Количественная оценка модуляции активности фермента эластазы с помощью колориметрического анализа

Summary

Данный протокол описывает разработку колориметрического метода анализа для определения способности соединений ингибировать или активировать эластазную активность.

Abstract

Эластаза, сериновая протеаза, играет важную роль в деградации эластина. Эластин — это внеклеточный белок, который помогает поддерживать эластичность тканей легких, кожи и кровеносных сосудов. Жесткая регуляция активности эластазы имеет решающее значение для тканевого гомеостаза, поскольку нарушение регуляции может способствовать таким патологиям, как эмфизема, морщины и атеросклероз. Некоторые соединения, такие как фитохимические вещества природного происхождения, продемонстрировали потенциал для терапевтического вмешательства и вызвали значительный интерес. Выяснение модулирующих эффектов различных соединений на эластазу, будь то ингибиторные или стимулирующие, имеет решающее значение для разработки новых терапевтических и косметических стратегий, направленных на эластаза-ассоциированные расстройства. Широко распространенным методом измерения активности эластазы является колориметрический анализ эластазы. В этом анализе специфический субстрат используется для расщепления эластазы, высвобождая обнаруживаемое желтое соединение,-нитроанилин (pNA). Количество вырабатываемой пНК отражает активность эластазы в образце и может быть измерено с помощью колориметрии. Этот анализ имеет ряд преимуществ, включая простоту, высокую чувствительность, быстрые результаты и адаптируемость к различным исследовательским потребностям. Колориметрический анализ эластазы остается ценным инструментом для изучения того, как соединения влияют на активность эластазы. Благодаря своей простоте использования и эффективности, этот анализ является краеугольным камнем исследований в этой области.

Introduction

Эластаза — это фермент сериновой протеазы, который играет решающую роль в расщеплении эластина, белка, обеспечивающего эластичность различным тканям организма, включая легкие, кожу и кровеносные сосуды. Активность эластазы жестко регулируется для поддержания гомеостаза тканей, а нарушение регуляции может привести к патологическим и кожным заболеваниям, таким как эмфизема, атеросклероз и морщины на коже¹.

Существует несколько видов эластаз, каждый из которых обладает определенными характеристиками и функциями. Нейтрофильные эластазы, продуцируемые нейтрофилами, играют важную роль в им....

Protocol

Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованном для этого исследования, приведена в Таблице материалов.

1. Приготовление 0,2 М М трис-основания реакционного буфера (RB)

1. Взвесьте соответствующее основание Tris с помощью аналитических весов.
2. Переложите основание Tris в стакан и добавьте деионизированную воду с помощью градуированного цилиндра.
3. Размешайте раствор магнитной мешалкой до полного растворения основы Триса.
4. Отрегулируйте pH до 8,0, добавив 4 Н HCl по каплям. Используйте рН-метр для контроля pH.
5. Как ....

Results

После завершения разработки протокола можно получить данные об абсорбции, необходимые для выполнения соответствующих расчетов и количественной оценки способности образцов модулировать активность эластазы. На рисунке 3 показано расположение скважин с различными контрольными элементами и образцами. В случае цветных образцов, таких как использованный в этом примере, необходимо добавить элементы управления цветом для минимизации спектрофотометрических помех, так как цвет может мешать измерению ж.......

Discussion

В настоящем методе модулирующие эффекты фитохимических веществ на ферменты эластазы исследуются с помощью колориметрического анализа. Эластаза, сериновая протеаза, имеющая решающее значение для деградации эластина, играет важную роль в поддержании эластичности тканей в различных органах. Колориметрический анализ эластазы, описанный в этой работе, предлагает простой, чувствительный и быстрый метод измерения активности эластазы.

В этом контексте исследователи со.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Cell Culture Plate	Corning Incorporated	3599	Плоское дно с крышкой, полистирол
Многорежимный считыватель для визуализации клеток	Agilent	BioTek Cytation 1	Используется с программным обеспечением Gen5
Эластаза из поджелудочной железы свиньи	Sigma-Aldrich	E7885	CAS 39445-21-1; 25,9 кДа
изопропанол 99,5%	Fisher Scientific	AC184130010	CAS 67-63-0; С3Н8О; 60,10 г/моль
N-сукцинил-(Ala)3-нитроанилид	Sigma-Aldrich	S4760	CAS 52299-14-6; C19H25N5O8 ; 451,43 г/моль
pH-метр	Hach Lange	sensION+ PH31	С магнитной мешалкой и держателем датчика
Фенилметансульфонилфторид	Sigma-Aldrich	P7626	CAS 329-98-6; C7H7FO2S; 174,19 г/моль
Tris для молекулярной биологии	PanReac AppliChem	A2264	CAS 77-86-1; C4H11NO3; 121,14 г/моль