Методическая статья

Индуцирование вхождения в третью стадию рассеивания молоди Bursaphelenchus xylophilus в криптобиоз посредством осмотической регуляции

859 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67350

⸱

27 декабря 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
11State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Institute of Ecological Conservation and Restoration, Chinese Academy of Forestry, 2Comprehensive Experimental Center in Yellow River Delta of Chinese Academy of Forestry, 3Tianjin Institute of Forestry Science, Chinese Academy of Forestry, 4Ningbo Yongsen Biotechnology Co. Ltd, 5Xiangshan Natural Resources and Planning Bureau of Zhejiang

В этой статье

Краткое содержание

В настоящем протоколе описан способ индуцирования распыления молодых особей третьей стадии (молодь до Дауэра, JIII.) Bursaphelenchus xylophilus в криптобиоз посредством осмотической регуляции ионов хлорида калия (KCl). Этот метод может обеспечить техническую поддержку для исследований механизмов стрессоустойчивости B. xylophilus.

Аннотация

Криптобиоз — это состояние, при котором организмы теряют почти всю свою внутреннюю воду и входят в ангидробиоз под экстремальным экологическим стрессом. Расселяющаяся молодь третьей стадии (pre-dauer juveniles, figure-abstract-1) Bursaphelenchus xylophilus может проникать в криптобиоз через обезвоживание и возрождаться при регидратации при улучшении условий окружающей среды. Осмотическая регуляция имеет решающее значение для их выживания в этом процессе. В этом исследовании образцы B. xylophilus были собраны figure-abstract-2 у мертвой сосны Pinus massoniana из-за болезни соснового увядания в Нинбо, провинция Чжэцзян, Китай. После погружения в 8% раствор figure-abstract-3 хлорида калия (KCl) B. xylophilus входил в криптобиотическое состояние после постепенного обезвоживания из-за повышенного внешнего осмотического давления в результате естественного испарения воды. figure-abstract-4 B. xylophilus мог противостоять низкотемпературному стрессу при -20 °C. figure-abstract-5 B. xylophilus мог возрождаться после регидратации, выживаемость составила 92,1%. Этот процесс может регулировать проникновение figure-abstract-6 B. xylophilus в криптобиоз, позволяя им противостоять экстремальным условиям. Этот метод, описанный в нашем исследовании, прост и надежен, обеспечивая техническую поддержку в изучении механизмов стрессоустойчивости B. xylophilus.

Введение

Болезнь соснового увядания является одной из самых тяжелых болезней леса в Китае1. Сосновая нематода Bursaphelenchus xylophilus (B. xylophilus) представляет значительную угрозу для таких видов сосны, как Pinus massoniana (P. massoniana), размножаясь внутри хозяина, что приводит к быстрому увяданию и гибели. При неблагоприятных условиях окружающей среды после смерти хозяина репродуктивная молодь B. xylophilus может проникать в молодь до дауэра (figure-introduction-1). Эти молодые особи ищут насекомых-переносчиков, чтобы продолжить их перенос и распространение, вызывая обширную гибель сосновых лесов2.

Криптобиоз — это состояние, при котором организмы теряют почти всю свою внутреннюю воду и впадают в ангидробиозпод экстремальным экологическим стрессом. В этом процессе организмы постепенно обезвоживаются, что приводит к остановке движения, снижению метаболизма и приостановке жизненного цикла4. При подходящих условиях они могут восстановиться после регидратации. Криптобиоз позволяет организмам противостоять экстремальным условиям, таким как низкие температуры, и продлевать свою жизнь5. Нематоды, которые выживали в криптобиозе в течение 30 000 лет, были обнаружены в вечной мерзлоте Антарктики6.

Предыдущие исследования показали, что нематоды могут адаптироваться к различным абиотическим стрессовым факторам, таким как низкая температура, засуха и высокое осмотическое давление, во время обезвоживания, регулируя свою поверхностнуюпроницаемость. Кроме того, нематоды могут скручивать свое тело, чтобы уменьшить площадь поверхности и свести к минимуму скорость потери воды. Например, Caenorhabditis elegans регулирует осмотический баланс, позволяя ионам и малым молекулам свободно проходить через его кутикулу, в то время как более крупные молекулы не могут8. figure-introduction-2 B. xylophilus также проявляет криптобиоз. На стадиях обезвоживания и регидратации криптобиоза осмотическая регуляция имеет важное значение для контроля обмена веществ через кутикулу, что делает ее ключевой для входа в криптобиоз или восстановления посленего.

В настоящем исследовании представлен метод индуцирования криптобиоза у figure-introduction-3 B. xylophilus посредством осмотической регуляции. Этот метод прост, эффективен и высоконадежен, обеспечивая техническую поддержку в исследовании механизмов стрессоустойчивости figure-introduction-4 B. xylophilus.

Протокол

1. Коллекция figure-protocol-1 B. xylophilus

  1. Коллекция зараженных дисков P. massoniana
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры соответствовали Административным мерам для эпидемической зоны болезни соснового увядания и зараженной древесины, а также другим применимым правилам. В качестве места отбора проб был выбран лес P. massoniana , зараженный B. xylophilus в уезде Сяншань, город Нинбо, провинция Чжэцзян. P. massoniana, которая умерла от болезни соснового увядания, была вырублена на участке отбора проб.
    1. Соберите круглые бревна (толщиной 5 см) с верхнего, среднего и нижнего отделов основного ствола срубленных деревьев.
    2. Собранные круглые бревна P. massoniana нарежьте на ломтики толщиной 0,5-1 см, затем нарежьте их небольшими полосками длиной 2-3 см.
    3. Поместите небольшие деревянные полоски в герметичные пакеты и храните их в лаборатории для дальнейшего использования.
  2. Экстракция figure-protocol-2 B. xylophilus
    1. Прикрепите резиновую трубку к узкому концу стеклянной воронки с длинным горлышком диаметром примерно 15 см. Закрепите резиновую трубку с помощью щипкова. Поместите собранную воронку на подставку для воронки.
    2. Полностью оберните небольшие деревянные полоски в один слой папиросной бумаги, а затем поместите их в воронку. Добавьте в воронку дистиллированную воду до тех пор, пока все древесные полосы не будут погружены в воду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Постояв в течение 12-24 часов, нематоды мигрировали из полос древесины и поселились на дне воронки10. Папиросная бумага предотвращала оседание древесных остатков, пропуская нематод.
    3. Медленно отпустите щепотку на дне воронки и дайте 2000-5000 мкл смеси просочиться в чашку Петри (5 см в диаметре) для микроскопического исследования и морфологической идентификации.
    4. Идентификация figure-protocol-3 B. xylophilus по таким особенностям, как стилеты, срединные луковицы пищевода, липидные капли и «пальцеобразные» формы хвоста11.
    5. Под микроскопом перенесите отдельную особь figure-protocol-4 B. xylophilus на предметное стекло, каждый раз отсасывая 10 мкл жидкости вместе с одной нематодой с помощью пипетки объемом 10 мкл. Повторите этот процесс 30 раз, чтобы собрать примерно 300 мкл смеси, содержащей нематоды.
    6. После извлечения figure-protocol-5 B. xylophilus простерилизуйте оставшиеся древесные полосы и зараженные древесные материалы, чтобы предотвратить дальнейшее загрязнение.

2. Управление процессом осмотической регуляции

  1. Приготовление смеси для осмотической регуляции
    1. Приготовьте 8% водный раствор KCl.
    2. С помощью пипетки добавляют 10 мкл 8% водного раствора KCl к предметному стеклу, содержащему смесь figure-protocol-6 B. xylophilus, получая приблизительно 310 мкл смеси нематод и раствора KCl.
  2. Регуляция повышенного осмотического давления и дегидратации figure-protocol-7 B. xylophilus
    1. Поместите предметное стекло на предметный столик микроскопа, позволив воде испариться естественным образом. Это будет постепенно увеличивать осмотическое давление окружающей среды, вызывая обезвоживание нематод в течение примерно 30-60 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оператору нужно только подождать, пока вода испарится естественным образом, пока кристаллы KCL не выпадут в осадок, и наблюдать за состоянием нематод под микроскопом. Требуется около 30-60 минут, чтобы 310 μл смеси испарились естественным образом до тех пор, пока кристаллы KCL не выпадут в осадок.
    2. Понаблюдайте за процессом обезвоживания (например, скручиванием тела, агрегацией и т.д.) figure-protocol-8 B. xylophilus под микроскопом. Когда вода полностью испаряется и кристаллы KCl выпадают в осадок, figure-protocol-9 B. xylophilus перестает двигаться и входит в криптобиоз.
  3. Лечение низкотемпературным стрессом криптобиотика figure-protocol-10 B. xylophilus
    1. Поместите криптобиотика figure-protocol-11 B. xylophilus в среду постоянной температуры -20 °C на 24 часа.
  4. Регуляция пониженного осмотического давления и регидратации figure-protocol-12 B. xylophilus
    1. Добавьте около 300 μЛ дистиллированной воды вокруг молодых особей, подвергшихся низкотемпературной обработке с помощью пипетки. Процесс регидратации, продолжающийся около 30-60 минут, постепенно снижает осмотическое давление окружающей среды.
    2. Понаблюдайте за процессом figure-protocol-13 регидратации B. xylophilus (например, растяжение тела, возобновление движения и т.д.) под микроскопом. Рассчитайте выживаемость через 24 ч.

Результаты

В 8% растворе KCl, по мере испарения воды, figure-results-1 B. xylophilus первоначально проявлял заметную «скручиваемость», оставаясь при этом подвижным (рис. 1A). Как только вода полностью испарялась, нематоды прекращали движение и скручивались, с вдавленными поверхностями и накопленными каплями липидов (рис. 1В), что указывает на их вхождение в криптобиотическое состояние. При добавлении дистиллированной воды в окружающую среду нематоды регидратировались и оживали (рис. 1C). После того, как вода испарится, появятся кристаллы KCL (Рисунок 1D). На рисунке 1E показаны морфологические характеристики figure-results-2 B. xylophilus.

Эксперимент по обезвоживанию показал, что в исходном 8% растворе KCl испарение воды привело к figure-results-3 потере воды B. xylophilus . После обезвоживания figure-results-4 B. xylophilus подвергали низкотемпературному стрессу при температуре -20 °C в течение 24 ч, средняя выживаемость составила 92,1%11. По сравнению с выживаемостью 0% в контрольной группе, которая не входила в криптобиотическое состояние, вышеуказанные данные свидетельствуют о том, что обезвоживание может значительно повысить выживаемость figure-results-5 B. xylophilus в условиях низких температур.

Во время фазы регидратации после криптобиоза figure-results-6 B. xylophilus мы наблюдали, что у 100% нематод проявлялись «пузырьки» in vivo при переносе из 40% раствора KCl в дистиллированную воду (рис. 2).

figure-results-7
Рисунок 1: Процесс figure-results-8 обезвоживания-криптобиоза-регидратации B. xylophilus. На этом изображении показан процесс криптобиоза у figure-results-9 B. xylophilus, включая (A) стадию дегидратации, (B) стадию криптобиоза, (C) стадию регидратации, (D) стадию кристаллизации KCL и (E) figure-results-10 B. xylophilus. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-11
Рисунок 2: Накопление жировых гранул у невозрожденного figure-results-12 B. xylophilus. На этом изображении figure-results-13 показано состояние B. xylophilus после регидратации, характеризующееся наличием in vivo пузырьчатых жировых гранул. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

В этом исследовании figure-discussion-1 B. xylophilus был собран у мертвых P. massoniana в Нинбо, провинция Чжэцзян. Следует отметить, что figure-discussion-2 B. xylophilus был отобран из смешанной популяции с разными возрастами. В частности, были выбраны круглые бревна с высокой плотностью B. xylophilus с последующим отсевом B figure-discussion-3 . xylophilus. Зимой, когда ежедневная минимальная температура в провинции Ляонин составляет около -20 °C, большое количество B. xylophilus в одновозрастном возрасте figure-discussion-4 может быть получено из мертвых Pinus tabuliformis, что упростило процесс отбора в этом эксперименте.

Во время криптобиотического процесса медленная скорость обезвоживания нематод способствует их выживанию и предотвращает структурное повреждение белков13. Время обезвоживания имеет решающее значение для определения выживаемости figure-discussion-5 B. xylophilus. В данном исследовании использовался раствор KCl в исходной концентрации 8%, а его концентрация увеличивалась постепенно с естественным испарением воды, что позволяло figure-discussion-6 B. xylophilus медленно обезвоживаться и входить в криптобиоз. Если вода испаряется слишком быстро или нематоды помещаются непосредственно в раствор KCl с высокой концентрацией, их выживаемость значительно снижается.

Метод, описанный в данном исследовании, имеет ряд преимуществ. Экспериментальные материалы легко доступны, для регулирования дегидратации и регидратации B. xylophilus требуется только раствор KCl и дистиллированная figure-discussion-7 вода. Процедуры просты: обезвоживание происходило за счет естественного испарения, а регидратация достигалась за счет добавления дистиллированной воды. Весь процесс может быть завершен в течение 2 часов. Этот метод может похвастаться высокими показателями успешности и выживаемости, при этом большинство B figure-discussion-8 . xylophilus входят в криптобиоз после обезвоживания, а большинство возрождается после регидратации, соответственно11.

Предложенный метод применим для регуляции криптобиотического состояния как B. xylophilus, так figure-discussion-9 и молоди четвертой стадии расселения (figure-discussion-10)14. Однако он может быть неэффективен для размножительного B. xylophilus.

В последние годы болезнь соснового увядания, вызываемая B. xylophilus , распространилась из южного Китая в северные районы. figure-discussion-11 B. xylophilus, который обитает на соснах в этих более холодных северных регионах, имеет тенденцию проявлять большую холодостойкость15. Предложенный метод может индуцировать криптобиоз у figure-discussion-12 B. xylophilus, повышая их устойчивость к холоду и засухе. В совокупности этот метод может обеспечить техническую поддержку для изучения механизмов стрессоустойчивости B. xylophilus и механизма передачи болезни соснового увядания.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование финансировалось Центральным общественным научным учреждением «Фонд базальных исследований» Государственной ключевой лаборатории генетики и селекции деревьев (грант No CAFYBB2020ZY001-2), исследовательскими проектами Enterprise (202404016-4320) и Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC 32271896).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Предметное стеклоБиолендГС7101-752575 мм & раз; 25 мм & раз; 1 мм
Стеклянная воронка с длинным горлышкомЭкспериментальная технология Nanjing KangluodaН/Д150 мм
МикроскопФениксХСП-35-1600ХРН100-2Б41Л-ИПЛ
Чашка ПетриЭкспериментальная технология Nanjing Kangluoda  ТБ-62493579274550 мм и раз; 50 мм
ПинчкокЭкспериментальная технология Nanjing Kangluoda  ТБ-62497331174336 мм & раз; 11 мм  × 55 мм
ПипеткаЭппендорф312300001210– 100 &микро; L
Хлорид калия (KCL)Solarbio Медико-биологические наукиП9921500 г
Резиновая трубкаЭкспериментальная технология Nanjing KangluodaТБ-6249234570947 мм и раз; 5 мм
СтерилизаторБиньцзян https://detail.1688.com/offer/644766597053.html?_t=1730892390541&spm=
a2615.7691456.co_0_0_wangpu
_score_0_0_0_0_1_0_0000_0.0		75л
Папиросная бумага Отпечаток от сердца к сердцуМ322,5 см и раз; 21,5 см

Ссылки

  1. Li, Y., Zhang, X. Analysis on the trend of invasion and expansion of Bursaphelenchus xylophilus. Forest Pest and Disease. 37 (5), 1-4 (2018).
  2. Futai, K. Pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Annu Rev Phytopathol. 51 (51), ?61(2013).
  3. Crowe, J. H., Cooper, A. F. Cryptobiosis. Sci Am. 225, 30-36 (1971).
  4. Wharton, D. A. Anhydrobiosis. Curr Biol. 25, 1107-1125 (2015).
  5. Browne, J., Tunnacliffe, A., Burnell, A. Anhydrobiosis: plant desiccation gene found in a nematode. Nature. 416 (6876), 38(2002).
  6. Shatilovich, A. V., et al. Viable nematodes from late Pleistocene permafrost of the Kolyma river lowland. Dokl Biol Sci. 480 (1), 100-102 (2018).
  7. Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Osmotic regulation of seamless tube growth. Nat Cell Biol. 15 (2), 137-139 (2013).
  8. Erkut, C., et al. Trehalose renders the dauer larva of Caenorhabditis elegans resistant to extreme desiccation. Curr Biol. 21 (1), 1331-1336 (2012).
  9. Pan, L., et al. Third-stage dispersal juveniles of Bursaphelenchus xylophilus can resist low-temperature stress by entering cryptobiosis. Biology. 10 (8), 785(2021).
  10. Mao, X. F., Li, H. X., Chen, X. Y., Hu, F. Extraction efficiency of soil nematodes by different methods. Chinese J Ecol. 23 (3), 149-151 (2004).
  11. Pan, L., et al. Isolation and identification of pine wood nematode in Pinus koraiensis in Fengcheng, Liaoning province. Forest Pest and Disease. 38 (1), 4(2019).
  12. Pan, L., Cui, R., Li, Y., Feng, Y., Zhang, X. Investigation of pinewood nematodes in Pinus tabuliformis Carr. under low-temperature conditions in Fushun, China. Forests. 11 (9), 993(2020).
  13. Madin, K. A. C., Crowe, J. H. Anhydrobiosis in nematodes: Carbohydrate and lipid metabolism during dehydration. J Exp Zool. 3, 193(2010).
  14. Wharton, D. A. Anhydrobiosis: The model worm as a model. Curr Biol. 21 (15), 578-579 (2011).
  15. Li, Y., Zhang, X. High risk of invasion and expansion of pine wood nematode in the middle temperate zone of China. J Temperate Res. 1 (1), 4(2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи