Методическая статья

Микробиота садов муравьёв Аттина: визуализация микробного ландшафта с помощью сканирующей электронной микроскопии

DOI:

10.3791/67334

⸱

4 октября 2024 г.

 ,  ,  , 
1Institute of Biosciences, Rio Claro, Department of General and Applied Biology, São Paulo State University (UNESP), 2Plant Pathology and Nematology Department, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, University of São Paulo (USP)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы предлагаем оптимизированный протокол сканирующей электронной микроскопии для визуализации высокогетерогенных и хрупких образцов, содержащих растительную и грибковую биомассу, а также микробиоту и биопленку. Этот протокол позволяет описать пространственные размеры организации микробиоты.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В макромасштабных экосистемах, таких как тропические леса или коралловые рифы, пространственная локализация организмов является основой нашего понимания экологии сообществ. В микробном мире микромасштабные экосистемы также далеки от случайной и однородной смеси организмов и сред обитания. Доступ к пространственному распределению микробов имеет основополагающее значение для понимания функционирования и экологии микробиоты, поскольку соживущие виды с большей вероятностью взаимодействуют и влияют на физиологию друг друга.

Межцарственная микробная экосистема лежит в основе колоний муравьев, выращивающих грибы, которые выращивают базидиомицеты в качестве пищевого ресурса. Муравьи Аттин питаются разнообразными субстратами (в основном растительного происхождения), метаболизируемыми культивируемым грибом, образуя губчатую структуру, «микробный сад», который действует как внешний кишечник. Сад представляет собой переплетенную сетку гиф грибов, растущих путем метаболизма субстрата, открывая ниши для создания характерной и адаптированной микробиоты. Считается, что микробиота способствует деградации субстрата и росту грибков, хотя ее пространственная организация еще не определена.

В этой статье мы опишем, как мы используем сканирующую электронную микроскопию (СЭМ) для исследования с беспрецедентной детализацией микробиоты и пространственной организации биопленки в различных системах выращивания грибов у муравьев, выращивающих грибы. Визуализация СЭМ позволила описать пространственную структуру и организацию микробиоты. СЭМ показала, что микробиота обычно собирается в биопленки, что является широко распространенной структурой микробных ландшафтов в грибоводстве. Мы представляем протоколы, используемые для фиксации, обезвоживания, сушки, распыления покрытия и визуализации такого сложного сообщества. Эти протоколы были оптимизированы для работы с деликатными и неоднородными образцами, содержащими биомассу растений и грибов, а также микробиоту и биопленку.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экосистемы состоят из организмов, связанных между собой процессами в определенном географическом месте (т.е. в окружающей среде). Организмы взаимодействуют с окружающей средой с течением времени, из чего возникают сложные и неоднородные пространственные структуры. Пространственная структура определяет экологическое разнообразие и стабильность и, в конечном счете, функционирование экосистемы 1,2,3,4. В макромасштабных экосистемах, таких как водно-болотные угодья, саванны, коралловые рифы и засушливые экосистемы, пространственные закономерности коррелируют с потоком и концентрацией ресурсов. Обеспечение оптимизации ресурсов, пространственной неоднородности и структурированности приводит к созданию более устойчивых экосистем, чем однородные2. Пространственная локализация организмов, лежащая в основе экологии сообщества, транслируется и в микробный мир.

Микробные экосистемы, далекие от организмов, хаотично и равномерно перемешанных в микросредах обитания, демонстрируют пространственные закономерности, определяющие большую часть их функционирования 5,6,7. От колонн Виноградского до микробиоты, связанной с окружающей средой и хозяином, эти экосистемы неоднородно организованы в пространстве, при этом пространственное расположение вызывает различные фенотипические реакции. Сожительствующие виды с большей вероятностью будут взаимодействовать и влиять на физиологию друг друга. Таким образом, пространственная организация сообщества, в большей степени, чем его состав как таковой, ограничивает свойства экосистем и экологические ниши 5,7,8. Иллюстрируя эти концепции, изменения в пространственной структуре, по-видимому, коррелируют с патологическим прогрессированием зубных налетов, кариеса, заболеваний десен 9,10, воспалительных заболеваний кишечника11, инфекций легких муковисцидоза, хронических раневых инфекций12,13, колоректального рака и аденом14.

В рамках микробной биогеографии (изучение распределения и структуры биоразнообразия в пространстве и времени в микромасштабе) знания о микробных экосистемах получают огромную пользу от понимания их пространственных закономерностей 6,13,15,16,17. Мы изучили пространственные закономерности микробной экосистемы, созданной насекомыми, обнаруженной в ядре колоний харизматичных муравьев-аттинов (Hymenoptera: Formicidae: Myrmicinae: Attini: Attina). Здесь находится «микробный сад», сосредоточенный вокруг базидиомицетного гриба из трибы Leucocoprinae (Basidiomycota: Agaricaceae) или из семейства Pterulaceae (Basidiomycota: Agaricales)18,19,20,21,22. Сад представляет собой губчатую структуру, возникающую из переплетенной сетки гиф, которая растет за счет метаболизма в основном растительного субстрата, используемого муравьями (Рисунок 1). Они могут включать, в зависимости от родов аттине: сухие части растений, обломки и туши насекомых, свежесрезанные листья, семена и части цветов23,24. Подобно внешнему травоядному кишечнику, сад ферментативно и химически преобразует неподатливые полимеры в лабильные питательные ресурсы, обеспечивая муравьев незаменимыми аминокислотами, липидами и растворимыми сахарами 21,25,26,27,28.

Ультраструктурный, ферментативный и транскриптомный анализы, проведенные для садов родов листорезов Atta и Acromyrmex, показывают, что эти среды структурируют континуум деградации субстрата и питательных пятен 26,29,30,31,32. Молодые участки сада, как правило, темнее из-за свежезасыпанного субстрата после фрагментации. Эти недавно добавленные субстраты часто колонизируются с краев, которые были разрезаны муравьиными рабочими и инокулированы мицелиальными сгустками. Расходясь от краев среза, грибковые гифы распространяются по субстрату 29,32,33. Обилие гиф увеличивается по мере прогрессирования деградации субстрата, что приводит к образованию беловатых и метаболически активных областей 30,31,32. Более старые регионы, с более деградированным субстратом и обильной микробиотой29,32, как правило, имеют коричневатые тона и более высокую влажность. Рабочие удаляют фрагменты этого участка, разделяя их в кучи отходов, где также берут субстраты, наносящие вред грибковому симбионту 34,35,36. Кучи отходов, хотя и физически отделены от сада, являются местом непрерывной деградации субстрата и круговорота питательных веществ из-за обильной микробиоты обитателей 29,32,37,38,39.

Микробиота, состоящая в основном из Enterobacter, Klebsiella, Pantoea, Pseudomonas и Serratia, также населяет сад, по-видимому, являясь общей для различных систем выращивания грибов. Кодируя метаболические пути, которые могут дополнять метаболизм грибков, микробиота потенциально участвует в физиологических реакциях сада 40,41,42,43,44. Не только метагеномные данные показали, что микробиота присутствовала41,42, но и анализ грибов муравьев-листорезов с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) показал в основном палочковидные бактерии над растительным субстратом32. Хотя бактерии (в том числе целлюлолитические штаммы) были выделены из всего сада, они были визуализированы только в старых частях сада и в кучах отходов, а также в первоначальной грануле, которую несли королевы основательниц 29,32. Кроме того, было неясно, может ли микробиота образовывать биопленки in vivo (т.е. в саду и отходах), о чем свидетельствует их метаболическая способность42 и наблюдается in vitro44.

В данной работе мы использовали SEM для дальнейшего понимания пространственной организации микробиоты в районах сада, детализируя физические взаимодействия микробиоты и субстрата и микробиоты и гиф. Предоставляя изображения с большей фокусной глубиной, SEM позволяет наблюдать трехмерные микроскопические структуры с высоким разрешением, что позволяет тщательно анализировать пространственные структуры микробиоты сада. Мы подробно описываем шаги по фиксации, обезвоживанию, сушке, распылению шерсти и визуализации таких неоднородных и хрупких грибковых образцов. Убрав стадию постфиксации с помощью тетраоксида осмия (OsO4) и сократив время обезвоживания, мы упростили протоколы 32,33,45 по подготовке садовых проб и образцов отходов для СЭМ-анализа. Этот адаптированный протокол сохраняет структурные структуры гиф, а также микробиоту и пространственную организацию биопленки и может быть применен к другим хрупким микробным экосистемам и биопленкам.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Микробные сады Аттина. Сад представляет собой губчатую структуру, возникшую в результате переплетенной сетки гиф, которая растет путем метаболизма в основном растительного субстрата, используемого муравьями. Также в саду обитает микробиота, которая кодирует метаболические пути, которые могут дополнять метаболизм грибков. Метагеномные данные и предыдущий анализ с помощью сканирующей электронной микроскопии указывали на его присутствие, хотя у нас было мало знаний о его пространственной организации и физическом взаимодействии с субстратом и гифами грибов. Мы использовали SEM для выявления пространственной организации и структуры микробиоты и биопленки. Иллюстрации Марианы Баркото (сад и микробиота адаптированы из Barcoto and Rodrigues 94), а фотографии Марианы Баркото и Энцо Соррентино. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Отбор проб полевых колоний

ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе колоний муравьев убедитесь, что перед сбором получены все разрешения, требуемые местным законодательством. В нашем случае разрешение на сбор #74585 было выдано Instituto Chico Mendes de Conservação e Biodiversidade (ICMBio). Когда образцы будут получены из лабораторной колонии, перейдите к разделу 2.

  1. Найдите и отметьте колонию. Выкопайте траншею вокруг гнезда до тех пор, пока садовая камера не обнажится (Рисунок 2А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые виды аттинов могут строить свои колонии под опавшей листвой или внутри гнилых бревен. В таких случаях аккуратно вращайте подстилку или аккуратно ломайте бревна для сбора образцов. Для получения подробной информации о поиске, сборе и поддержании живых колоний различных видов муравьев см. Sosa-Calvo et al.46.
  2. Откройте садовую камеру сбоку, чтобы почва не упала на поверхность сада. Тщательно соберите садовые образцы с помощью энтомологических щипцов, ложки или кухонного шумовника, в зависимости от размера сада.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно простерилизуйте инструменты перед сбором. При сборе садов муравьев-листорезов надевайте плотные тканевые перчатки, чтобы предотвратить (или, по крайней мере, смягчить) укусы рабочих. Для других видов аттин тканевые перчатки не являются обязательными.
  3. Перенесите садовые образцы в чистую пластиковую упаковку, содержащую слой штукатурки для балансировки влажности в саду. После переноса садовых и муравьиных тружеников герметично закройте реципиент, чтобы избежать высыхания образца. Храните садовые образцы при температуре 23-25 °С до обработки.
  4. Закройте траншею с предварительно удаленным грунтом.

figure-protocol-1
Рисунок 2: Протокол пробоподготовки. (А) Отбор проб из полевых колоний. (B) Обработка образцов. (C) Краткие основы и рабочий процесс для подготовки образцов: 1. Фиксация: для укрепления и сохранения структуры образца. 2. Обезвоживание: содержание воды в образцах обменивается на этанол. 3. Сушка в критической точке: жидкийCO2 заменяет этанол и испаряется. 4. Монтаж: образец отображается для анализа. 5. Напыление-покрытие золотом: предотвращение загрузки пробы. 6. Визуализация. Иллюстрации и фотографии Марианы Баркото. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

2. Реактивы

ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что следующие растворы должны быть приготовлены заранее.

  1. Приготовьте 0,2 М буфера из какодилата натрия. Для этого 42,8 г какодилата натрия растворить в 800 мл дистиллированной воды, помешивая до растворения и стабилизации рН на уровне 7,2 (при необходимости отрегулировать рН с помощью соляной кислоты). Доведите объем раствора до 1 л, добавив дистиллированную воду. Хранить раствор при температуре 4 °C (~1 месяц).
    ВНИМАНИЕ: Глутаральдегид и параформальдегид токсичны, и их следует обрабатывать в вытяжном шкафу. При работе с такими реактивами постоянно надевайте нитриловые перчатки и защитные очки.
  2. Приготовьте фиксатор Карновского (модифицированный из Карновского)47. Для этого добавьте 10 мл 25% водного раствора глутаральдегида и 10 мл 20% водного раствора параформальдегида в 25 мл 0,2 М буфера для какодилата натрия и перемешайте. Добавьте 1 мл 0,1 М хлорида кальция (CaCl2) и доведите объем до 100 мл, добавив дистиллированную воду. Хранить раствор при температуре 4 °C (до 1 месяца).
    ВНИМАНИЕ: Фиксатор Карновского вреден при вдыхании и может вызвать раздражение кожи и глаз. Таким образом, избегайте вдыхания паров, используя только на открытом воздухе или в хорошо проветриваемом помещении. При работе с раствором постоянно надевайте нитриловые перчатки и защитные очки.
  3. Используя абсолютный этанол (аналитический класс), приготовьте 30%, 50%, 70% и 90% растворы этанола в дистиллированной воде; Также требуется 100% этанол.

3. Фиксация образца

ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксаторы затвердевают и сохраняют образцы, сохраняя морфологические особенности. Альдегиды (такие как параформальдегид и глутаральдегид) представляют собой некоагулянтные фиксаторы сшивающего типа, индуцирующие перекрестные связи внутри и между белками и нуклеиновыми кислотами48.

  1. Удалите рабочих, яйца, куколки и личинки из садовых образцов с помощью энтомологических щипцов (рисунок 2B). Отложите садовые фрагменты размером не более 5 мм3. Добавьте фрагменты в пробирку объемом 2 мл (рисунок 2C).
  2. В пробирки, содержащие образцы, с помощью стеклянной пипетки Пастера добавьте ~1 мл фиксирующего раствора Карновского (убедитесь, что образец полностью покрыт). Перемешайте путем осторожного перемешивания, чтобы образец пропитался и инкубировался при 4 °C в течение не менее 24 часов, прежде чем продолжить обработку образца (Рисунок 2C.1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если следующие этапы обезвоживания не будут проведены сразу после фиксации, протокол может быть приостановлен на этом этапе, и образцы могут храниться в течение ~1 года при температуре 4 °C.
    Мы рекомендуем использовать стеклянную пипетку Пастера, так как она состоит из инертного материала и ее легче чистить для последующего повторного использования. Садовый материал обладает высокой гидрофобностью, имеет тенденцию плавать по поверхности фиксирующего раствора. Обычно требуется до 5 минут, чтобы полностью пропитаться фиксатором. Убедитесь, что фиксатор покрывает садовые фрагменты, так как его объем имеет тенденцию уменьшаться при попадании в поры образца. Мы опытным путем убедились, что после того, как образец размокал и становился влажным, его компоненты (в частности, нежный мицелий гриба) становились восприимчивыми к разрушению при дальнейшем перемешивании. Таким образом, мы рекомендуем по возможности избегать встряхивания образцов.

4. Обезвоживание образца

ПРИМЕЧАНИЕ: Серия промывки этанолом постепенно заменяет воду в образцах на этанол. Важно начинать с раствора этанола в низкой концентрации (см. ниже), чтобы избежать чрезмерного повреждения или разрушения таких хрупких образцов49.

  1. Полностью удалите фиксирующий раствор Карновского с помощью стеклянной пипетки, стараясь не нарушить работу образца (рисунок 2C.1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбросьте фиксатор Карновского в реципиент, правильно маркированный для обработки токсичных химических остатков.
  2. Сразу после снятия фиксатора добавьте 1 мл 30% этанола, стараясь не нарушить образец, и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре (рис. 2C.2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы всегда должны быть замочены в растворе. Обязательно быстро заменяйте растворы во время серии постепенной стирки этанолом. Поскольку сад теряет свой пористый вид и накапливается на дне трубки, 1 мл этанола, как правило, достаточно, чтобы покрыть образец (когда размер образца не превышает 5мм3). Однако, если образцы не полностью покрыты, добавляйте этанол до тех пор, пока образец не будет полностью покрыт.
  3. Полностью удалите 30% этанол стеклянной пипеткой, стараясь не нарушить образец. Тщательно выбросьте 30% этанол.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для всей серии постепенной стирки этанола выбросьте этанол в контейнер с соответствующей маркировкой для удаления остатков токсичных химических веществ.
  4. Добавьте 1 мл 50% этанола и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. Полностью удалите 50% этанол стеклянной пипеткой, стараясь не нарушить образец. Правильно выбросьте 50% этанол.
  5. Добавьте 1 мл 70% этанола и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. Полностью удалите 70% этанол стеклянной пипеткой, стараясь не нарушить образец. Тщательно выбросьте 70% этанол.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этапе промывки этанолом на 70% пользователь может приостановить протокол, если это необходимо, так как пробирки с образцами могут храниться в течение ночи при температуре 4 °C, когда материал не будет немедленно обработан.
  6. Добавьте 1 мл 90% этанола и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. Полностью удалите 90% этанола стеклянной пипеткой, стараясь не нарушить образец. Правильно выбросьте 90% этанол.
  7. Добавьте 1 мл 100% этанола и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. Полностью удалите 100% этанол стеклянной пипеткой, стараясь не нарушить образец. Правильно выбросьте 100% этанол.
  8. С помощью щипцов и/или шпателя осторожно переложите образцы в контейнеры для образцов для сушилки для критических точек (CPD), содержащие идентификационные этикетки образцов (предварительно выполненные на бумаге и карандаше). Во избежание высыхания образцов этот перенос осуществляется с контейнером, помещенным в чашку Петри, покрытую 100% этанолом.
  9. Накройте контейнеры крышками и погрузите их в стакан из градуированного стекла, содержащий 100% этанол в количестве, достаточном для погружения контейнеров. Накройте стеклянный стакан крышкой и выдерживайте 10 минут при комнатной температуре; Затем правильно выбросьте 100% этанол.
  10. Переложите контейнеры с образцами в другой стакан из градуированного стекла, содержащий достаточное количество 100% этанола для погружения контейнеров. Накройте стеклянный стакан крышкой и выдерживайте 10 минут при комнатной температуре; Затем переместите контейнеры с образцами в сушилку для критических точек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После серии мытья стеклянные пипетки и стаканы следует обильно промыть дистиллированной водой, а эту остаточную воду следует сбросить в реципиент с соответствующей маркировкой для удаления остатков токсичных химических веществ. После ополаскивания стеклянные изделия можно мыть нейтральным моющим средством, ополаскивать водопроводной водой и сушить на воздухе.

5. Сушка в критических точках

ПРИМЕЧАНИЕ: Осушитель для критических точек заменяет этанол в образцах на жидкий углекислый газ (CO2), который испаряется из образца при более высокой температуре и давлении. Пожалуйста, следуйте инструкциям производителя для таких процедур.

  1. Включите оборудование.
  2. Откройте камеру, поместите внутрь контейнеры с образцами и добавьте 100% этанол, пока он не покроет контейнеры. Закройте камеру.
  3. Активируйте опцию Cool , и дождитесь, пока температура достигнет 10 °C.
  4. Откройте клапан баллона CO2 и активируйте опцию «Мешалка ».
  5. Активируйте опцию CO2 в, всегда проверяя камеру, чтобы убедиться, насколько CO2 уже заполнил ее. Когда камера почти заполнится, отключите опцию CO2 in и активируйте опцию Exchange , продолжая ее активировать до тех пор, пока CO2 не будет достаточно только для покрытия контейнеров. Убедитесь, что контейнеры всегда покрыты CO2 (т. е. отключите опцию «Обмен» до того, как весь CO2 покинет камеру). Повторите шаг 5.5 6 раз.
  6. Активируйте CO2 в последний раз и заполните камеру до тех пор, пока контейнеры не будут закрыты.
  7. Активируйте опцию «Нагрев » и выключите опцию «Мешалка ». Закройте вентиль баллона CO2.
  8. Дождитесь, пока температура поднимется до 35 °C; затем активируйте опцию Gas out.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При температуре около 30 °C камера достигает давления 70-80 бар, достигая критической точки, где жидкость исчезает.
  9. Когда давление в камере достигает 1 бар, все содержимое газа удаляется. Откройте камеру и извлеките емкости.
  10. Выключите оборудование.

6. Монтаж

  1. Подготовьте держатели образцов SEM (т.е. алюминиевые заглушки; Рисунок 2C.4).
    1. Оберните корешки куском алюминиевой фольги, накрыв только верх, чтобы облегчить очистку корешков после анализа.
    2. Определите заглушки, написав код/номер образца на нижней части держателя, гарантируя идентификацию того, что размещено сверху.
    3. Верхнюю часть накройте двусторонним углеродным скотчом. Поместите огрызки в держатель для образцов.
  2. Откройте крышку контейнера для образцов и осторожно переложите высушенный образец в стеклянную чашку Петри с помощью щипцов и шпателя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сады критической точечной сушки имеют тенденцию к агломерации, образуя плотно упакованные образцы, которые должны быть аккуратно разделены на фрагменты размером не более 1мм3.
  3. Аккуратно поместите фрагменты на липкую поверхность обтянутого скотчем огрызка. Как только садовый фрагмент соприкоснется с лентой, его очень трудно (пере)переместить, поэтому будьте осторожны, чтобы не разместить его в нежелательных местах или положениях. Добавляйте до девяти фрагментов на заготовку.
  4. Повторите шаги 6.2 и 6.3 для каждого образца.

7. Напыление с золотом

ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения зарядки образца необходимо покрыть его. Следуйте инструкциям производителя по регулировке таких параметров, как давление рабочего газа (0,5 × 10-1 мм рт.ст. давления газа в этом протоколе), время распыления (220 с), толщина слоя золота (~120 Å), ток (50 мА) и напряжение питания. Распыление, как правило, происходит по общему рабочему процессу, хотя оборудование разных производителей может работать немного по-разному.

  1. Откройте шарнирный рычаг мишени и положите заглушки на стол для образцов.
  2. Закройте шарнирный кронштейн мишени и проверьте, правильно ли встроен противоосколочный экран стеклянной вакуумной камеры.
  3. Откройте клапан баллона с аргоном и включите главный выключатель питания.
  4. Следите за повышением вакуума на дисплее оборудования до тех пор, пока он не достигнет отметки 0,5 × 10-1 мм рт.ст. на дисплее; затем активируйте Полоскание. Повторите операцию 5 раз.
  5. Включите систему циркуляции воды, активируйте опцию HV On и откройте крышку с золотой пленкой. Убедитесь, что цвет плазмы розоватый. Чтобы следовать этому протоколу, настройте 220 с распыления с напряжением 50 мА, что приведет к нанесению золотого слоя ~120 Å (12 нм).
  6. Функция HV On автоматически отключается. Выключите систему циркуляции воды и закройте крышку с золотой пленкой.
  7. Выключите главный выключатель питания, дав возможность воздуху поступать в вакуумную камеру. Для садовых образцов и образцов отходов повторите шаги 7.1-7.7 3 раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если визуализация не будет выполнена сразу после подготовки образца, храните заглушки в герметичном контейнере, заполненном слоем диоксида кремния, чтобы избежать регидратации образцов.

8. Визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте инструкциям производителя по регулировке настроек СЭМ, таких как диаметр объективной апертуры, рабочее напряжение, юстировка электронно-лучевой системы, осевое выравнивание и стигматоры.

  1. Поместите корешки в держатель для образцов, делая заметки о положении каждого образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Надевайте перчатки при установке или снятии держателя для образцов и следите за тем, чтобы держатель был как можно более чистым.
  2. Запустите операционное программное обеспечение с рабочего стола.
  3. Выберите настройки прибора. Визуализируйте садовые образцы с диаметром апертуры объектива 30 мкм (т.е. во второй ступени), работающие в высоком вакууме, регистрирующие сигналы от вторичных электронов (СЭД), ускоряющее напряжение 20 кВ, рабочее расстояние 15 - 20 мм, ток зонда 40,0 (в режиме большого тока) и варьирующие увеличение в зависимости от образца.
  4. Следуя инструкциям по навигации, нажмите значок вентиляционного отверстия и подождите, пока камера для образцов будет проветрена. Индикатор выполнения показывает состояние очистки.
  5. Когда атмосферное давление будет достигнуто, откройте камеру для образцов и осторожно вставьте держатель для образцов.
  6. Осторожно закройте дверцу камеры и нажмите значок эвакуации , чтобы эвакуировать прибор, отслеживая состояние вакуума через индикатор выполнения. Навигационная система покажет положение движущейся сцены и предоставит график держателя, когда перемещение будет завершено. Нажмите значок камеры , чтобы записать фотографию держателя, чтобы получить вид сверху, который поможет перемещаться между образцами во время визуализации.
  7. Нажмите на значок наблюдения , чтобы включить электронную пушку, и дождитесь формирования изображения. Используйте ручной пользовательский интерфейс (ручное управление) для ручного перемещения оси Z на нужную высоту (в зависимости от высоты образца и определенного рабочего расстояния).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы продлить срок службы вольфрамовой нити накала, приостанавливайте функцию наблюдения , когда она не ведет активную визуализацию.
  8. Используйте либо параметры, показанные на экране, либо ручное управление, чтобы изменить скорость растра и положение изображения. Перемещайте рабочую область, чтобы получить полное представление о образце, используя функцию RDC , чтобы сосредоточиться на определенных областях. При наблюдении за целевой (или интересной) структурой отрегулируйте увеличение, фокусировку, яркость, контраст и стигмацию соответственно. Исправьте стигмацию, используя ручной пользовательский интерфейс , чтобы переместить сцену в направлениях X и Y.
    1. Отрегулируйте увеличение в диапазоне от 100x до 700x, чтобы визуализировать общие аспекты сада (такие как плотность гиф, субстрат и узоры колонизации).
    2. Отрегулируйте увеличение в диапазоне от 700x до 1 500x, чтобы визуализировать пространственные паттерны микробиоты.
    3. Отрегулируйте увеличение в диапазоне от 1 500x до 3 000x, чтобы наблюдать за физическим взаимодействием микробиоты и биопленки.
    4. Отрегулируйте увеличение в диапазоне от 3 000x до 4 000x, чтобы сфокусироваться на определенных микробных кластерах.
  9. Чтобы сохранить изображение, воспользуйтесь функцией «Заморозить », нажмите на значок «Фото » и настройте путь к файлу. Как правило, проанализируйте как минимум три фрагмента сада, визуализируя каждый из них во всех диапазонах увеличения, упомянутых в шаге 8.8. В результате получается не менее 12 изображений на выборку, хотя большее количество изображений может поддерживать более подробные описания. Мы предполагаем, что 15-25 изображений на образец, ранжируя все увеличения на шаге 8.8, как правило, обеспечивают мелкие детали для описания образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Растрирование и сохранение изображения занимает несколько секунд, в течение которых следует избегать любой вибрации на плавающем столе SEM.
  10. После завершения визуализации нажмите опцию «Вентиляция », чтобы прокачать камеру, отслеживая состояние вакуума через индикатор выполнения. Осторожно снимите держатель, осторожно закройте дверцу камеры и нажмите кнопку Evac для эвакуации из камеры.
  11. Как только эвакуация будет завершена, выйдите из программного обеспечения операции.
  12. Отрегулируйте яркость и контрастность для улучшения визуализации с помощью редактора изображений.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы представили упрощенный протокол для визуализации компонентов садовых образцов и образцов отходов, таких как гифы грибов, субстрат, микробиота и биопленки. СЭМ улучшила наше понимание того, как сад и отходы формируют структурные структуры микробиоты (Рисунок 3). В садах аттина грибковые гифы представляют собой ветвистые структуры, покрывающие участки поверхности субстрата. Поскольку гифы грибов, как правило, очень чувствительны к обезвоживанию и разрыву, пользователь может руководствоваться аспектом гиф для оценки результатов подготовки образца. Как также отмечалось в предыдущих работах 32,33,45, гифы имеют трубчатый аспект; неповрежденные, трубчатые гифы указывают на эффективную подготовку образца (Рисунок 3A и Рисунок 4C). Когда гифы имеют ленточную форму, такое уплощение, возможно, является артефактом техники (рис. 4C).

Поверхности растительного субстрата можно распознать по слоям кутикулы и эпидермиса, а также устьицам и трихомам. Такие структуры более узнаваемы, когда субстраты еще не колонизированы гифами грибов и микробиотой (рис. 3A и рис. 4C). Когда субстрат колонизируется, микробиота и/или гифы грибов покрывают его поверхность таким образом, что специфические структуры растений трудно различить (рисунок 3A). Микробиота может колонизировать либо гифы грибов, либо субстрат, каждый из которых имеет кажущуюся различную пространственную организацию. На рисунке 3 такие пространственные структуры были схематически проиллюстрированы и помещены в соответствующие изображения SEM, где они были идентифицированы; это может облегчить связь между результатами СЭМ и их интерпретацией.

Гифально-колонизирующая микробиота наблюдается реже и при обнаружении состоит из палочек или коккоидных клеток, встречающихся изолированно или небольшими группами, прикрепленных к поверхности гиф. Биопленочный экзополисахаридный матрикс (ЭПС), выглядящий как структура «кружевной ткани», может быть замечен вокруг гиф небольшими скоплениями (рис. 3А). Гораздо более распространена субстратоколонизирующая микробиота, обнаруженная в садах различных видов муравьев. Модели колонизации, по-видимому, в некоторой степени определяются стадиями разрушения субстрата. Таким образом, колонизируя еще не деградировавшие субстраты, микробиота может либо проявляться в виде отдельных клеток, либо собираться в небольшие группы. Микробиота может наслаивать субстрат при наличии микроскопических признаков ухудшения состояния (т. е. когда кутикулярные/эпидермальные слои растений и другие структуры растений не различимы, а борозды и углубления обильны).

В этих «микробных матах» морфология клеток более узнаваема, когда матрица EPS отсутствует. В тех случаях, когда микробные клетки встроены в матрицу EPS, их морфологию нелегко различить. В соответствии с их пространственной организацией мы охарактеризовали биопленки как «распространяющиеся» или как «трехмерные». Когда биопленка распространяется, микробные клетки и матрица EPS периодически покрывают поверхность субстрата, образуя плоский слой толщиной 1-3 клетки (рис. 3B). Когда биопленка трехмерна, микробные клетки и матрица EPS накапливаются, образуя кластеры с толщиной в несколько клеток. Садовые районы, состоящие из испорченных субстратов (таких как старые сады и отходы), укрывают микробиоту в бороздах и углублениях, где они образуют густые сообщества (рисунок 3C). В частности, сильно деградировавшие субстраты в образцах отходов содержат обильную микробиоту, наиболее морфологически разнообразную среди всех регионов. Дрожжи усложняют это сообщество, физически взаимодействуя с прокариотами через биопленку. В образцах отходов Atta sexdens и Acromyrmex sp. было обнаружено, что матрицы EPS образуют заметную фибриллярную сетку, окружающую палочковидные и коккоидные прокариоты, а также веретенообразные и сферические дрожжи (рис. 3C).

Губчатая структура сада, возникающая в результате переплетения сетки гиф, требует дополнительного распыления для более равномерного покрытия образца. Такие действия позволяют избежать рассеяния электронов, которое искажает изображение и снижает его разрешение (рис. 4А). На этапах подготовки образцов была сохранена большая часть структуры сада, что позволило выявить пространственное распределение и организацию микробиоты. Тем не менее, стоит повторить, что такие структуры, как гифы гриба и матрица EPS, очень чувствительны к обезвоживанию и очень трудно сохраняются, особенно при СЭМ. Гифальная структура сохранилась относительно хорошо, однако разумно предположить, что биопленка, визуализированная в некоторых садовых образцах, могла отсутствовать в некоторых структурных компонентах матрицы EPS. Несмотря на то, что в некоторых образцах сохранился самый гладкий наружный слой полисахаридов, окружающих микробиоту (рис. 3A, B), некоторые из них сохранили морфологические особенности микробиоты, но не имели матрицы EPS. Однако неясно, действительно ли матрица EPS отсутствовала или она была удалена во время пробоподготовки.

С одной стороны, удаление гладкого слоя биопленки ухудшает понимание точной структуры биопленки. С другой стороны, она раскрывает морфологию, пространственную организацию и физические взаимодействия клеток, обитающих под слоем, что является нашим основным направлением исследований. В предыдущих исследованиях сообщалось о сохранении как гиф грибов, так и матрицы биопленки путем использования паров тетраоксида осмия (OsO4) в качестве основного фиксатора 44,50,51,52,53,54. Затем мы провели сравнительный эксперимент по фиксации свежих садовых образцов парами OsO4, которые, по-видимому, сохранили гладкий вид биопленок (рис. 4В). Однако этот метод привел к значительному уплощению гиф и микробиоты. Это сглаживание привело к утрате общих пространственных аспектов сада, описанных ранее 29,33,32,45, что ограничило дальнейшие исследования структурных моделей сада. Фиксация с помощью OsO4 затрудняла как различие морфологии и распределения микроорганизмов, так и дифференциацию клеточных структур от технических артефактов, что затрудняло интерпретацию данных.

figure-results-1
Рисунок 3: Архитектурные паттерны микробиоты. Микробиота колонизирует либо гифы грибов, либо субстрат в различной пространственной организации. Такие пространственные закономерности были схематически проиллюстрированы и помещены в рамки на соответствующих изображениях SEM, где они были идентифицированы (ограничены на рисунке белыми квадратами): (A) Гифально-колонизирующая микробиота состоит из изолированных или небольших групп клеток, при этом в некоторых образцах обнаруживается экзополисахаридный матрикс биопленки. (B) Колонизирующая субстрат микробиота распространяется по всему субстрату, при этом матрица EPS покрывает клетки таким образом, что их морфологию трудно различить. (C) Колонизирующая субстрат микробиота, образующая трехмерные группы, представляющие собой моно- или мультиморфологические биопленки, в некоторых случаях свидетельствующие о матрице EPS. Иллюстрации Марианы Баркото. Аббревиатура: EPS = экзополисахаридная матрица. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 4: Бесплодная визуализация. Изображения низкого качества, приводящие к неэффективным результатам и/или затрудняющие интерпретацию архитектурных шаблонов. (А) Рассеяние электронов искажает изображение, затрудняя его разрешение и, следовательно, морфологическую идентификацию. Это часто наблюдалось в образцах с напылением только один раз и уменьшалось за счет дополнительного покрытия. (B) Фиксация свежих садовых образцов парами тетраоксида осмия (OsO4) в качестве первичного фиксатора 44,50,51,52,53,54, по-видимому, сохранила гладкий вид биопленок. Тем не менее, это привело к обширному уплощению гиф и микробиоты, повредив архитектурные узоры сада. (C) Подготовка образцов с использованием фиксатора Карновского позволила получить изображения более высокого качества по сравнению с препаратами с использованием OsO4, сохранив большую часть структуры гиф, распределения микробиоты и пространственных структур садов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

СЭМ использует электронный пучок для сканирования образца, генерируя его увеличенное изображение, чтобы можно было визуализировать трехмерные микроструктуры в высоком разрешении. Поскольку SEM работает в условиях высокого вакуума, требуется удаление до или более 99% воды из проб. Внутри вакуумной камеры SEM частично гидратированные образцы могут обезвоживаться и разрушаться, не говоря уже о рассеивании электронов. Для визуализации с высоким разрешением в СЭМ пробоподготовка должна включать процедуры удаления воды с минимальными изменениями объема и морфологии, а также нанесение покрытия для предотвращения зарядки во время визуализации 55,56,57.

Во-первых, образец химически фиксируется путем сшивания его белков и нуклеиновых кислот, что достигается различными методами. Широко используемый метод включает в себя соединение глутаральдегида и формальдегида (или параформальдегида) в буфере, таком как пиперазин-1,4-бис [2-этансульфоновая кислота] (PIPES); N-[2-гидроксиэтил]-пиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота (HEPES); фосфатно-солевой буфер (PBS); или какодилат натрия. Химическая фиксация укрепляет образец, сохраняя его структуру для сушки. В зависимости от их характера образцы могут нуждаться во вторичной фиксации (в тетраоксиде осмия) и даже третичной фиксации (в уранилацетате). Во-вторых, образцы должны быть обезвожены. Поскольку сушка на воздухе приводит к обширному разрушению тонких структур, распространенным альтернативным методом является сушка в критических точках (CPD). При CPD образец не подвергается поверхностному натяжению, что предотвращает образование артефактов. С одной стороны, вода достигает критической точки при 228,5 бар и 374 °C, что легко разрушило бы образец. С другой стороны, критическая точка CO2 составляет 73,8 бар и 31 °C, что оправдывает его использование в качестве переходной жидкости. При повышении температурыСО2 переводится в газообразную форму и удаляется из образца 58,59,60,61,62,63. В-третьих, непроводящие образцы должны быть покрыты таким образом, чтобы предотвратить их зарядку и увеличить выход вторичных электронов, что в свою очередь способствует получению четких сигналов изображения64.

Представленный здесь протокол сочетает в себе процедуры сохранения образцов на основе грибов 32,33,45,65,66,67,68 и биопленок 69,70, хотя и упрощает процесс за счет исключения этапов постфиксации и сокращения времени обезвоживания. Тем не менее, он сохранил хрупкую структуру сада, еще больше детализировав физические взаимодействия микробиоты и раскрыв пространственную структуру биопленки. Пространственная сборка микробиоты имеет важное значение как для установления взаимодействий, так и для установления их регуляторных моделей. Пространственное распределение формирует социальную динамику микробов, из которой могут вытекать внутренние свойства. Они необходимы для решения проблем, связанных с изменчивостью и сложностью, с которыми сталкиваются микробные экосистемы 71,72,73. Наши результаты подтверждают микробиоту, интегрирующую структурные модели сада, подтверждая их предполагаемое участие в физиологических реакциях 32,42,43,44. Мы предоставили доказательства in situ того, что биопленки имеют отношение к микробным взаимодействиям в грибной культуре аттина42,44. Биопленки представляют собой сложные и гетерогенные многоклеточные системы, в которых микроорганизмы, встроенные в самосекретируемый матрицу EPS, образуют социальные сети. Совместно и/или антагонистически взаимодействия внутри биопленки определяют открытие, занятие и модификацию ниш 71,72,73,74. СЭМ позволила глубже понять пространственную организацию микробиоты в районах сада, детализировав физические взаимодействия микробиоты и субстрата и микробиоты и гиф, а также упростив методы предстоящих исследований в этой области.

Исследования микробиоты сада привлекают все больше внимания, в частности, уделяя особое внимание процессам, которые могут формировать состав этих уникальных сообществ75,76, а также их функции и взаимодействия 42,43,44. Бактериально-грибковые взаимодействия культур могут помочь грибу в солюбилизации фосфатов, производстве сидерофоров и разложении целлюлозы и хитина. Такие взаимодействия, которые могут происходить в виде континуума мутуализм-антагонизм, могутрегулировать функционирование сада. Методологический подход, который мы здесь представляем, позволяет взглянуть на структурное измерение, в котором могут происходить взаимодействия. Подчеркивается, что, как и большинство уже изученных микробных экосистем, сады аттине имеют узорчатый, неоднородно организованный в пространстве 5,7,8. SEM уже обеспечил in situ пространственную перспективу динамики микробиоты в различных сообществах, ассоциированных с хозяином, таких как цианогубки77, кожа горбатого кита78, грибы66, книдарии79, кишечник человека80, лишайники81, а также внесла свой вклад в описание пластисферы (новой экосистемы, полученной антропогенным путем)82. Однако в каждом из этих исследований использовался несколько отличающийся поэтапный метод подготовки образцов.

Садовые образцы являются очень хрупкими и неоднородными, с гифами грибов, которые, как считается, приспособлены к тому, чтобы не терять воду26, помимо разнообразного набора включенных субстратов24, микробиоты и ее биопленки. Тем не менее, адаптированный нами протокол пробоподготовки сохранил большую часть таких структур и позволил расширить характеристику пространственной структуры микробиоты. Мы считаем фиксацию с помощью решения Карновского критическим этапом в протоколе, так как трехмерный аспект такого хрупкого образца может схлопнуться и/или сплющиться в этот момент. Сложные образцы на грибковой основе обычно готовят для СЭМ путем фиксации глутаральдегидом и постфиксации OsO4 65,66,67,68. Однако, как сообщается, сочетание альдегидов (параформальдегида и глутаральдегида) улучшает сохранение биопленки для SEM69,70. Методы сохранения биопленок могут также включать 0,15% альциевого синего или 0,15% рутения красного к исходному фиксатору Карновского, а также 1% дубильной кислоты до 1% осмия для постфиксации. Фиксация садов и отходов с помощью Карновского и постфиксация с помощью OsO4 сохранили бактерии в старых образцах садов и отходов, хотя и не подтверждают биопленку32. Поскольку структура сада, микробиота и биопленки наших образцов сохранились без этапа постфиксации осмия, использованного в предыдущих протоколах 32,33,69,70, мы предпочли упростить протокол, убрав этот этап. OsO4 является окислителем, используемым для фиксации (особенно) компонентов липидных клеток83. ПосколькуOsO4 обладает высокой коррозионной активностью, он может вызывать серьезные ожоги при контакте с кожей и слизистыми оболочками, а также повреждать дыхательные пути или желудочно-кишечный тракт при вдыхании или проглатывании84,85. Удаляя постфиксациюOsO4, протокол, следовательно, уменьшает количество токсичных регентов, которыми можно манипулировать.

Мы также предлагаем серию промывки этанолом вместо использования ацетона, который может быть слишком жестким для деликатных образцов86. Серия промывки этанолом с шагом 10 минут также упрощает прежние протоколы SEM45 без снижения разрешения изображения. Кроме того, мы опытным путем убедились в том, что дополнительные этапы распыления дают более высокое качество изображений, что было одинаково для садовых образцов всех протестированных нами видов. Такие дополнительные шаги, возможно, покрывали образцы более равномерно, так как рассеяние электронов происходило гораздо чаще в образцах, покрытых только одним способом (рис. 4А). Таким образом, мы поощряем будущую работу по тестированию добавок и условий, которые могли бы обеспечить улучшенный протокол визуализации биопленки в образцах сада.

SEM является мощным инструментом для детализации клеточной морфологии микробиоты и пространственного расположения ЭПС на поверхностях, выявляя топографию и текстуру садовых образцов в высоком разрешении и увеличении70,87. Тем не менее, он не обеспечивает таксономической дискриминации для членов сообщества, и, следовательно, у нас нет различия, кто где находится. Кроме того, несмотря на большую фокусную глубину СЭМ, она не информирует о трехмерных особенностях образца. Для полного описания микробного сада Аттина, включая таксономическую биогеографию и трехмерное пространственное разрешение, анализ SEM можно рассматривать как первую процедуру в методах поэтапной визуализации садовых образцов. Для таксономического разрешения SEM может быть сочетаться с флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH)88,89 и ее вариантами, такими как FISH с высоким филогенетическим разрешением (HiPR-FISH)90, комбинаторное мечение и спектральная визуализация FISH (CLASI-FISH)9,91 и 3-D проекции92. Трехмерный анализ микроструктуры может быть дополнительно детализирован с помощью рентгеновской микротомографии (рентгеновская μКТ)93. До сих пор SEM позволял нам детально наблюдать пространственную организацию микробиоты вокруг гиф и на поверхности субстрата, бороздах и углублениях. Такая микробная структура расширяет наши знания о предполагаемых микробных взаимодействиях в садах аттина. Мы считаем, что представленные нами подготовительные этапы могут быть широко применены для уточнения исследований микробной пространственной организации в других хрупких микробных экосистемах.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) за предоставление финансовой поддержки (Грант #2019/03746-0). MOB благодарит за стипендию доктора философии, полученную от FAPESP (процесс 2021/08013-0) и Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brazil (CAPES) - Финансовый код 001. AR также благодарит Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) за исследовательскую стипендию (#305269/2018). Авторы хотели бы поблагодарить Марсию Регину де Моура Ауада и Антонио Теруёси Ябуки за помощь в проведении пилотных испытаний для подготовки образцов, Ренато Барбоза Салароли за техническую помощь и Энцо Соррентино за помощь в фотосъемке. Данное исследование проводилось в рамках разрешения на доступ к генетическому наследию #SISGen AA39A6D.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2 мл пробиркаAxygenMCT-200-C-BRAДля фиксации и обезвоживания образцов
Кальция хлорид безводныйMerckC4901CaCl2 безводный для приготовления Карновского s Фиксатор
Сушилка для критических точекLeicaEM CPD 300Для сушки в критических точках
Двусторонняя углеродная проводящая лента, 12 мм (Ш) X 5 М (Л)Электронная микроскопия Науки77819-12Для монтажа образцов
Энтомологические щипцыНет конкретного поставщикаДля манипуляций с садовыми образцами
Этиловый спирт (=этанол), чистый (≥ 99.5%)Sigma-Aldrich459836Для обезвоживания
ЩипцыНет конкретного поставщикаДля манипуляций с садовыми образцами
Стеклянный стаканНет конкретного поставщикаДля обезвоживания
Стеклянная чашка ПетриНет конкретного поставщикаДля манипуляций с садовыми образцами
Стеклянная пипеткаНет конкретного поставщикаДля фиксации и обезвоживания образцов
Глутаровый альдегид (водный глутаровый альдегид ЭМ марки 25%)Электронная микроскопия наук16220Для получения Карновского s фиксирующая
цель по золоту Тед Пелла, Инк.8071Для распыления покрытия с золотом
Соляная кислотаSigma-Aldrich320331Для корректировки растворов
pH Редактор изображенийФотошоплюбой вариантДля корректировки изображений
Параформальдегид (Параформальдегид 20% Водный раствор ЭМ марки)Электронная микроскопия наук15713Для приготовления Карновского s фиксирующий
реципиент ПропиленНет конкретного поставщикаДля поддержания живых колоний муравьев
Сканирующий электронный микроскопJEOL IT300 SEMДля визуализации образцов 
Тригидрат какодилата натрияSigma-AldrichC0250Для приготовления буфера какодилата
натрия ШпательНет конкретного поставщикаДля манипуляций с садовыми образцами
Контейнеры для образцов диаметром 15 мм x высотой 10 ммTed Pella, Inc.4591Для сушки в критических точках
Sputter Coater Coater Baltec SCD 050Для покрытия золотом
Заглушка (Алюминиевое крепление, штифт плоского конца) 12,7 мм x 8 мм Электронная микроскопияSciences 75520Для монтажа образцов

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Turner, M. G. Landscape ecology: the effect of pattern on process. Annu Rev Ecol Evol Syst. 20 (1), 171-197 (1989).
  2. Rietkerk, M., Van de Koppel, J. Regular pattern formation in real ecosystems. Trends Ecol Evol. 23 (3), 169-175 (2008).
  3. Schmitz, O. J. Spatial dynamics and ecosystem functioning. PLOS Biol. 8 (5), e1000378(2010).
  4. Pringle, R. M., Doak, D. F., Brody, A. K., Jocqué, R., Palmer, T. M. Spatial pattern enhances ecosystem functioning in an African savanna. PLOS Biol. 8 (5), e1000377(2010).
  5. Wimpenny, J. W. Spatial order in microbial ecosystems. Biol Rev. 56 (3), 295-342 (1981).
  6. Martiny, J. B. H., et al. Microbial biogeography: putting microorganisms on the map. Nat Rev. Microbiol. 4 (2), 102-112 (2006).
  7. McCallum, G., Tropini, C. The gut microbiota and its biogeography. Nat Rev Microbiol. 22 (2), 105-118 (2024).
  8. Lamont, R. J., Hajishengallis, G., Koo, H. Social networking at the microbiome-host interface. Infec Immun. 91 (9), e00124-e00223 (2023).
  9. Welch, J. L. M., Rossetti, B. J., Rieken, C. W., Dewhirst, F. E., Borisy, G. G. Biogeography of a human oral microbiome at the micron scale. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (6), E791-E800 (2016).
  10. Kim, D., et al. Spatial mapping of polymicrobial communities reveals a precise biogeography associated with human dental caries. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (22), 12375-12386 (2020).
  11. Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. Spatial organization and composition of the mucosal flora in patients with inflammatory bowel disease. J Clin Microbiol. 43 (7), 3380-3389 (2005).
  12. Ibberson, C. B., Barraza, J. P., Holmes, A. L., Cao, P., Whiteley, M. Precise spatial structure impacts antimicrobial susceptibility of S. aureus in polymicrobial wound infections. Proc Natl Acad Sci USA. 119 (51), e2212340119(2022).
  13. Azimi, S., Lewin, G. R., Whiteley, M. The biogeography of infection revisited. Nat Rev Microbiol. 20 (10), 579-592 (2022).
  14. Dejea, C. M., et al. Microbiota organization is a distinct feature of proximal colorectal cancers. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (51), 18321-18326 (2014).
  15. Hanson, C. A., Fuhrman, J. A., Horner-Devine, M. C., Martiny, J. B. Beyond biogeographic patterns: processes shaping the microbial landscape. Nat Rev Microbiol. 10 (7), 497-506 (2012).
  16. Adade, E. E., Al Lakhen, K., Lemus, A. A., Valm, A. M. Recent progress in analyzing the spatial structure of the human microbiome: Distinguishing biogeography and architecture in the oral and gut communities. Curr Opin Endocr. 18, 275-283 (2021).
  17. Mony, C., Bohannan, B. J., Leibold, M. A., Peay, K., Vandenkoornhuyse, P. Microbial landscape ecology: Highlights on the invisible corridors. Front Ecol Evol. 9, 753213(2021).
  18. Hölldobler, B., Wilson, E. O. The Ants. , Harvard University Press. (1990).
  19. Chapela, I. H., Rehner, S. A., Schultz, T. R., Mueller, U. G. Evolutionary history of the symbiosis between fungus-growing ants and their fungi. Science. 266 (5191), 1691-1694 (1994).
  20. Mueller, U. G., Rehner, S. A., Schultz, T. R. The evolution of agriculture in ants. Science. 281 (5385), 2034-2038 (1998).
  21. Mueller, U. G., Gerardo, N. M., Aanen, D. K., Six, D. L., Schultz, T. R. The evolution of agriculture in insects. Annu Rev Ecol Evol Syst. 36, 563-595 (2005).
  22. Dentinger, B. T., Lodge, D. J., Munkacsi, A. B., Desjardin, D. E., McLaughlin, D. J. Phylogenetic placement of an unusual coral mushroom challenges the classic hypothesis of strict coevolution in the Apterostigma pilosum group ant-fungus mutualism. Evolution. 63 (8), 2172-2178 (2009).
  23. Schultz, T. R., Brady, S. G. Major evolutionary transitions in ant agriculture. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 5435-5440 (2008).
  24. de Fine Licht, H. H., Boomsma, J. J. Forage collection, substrate preparation, and diet composition in fungus-growing ants. Ecol Entomol. 35 (3), 259-269 (2010).
  25. Martin, M. M. The biochemical basis of the fungus-attine ant symbiosis: A complex symbiosis is based upon integration of the carbon and nitrogen metabolisms of the two organisms. Science. 169 (3940), 16-20 (1970).
  26. Grell, M. N., et al. The fungal symbiont of Acromyrmex leaf-cutting ants expresses the full spectrum of genes to degrade cellulose and other plant cell wall polysaccharides. BMC Genomics. 14, 928(2013).
  27. Lange, L., Grell, M. N. The prominent role of fungi and fungal enzymes in the ant-fungus biomass conversion symbiosis. Appl Microbiol Biotechnol. 98, 4839-4851 (2014).
  28. Huang, E. L., et al. The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation. Environ Microbiol Rep. 6 (4), 389-395 (2014).
  29. Craven, S. E., Dix, M. W., Michaels, G. E. Attine fungus gardens contain yeasts. Science. 169 (3941), 184-186 (1970).
  30. De Fine Licht, H. H., Boomsma, J. J., Tunlid, A. Symbiotic adaptations in the fungal cultivar of leaf-cutting ants. Nat Commun. 5 (1), 5675(2014).
  31. Aylward, F. O., et al. Enrichment and broad representation of plant biomass-degrading enzymes in the specialized hyphal swellings of Leucoagaricus gongylophorus, the fungal symbiont of leaf-cutter ants. PLoS One. 10 (8), e0134752(2015).
  32. Moreira-Soto, R. D., Sanchez, E., Currie, C. R., Pinto-Tomás, A. A. Ultrastructural and microbial analyses of cellulose degradation in leaf-cutter ant colonies. Microbiology. 163 (11), 1578-1589 (2017).
  33. Erthal Jr, M., Silva, C. P., Cooper, R. M., Samuels, R. I. Hydrolytic enzymes of leaf-cutting ant fungi. Comp Biochem. 152 (1), 54-59 (2009).
  34. North, R. D., Jackson, C. W., Howse, P. E. Communication between the fungus garden and workers of the leaf-cutting ant, Atta sexdens rubropilosa, regarding choice of substrate for the fungus. Physiol Entomol. 24 (2), 127-133 (1999).
  35. Herz, H., Hölldobler, B., Roces, F. Delayed rejection in a leaf-cutting ant after foraging on plants unsuitable for the symbiotic fungus. Behav Ecol. 19 (3), 575-582 (2008).
  36. Schiøtt, M., De Fine Licht, H. H., Lange, L., Boomsma, J. J. Towards a molecular understanding of symbiont function: identification of a fungal gene for the degradation of xylan in the fungus gardens of leaf-cutting ants. BMC Microbiol. 8, 40(2008).
  37. Bot, A. N., Currie, C. R., Hart, A. G., Boomsma, J. J. Waste management in leaf-cutting ants. Ethol Ecol Evol. 13 (3), 225-237 (2001).
  38. Scott, J. J., et al. Microbial community structure of leaf-cutter ant fungus gardens and refuse dumps. PLOS One. 5 (3), e9922(2010).
  39. Lewin, G. R., et al. Cellulose-enriched microbial communities from leaf-cutter ant (Atta colombica) refuse dumps vary in taxonomic composition and degradation ability. PLOS One. 11 (3), e0151840(2016).
  40. Suen, G., et al. An insect herbivore microbiome with high plant biomass-degrading capacity. PLOS Genet. 6 (9), e1001129(2010).
  41. Aylward, F. O., et al. Convergent bacterial microbiotas in the fungal agricultural systems of insects. MBio. 5 (6), e02077(2014).
  42. Barcoto, M. O., et al. Fungus-growing insects host a distinctive microbiota apparently adapted to the fungiculture environment. Sci Rep. 10 (1), 12384(2020).
  43. Francoeur, C. B., et al. Bacteria contribute to plant secondary compound degradation in a generalist herbivore system. mBio. 11, e02146-e02220 (2020).
  44. Martiarena, M. J. S., Deveau, A., Montoya, Q. V., Flórez, L. V., Rodrigues, A. The hyphosphere of leaf-cutting ant cultivars is enriched with helper bacteria. Microb Ecol. 86 (3), 1773-1788 (2023).
  45. Leal-Dutra, C. A., et al. Evidence that the domesticated fungus Leucoagaricus gongylophorus recycles its cytoplasmic contents as nutritional rewards to feed its leafcutter ant farmers. IMA Fungus. 14 (1), 19(2023).
  46. Sosa-Calvo, J., Jesovnik, A., Okonski, E., Schultz, T. R. Locating, collecting, and maintaining colonies of fungus-farming ants (Hymenoptera: Myrmicinae: Attini). Sociobiology. 62 (2), 300-320 (2015).
  47. Karnovsky, M. J. A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J Cell Biol. 27, 137-138 (1965).
  48. Eltoum, I., Fredenburgh, J., Myers, R. B., Grizzle, W. E. Introduction to the theory and practice of fixation of tissues. J Histotechnol. 24 (3), 173-190 (2001).
  49. Gusnard, D., Kirschner, R. H. Cell and organelle shrinkage during preparation for scanning electron microscopy: effects of fixation, dehydration and critical point drying. J Microsc. 110 (1), 51-57 (1977).
  50. Surman, S. B., et al. Comparison of microscope techniques for the examination of biofilms. J Microbiol Methods. 25 (1), 57-70 (1996).
  51. Augustin, J. O., et al. Yet more "weeds" in the garden: fungal novelties from nests of leaf-cutting ants. PLOS One. 8 (12), e82265(2013).
  52. Montoya, Q. V., Martiarena, M. J. S., Polezel, D. A., Rodrigues, A. More pieces to a huge puzzle: Two new Escovopsis species from fungus gardens of attine ants. MycoKeys. 46, 97(2019).
  53. Varanda-Haifig, S. S., et al. Nature of the interactions between hypocrealean fungi and the mutualistic fungus of leaf-cutter ants. Antonie van Leeuwenhoek. 110, 593-605 (2017).
  54. Custodio, B. C., Rodrigues, A. Escovopsis kreiselii specialization to its native hosts in the fungiculture of the lower attine ant Mycetophylax morschi. Antonie van Leeuwenhoek. 112, 305-317 (2019).
  55. Schröttner, H., Schmied, M., Scherer, S. Comparison of 3D surface reconstruction data from certified depth standards obtained by SEM and an Infinite Focus Measurement Machine (IFM). Microchim Acta. 155, 279-284 (2006).
  56. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z. L., Joy, D. Fundamentals of scanning electron microscopy (SEM). Scanning microscopy for nanotechnology: Techniques and applications. Zhou, W., Wang, Z. L. , Springer. New York, NY. 1-40 (2007).
  57. Kannan, M. Scanning electron microscopy: Principle, components and applications. A Textbook on Fundamentals and Applications of Nanotechnology. Raja, K., Subramanian, K. S., Kannan, M. , Daya Publishing House. 81-92 (2018).
  58. Ruffolo, J. J. Jr Critical point drying of protozoan cells and other biological specimens for scanning electron microscopy: apparatus and methods of specimen preparation. Trans Am Microsc. 93 (1), 124-131 (1974).
  59. Echlin, P. Recent advances in specimen coating techniques for electron microscopy. Scanning Electron Microscopy 1981/1. , IITRI. Chicago. 79-90 (1981).
  60. Ris, H. The cytoplasmic filament system in critical point-dried whole mounts and plastic-embedded sections. J Cell Biol. 100 (5), 1474-1487 (1985).
  61. Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical-point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microsc Res Tech. 26 (6), 489-495 (1993).
  62. Bergmans, L., Moisiadis, P., Van Meerbeek, B., Quirynen, M., Lambrechts, P. Microscopic observation of bacteria: review highlighting the use of environmental SEM. Int Endod J. 38 (11), 775-788 (2005).
  63. Kirk, S. E., Skepper, J. N., Donald, A. M. Application of environmental scanning electron microscopy to determine biological surface structure. J Microsc. 233 (2), 205-224 (2009).
  64. Kemmenoe, B. H., Bullock, G. R. Structure analysis of sputter-coated and ion-beam sputter-coated films: a comparative study. J Microsc. 132 (2), 153-163 (1983).
  65. Kinden, D. A., Brown, M. F. Technique for scanning electron microscopy of fungal structures within plant cells. Phytopathology. 65, 74-76 (1975).
  66. Masaphy, S., Levanon, D., Tchelet, R., Henis, Y. Scanning electron microscope studies of interactions between Agaricus bisporus (Lang) Sing hyphae and bacteria in casing soil. Appl Environ Microbiol. 53 (5), 1132-1137 (1987).
  67. Massicotte, H. B., Melville, L. H., Peterson, R. L. Scanning electron microscopy of ectomycorrhizae potential and limitations. Scanning Microsc. 1 (3), 58(1987).
  68. Visen, A., Singh, P. N., Chakraborty, B., Singh, A., Bisht, T. S. Scanning electron microscopy indicates Pseudomonad strains facilitate AMF mycorrhization in litchi (Litchi chinensis Sonn.) air-layers and improving survivability, growth and leaf nutrient status. Curr Res Microb Sci. 2, 100063(2021).
  69. Fleeman, R. M., Mikesh, M., Davies, B. W. Investigating Klebsiella pneumoniae biofilm preservation for scanning electron microscopy. Access Microbiol. 5 (2), 000470-000473 (2023).
  70. Wells, M., Mikesh, M., Gordon, V. Structure-preserving fixation allows scanning electron microscopy to reveal biofilm microstructure and interactions with immune cells. J Microsc. 293 (1), 59-68 (2024).
  71. Nadell, C. D., Drescher, K., Foster, K. R. Spatial structure, cooperation and competition in biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (9), 589-600 (2016).
  72. Madsen, J. S., et al. Coexistence facilitates interspecific biofilm formation in complex microbial communities. Environ Microbiol. 18 (8), 2565-2574 (2016).
  73. Madsen, J. S., Sørensen, S. J., Burmølle, M. Bacterial social interactions and the emergence of community-intrinsic properties. Curr Opin Microbiol. 42, 104-109 (2018).
  74. Flemming, H. C., Wuertz, S. Bacteria and archaea on Earth and their abundance in biofilms. Nat Rev Microbiol. 17 (4), 247-260 (2019).
  75. Bringhurst, B., Allert, M., Greenwold, M., Kellner, K., Seal, J. N. Environments and hosts structure the bacterial microbiomes of fungus-gardening ants and their symbiotic fungus gardens. Microb Ecol. 86 (2), 1374-1392 (2023).
  76. Bringhurst, B., Greenwold, M., Kellner, K., Seal, J. N. Symbiosis, dysbiosis and the impact of horizontal exchange on bacterial microbiomes in higher fungus-gardening ants. Sci Rep. 14 (1), 3231(2024).
  77. Vargas, S., et al. Body-plan reorganization in a sponge correlates with microbiome change. Mol Biol Evol. 40 (6), msad138(2023).
  78. Apprill, A., et al. Humpback whale populations share a core skin bacterial community: towards a health index for marine mammals. PLOS One. 9 (3), e90785(2014).
  79. Fraune, S., et al. Bacteria-bacteria interactions within the microbiota of the ancestral metazoan Hydra contribute to fungal resistance. ISME J. 9 (7), 1543-1556 (2015).
  80. Gowen, R., Gamal, A., Di Martino, L., McCormick, T. S., Ghannoum, M. A. Modulating the microbiome for Crohn's disease treatment. Gastroenterology. 164 (5), 828-840 (2023).
  81. Moya, P., et al. Molecular phylogeny and ultrastructure of the lichen microalga Asterochloris mediterranea sp. nov. from Mediterranean and Canary Islands ecosystems. Int J Syst Evol Microbiol. 65 (6), 1838-1854 (2015).
  82. Zettler, E. R., Mincer, T. J., Amaral-Zettler, L. A. Life in the "plastisphere": microbial communities on plastic marine debris. Environ Sci Technol. 47 (13), 7137-7146 (2013).
  83. Porter, K. R., Kallman, F. The properties and effects of osmium tetroxide as a tissue fixative with special reference to its use for electron microscopy. Exp Cell Res. 4 (1), 127-141 (1953).
  84. Ligon, J. J., Abraham, J. L., Boyd, A. S. Traumatic osmium tetroxide inoculation. J Am Acad Dermatol. 45 (6), 949-952 (2001).
  85. Friedova, N., et al. Osmium absorption after osmium tetroxide skin and eye exposure. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 127 (5), 429-433 (2020).
  86. Fratesi, S. E., Lynch, F. L., Kirkland, B. L., Brown, L. R. Effects of SEM preparation techniques on the appearance of bacteria and biofilms in the Carter Sandstone. J Sediment. 74 (6), 858-867 (2004).
  87. Dassanayake, R. P., et al. Identification of a reliable fixative solution to preserve the complex architecture of bacterial biofilms for scanning electron microscopy evaluation. PLOS One. 15 (5), e0233973(2020).
  88. Desiro, A., et al. Detection of a novel intracellular microbiome hosted in arbuscular mycorrhizal fungi. ISME J. 8 (2), 257-270 (2014).
  89. Morales, D. P., et al. Advances and challenges in fluorescence in situ hybridization for visualizing fungal endobacteria. Front Microbiol. 13, 892227(2022).
  90. Shi, H., et al. Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities. Nature. 588 (7839), 676-681 (2020).
  91. Valm, A. M., Welch, J. L. M., Borisy, G. G. CLASI-FISH: principles of combinatorial labeling and spectral imaging. Syst Appl Microbiol. 35 (8), 496-502 (2012).
  92. Fernandez-Brime, S., Muggia, L., Maier, S., Grube, M., Wedin, M. Bacterial communities in an optional lichen symbiosis are determined by substrate, not algal photobionts. FEMS Microbiol Ecol. 95 (3), fiz012(2019).
  93. Schluter, S., Eickhorst, T., Mueller, C. W. Correlative imaging reveals holistic view of soil microenvironments. Environ Sci Technol. 53 (2), 829-837 (2018).
  94. Barcoto, M. O., Rodrigues, A. Lessons from insect fungiculture: from microbial ecology to plastics degradation. Front Microbiol. 13, 812143(2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи