Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Скрининг и выделение кишечных бактерий, расщепляющих С-гликозид

945 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67346

⸱

28 февраля 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Это исследование устанавливает набор стандартных операционных процедур (СОП) для эффективного скрининга и выделения кишечных бактерий, способных расщеплять С-гликозиды.

Аннотация

С-гликозиды обычно встречаются в лекарственных растениях и демонстрируют обширное структурное разнообразие наряду с различной биологической активностью, включая антибактериальную, противовоспалительную, противовирусную, антиоксидантную и противоопухолевую активность. В С-гликозидах аномерный углерод сахарной группы напрямую связан с агликоном посредством углерод-углеродной связи. По сравнению с О-гликозидами, С-гликозиды структурно стабильны и устойчивы к кислотам и ферментам. Следовательно, они, как правило, небьющиеся, что приводит к плохой усвояемости и низкой биодоступности. Интересно, что некоторые кишечные бактерии могут расщеплять C-C гликозидные связи, обеспечивая специфический и экологически чистый биологический подход к расщеплению C-гликозидов. В этом исследовании был разработан набор стандартных операционных процедур (СОП) для скрининга кишечных бактерий, способных расщеплять гликозидные связи C-C на основе модели биотрансформации природных соединений. СОП включают в себя подготовку и обогащение кишечных бактерий, скрининг, ориентированный на активность, и валидацию активности в исходной среде с низким содержанием углерода. Эта методология является основополагающим ориентиром для исследователей, стремящихся изолировать и изучить эти специализированные функциональные бактерии.

Введение

С-гликозиды представляют собой группу соединений, характеризующихся прямой связью гликозильных групп с агликонами через связиС-С 1. В природе ориентин, витексин, пуэрин и их производные обычно идентифицируются как С-гликозиды2. Эти соединения часто встречаются в лекарственных растениях, таких как Trollius chinensis3, и в животных, таких как Styela plicata4. Исследования показали, что эти соединения полезны для здоровья и проявляют различные биологические активности, включаяантибактериальную 5,6,7, противовоспалительную 8,9,10,11,12, противовирусную 3,12,13, антиоксидантную 14,15,16 и Противоопухолевая деятельность17.

Благодаря связыванию гликозильных групп со скелетом через связи С-С, эти соединения проявляют высокую стабильность и устойчивость к кислотному и ферментативномугидролизу18, что приводит к плохой абсорбции и низкой биодоступности19. Это ограничение влияет на выработку и утилизацию С-гликозидов. Тем не менее, препараты, содержащие С-гликозиды, часто назначаемые перорально, дегликозилируются специфическими ферментами, производя более мощные биоактивные агликоны 20,21,22,23. В то время как собственные ферменты хозяина не способны дегликозилировать С-гликозиды, кишечные бактерии, как сообщается, метаболизируют определенные типы. Например, некоторые кишечные бактерии превращают мангиферин в норатириол, который проявляет большую активность в качестве противодиабетического или противоопухолевогоагента. Несмотря на эти результаты, было охарактеризовано лишь ограниченное число бактерий, способных расщеплять С-гликозиды, и лежащие в их основе механизмы остаются плохо изученными. Эффективный и стандартизированный скрининг этих бактерий улучшит понимание их функций и ускорит выработку С-гликозидов.

Метод скрининга был разработан и усовершенствован с течением времени, превратившись в зрелую систему. Основные подходы включают обогащение, скрининг, ориентированный на деятельность, и валидацию активности в исходных средах с низким содержанием углерода. Этот метод облегчает выделение чистых целевых штаммов, а также идентификацию видов, геномных данных и признаков целевых микроорганизмов. Используя эту систему, кишечные бактерии, способные расщеплять С-гликозиды, могут быть эффективно проверены и изолированы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Проводимые эксперименты проводились в соответствии с местными, национальными и международными нормами локализации биобезопасности, соответствующими конкретным угрозам биобезопасности, связанным с каждым штаммом. Образцы кала были собраны у здоровых добровольцев, которые не принимали никаких лекарств в течение как минимум одной недели. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании представлена в Таблице материалов.

1. Построение модели бактериальной трансформации кишечника человека in vitro

  1. Приготовление общеанаэробной среды (ГАМ)25
    1. Приготовление раствора А
      1. Смешайте в 500 мл колбы Эрленмейера 10,0 г триптона, 10,0 г пептона протеозы, 3,0 г соевого пептона, 13,5 г порошка пищеварительной сыворотки, 1,2 г порошка экстракта печени, 2,2 г экстракта говядины и 5,0 г экстракта дрожжей.
      2. Добавьте 500 мл дистиллированной воды и размешайте при нагревании до полного растворения веществ.
    2. Приготовление раствора Б
      1. Приготовьте раствор В, следуя той же процедуре, что и раствор А, за исключением того, что смешайте 3,0 г глюкозы, 5,0 г растворимого крахмала, 2,5 г гидрофосфата дикалия и 3,0 г хлорида натрия в колбе Эрленмейера объемом 250 мл.
    3. Приготовление раствора С
      1. Приготовьте раствор С по той же схеме, что и растворы А и В, за исключением того, что смешайте 0,3 г L-цистеина гидрохлорида и 0,3 г тиогликолата натрия в 100 мл колбы Эрленмейера.
      2. Смешайте все три раствора в колбе Эрленмейера объемом 1000 мл, отрегулируйте pH до 7,2 с помощью 10% раствора гидроксида натрия и добавьте дистиллированную воду, чтобы получить окончательный объем 1000 мл.
      3. Распределите среду по колбам Эрленмейера объемом 250 мл и автоклавируйте при температуре 121 °C в течение 30 минут. Охладите до комнатной температуры и храните при температуре 4 °C.
    4. Приготовление твердой общеанаэробной среды
      1. Добавьте в жидкую среду GAM 1%-2% агара и нагревайте до полного растворения. Распределите по колбам Эрленмейера объемом 250 мл и автоклавируйте при температуре 121 °C в течение 30 минут.
    5. Подготовка низкоуглеродистой исходной среды
      1. Приготовьте исходную среду с низким содержанием углерода, используя ту же процедуру, что и ГАМ, но исключите дрожжевой экстракт, глюкозу и растворимый крахмал.
  2. Приготовление смешанной кишечной флоры человека
    1. Соберите 1-2 г свежих человеческих фекалий в одноразовую стерильную трубку для сбора кала, наполненную газообразным азотом. Быстро закройте трубку. Добавьте 5 мл среды GAM, укупорьте и закваскуйте при 37 °C в течение 24 ч в стерильный анаэробный инкубатор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте кислородметр для контроля уровня кислорода в анаэробном инкубаторе и заменяйте газообразный азот по мере необходимости для поддержания анаэробных условий.
  3. Активизация смешанной кишечной флоры человека
    1. Через 24 ч перенесите 0,5 мл кишечной бактериальной суспензии человека в новую микроцентрифужную пробирку, содержащую 4,5 мл свежей среды GAM.
    2. Укупорить и инкубировать при 37 °C в течение 24 ч в анаэробных условиях для получения активной смешанной кишечной флоры человека.
  4. Подготовка эталонных решений
    1. Взвесьте по 5 мг ориентина и лютеолина и растворите их отдельно в 1 мл ДМСО для приготовления референтных растворов ориентина и лютеолина в концентрации 5 мг/мл.
  5. Скрининг активной кишечной флоры, способной расщеплять С-гликозиды
    1. Смешать 260 мкл активированной кишечной флоры с 6 мл свежей низкоуглеродистой исходной среды, содержащей 40 мкл референтного раствора ориентина, и инкубировать при 37 °С.
    2. Включают контрольную группу (6 мл низкоуглеродистой исходной среды, 40 мкл референтного раствора ориентина и 260 мкл нормального физиологического раствора) и холостую группу (6 мл низкоуглеродистой исходной среды, 40 мкл нормального физиологического раствора и 260 мкл активированной кишечной флоры).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все тесты в трех экземплярах в анаэробном инкубаторе.
  6. Предварительная обработка решений по трансформации
    1. Через 24 ч и 48 ч пипетировать 1 мл реакционных растворов в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и центрифугировать при давлении 13 400 х г в течение 15 мин при комнатной температуре для удаления бактерий.
    2. Добавьте 200 мкл надосадочной жидкости к 600 мкл метанола, перемешайте и центрифугируйте при 13 400 x g в течение 15 мин при комнатной температуре для удаления белков.
  7. Обнаружение продуктов трансформации
    1. Отфильтруйте надосадочную жидкость с помощью микропористой мембраны толщиной 0,22 мкм и проанализируйте фильтрат с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Проводите анализ ВЭЖХ на приборе, оснащенном колонкой C18 (4,6 мм × 250 мм, 5 мкм).
    2. Поддерживайте температуру в колонной духовке на уровне 40 °C, с расходом 1 мл/мин. Используйте ацетонитрил в качестве подвижной фазы А и 0,1% муравьиной кислоты в очищенной воде в качестве подвижной фазы В.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте систему линейного градиента следующим образом: 5%-55% A через 0-20 мин, 55%-95% A через 20-25 мин, 95%-5% A через 25-30 мин и 5% A через 30-32 мин.

2. Выделение отдельных штаммов из кишечной бактериальной флоры человека

  1. Активация смешанной бактериальной флоры кишечника человека
    1. Активируйте смешанную кишечную бактериальную флору человека, способную расщеплять ориентин, как описано в шаге 1.3, для получения активированного раствора кишечной бактериальной флоры человека.
  2. Подготовка твердых пластин GAM
    1. Подготовленную твердую среду ГАМ растворить нагреванием, и разлить по одноразовым стерильным чашкам Петри в анаэробном инкубаторе. Дайте среде застыть, чтобы получить твердые пластины GAM.
  3. Предварительный скрининг отдельных штаммов кишечной бактериальной флоры человека
    1. Пипетку 100 мкл раствора активированной бактерии в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл физиологического раствора.
    2. Введите соответствующий объем бактериального раствора в чашку Петри с помощью одноразового кольца для инокуляции. Закройте чашку и инкубируйте ее в анаэробном инкубаторе.
  4. Наблюдение за морфологией колонии
    1. После 48 ч инкубации при 37 °C наблюдайте за размером, морфологией и цветом колоний на планшете.
  5. Отбор отдельных колоний для получения одиночных штаммов
    1. Отбирайте отдельные колонии бактерий и культивируйте их в микроцентрифужных пробирках объемом 10 мл, содержащих 4,5 мл свежей среды GAM. Инкубировать в анаэробных условиях при 37 °C в течение 24 ч для получения одиночных штаммов.
  6. Верификация активности одиночной деформации
    1. Проверьте активность отдельных штаммов, как описано в шагах 1.5, 1.6 и 1.7. Выполнение верификации активности с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и маркировки пластин25.
  7. Очистка отдельных штаммов от бактериальной флоры кишечника человека
    1. Очистите активный одиночный штамм, как описано в шаге 2.1. Проверьте его активность с помощью экспериментов по преобразованию с ориентином, следуя процедурам, описанным в шагах 1.5, 1.6 и 1.7.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Образцы кала десяти здоровых добровольцев были проверены с помощью экспериментов по трансформации, в результате чего один образец продемонстрировал активность в дегликозилировании ориентина. Это открытие подтвердило возможность скрининга активных образцов. Активный образец изолировали с помощью метода маркировки пластинами. На основе морфологии и характеристик колоний для дальнейшего анализа было отобрано около 18 одиночных колоний бактерий с желтой или белой окраской, разнообразными формами и неровными краями. Среди них...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Была разработана стандартная операционная процедура (СОП) для скрининга кишечных бактерий человека, способных расщеплять С-гликозиды. С помощью этих процедур был успешно получен чистый активный штамм, а его способность к дегликозилированию была подтверждена в ходе испытаний на трансформацию. СОП включает в себя подготовку и обогащение кишечных бактерий, скрининг, ориентированный на активность, и валидацию активности в исходной среде с низким содержанием углерода.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая 82374134.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АцетонитрилThermo Fisher ScientificF2408R205ВЭЖХ
Анаэробный инкубаторShanghai CIMO Medical Instrument Manufacturing Co., LtdYQX-II
Экстракт говядиныBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD01-009BR
Порошок пищеварительной сывороткиBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD01-087BR
Dipotassium ГидрофосфатПекинский химический заводM26298AR
Одноразовая стерильная трубка для сбора стулаLang Fu Co., LTD5 мл
дистиллированной водыКафедра биофармацевтики, Пекинский университет традиционной китайской медицины
DMSOSigma-Aldrich CorporationWXBD2861VAR
EP TubeBeijing Biodee Biotechnology Co., LTD10 мл/1,5 мл
Центрифуга EppendorfEppendorf AG5418
ГлюкозаBeijing Chemical WorksGC205003AR
Высокопроизводительный жидкостный хроматографShimadzu CorporationLC-20
Паровой стерилизатор высокого давленияSanyo Denki Shanghai Co., LtdMLS-3780
Innoval C18 Хроматографическая колонкаAgela Technologies Co., LTD4,6 мм × 250 мм, 5 & микро; m
L-цистеина гидрохлоридBeijing Abxing Biotechnology Co., LTDBGASY01BR
Порошок экстракта печениBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD01-085BR
ЛютеолинНациональные институты по контролю за пищевыми продуктами и лекарствами>98%
Научная20240901312мембрана
для фильтра с миллипорамиAR Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.0,22 & микро; L & times; 50 мм
OrientinYishiming (Beijing) Biotechnology Co., LTD19120601>98%
ПептонBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD1685787BR
Petri DishBeijing Biodee Biotechnology Co., LTD150 мм
Хлорид натрияBeijing Abxing Biotechnology Co., LTDBN20008AR
ТиогликолятнатрияShanghai Jianglai Biotechnology Co., LtdJ031S219019AR
Растворимый крахмалBeijing Abxing Biotechnology Co., LTDS9765BR
Соевый пептонBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD2147955BR
TryptoneAgela Technologies Co., LTD1685787BR
Ультразвуковой очистительKun Shan Ultrasonic Instruments Co., LtdKQ-500DE
Дрожжевой экстрактBeijing Abxing Biotechnology Co., Ltd01-014BR
Магнитная мешалка Ika Werke Co., LTD RCT базовый метанол Thermo Fisher

Ссылки

  1. Zhang, Y. Q., Zhang, M., Wang, Z. L., Qiao, X., Ye, M. Advances in plant-derived C-glycosides: phytochemistry, bioactivities, and biotechnological production. Biotechnol Adv. 60, 108030(2022).
  2. Franz, G., Grun, M. Chemistry, occurrence and biosynthesis of C-glycosyl compounds in plants. Planta Med. 47 (3), 131-140 (1983).
  3. Cai, S., et al. Antiviral flavonoid-type C-glycosides from the flowers of Trollius chinensis. Chem Biodivers. 3 (3), 343-348 (2006).
  4. Shi, X., et al. A flavone C-glycoside from Styela plicata. Biochem Syst Ecol. 86, 103924(2019).
  5. Xiao, J., Capanoglu, E., Jassbi, A. R., Miron, A. Advance on the flavonoid C-glycosides and health benefits. Crit Rev Food Sci Nutr. 56 (Suppl 1), S29-S45 (2016).
  6. Ma, R., Cheng, S., Sun, J., Zhu, W., Fu, P. Antibacterial gilvocarcin-type aryl-C-glycosides from a soil-derived Streptomyces species. J Nat Prod. 85 (10), 2282-2289 (2022).
  7. Le Dang, Q., et al. Desmodinosides A-E: New flavonoid C-glycosides from Desmodium heterocarpon var. stigosum with hepatoprotective and antifungal activity. Fitoterapia. 169, 105609(2023).
  8. Choi, J. S., et al. Effects of C-glycosylation on antidiabetic, anti-Alzheimers disease and anti-inflammatory potential of apigenin. Food Chem Toxicol. 64, 27-33 (2014).
  9. Courts, F. L., Williamson, G. The occurrence, fate and biological activities of C-glycosyl flavonoids in the human diet. Crit Rev Food Sci Nutr. 55 (10), 1352-1367 (2015).
  10. Thao, N. P., et al. Anti-inflammatory flavonoid C-glycosides from Piper aduncum leaves. Planta Med. 82 (17), 1475-1481 (2016).
  11. Kim, M. K., Yun, K. J., Lim, D. H., Kim, J., Jang, Y. P. Anti-inflammatory properties of flavone di-C-glycosides as active principles of camellia mistletoe, Korthalsella japonica. Biomol Ther (Seoul). 24 (6), 630-637 (2016).
  12. Chen, Y. L., Chen, C. Y., Lai, K. H., Chang, Y. C., Hwang, T. L. Anti-inflammatory and antiviral activities of flavone C-glycosides of Lophatherum gracile for COVID-19. J Funct Foods. 101, 105407(2023).
  13. Wang, Y., et al. Flavone C-glycosides from the leaves of Lophatherum gracile and their in vitro antiviral activity. Planta Med. 78 (1), 46-51 (2012).
  14. Devkota, H. P., Fukusako, K., Ishiguro, K., Yahara, S. Flavone C-glycosides from Lychnis senno and their antioxidative activity. Nat Prod Commun. 8 (10), 1413-1414 (2013).
  15. Stark, T. D., et al. Isolation and structure elucidation of highly antioxidative 3,8-linked biflavanones and flavanone-C-glycosides from Garcinia buchananii bark. J Agric Food Chem. 60 (8), 2053-2062 (2012).
  16. Stark, T. D., Germann, D., Balemba, O. B., Wakamatsu, J., Hofmann, T. New highly in vitro antioxidative 3,8-linked biflav(an)ones and flavanone-C-glycosides from Garcinia buchananii stem bark. J Agric Food Chem. 61 (51), 12572-12581 (2013).
  17. Xiao, J., Capanoglu, E., Jassbi, A. R., Miron, A. Advance on the flavonoid C-glycosides and health benefits. Crit Rev Food Sci Nutr. 56 (Suppl 1), 29-45 (2016).
  18. Xie, K., Zhang, X., Sui, S., Ye, F., Dai, J. Exploring and applying the substrate promiscuity of a C-glycosyltransferase in the chemo-enzymatic synthesis of bioactive C-glycosides. Nat Commun. 11 (1), 5162(2020).
  19. Liu, L., et al. Characterization of the intestinal absorption of seven flavonoids from the flowers of Trollius chinensis using the Caco-2 cell monolayer model. PLoS One. 10 (3), e0119263(2015).
  20. Xu, M., et al. Mechanism and application of microbial transformation of glycosides in traditional Chinese medicine. World Sci Technol. 2, 24-27 (2006).
  21. Xie, L., et al. Comparison of flavonoid O-glycoside, C-glycoside and their aglycones on antioxidant capacity and metabolism during in vitro digestion and in vivo. Foods. 11 (6), 882(2022).
  22. Hostetler, G. L., Ralston, R. A., Schwartz, S. J. Flavones: Food sources, bioavailability, metabolism, and bioactivity. Adv Nutr. 8 (3), 423-435 (2017).
  23. Xiao, J. Dietary flavonoid aglycones and their glycosides: which show better biological significance. Crit Rev Food Sci Nutr. 57 (9), 1874-1905 (2017).
  24. Hasanah, U., Miki, K., Nitoda, T., Kanzaki, H. Aerobic bioconversion of C-glycoside mangiferin into its aglycone norathyriol by an isolated mouse intestinal bacterium. Biosci Biotechnol Biochem. 85 (4), 989-997 (2021).
  25. Yang, X., Xu, W. Establishment of model and standard operation procedure for biotransformation of chemical constituents of traditional Chinese medicine by human intestinal bacteria. China J Chin Mater Med. 36 (1), 19-26 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Расщепление C-гликозидовбактериальный скринингизоляция бактерийсреда с низким содержанием углеродаанаэробная инкубациявысокоэффективная жидкостная хроматографиямикрофлора кишечника человекаморфология колонийдегликозилирующая активность
Скрининг и выделение кишечных бактерий, расщепляющих С-гликозид
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.