Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Платформа поддержки принятия врачебных решений для выявления тромбоспондина 1 при неалкогольной жировой болезни печени с помощью иммуноинфильтрационного анализа

742 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67328

⸱

30 августа 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Geriatric Cardiology, General Hospital of Southern Theater Command, 2Guangzhou Key Laboratory of Cardiac Rehabilitation, 3Branch of National Clinical Research Center for Geriatric Diseases, Chinese PLA General Hospital, 4The First School of Clinical Medicine, Southern Medical University, 5Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Cardiovascular Department/The Second School of Clinical Medicine, Southern Medical University, 6Department of Electronics & Communication Engineering, Mepco Schlenk Engineering College, 7Department of Teleinformatics Engineering, Federal University of Ceará

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании изучали связь между неалкогольной жировой болезнью печени (НАЖБП) и инфарктом миокарда (ИМ) через ко-экспрессируемые гены, идентифицируя тромбоспондин 1 (THBS1) в качестве биомаркера. Иммуноинфильтрационный анализ показал, что CD8+ Т-клетки и нейтрофилы являются ключевыми факторами, при этом THBS1 демонстрирует потенциал в качестве диагностического инструмента для НАЖБП и ИМ.

Аннотация

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) и инфаркт миокарда (ИМ) являются двумя основными проблемами для здоровья со значительной распространенностью и смертностью. Это исследование было направлено на изучение ко-экспрессируемых генов, чтобы понять взаимосвязь между НАЖБП и ИМ и определить потенциальные важные биомаркеры ИМ, связанного с НАЖБП, с помощью биоинформатики и машинного обучения. Для идентификации одного дифференциально экспрессируемого гена (DEG) был использован метод машинного исключения функций опорного вектора (SVM-RFE) и метода наименьшего абсолютного сокращения и оператора отбора (LASSO) с использованием методов машинного устранения признаков опорного вектора (SVM-RFE) и наименьшего оператора абсолютной усадки и отбора (LASSO). THBS1 продемонстрировал высокую эффективность в различении пациентов с НАЖБП (AUC = 0,981) и пациентов с ИМ (AUC = 0,900). Иммуноинфильтрационный анализ выявил значительно более низкий уровень CD8+ Т-клеток и более высокие уровни нейтрофилов у пациентов с НАЖБП и ИМ. CD8+ Т-клетки и нейтрофилы были эффективны в дифференциации НАЖБП/ИМ от здоровых контрольных групп. Корреляционный анализ показал, что THBS1 положительно коррелирует с CCR (хемокиновым рецептором), классом MHC (классом основных комплексов гистосовместимости), нейтрофилами, паравоспалением и Tfh (фолликулярными хелперными Т-клетками) и отрицательно коррелирует с CD8+ Т-клетками, цитолитической активностью и TIL (инфильтрирующими опухоль лимфоцитами) у пациентов с НАЖБП и ИМ. THBS1 стал новым биомаркером для диагностики НАЖБП/ИМ по сравнению со здоровыми контрольными группами. Результаты показывают, что CD8+ Т-клетки и нейтрофилы могут служить воспалительными иммунными признаками для дифференциации пациентов с НАЖБП/ИМ от здоровых людей.

Введение

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) является серьезной проблемой общественного здравоохранения с распространенностью 25–30%1. Сообщалось, что распространенность НАЖБП высока среди пациентов с сахарным диабетом2-го типа. Тем не менее, значение НАЖБП у пациентов без диабета еще не ясно. Исследования показали, что НАЖБП играет самостоятельную роль в патогенезе атеросклероза 3,4. Кроме того, метаанализ показал, что НАЖБП тесно связана с кальцификацией коронарных артерий, эндотелиальной дисфункцией и атеросклерозом и сталанезависимым фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний5. Связь между НАЖБП и сердечно-сосудистыми заболеваниями все еще требует дальнейшего изучения.

Инфаркт миокарда (ИМ) – это катастрофическое заболевание, которое угрожает здоровью и ложится значительным экономическим бременем на пациентов и их семьи во всем мире6. ИМ также является основной причиной смерти у пациентов с НАЖБП. Клиническое исследование, опубликованное в Британском медицинском журнале, показало, что риск инфаркта миокарда у пациентов с НАЖБП в 1,17 раза выше, чем у пациентов без НАЖБП в 7,8 раза. В некоторых исследованиях были выявлены молекулярные пути, включая воспаление, окислительный стресс и метаболизм липидов, которые способствуют развитию ИМ 9,10,11, связанного с НАЖБП. Тем не менее, основные механизмы, связывающие НАЖБП и ИМ, остаются неясными. Крайне важно определить новые биомаркеры, связанные с прогнозом НАЖБП и ИМ.

Растущая распространенность НАЖБП, которая поражает широкий сегмент населения, подчеркивает серьезную проблему общественного здравоохранения, особенно учитывая ее связь с диабетом. Тем не менее, влияние НАЖБП на пациентов без диабета остается плохо изученным. НАЖБП участвует в патогенезе атеросклероза и признана независимым фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний, тесно связанным с кальцификацией коронарных артерий, эндотелиальной дисфункцией и атеросклерозом. Несмотря на эти ассоциации, точные механизмы, связывающие НАЖБП и сердечно-сосудистые заболевания, такие как инфаркт миокарда (ИМ), требуют дальнейшего выяснения. ИМ является одной из ведущих причин смертности во всем мире и налагает значительное экономическое бремя. Риск развития ИМ у пациентов с НАЖБП значительно выше, чем у пациентов без НАЖБП, что подчеркивает необходимость более глубокого понимания молекулярных путей, соединяющих эти состояния. В то время как воспаление, окислительный стресс и метаболизм липидов были предложены в качестве способствующих факторов, точные механизмы остаются неясными. Существует острая необходимость в выявлении новых биомаркеров, которые могут дать представление о прогнозе и лечении ИМ, связанного с НАЖБП.

Следовательно, в этом исследовании наборы данных микрочипов РНК для НАЖБП и ИМ были загружены из Национального центра биотехнологической информации-экспрессии генов Omnibus (NCBI-GEO, см. Таблицу материалов) для идентификации и анализа взаимодействия дифференциально экспрессируемых генов (DEGs) между НАЖБП и ИМ. Анализ обогащения, построение диаграммы сети белок-белковое взаимодействие (PPI), устранение рекурсивных признаков опорного вектора (SVM-RFE), и алгоритмы оператора наименьшей абсолютной усадки и отбора (LASSO) были использованы для идентификации генов-хабов 12,13,14,15,16,17,18,19. Иммуноинфильтрационный анализ проводили для изучения иммунных клеток у пациентов с НАЖБП и ИМ. В конечном счете, эти методы были интегрированы для выяснения взаимосвязи между НАЖБП и ИМ. Рисунок 1 иллюстрирует последовательность дизайна, использованную в этом исследовании. Сочетая биоинформатику, машинное обучение и иммуноинфильтрационный анализ, это исследование призвано внести свой вклад в разработку новой платформы поддержки принятия медицинских решений.

Основными вкладами этой статьи являются: (1) Идентификация ко-экспрессируемых генов: Исследование подчеркивает связь между НАЖБП и ИМ путем идентификации ко-экспрессированных генов, предлагая более глубокое понимание молекулярных связей между этими двумя состояниями. (2) Применение биоинформатики и машинного обучения: Используя методы биоинформатики и машинного обучения, включая машинно-рекурсивное устранение опорных векторов (SVM-RFE)17 и оператор наименьшей абсолютной усадки и отбора (LASSO)19, исследование идентифицирует THBS1 как дифференциально экспрессируемый ген. THBS1 демонстрирует высокую эффективность в дифференциации пациентов с НАЖБП и ИМ от здоровых контрольных групп. (3) Иммуноинфильтрационный анализ: Исследование проводит иммуноинфильтрационный анализ, выявляющий значительно более низкие уровни CD8+ Т-клеток и более высокие уровни нейтрофилов у пациентов с НАЖБП и ИМ. (4) Корреляционный анализ: Исследование демонстрирует, что THBS1 положительно коррелирует с несколькими иммунными факторами, включая CCR (хемокиновый рецептор), MHC класс I (основной комплекс гистосовместимости класса I), нейтрофилы, паравоспаления и Tfh (фолликулярные хелперы Т). Он отрицательно коррелирует с CD8+ Т-клетками, цитолитической активностью и инфильтрирующими опухоль лимфоцитами (TIL).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Подробная информация о базах данных, веб-ссылках и используемом программном обеспечении/пакетах приведена в Таблице материалов. Используемые параметры моделирования приведены в таблице 1.

1. Получение наборов данных микрочипов РНК

  1. Загрузите набор данных об инфаркте миокарда ( ИМ) GSE66360 из базы данных NCBI-GEO .
  2. Загрузите набор данных о неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) GSE89632 из базы данных NCBI-GEO .
  3. Убедитесь, что загруженные наборы данных включают 49 образцов MI, 50 работоспособных контрольных образцов для GSE66360, 39 образцов NAFLD и 24 работоспособных контрольных для GSE89632.

2. Идентификация DEG

  1. Предварительная обработка данных и идентификация DEG
    1. Загрузите наборы данных в RStudio с помощью соответствующих функций R.
    2. Используйте лимму пакета R для идентификации DEGs12 со следующими пороговыми значениями: P < 0,05P и |log FC | > 1,5.
    3. Используйте пакеты R pheatmap, ggplot2 и Venn для создания тепловых карт и диаграмм Венна для визуализации DEG.
  2. Создание визуализаций
    1. Используйте pheatmap для создания тепловых карт DEG.
    2. Используйте ggplot2 для создания диаграмм Венна, показывающих перекрытие DEGs между НАЖБП и MI.

3. Анализ обогащения

  1. Выполнение анализа обогащения GO, KEGG и DO
    1. Загрузите DEG в пакет R clusterProfiler13.
    2. Проведите анализ обогащения онтологии генов (GO) для классификации ДЭГ по молекулярным функциям, биологическим процессам и клеточным компонентам.
    3. Выполняйте анализ путей Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) для сопоставления ДЭГ с биохимическими путями.
    4. Используйте обогащенный анализ онтологии заболевания (DO) для связывания ДЭГ с конкретными клиническими состояниями.

4. Анализ PPI путем построения сетей PPI

  1. Используйте онлайн-платформуSTRING 14 для построения диаграмм сети белок-белковых взаимодействий (ИПП) ко-ДЭГ с доверительной вероятностью 0,4.
  2. Визуализируйте сети PPI с помощью Cytoscape15.

5. Отбор кандидатов в DEG хаба с применением алгоритмов машинного обучения

  1. Используйте алгоритмы регрессии SVM-RFE (Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination) и LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator) в RStudio для выбора наиболее релевантных DEGs 16,17,18.
  2. Убедитесь, что SVM-RFE ранжирует и удаляет объекты итеративно, в то время как регрессия LASSO19 применяет регуляризацию для идентификации разреженного набора DEG.

6. Построение ROC-кривой для оценки эффективности диагностики

  1. Использование RStudio для анализа кривой ROC (Receiver Working Characteristic)20.
  2. Рассчитайте площадь под кривой (AUC) для критических со-DEG.

7. Иммуноинфильтрационный анализ для изучения иммунной инфильтрации

  1. Проведите анализ обогащения набора генов (ssGSEA) с использованием пакетов R GSVA и GSEABase для анализа иммунной инфильтрации при НАЖБП и MI21.
  2. Сравните относительную распространенность типов иммунных клеток между образцами НАЖБП и ИМ и здоровыми контрольными группами.

8. Статистический анализ

  1. Выполняйте все статистические анализы в RStudio.
  2. Примените корреляционный анализ Пирсона для изучения паттернов коэкспрессии генов.
  3. Обеспечьте статистическую значимость с помощью P < 0,05.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед запуском протокола убедитесь, что все программное обеспечение и пакеты R правильно установлены и обновлены до последних версий.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Здесь представлены основные результаты предлагаемого исследования, охватывающие различные анализы, проведенные для выяснения молекулярных механизмов, лежащих в основе НАЖБП и ИМ.

Идентификация DEG
В наборе данных GSE89632 76 генов с повышенной регуляцией и 20 генов с пониженной регуляцией были идентифицированы как NAFLD-DEG (рис. 2B,D), в то время как набор данных GSE66360 выявил 118 генов с повышенной регуляцией и 8 генов с по...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод, описанный в данном исследовании, имеет важное значение для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе НАЖБП и ИМ. Идентифицируя ключевые биомаркеры, такие как THBS1, предлагаемый протокол предлагает потенциальные мишени как для диагностических, так и для терапевтических вмешательств. Этот подход может быть распространен на другие сложные заболевания, включающие несколько путей и иммунных реакций, что способствует открытию новых биомаркеров и терапевтических мишеней. Кроме ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (No 62271511, U21A200949), Фондом Юкай больницы общего профиля Южного командования театра военных действий (2022NZC011), Проектом научно-технической программы Гуанчжоу (2023A03J0170), Национальным клиническим исследовательским центром гериатрии (NCRCG-PLAGH-2023006) и Фондом фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований провинции Гуандун (No 2020A1515010288, No 2021A1515220101).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
CytoscapeCytoscape Consortiumверсии 3.6.1Используется для визуализации белок-белковых взаимодействий (ИПП) сетей
набора данных MI GSE66360 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).NCBI-GEO database -Для сбора наборов данных РНК-микрочипов для анализа
R пакет clusterProfilerBioconductor  -Используется для анализа обогащения GO, KEGG и DO
R пакет R ggplot2CRAN  -Используется для создания диаграмм Венна и других визуализаций
R пакет GSEABaseBioconductor -Используется совместно с GSVA для анализа обогащения набора генов
Пакет R GSVABioconductor -Используется для анализа обогащения набора генов одного образца (ssGSEA)
Пакет R limmaBioconductor -Используется для идентификации дифференциально экспрессируемых генов (DEGs)
Пакет R pheatmapCRAN -Используется для создания тепловых карт
R пакет vennCRAN -Используется для создания диаграмм Венна, наборов
данных РНК-микрочипов (GSE66360, GSE89632)NCBI-GEO -Общедоступные наборы данных РНК-микрочипов, используемые для анализа
RStudioRStudio, PBCVersion 1.4.1717Интегрированная среда разработки
для базы данных R StringSTRING (www.string-db.org/) -Онлайн-инструмент для построения сетей PPI

Ссылки

  1. de Alwis, N. M. W., Day, C. P. Non-alcoholic fatty liver disease: The mist gradually clears. J Hepatol. 48 (Suppl), S104-S112 (2008).
  2. Adams, L. A., Anstee, Q. M., Tilg, H., Targher, G. Non-alcoholic fatty liver disease and its relationship with cardiovascular disease and other extrahepatic diseases. Gut. 66 (6), 1138-1153 (2017).
  3. Bhatia, L. S., Curzen, N. P., Calder, P. C., Byrne, C. D. Non-alcoholic fatty liver disease: A new and important cardiovascular risk factor. Eur Heart J. 33 (9), 1190-1200 (2012).
  4. Boddi, M., et al. Non-alcoholic fatty liver in non-diabetic patients with acute coronary syndromes. Eur J Clin Invest. 43 (4), 429-438 (2013).
  5. Oni, E. T., et al. A systematic review: Burden and severity of subclinical cardiovascular disease among those with non-alcoholic fatty liver; should we care. Atherosclerosis. 230 (2), 258-267 (2013).
  6. Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. Acute myocardial infarction. Lancet. 389 (10070), 197-210 (2017).
  7. Stahl, E. P., et al. Non-alcoholic fatty liver disease and the heart: JACC state-of-the-art review. J Am Coll Cardiol. 73 (8), 948-963 (2019).
  8. Alexander, M., et al. Non-alcoholic fatty liver disease and risk of incident acute myocardial infarction and stroke: findings from matched cohort study of 18 million European adults. BMJ. 367, 1934578X221093907(2019).
  9. Cobbina, E., Akhlaghi, F. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)-pathogenesis, classification, and effect on drug metabolizing enzymes and transporters. Drug Metab Rev. 49 (2), 197-211 (2017).
  10. Pawlak, M., Lefebvre, P., Staels, B. Molecular mechanism of PPARα action and its impact on lipid metabolism, inflammation and fibrosis in non-alcoholic fatty liver disease. J Hepatol. 62 (3), 720-733 (2015).
  11. Katsiki, N., Mikhailidis, D. P., Mantzoros, C. S. Non-alcoholic fatty liver disease and dyslipidemia: An update. Metabolism. 65 (8), 1109-1123 (2016).
  12. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 43 (7), e47(2015).
  13. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: An R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
  14. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2021: Customizable protein-protein networks, and functional characterization of user-uploaded gene/measurement sets. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D605-D612 (2021).
  15. Sriroopreddy, R., Sajeed, R., Raghuraman, P., Sudandiradoss, C. Differentially expressed gene (DEG) based protein-protein interaction (PPI) network identifies a spectrum of gene interactome, transcriptome and correlated miRNA in nondisjunction Down syndrome. Int J Biol Macromol. 122, 1080-1089 (2019).
  16. Engebretsen, S., Bohlin, J. Statistical predictions with glmnet. Clin Epigenetics. 11, 123(2019).
  17. Ma, H., Ding, F., Wang, Y. A novel multi-innovation gradient support vector machine regression method. ISA Trans. 130, 343-359 (2022).
  18. Han, Y., Huang, L., Zhou, F. A dynamic recursive feature elimination framework (dRFE) to further refine a set of OMIC biomarkers. Bioinformatics. 37 (12), 2183-2189 (2021).
  19. Colombani, C., et al. Application of Bayesian least absolute shrinkage and selection operator (LASSO) and BayesCπ methods for genomic selection in French Holstein and Montbéliarde breeds. J Dairy Sci. 96 (2), 575-591 (2013).
  20. Gamper, M., et al. Gene expression profile of bladder tissue of patients with ulcerative interstitial cystitis. BMC Genomics. 10 (1), 1-17 (2009).
  21. Hänzelmann, S., Castelo, R., Guinney, J. GSVA: Gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics. 14, 1-15 (2013).
  22. Valbusa, F., et al. Non-alcoholic fatty liver disease and increased risk of all-cause mortality in elderly patients admitted for acute heart failure. Int J Cardiol. 265, 162-168 (2018).
  23. Zhang, Q., et al. Identification of hub biomarkers of myocardial infarction by single-cell sequencing, bioinformatics, and machine learning. Front Cardiovasc Med. 9, 939972(2022).
  24. Zhang, Q., et al. 7-Hydroxyflavone alleviates myocardial ischemia/reperfusion injury in rats by regulating inflammation. Molecules. 27 (17), 5371(2022).
  25. Zhang, Q., Guo, Y., Zhang, D. Network pharmacology integrated with molecular docking elucidates the mechanism of wuwei yuganzi san for the treatment of coronary heart disease. Nat Prod Commun. 17 (1), 1934578X221093907(2022).
  26. Baenziger, N. L., Brodie, G., Majerus, P. W. A thrombin-sensitive protein of human platelet membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 68 (2), 240-243 (1971).
  27. Zhang, N., Aiyasiding, X., Li, W. J., Liao, H. H., Tang, Q. Z. Neutrophil degranulation and myocardial infarction. Cell Commun Signal. 20 (1), 50(2022).
  28. Lawler, J. Thrombospondin-1 as an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. J Cell Mol Med. 6 (1), 1-12 (2002).
  29. Kaur, S., et al. Functions of thrombospondin-1 in the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 22 (9), 4570(2021).
  30. Asch, A. S., et al. Isolation of the thrombospondin membrane receptor. J Clin Invest. 79 (4), 1054-1061 (1987).
  31. Armstrong, L. C., Bornstein, P. Thrombospondins 1 and 2 function as inhibitors of angiogenesis. Matrix Biol. 22 (1), 63-71 (2003).
  32. Roberts, D. D., Isenberg, J. S. CD47 and thrombospondin-1 regulation of mitochondria, metabolism, and diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 321 (1), C201-C213 (2021).
  33. Emre, A., et al. Impact of non-alcoholic fatty liver disease on myocardial perfusion in non-diabetic patients undergoing primary percutaneous coronary intervention for ST-segment elevation myocardial infarction. Am J Cardiol. 116 (11), 1810-1814 (2015).
  34. Mouton, A. J., et al. Fibroblast polarization over the myocardial infarction time continuum shifts roles from inflammation to angiogenesis. Basic Res Cardiol. 114 (1), 1-16 (2019).
  35. Liu, Y., et al. Atherosclerotic conditions promote the packaging of functional microRNA-92a-3p into endothelial microvesicles. Circ Res. 124 (4), 575-587 (2019).
  36. Bai, J., et al. Thrombospondin 1 improves hepatic steatosis in diet-induced insulin-resistant mice and is associated with hepatic fat content in humans. EBioMedicine. 57 (1), 102-111 (2020).
  37. Wabitsch, S., et al. Metformin treatment rescues CD8+ T-cell response to immune checkpoint inhibitor therapy in mice with NAFLD. J Hepatol. 77 (4), 748-760 (2022).
  38. Dolejsi, T., et al. Adult T-cells impair neonatal cardiac regeneration. Eur Heart J. 43 (27), 2698-2709 (2022).
  39. Qin, Z., et al. Systemic immune-inflammation index is associated with increased urinary albumin excretion: a population-based study. Front Immunol. 13, 863640(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Биоинформатический анализмашинное обучениеметод опорных векторовбелок-белковое взаимодействиедифференциально экспрессируемый генCD8+ T-клеткиуровень нейтрофилов

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.