6×His в клетки BL21 (DE3) Escherichia coli для экспрессии белка18.
  5. Добавьте 5 μL рекомбинантного вектора в компетентные клетки BL21(DE3), инкубируйте на льду в течение 30 минут, выполните тепловой шок при 42 °C в течение 45 секунд, затем немедленно вернитесь на лед.
  6. Добавьте 900 μL LB среды, встряхните при 37 °C в течение 1 часа (160-200 об/мин), затем центрифугируйте при ~3000 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
  7. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте бактериальную гранулу в 100 мкл среды LB и распределите на твердую среду. Переверните планшеты и закваску при температуре 37 °C в течение 12-16 часов.
  8. Отбор отдельных колоний для секвенирования, идентификации и последующей экспрессии и очистки белков.

2. Экспрессия и очистка рецепторного белка

  1. Трансформированные клетки BL21 (DE3) инкубируют в среде объемом 200 мл LB с добавлением ампициллина 100 мкг/мл на орбитальном шейкере (230 об/мин) в течение 1-2 ч при 37 °C.
  2. Индуцируют клетки, когда OD600 достигает 0,4-0,6 единиц абсорбции путем добавления 10 мкМ изопропил β-D-1-тиогалактопиранзида (IPTG) и инкубируют при 16 °C в течение 16 ч.
  3. Соберите бактериальную суспензию и центрифугируйте при 8000 × г, 4 °C, в течение 10 минут.
  4. Лизировать клетки в 20 мл растворимого лизисного буфера (50 мМ2PO4, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, pH 8,0), добавив 200 мкл фенилметилсульфонилфторида (PMSF) и 200 мкл лизоцима. Повторно суспендируйте бактериальную гранулу с помощью пипетки объемом 5 мл, затем продолжайте ультразвуковую обработку при мощности 30% в течение 20 минут.
  5. Добавьте буфер для лизиса, равный 5-кратному объему колонки, чтобы уравновесить никелевую колонну. Повторите этот процесс дважды и отложите в сторону.
  6. Центрифугирование ультразвуковой бактериальной суспензии при 8000 × г в течение 15 мин при 4 °C с получением лизата надосадочной жидкости бактерий (CL).
  7. Загрузите CL на никелевую колонку (для адсорбции белка) для получения проточного (FT).
  8. Промойте колонку в 5 раз большим объемом промывочного буфера (50 мМ2PO4, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазола, pH 8,0) для получения промывочного элюата (W1-W6).
  9. Промойте колонку 1 мл элюирующего буфера (50 мМ2PO4, 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазола, pH 8,0) для элюирования целевого белка и получения белковых фракций (E1-E5).
  10. Возьмите аликвоту объемом 20 мкл каждой фракции (CL, FT, W1-W6 и E1-E5) и проанализируйте с помощью SDS-PAGE18 с окрашиванием Coomassie Brilliant Blue. PPARγ-LBD работает как белок с массой 34,9 кДа на денатурирующем геле.

3. Анализ связывания рецепторов

Примечание: В этом анализе C1-BODIPY-C12 использовали в качестве сайт-специфичного флуоресцентного зонда для установления системы связывания рецептор-лиганд. C1-BODIPY-C12, специфический лиганд для PPARγ, представляет собой флуоресцентный аналог жирной кислоты с флуоресцентной группой BODIPY, включенной в жирную кислоту в положении C1.

  1. Разведите очищенный человеческий PPARγ-LBD в буфере Tris-HCl (20 мМ Tris, 100 мМ NaCl, pH 8,0) до диапазона концентраций от 1 нМ до 6400 нМ. Кроме того, разведите зонд C1-BODIPY-C12 в буфере Tris-HCl до концентрации 50 нМ.
  2. Смешайте разбавленный раствор PPARγ-LBD (55 μл на лунку) и раствор зонда C1-BODIPY-C12 (55 μл на лунку) в 96-луночной черной пластине. Выдерживать при комнатной температуре в течение 5 минут.
  3. Измерьте поляризацию флуоресценции (FP) с помощью считывателя микропланшетов.
  4. Нанесите диаграмму значений FP в зависимости от концентрации рецептора, сопоставьте кривую с помощью специфической связи с уравнением склона Хилла с помощью статистического и графического программного обеспечения и рассчитайте значение Kd .

4. Конкурентный анализ связывания

Примечание: В этом анализе для связывания рецепторов использовали 800 нМ человеческого зонда PPARγ-LBD и 50 нМ зонда C1-BODIPY-C12. Росиглитазон (Rosi), трифенилфосфат (TPHP) и перфтороктансульфоновая кислота (PFOS) использовались для конкуренции с связыванием зонда с PPARγ.

  1. Разбавьте три соединения в буфере Tris-HCl в диапазоне концентраций от 0 до 200 мкМ.
  2. Готовят раствор для связывания рецептора и зонда с конечной концентрацией 800 нМ человеческого PPARγ-LBD и 50 нМ зонда C1-BODIPY-C12.
  3. Смешайте раствор для связывания рецептора и зонда (55 л на лунку) и раствор соединения (55 л на лунку) в 96-луночной черной пластине. Выдерживать при комнатной температуре в течение 5 минут.
  4. Измерьте поляризацию флуоресценции (FP) с помощью считывателя микропланшетов.
  5. Построение графика значений FP в зависимости от концентрации лиганда. Получите полумаксимальную ингибиторную концентрацию (IC50) каждого лиганда из кривой конкуренции с помощью сигмоидальной модели, обработанной программным обеспечением для построения графиков и анализа.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспрессия белка и очистка PPARγ-LBD
PPARγ-LBD гетерологически экспрессировался в BL21 (DE3) в виде белка, меченного гистидином. Белок был обнаружен в растворимых фракциях, и очищенный PPARγ-LBD показал одну полосу на SDS-PAGE с видимой молекулярной массой около 34,9 кДа (рис. 2), что согласуется с предсказанной молекулярной массой белка.

Связывание зонда C 1-BODIPY-C12 с PPARγ-LBD
В анализе связывания рецепторов C1-BODIPY-C12, меченная BODIPY жирная кислота, которая может связываться с PPARγ-LBD, была использована в качестве флуоресцентного зонда для изучения связывающей способности загрязнителей окружающей среды с hPPARγ-LBD. Как показано на рисунке 3А, значения поляризации флуоресценции (ФП) увеличивались с 20 до 250 при добавлении PPARγ-LBD, что указывает на связывание C1-BODIPY-C12 с рецептором. Кривая связывания достигала насыщения при 800 нМ PPARγ-LBD с константой диссоциации (Kd) 253,5 нМ ± 10,05 нМ. Поэтому для последующих конкурентных анализов связывания был выбран 800 нМ PPARγ-LBD.

Конкурентное связывание загрязнителей окружающей среды с PPARγ-LBD
Росиглитазон (Rosi), специфический агонист PPARγ, использовали в качестве положительного контроля для вытеснения флуоресцентного зонда в конкурентных анализах связывания лигандов. Как показано на рисунке 3B, Рози ингибировал связывание зонда C1-BODIPY-C12 с PPARγ-LBD дозозависимым образом, с IC50 6,89 мкМ, что демонстрирует осуществимость анализа. Затем было определено сродство связывания TPHP и PFOS с PPARγ-LBD. Как показано на рисунках 3C,D, TPHP и ПФОС также ингибировали связывание зонда C1-BODIPY-C12 с PPARγ-LBD дозозависимым образом, при этом значения IC50 составляли 60,45 мкМ и 37,27 мкМ соответственно.

figure-results-1
Рисунок 1: Схематическое изображение анализов конкурентного связывания рецепторов на основе флуоресцентной поляризации (ФП). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: SDS-PAGE анализ очищенного PPARγ-LBD. M — маркер молекулярной массы белка. Cl – клеточный лизат, FT – проточная фракция, W1-W6 – промывочные растворы, E1 – элюат, E2-E4 – очищенные белки PPARγ-LBD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Кривая связывания рецепторов на основе флуоресцентной поляризации (ФП) и кривые конкурентного связывания. (A) Кривая связывания C 1-BODIPY-C12 на основе FP с PPARγ-LBD человека. (Б-Г) Основанные на ФП конкурентные кривые связывания ROSI, TPHP и ПФОС с человеческим PPARγ-LBD. Полосы погрешностей обозначают стандартное отклонение (SD) для трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

ИДЕНТИФИКАТОРпоследовательный
pET28a-Человек PPARG-P1CAAATGGGTCGCGGATCCATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCC
pET28a-Человек PPARG-P2GTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGTACAAGTCCTTGTAGATCTC
Нуклеотидная последовательность PPARγ-LBDAGACGACATTCCCTCTAGAATAATTTTTTTTAACTTTAAGAAGGAGAT
ATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACACCAGCGGCCTG
GTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAA
TGGGTCGCGGATCCATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCCGCTGAC
CTCCGGGCCCTGGCAAAACATTTGTATGACTCATACATAAAGTCCTTCC
CGCTGACCAAAGCAAAGGCGAGGCGATCTGACAGGAAAGACAACA
GACAAATCACCATTCGTTATGACATGAATTCCTTAATGATGGGAGA
AGATAAAATCAAGTTCAAACACATCACCCCCTGCAGGAGCAGAGCAA
AGAGGTGGCCATCCGCATCTTTTTCAGGGCTGCCAGTTTCGCTCCGTGG
AGGCTGTGCAGGAGATCACAGAGTATGCCAAAAGCATTCCTGGTTTTG
TAAATCTTGACTTGAACGACCAAGTAACTCTCCTCAAATGGAGTCCA
CGAGATCATTTACAAATGCTGGCCTCCTTGATGAATAAAGATGGGGT
TCTCATATCCGAGGGCCAAGGCTTCATGACAAGGGAGTTTCTAAAG
AGCCTGCGAAAGCCTTTTGGTGACTTTATGGAGCCCAAGTTTGAGT
TTGCTGTGAAGTTCAATGCACTGGAATTAGATGACAGCGACTTGGCAA
TATTTATTGCTGTCATTATTCTCAGTGGAGACCGCCCAGGTTTTTGCTGAA
TGTGAAGCCCATTGAAGACATTCAAGACAACCTGCTAAGCCCTGG
AGCTCCAGCTGAAGCTGAACCCTGAGTCCTCACAGCTG
CCAAGCTGCTCCAGAAAATGACAGACCTCAGACAGATTGTCACGGA
ACACGTGCAGCTACTGCAGGTGATCAAGAAGAGAGGAAACCGACATG
AGTCTTCACCCGCTCCTGCAGGAGATCTAAGGACTTGGACTGGACTGG
CTCGAGGCCACCCCCC

Таблица 1: Праймер и нуклеотидная последовательность лиганд-связывающего домена PPARγ.

Названия экспериментальных реагентовОбъем/Доза
pET28a-Человек PPARG-P11 μл
pET28a-Человек PPARG-P21 μл
2×phanta Max Мастер Микс12,5 мкл
кДНК2 мкл
ддН2О8,5 мкл

Таблица 2: Экспериментальная система реагентов ПЦР.

Названия экспериментовТемператураВремя
Предварительная денатурация95 °C3 мин
Денатурация95 °C15 с
Отжиг65 °C15 с
Расширение72 °C6 мин
Магазин12 °C--

Таблица 3: Программа экспериментальной реакции ПЦР.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Флуоресцентная поляризация (ФП), поверхностный плазмонный резонанс (СПР) и ядерный магнитный резонанс (ЯМР) являются распространенными методами, используемыми для оценки прямых взаимодействий между белками и соединениями19,20. FP широко используется в исследовании молекулярных взаимодействий для разработки лекарств и химического скрининга 21,22,23. Для сравнения, анализы SPR и ЯМР являются дорогими и трудоемкими, что делает их менее подходящими для высокопроизводительного скрининга (HTS). Этот протокол описывает метод рецепторно-лигандного анализа, основанный на FP с многолуночной системой детектирования, позволяющей проводить HTS химических веществ.

Выбор подходящего зонда для анализа связывания рецепторов имеет решающее значение. Зонд должен состоять из двух компонентов: специфического лиганда для ядерного рецептора и флуоресцентной группы. Как правило, такие зонды могут быть получены коммерчески, как это видно на примере зонда C1-BODIPY-C12, используемого в данном исследовании. C1-BODIPY-C12 является флуоресцентным аналогом жирной кислоты с флуоресцентной группой BODIPY в положении C1 и является специфическим лигандом для PPARγ. Если коммерчески доступный флуоресцентный зонд не является вариантом, его следует химически синтезировать путем присоединения флуоресцентной группы к известному конкретному лиганду.

Классическая структура ядерного рецептора включает ДНК-связывающий домен, ответственный за регуляцию экспрессии генов-мишеней, и лиганд-связывающий домен (LBD), обычно расположенный на С-конце24 рецептора. Сайт связывания корегулятора обычно находится в домене функции активации транскрипции ядерного рецептора, где он взаимодействует с ядерными корегуляторными факторами25. Эти корегуляторы могут либо усиливать, либо подавлять транскрипционную активность рецептора, тем самым модулируя экспрессию генов. LBD, расположенный в определенной области рецепторного белка, регулирует конформационные изменения рецептора при связывании с лигандом, что, в свою очередь, активирует или ингибирует его транскрипционную активность. Поскольку LBD является четко определенным доменом, имеющим решающее значение для распознавания и связывания специфических низкомолекулярных лигандов24, в данном исследовании в анализе конкурентного связывания рецептора использовался только рецептор-LBD. Этот подход, который включал экспрессию и очистку лиганд-связывающего домена PPARγ, снизил затраты на анализ.

Реагенты, используемые в этом методе, в том числе буферы для очистки белков, зонд C1-BODIPY-C12 и Tris-HCl, коммерчески доступны и недороги, что является существенным преимуществом для анализа. Детектирование флуоресцентной поляризации (ФП) выполняется в многолуночном планшете (96-луночный или 384-луночный) с быстрым временем считывания 3-5 минут на планшет, что повышает производительность и эффективность тестирования. Подход к связыванию рецептор-лиганд является очень гибким и может быть легко адаптирован к различным рецепторам при условии наличия рецепторных белков. Такая адаптивность расширяет рамки исследований, которые могут быть проведены с использованием этого метода. В целом, сочетание этих преимуществ - простота использования, экономическая эффективность, высокая пропускная способность, быстрая обработка и гибкость в адаптации рецепторов - делает этот метод многообещающим вариантом для скрининга токсичных загрязнителей окружающей среды.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что ПФОС и ТФГ могут связываться с PPARγ, что согласуется с предыдущими результатами молекулярного докинга и анализа репортерных генов 9,26. Кроме того, метод, описанный в данной рукописи, был использован для оценки активности связывания нескольких загрязнителей окружающей среды с ядерными рецепторами. Например, с помощью анализа конкурентного связывания рецептор-лиганд на основе FP была определена активность связывания 19 пер- и полифторалкильных веществ (PFAS) и 7 соединений бисфенола А (BPA) с рецептором, активируемым пролифератором пероксисом, β/δ (PPARβ/δ)7,10, 12 PFAS с PPARγ 9,13, 7 соединений BPA и 3 твердых частиц (PM2,5) компонентов с фарнезоидным рецептором X (FXR)11, 12 и 8 полибромированных дифениловых эфиров (ПБДЭ) и 6 полихлорированных бифенилов (ПХБ) в рецептор щитовидной железы (TR)14,15. Эти результаты подчеркивают потенциал данного метода для скрининга связывающих взаимодействий между загрязнителями окружающей среды и ядерными рецепторами.

В предыдущих исследованиях сообщалось о методах анализа флуоресцентной поляризации (FP) для PPARγ, которые включают использование гелевой фильтрации для измерения связывания, что требует не менее 1,5 ч для обнаружения связывания одного соединения23. В отличие от этого, этот метод позволяет определить аффинность связывания по меньшей мере 12 соединений с PPARγ в течение 10 минут. Кроме того, некоторые коммерчески доступные наборы для анализа (см. Таблицу материалов) стоят более 3000 долларов США за формат 800 × 20 μL. Эти методы особенно дороги и трудоемки. В этом исследовании представлены усовершенствования по сравнению с существующими методами.

Одним из потенциальных ограничений этого метода является то, что флуоресцентный зонд должен быть лигандом для рецептора, а флуоресцентные зонды не взаимодействуют с загрязнителями окружающей среды напрямую. Поэтому крайне важно следить за тем, чтобы зонд и загрязнители окружающей среды содержались отдельно в растворе. Кроме того, этот анализ отражает ситуацию in vitro и не может полностью охватить взаимодействия in vivo , поскольку рецепторы являются гетеродимерными in vivo27. Следовательно, хотя этот метод служит инструментом быстрого скрининга, необходимо дальнейшее исследование активации рецепторов и связанных с ними токсикологических механизмов in vivo .

Еще одним недостатком является явление «сдвига вправо», наблюдаемое в анализах флуоресцентной поляризации (ФП) при оценке аффинности связывания, что может привести к систематической недооценке измеряемых аффинностей. В предыдущих исследованиях аффинность связывания росиглитазона с PPARγ оценивали с помощью анализа28 флуоресцентного резонансного переноса энергии с временным разрешением (TR-FRET), который является высокочувствительным методом измерения аффинности связывания лиганд-рецепторов. Тем не менее, анализ TR-FRET является относительно трудоемким и громоздким, требующим 4-часовой инкубации реакционного раствора при комнатной температуре перед обнаружением. Несмотря на то, что анализ FP имеет более низкую чувствительность по сравнению с анализом TR-FRET, он больше подходит для высокопроизводительного скрининга лигандов окружающей среды, которые связываются с ядерными рецепторами. Тем не менее, в анализе FP могут отсутствовать некоторые слабые экологические лиганды. Кроме того, в предыдущих исследованиях аффинность связывания ПФОС с PPARγ определялась с помощью равновесного диализа (EqD)29 – еще одного высокочувствительного метода измерения аффинности связывания лиганд-рецепторов. Тем не менее, EqD полагается на дорогостоящее аналитическое оборудование (LC-MS/MS), что ограничивает его применение и исключает возможности высокопроизводительного скрининга.

Несмотря на то, что этот анализ флуоресцентной поляризации (FP) демонстрирует явление «сдвига вправо», которое может привести к более высоким расчетным значениям IC50 , он не влияет на ранжирование относительного сродства или последующие прогнозы оценки риска. Кроме того, FP-анализ является экономически эффективным, эффективным по времени и способен проводить скрининг широкого спектра соединений на предмет их сродства к нескольким ядерным рецепторам. В целом, высокопроизводительный скрининг лигандов окружающей среды на основе FP способствует быстрой идентификации токсичных загрязнителей окружающей среды.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (грант No 82103875).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
C1-BODIPY-C12 ЗондThermo Fisher Scientific, China102209-82-3Связывается с PPARγ-LBD и излучает флуоресценцию.
Coomassie Brilliant Blue R-250Solarbio, Китай6104-59-2Окрашивание белковых полос.
Призма GraphPadDotmaticshttps://www.graphpad.com/features
имидазолаSolarbio, КитайI8090Подготовьте буферы для процесса очистки белка.
Изопропил&бета;-D-1-тиогалактопиранозидSolarbio, Китай367-93-1Индуцировать экспрессию PPARγ-LBD
Микропланшетный ридерBiotek, СШАSynergy H1 Определение значения FP
NaClShanghai Reagent7647-15-5Подготовьте буферы для процесса очистки белка.
2PO4 · 2H2OШанхайский реагент13472-35-0Подготовьте буферы для процесса очистки белка.
Ni NTA Beads 6FFSmart-Lifesciences, КитайSA005005Очистка белка.
Происхождение 8.5 OriginLab, Нортгемптон, Массачусетс, США
Перфтороктансульфоновая кислота (ПФОС)J& K Scientific Ltd, Китай1763-23-1Обнаруженные загрязнители окружающей среды
Фенилметилсульфонилфторид (PMSF)Solarbio, КитайP0100Ингибируют деградацию белка.
Набор для анализа PPARγ-конкурентThermo Fisher ScientificPV6136https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/PV6136
Набор для скрининга лиганда PPARγ-LBDCayman600616 https://www.caymanchem.com/product/600616
Росиглитазон (Рози)аладдин, Китай122320-73-4Агонисты PPAR&гамма;
ШейкерZHICHENG, КитайZWY-211CРасширение бактериальной культуры и индукция экспрессии белка
Трифенилфосфат (TPHP)Macklin, КитайT819317Обнаруженные загрязнители окружающей среды
TrisSolarbio, КитайT8230Подготовьте буферы для процесса очистки белка.
ТриптонОКСОИД Лимитед, КитайLP0042Bприготовления лизогенного бульона (ЛБ) средняя.
Ультразвуковой очистительKimberly, КитайLHO-1Разрушайте бактерии для достижения полного лизиса
мочевиныSolarbio, ChinaU8020Готовьте буферы для процесса очистки белка.
Дрожжевой экстрактOXOID Limited, КитайLP0021BПриготовьте среду Лизогения Бульон (LB).

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maddela, N. R., Ramakrishnan, B., Dueñas-Rivadeneira, A. A., Venkateswarlu, K., Megharaj, M. Chemicals/materials of emerging concern in farmlands: sources, crop uptake, and potential human health risks. Environ Sci Process Impacts. 24 (12), 2217-2236 (2022).
  2. Naidu, R., et al. Chemical pollution: A growing peril and potential catastrophic risk to humanity. Environ Int. 156, 106616(2021).
  3. Ryu, H., Li, B., De Guise, S., McCutcheon, J., Lei, Y. Recent progress in the detection of emerging contaminants PFASs. J Hazard Mater. 408, 124437(2021).
  4. Alofe, O., et al. Determining the endocrine disruption potential of industrial chemicals using an integrative approach: Public databases, in vitro exposure, and modeling receptor interactions. Environ Int. 131, 104969(2019).
  5. Bajard, L., et al. Endocrine disrupting potential of replacement flame retardants - Review of current knowledge for nuclear receptors associated with reproductive outcomes. Environ Int. 153, 106550(2021).
  6. Chen, Q., Chou, W. C., Lin, Z. Integration of toxicogenomics and physiologically based pharmacokinetic modeling in human health risk assessment of perfluorooctane sulfonate. Environ Sci Technol. 56 (6), 3623-3633 (2022).
  7. Li, C. H., Ren, X. M., Cao, L. Y., Qin, W. P., Guo, L. H. Investigation of binding and activity of perfluoroalkyl substances to the human peroxisome proliferator-activated receptor β/δ. Environ Sci Process Impacts. 21 (11), 1908-1914 (2019).
  8. Li, C. H., et al. Chlorinated polyfluorinated ether sulfonates exhibit higher activity toward peroxisome proliferator-activated receptors signaling pathways than perfluorooctanesulfonate. Environ Sci Technol. 52 (5), 3232-3239 (2018).
  9. Li, C. H., Shi, Y. L., Li, M., Guo, L. H., Cai, Y. Q. Receptor-bound perfluoroalkyl carboxylic acids dictate their activity on human and mouse peroxisome proliferator-activated receptor γ. Environ Sci Technol. 54 (15), 9529-9536 (2020).
  10. Li, C. H., Zhang, D. H., Jiang, L. D., Qi, Y., Guo, L. H. Binding and activity of bisphenol analogues to human peroxisome proliferator-activated receptor β/δ. Ecotoxicol Environ Saf. 226, 112849(2021).
  11. Zhang, D., et al. Binding activity and risk assessment of bisphenols toward farnesoid X receptor pathway: In vitro and in silico study. Sci Total Environ. 869, 161701(2023).
  12. Zhang, D., et al. Fine particulate matter disrupts bile acid homeostasis in hepatocytes via binding to and activating farnesoid X receptor. Toxicology. 506, 153850(2024).
  13. Li, C. H., Ren, X. M., Guo, L. H. Adipogenic activity of oligomeric hexafluoropropylene oxide (perfluorooctanoic acid alternative) through peroxisome proliferator-activated receptor γ pathway. Environ Sci Technol. 53 (6), 3287-3295 (2019).
  14. Qin, W. P., Li, C. H., Guo, L. H., Ren, X. M., Zhang, J. Q. Binding and activity of polybrominated diphenyl ether sulfates to thyroid hormone transport proteins and nuclear receptors. Environ Sci Process Impacts. 21 (6), 950-956 (2019).
  15. Ren, X. M., Li, C. H., Zhang, J. Q., Guo, L. H. Binding and activity of sulfated metabolites of lower-chlorinated polychlorinated biphenyls towards thyroid hormone receptor alpha. Ecotoxicol Environ Saf. 180, 686-692 (2019).
  16. Evans, N., et al. In vitro activity of a panel of per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS), fatty acids, and pharmaceuticals in peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) alpha, PPAR gamma, and estrogen receptor assays. Toxicol Appl Pharmacol. 449, 116136(2022).
  17. Kim, S., et al. Triphenyl phosphate is a selective PPARγ modulator that does not induce brite adipogenesis in vitro and in vivo. Arch Toxicol. 94 (9), 3087-3103 (2020).
  18. Matsumoto, H., Haniu, H., Komori, N. Determination of protein molecular weights on SDS-PAGE. Methods Mol Biol. 1855, 101-105 (2019).
  19. Nguyen, H. H., Park, J., Kang, S., Kim, M. Surface plasmon resonance: A versatile technique for biosensor applications. Sensors (Basel). 15 (5), 10481-10510 (2015).
  20. Hu, J., Kim, J., Hilty, C. Detection of protein-ligand interactions by 19F nuclear magnetic resonance using hyperpolarized water. J Phys Chem Lett. 13 (17), 3819-3823 (2022).
  21. LeBlanc, E. V., Shekhar-Guturja, T., Whitesell, L., Cowen, L. E. Fluorescence polarization-based measurement of protein-ligand interaction in fungal cell lysates. Curr Protoc. 1 (1), e17(2021).
  22. Huang, X., Aulabaugh, A. Application of fluorescence polarization in HTS assays. Methods Mol Biol. 1439, 115-130 (2016).
  23. Seethala, R., et al. A rapid homogeneous fluorescence polarization binding assay for peroxisome proliferator-activated receptors alpha and gamma using a fluorescein-tagged dual PPARalpha/gamma activator. Anal Biochem. 363 (2), 263-274 (2007).
  24. Hu, W., et al. Activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma and disruption of progesterone synthesis of 2-ethylhexyl diphenyl phosphate in human placental choriocarcinoma cells: Comparison with triphenyl phosphate. Environ Sci Technol. 51 (7), 4061-4068 (2017).
  25. Weatherman, R. V., Fletterick, R. J., Scanlan, T. S. Nuclear-receptor ligands and ligand-binding domains. Annu Rev Biochem. 68, 559-581 (1999).
  26. Khazaee, M., et al. Perfluoroalkyl acid binding with peroxisome proliferator-activated receptors α, γ, and δ and fatty acid binding proteins by equilibrium dialysis with a comparison of methods. Toxics. 9 (3), 45(2021).
  27. de Vera, I. M. S., et al. Synergistic regulation of coregulator/nuclear receptor interaction by ligand and DNA. Structure. 25 (10), 1506-1518.e4 (2017).
  28. Hendrickson, O. D., Taranova, N. A., Zherdev, A. V., Dzantiev, B. B., Eremin, S. A. Fluorescence polarization-based bioassays: New horizons. Sensors (Basel). 20 (24), 7132(2020).
  29. Liu, C., et al. Identification of a novel selective agonist of PPARγ with no promotion of adipogenesis and less inhibition of osteoblastogenesis. Sci Rep. 5, 9530(2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

High Throughput ScreeningNuclear ReceptorsBinding AffinityEnvironmental PollutantsReceptor Ligand BindingFluorescence PolarizationMicroplate ReaderProtein ExpressionCompetitive BindingPPAR Gamma
Video Coming Soon

Related Articles