Анализ экспрессии тканевых факторов в тромбоцитах человека с помощью потоковой цитометрии

Краткое содержание

В этой статье изложен протокол количественного определения процента тромбоцитов, положительных к тканевому фактору (TF), с помощью цитометрии цельного кровотока, оценивая белок: (1) внутриклеточно в условиях покоя и (2) на поверхности клетки, как в состоянии покоя, так и в активированном состоянии. Также предоставляются рекомендации для оценки TF-положительных тромбоцитов в плазме, богатой тромбоцитами.

Аннотация

Часть циркулирующих человеческих тромбоцитов хранит тканевой фактор (ТФ) внутриклеточно, который является ключевым активатором каскада свертывания крови и образования тромба. После активации тромбоцитов TF воздействует на клеточной мембране, где связывается с FVII, что в конечном итоге приводит к образованию тромбина. Учитывая, что (1) уровень тромбоцитов-положительных к ТФ увеличивается в различных клинических условиях, способствуя формированию протромботического фенотипа пациента, и (2) различные препараты могут модулировать экспрессию тромбоцитов, ассоциированных с тромбоцитами, ценен стандартизированный метод оценки тромбоцитов, так как его оценка в прошлом вызывала споры. Здесь мы описываем протокол измерения процента TF-положительных тромбоцитов с помощью проточной цитометрии в цельной крови и плазме, богатой тромбоцитами (PRP)/промытых тромбоцитах. Этот протокол направлен на предоставление подробных инструкций по количественному определению процента TF-положительных тромбоцитов, оценивая белок (1) внутриклеточно в условиях покоя и (2) на поверхности клетки как в состоянии покоя, так и в активированном состоянии. Первый раздел содержит важную информацию для правильного проведения забора крови, чтобы преданалитические процедуры не повлияли на результаты. Далее протокол сосредоточен на процедурах подготовки образцов и маркировки для анализа потоковой цитометрии. Подробно описаны этапы стимуляции клеток, маркировки, фиксации и проницаемости — где это необходимо. Наконец, описываются инструкции по настройкам потоковой цитометрии для правильного определения популяции тромбоцитов и анализа TF-положительных событий. Наконец, метод включает процедуру приготовления PRP, если TF-положительные тромбоциты измеряются в изолированных тромбоцитах. Поскольку только подмножество тромбоцитов содержит TF, важно убедиться, что эти тромбоциты не теряются во время этапов центрифугирования, необходимых для получения PRP.

Введение

Тканевой фактор (TF), трансмембранный гликопротеин и ключевой активатор каскада свертывания крови, экспрессируется подмножеством ~20%-30% циркулирующих человеческих^{тромбоцитов 1}, особенно тех, что имеют размер². При активации классическими агонистами тромбоцитов, такими как аденозиндифосфат (АДФ) и тромбин, тромбоциты экспонируют функционально активную TF на своей поверхности в зависимости от концентрации, позволяя им связываться с фактором VII/VIIa, что в конечном итоге приводит к генерации^{тромбина 1,3,4,5,6}. Примечательно, что при патологических состояниях, таких как ишемическая болезнь сердца (CAD)⁷, тяжелый острый респираторный синдром — инфекция коронавирусом-2 (SARS-CoV-2⁸), мигрень с аурой, связанной с открытым отвором овальным отверстием (MHA-PFO⁾⁹, рак¹⁰ и^{сепсис 11}, число тромбоцитов-положительных к TF, что способствует увеличению тромботического риска, наблюдаемого в таких клинических условиях.

Несмотря на эти убедительные данные, обнаружение TF-положительных тромбоцитов остаётся предметом споров в научном^{сообществе 6,12,13}. Методологические проблемы, включая преданалитические переменные, подготовку образца и специфичность антител, были предложены как возможные причины противоречивых результатов, представленных в^{литературе} 2,4,12,14. Поэтому крайне важно создать стандартизированный анализ на основе чётко определённого протокола измерения ТФ у тромбоцитов человека.

В этом контексте целостная цитометрия кровотока — единственная технология, позволяющая анализировать тромбоциты, положительные к ТФ, с минимальным использованием образцов, что крайне важно для предотвращения потери этого подмножества тромбоцитов.

В этой статье мы предлагаем протокол измерения тромбоцитарно-ассоциированного ТФ с помощью цитометрии полного кровотока, оценивая белок (1) внутриклеточно в условиях покоя и (2) на поверхности клетки как в состоянии покоя, так и в активированном состоянии. Также предоставляются инструкции, если требуется оценка TF-положительных тромбоцитов в плазме, богатой тромбоцитами (PRP).

Протокол

Протокол был утверждён Этическим комитетом учреждения (No70/24, CE 18.06.24), и было получено письменное информированное согласие от всех доноров крови. Протокол проведёт пользователя через семь основных шагов (рисунок 1). Первый шаг касается процедуры проведения пробы крови. Шаги 2 и 3 описывают протокол титрирования антител и подготовку образца для анализа внутриклеточной экспрессии ТФ с использованием моноклонального антитела (mAb), маркированного фикоэритрином (PE). Шаг 4 описывает протокол оценки белка, воздействующего на поверхности тромбоцитов, с использованием косвенного метода окрашивания с αCD142/HTF1 mAb. Из-за стерических препятствий фторхрома PE-меченый mAb, используемый для внутриклеточного окрашивания, не связывается с каталитическим доменом поверхностно открытого белка. Поэтому предлагается протокол косвенного окрашивания вторичным mAb, маркированным Alexa Fluor 633. Шаги 5 и 6 подробно описывают фазы анализа проточной цитометрии. Последний шаг описывает процедуру подготовки плазмы, богатой тромбоцитами (PRP), чтобы избежать потери крупной субпопуляции тромбоцитов. Информация о используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Отмена крови

ПРИМЕЧАНИЕ: Забор крови у человека должен проводиться только после получения одобрения Этического комитета.

1. Собрать образцы крови с помощью периферической венозной или игольной канюли из руки, не затронутой периферическими венозными инфузиями, желательно из предкубитальной вены.
   1. Для периферического венозного отбора наложите жгут, а после введения иголки G19 в вену удалите его, чтобы предотвратить активацию тромбоцитов (см. рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте иглу для бабочки меньше G21, чтобы избежать активации тромбоцитов.
   2. Для венозного отбора проб с помощью игольной канюли не накладывайте жгут ни в один момент во время отбора. При необходимости промой образец с раствором физиологического раствора 0,9% перед принятием. Всегда сбрасывайте первые 5 мл крови перед началом заполнения труб.
2. Возьмите 2 мл крови в вакутанер ЭДТА (для анализа кровяных клеток). Аккуратно перемешайте трубку три раза, чтобы кровь и антикоагулянт полностью смешали.
3. Заберите кровь в вакутайнер цитратного натрия объемом 0,129 млн для анализа экспрессии тромбоцитов, связанных с тромбоцитами. Аккуратно заполняйте вакутейнер до указанного уровня, чтобы поддерживать правильное соотношение крови и антикоагулянтов. Аккуратно переверните пробирки пять раз, чтобы обеспечить тщательное смешивание крови с антикоагулянтом, предотвратив образование тромбов и гемолиз образцов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать антикоагулянта с цитратом 0,129 млн для оптимизации обнаружения тромбоцитно-ассоциированного TF с клоном HTF1 αCD142 mAb. Если необходимо выделить тромбоциты из цельной крови, возьмите второй вакутанер цитратного натрия с концентрацией 0,129 млн для подготовки плазмы, обогащённой тромбоцитами (PRP).
4. Держите вакутейнеров вертикально в держателе для трубок. Не трясите их на вращающихся или наклоняющихся пластинах и избегайте пневматических транспортных систем. Не храните образцы крови в холодильнике, чтобы предотвратить активацию тромбоцитов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы крови следует обрабатывать в течение 15 минут после отмены, если планируется измерение другого маркера активации тромбоцитов, ассоциированных с гранулами, вместе с ТФ. В противном случае образцы должны быть обработаны не позднее чем через 3 часа после сбора (рисунок 3).

2. Титрование антитела к ТФ (для внутриклеточной оценки ТФ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Определение внутриклеточно хранящегося TF проводится с помощью PE-αCD142/HTF1 mAb.

1. Титрование антител с помощью бусинок
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование шариков позволяет определить правильное количество антител для использования (то есть концентрация антител, обеспечивающая наибольшее разделение пиков флуоресценции между положительными и отрицательными образцами). Этот анализ проводится с использованием двух образцов: один действительно положительный, другой — отрицательный. Концентрация антител не указывается производителем (см. Таблицу материалов), поэтому титрование антител проводится с использованием пяти точек разбавления.
   1. Центрифугуйте антитело при 17 000 x g в течение 5 минут при 4 °C. Для подготовки пяти точек разбавления антител пипетка 40 мкл антитела в пробирку 1 и 20 мкл ПБС в пробирки 2–5. Сделайте четыре последовательных последовательных разбавления 1:2, передав 20 мкл из трубки 1 в трубку 2 и далее.
   2. Подготовьте по одной пробирке для каждого объёма антител для тестирования. Добавьте по одной капле отрицательных шариков и одну каплю положительных шариков в каждую пробирку. Добавьте 20 мкл каждого разбавления антитела в пробирку и сразу же создайте вихрь. Инкубировать в темноте при комнатной температуре 20 минут.
   3. Добавьте 1 мл 1x PBS без Ca⁺⁺ и Mg⁺⁺, pH 7,4, в каждую трубку и вихрь.
   4. Получите образцы на проточном цитометре согласно инструкциям производителя и запишите файл данных с 10 000 событий в вороте «бусин». Оптимальная концентрация антител — это то, которое обеспечивает наибольшее разделение между положительными и отрицательными пиками.
2. Титрование антител на тромбоцитах
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, оптимальная концентрация антител, выявленная с помощью шариков, должна быть проверена на клетках для окрашивания — в данном случае тромбоциты в цельной крови.
   1. Фиксация
      1. Аккуратно переверните вакутайнер цитрат натрия пять раз, чтобы тщательно перемешать кровь и антикоагулянт. Пересадите 50 мкл крови в пробирку объёмом 1,5 мл, добавьте 950 мкл 1% параформальдегида (ПФА), аккуратно перемешайте и инкубуйте образец в течение 90 минут при комнатной температуре.
      2. Центрифугуйте образец при 1 500 x g в течение 5 минут, с тормозом, при комнатной температуре.
      3. Удалите супернатант и снова подвесьте гранулу, аккуратно вставив 1 мл 1x PBS без Ca⁺⁺ и Mg^++, pH 7.4.
   2. Проницаемость
      1. Подготовьте одну пробирку для каждого объёма антител, который будет тестироваться (проверьте объём, идентифицируемый титрованием шариков, а также более высокий и меньший разбавления, например, 10 мкл, 5 мкл, 2,5 мкл, если объём 5 мкл) и одну трубку для контроля по флуоресценции минус один (FMO).
      2. Вдайте 100 мкл фиксированной крови в каждую трубку и центрифугайте их при 1 500 x g в течение 5 минут, с тормозом, при комнатной температуре.
      3. Удалите супернатант, снова суспензируйте гранулу в 100 мкл Triton-PBS 0,1% для проницаемости образцов и инкубируют 10 минут при комнатной температуре.
   3. Окрашивание
      1. Центрифугуйте антитело при 17 000 x g в течение 5 минут при 4 °C. Добавьте необходимые объёмы антител в каждую пробирку, как определено в статье 2.2.2.1, и смешайте их.
      2. Инкубировать образцы в течение 15 минут в темноте при комнатной температуре.
      3. Добавьте 300 мкл 1x PBS без Ca⁺⁺ и Mg⁺⁺, pH 7,4, на каждую лампу и смешайте. Получите образцы с потокового цитометра (см. шаг 5).
      4. Вычислите индекс окраски по следующей^{формуле 15}:
                                
         где MFI_pos — это средняя интенсивность флуоресценции положительных событий, MFI_{отрицательная} — отрицательная интенсивность отрицательных событий, а SD — стандартное отклонение отрицательной популяции.
      5. Выбирайте наименьшую концентрацию антител с самым высоким индексом окрашивания.
         ПРИМЕЧАНИЕ: В текущих экспериментальных условиях самый высокий индекс окрашивания для PE-αCD142/HTF1 mAb достигается с использованием 5 мкл антител.

3. Подготовка образца для анализа проточной цитометрии внутриклеточной экспрессии ТФ

1. Фиксация цельной крови и пермеабилизация
   1. Для внутриклеточного анализа ТФ фиксируйте и пермеабилизуйте цельную кровь согласно процедуре, описанной на шаге 2.
2. Процедура окрашивания
   ПРИМЕЧАНИЕ: В следующем протоколе популяция тромбоцитов идентифицируется с помощью окрашивания αCD61-PerCP. Другие маркеры популяции могут использоваться по усмотрению оператора.
   1. Подготовьте одну трубку для контроля Fluorescence Minus One (FMO) и одну для окрашивания TF. Добавьте 100 мкл фиксированной и проницаемой цельной крови в каждую трубку вместе с антителами, перечисленными в Таблице 1.
   2. Инкубировать образцы в течение 15 минут в темноте при комнатной температуре.
   3. Добавьте 300 мкл 1x PBS без Ca⁺⁺ и Mg⁺⁺, pH 7,4, на каждую лампу и смешайте. Храните окрашенные образцы в темноте до анализа потоковой цитометрии (см. шаг 5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для расчёта матрицы компенсации подготовьте образцы, как описано в Таблице 2.

4. Подготовка образца для анализа проточной цитометрии экспрессии ТФ, ассоциированной с поверхностью клеток, у покоящихся и активированных тромбоцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для обнаружения ТФ, связанной с клеточной поверхностью, используйте немаркированный αCD142/HTF1 mAb (1 мг/мл) и козлый антимышиный IgG (2 мг/мл) Alexa Fluor 633 в качестве вторичного антитела для обнаружения сигнала. Аденозин-5-дифосфат (АДФ) используется в качестве агониста тромбоцитов для индуцирования экспозиции TF на поверхности клетки. Антитела, маркированные PE, используются в качестве маркера популяции тромбоцитов для минимизации переброса, который будет контролироваться компенсацией сигнала.

1. TF-окрашивание
   1. Разбавить αCD142/HTF1 mAb 1:100 в 1x PBS без Ca⁺⁺ и Mg⁺⁺, pH 7,4, чтобы получить рабочую концентрацию 10 мкг/мл. Разбавите противомышиный антимышиный Alexa Fluor 633 IgG 1:10 в 1x PBS без Ca⁺⁺ и Mg⁺⁺, pH 7,4, чтобы получить рабочую концентрацию 200 мкг/мл.
   2. Подготовьте три пробирки и дайте 1x PBS без Ca⁺⁺ и Mg⁺⁺, pH 7,4, как указано в таблице 3.
   3. Разведите 7,5 мкл разбавлённого αCD142/HTF1 мАб и добавьте 5 мкл АДФ (200 мкм) для получения конечной концентрации 10 мкм АДФ. Аккуратно переверните цитратный вакутейнер 5 раз, чтобы тщательно перемешать кровь и антикоагулянт, затем вдайте по 5 мкл цельной крови в каждую трубку. Аккуратно перемешайте образцы.
   4. Инкубировать образцы в течение 20 минут при комнатной температуре.
2. Фиксация образца
   1. Фиксируйте каждый образец, добавив 300 мкл 1% параформальдегида (PFA) и инкубируйте образцы в течение 1 часа при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Маркированные образцы, фиксированные 1% PFA и хранящиеся при 4 °C, остаются стабильными до 4 дней.
   2. Добавьте 300 мкл 1x PBS без Ca⁺⁺ и Mg⁺⁺, pH 7,4, в каждую трубку и центрифугу при 1500 x г на 5 минут с тормозом при комнатной температуре.
   3. Удалите супернатант и повторно суспензируйте гранулу в 95 мкл 1x PBS без Ca⁺⁺ и Mg⁺⁺, pH 7.4, аккуратно пипетируя.
3. Окрашивание вторичным антителом
   1. Разведите 5 мкл разбавленной плазмы Alexa Fluor 633 IgG и инкубуйте образцы в течение 15 минут в темноте при комнатной температуре.
   2. Добавьте 300 мкл 1x PBS без Ca⁺⁺ и Mg⁺⁺, pH 7,4, в каждую трубку и центрифугу при 1500 x г на 5 минут с тормозом при комнатной температуре. Удалите супернатант и повторно подвесите гранулу в 95 мкл при 1x PBS без Ca⁺⁺ и Mg⁺⁺, pH 7.4.
   3. В каждую трубку введите 5 мкл αCD41-PE (см. таблицу 4). Инкубировать образцы в течение 15 минут в темноте при комнатной температуре.
   4. Добавьте 300 мкл 1x PBS без Ca⁺⁺ и Mg⁺⁺, pH 7,4, на каждую лампу и смешайте.
   5. Храните окрашенные образцы в темноте до анализа потоковой цитометрии (см. шаг 6).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для расчёта матрицы компенсации подготовьте образцы в соответствии с шагами 4.1-4.3 и как указано в Таблице 5 и Таблице 6.

5. Анализ внутриклеточной экспрессии TF с помощью потоковой цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура относится к получению на эталонном потоковом цитометре; Таким образом, представленные локации и сюжеты должны считаться репрезентативными. Протокол может применяться к любому высокочувствительному потоковому цитометру нового поколения. Включите потоковый цитометр задолго до начала взятия образцов, чтобы обеспечить стабильность лазера. Тщательно промыйте флюидные элементы и проточную ячейку, так как тромбоциты небольшие, и любой остаток клетки может мешать визуализации популяции тромбоцитов в точном графике с областью переднего рассеяния/бокового рассеяния (FSC-A/SSC-A). Проведите контроль качества с контролем качества бусины согласно инструкции производителя и снова промой жидкости, чтобы удалить остатки шариков.

1. Структура приобретения
   1. Создайте точечный график FSC-A/SSC-A на логарифми, отображающий все события (рисунок 4A). Создайте точечный график CD61-A/SSC-A на логарифми, отображающий все события (рисунок 4B).
   2. Корректируйте усиление PE (Y-585) и PerCP (B690) в соответствии с ежедневным контролем качества. Установите порог примерно на 2000 на SSC-H и до 1000 по PerCP (B690-H), чтобы визуализировать популяцию тромбоцитов. Установите расход на НИЗКИЙ.
   3. Нарисуйте область между 10³ и 10⁵ под названием «CD61⁺», чтобы определить популяцию тромбоцитов.
   4. Приобрести элементы одиночного окраски для расчёта матрицы компенсации, а затем получить образцы. Запишите файл данных из 10 000 событий внутри вентиля «CD61⁺» (рисунок 4D,E). Начинайте записывать 5-10 секунд после начала сбора сэмпла.

6. Анализ экспрессии поверхностной TF с помощью проточной цитометрии

1. Создайте точечный график FSC-A/SSC-A на логарифмичной шкале, отображающий все события (рисунок 5A), и точечный график CD41-A/SSC-A на логарифми, отображающий все события (рисунок 5B).
2. Скорректируйте усиление Alexa Fluor 633 и PE (Y-585) в соответствии с ежедневным контролем качества, установите порог примерно до 1000 на SSC-H и до 2500 по PE (Y585-H), чтобы визуализировать популяцию тромбоцитов, как показано на рисунке 5B. Установите расход на НИЗКИЙ.
3. Нарисуйте область между 10⁴ и 10⁵ под названием «CD41⁺», чтобы определить популяцию тромбоцитов.
4. Приобрести элементы одиночного окраски для расчёта матрицы компенсации, а затем получить образцы. Запишите файл данных с 10 000 событий внутри вентиля «CD41⁺» (рисунок 5D,E). Начинайте записывать 5-10 секунд после начала сбора сэмпла.

7. Анализ TF-положительных тромбоцитов в плазме, богатой тромбоцитами,

1. Подготовка плазмы, обогащённой тромбоцитами (PRP)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выделение тромбоцитов должно проводиться при комнатной температуре, чтобы предотвратить активацию клеток. Убедитесь, что температура реагентов и приборов находится в диапазоне от 18 °C до 22 °C. Избегайте быстрого пипетирования и сильного встряхивания на протяжении всей процедуры.
   1. Аккуратно перемешайте вакутанер цитрат натрия с концентрацией 0,129 млн 5 раз и измерьте количество тромбоцитов дважды на счетчике кровяных клеток, чтобы рассчитать процент восстановленных тромбоцитов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте среднее значение двух определений как концентрацию тромбоцитов.
   2. Центрифугуйте вакутайнер цитрат натрия объемом 0,129 м при 100 x g в течение 10 минут, без тормозов, при комнатной температуре (рисунок 6). Соберите полученный PRP, перенесите его в полипропиленовую трубку объёмом 10 мл и запишите собранный объём.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте полистироловые трубки, чтобы избежать активации тромбоцитов.
   3. Подсчитайте тромбоциты дважды в PRP с помощью счетчика кровяных клеток и рассчитайте процент восстановления тромбоцитов следующим образом:
      
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если выздоровление ниже 65%, популяция тромбоцитов не полностью репрезентативна для этого показателя в цельной крови. Подумайте о том, чтобы отказаться от подготовки.
2. Подготовка образца для анализа проточной цитометрии внутриклеточной и поверхностно-ассоциированной экспрессии TF в PRP
   1. Для анализа внутриклеточной и поверхностной экспрессии ТФ при ПРП используйте тот же протокол, описанный для анализа цельной крови (см. шаги 3-6).

Результаты

Краткое описание анализа экспрессии TF, ассоциированных с тромбоцитами, описано в блок-диаграмме, показанной на рисунке 1. Этапы включают: (1) Забор крови: Собирать кровь из периферической вены человека, желательно из прекубитальной вены, с помощью иголки G19 или игольчатой канюли без жгута и с помощью вакутейнеров с антикоагулянтами. (2) Обработка образцов: Обработка образцов в соответствии с типом оценки TF, который должен выполняться. (3) Маркировка образцов: Маркировать образцы специфическими антителами. (4) Анализ потоковой цитометрии: Анализировать образцы для обнаружения поверхностного и внутриклеточного ТФ.

Во время удаления крови необходимо уделять особое внимание предотвращению активации тромбоцитов. Для этого соблюдаются две меры предосторожности: снятие жгута вскоре после введения иглы в вену и сбрасывание крови в первом взятом вакутейнере. Без использования жгута популяция тромбоцитов, отображаемая на точечном графике FSC-A/SSC-A, имеет типичную форму, как показано на рисунке 2A. Наоборот, при использовании жгута физические свойства популяции тромбоцитов приобретают удлинённую форму, напоминающую морфологию, наблюдаемую после стимуляции классическим агонистом тромбоцитов, таким как ADP (рисунок 2B,C).

Эксперименты, проведённые для оценки стабильности экспрессии ТФ, ассоциированной с тромбоцитами, со временем показали, что она была стабильной в течение 3 часов после забора крови (см. рисунок 3). При совмещении измерения экспрессии ТФ с показателем маркера активации тромбоцитов, такого как P-селектин, рекомендуется как можно скорее обработать образец крови, чтобы избежать дегрануляции тромбоцитов.

Для анализа внутриклеточно хранящегося ТФ цельная кровь фиксируется в 1% PFA, проницается PBS-Triton, а затем окрашивает антителом, маркированным PE. Популяция тромбоцитов идентифицируется на логарифмическом графике FSC-A/SSC-A (рисунок 4 A,D) и по окрашиванию αCD61 mAb (рисунок 4 B,E). Результаты анализа внутриклеточной ТФ у здоровых пациентов (n = 377) показали, что ТФ присутствует в пределах 26,8% ± 4,8% циркулирующих тромбоцитов (рисунок 4F).

Анализ поверхностно-ассоциированной экспрессии ТФ проводился в условиях покоя и после стимуляции клеток с АДФ 10 мкм. Вся популяция тромбоцитов крови, маркированная αCD41 mAb, была идентифицирована на логарифмическом графике FSC-A/SSC-A (рисунок 5A,B). Результаты показали, что у здоровых пациентов (n = 377) TF экспрессируется на 2,8% ± 1,4% от тромбоцитов в состоянии покоя (рисунок 5D-F) и увеличивается до 24,5% ± 5,8% при активации (рисунок 5G-I). TF выражается подмножеством тромбоцитов с наибольшим размером (рисунок 5D, G, зелёные точки). Кроме того, анализ с помощью визуализации потоковой цитометрии показывает, что сигнал TF связан только с положительным αCD61, а не с положительными событиями αCD45 (см. рисунок 7).

Как уже упоминалось, ТФ хранится в подгруппе тромбоцитов, характеризующихся наибольшим размером во всей популяции. Поэтому важно не терять эту фракцию тромбоцитов во время подготовки PRP. Следуя показаниям, приведённым в разделе метода (шаг 7), возможно выделить популяцию тромбоцитов внутри ПРП, которая является представительной для той, что присутствует в цельной крови. Как показано на рисунке 6, точечный график цитометрии потока тромбоцитов, полученный центрифугированием 100 г цельной крови, очень похож на график цельной крови по распределению FSC (рисунок 6 A,B). В отличие от этого, при более высокой силе и более длительном времени центрифуга, как часто сообщается в^{литературе} 12,14,16, у восстановленной популяции тромбоцитов FSC ниже по сравнению с цельной кровью (см. рисунок 6C), что указывает на потерю тромбоцитов крупного размера, которые являются высокоположительными по ТФ.

Рисунок 1: Схематическая схема анализа экспрессии тромбоцитов, связанных с тромбоцитами, и выделения тромбоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой рисунка.

Рисунок 2: Репрезентативные графики плотности популяции тромбоцитов, анализируемые с помощью цитометрии цельного кровотока. (A) Популяция тромбоцитов, анализируемая в образце крови без жгута или (B) с жгутом. (C) Сообщается популяция тромбоцитов, стимулируемая АДП, для сравнения. WBC: лейкоциты; Эритроциты: эритроциты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Стабильность экспрессии ТФ, связанной с поверхностью клеток, со временем. Экспрессия тромбоцитов, ассоциированных с тромбоцитами, в состоянии покоя, анализировалась в 4 разных временных моментах после отмены крови, сообщаемой по оси x: T0 = сразу после забора крови; T1 = 1 час после сбора крови; T2 = 2 часа после сбора крови; T3 = 3 часа после сбора крови. Данные отображаются как среднее ± SD, n = 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Репрезентативный анализ потоковой цитометрии внутриклеточно хранящегося ТФ .Популяция тромбоцитов (красная) в цельной крови идентифицируется на точечном графике FSC/SSC-A (A,D) и по окрашиванию αCD61 mAb (B,E). Экспрессия TF анализируется с помощью PE- αCD142/HTF1 mAb (зелёные точки). Гистограммные графики используются для определения отрицательных (C) и положительных (F) событий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Репрезентативный анализ потоковой цитометрии поверхностно-ассоциированных TF-положительных тромбоцитов. Свежая цельная кровь маркируется αCD142/HTF1 mAb, затем фиксируется 1% PFA и маркируется вторичным mAb и αCD41 mAb. Популяция тромбоцитов (красная) в цельной крови идентифицируется на точечном графике FSC/SSC-A (A,D,G) и по окрашиванию αCD41 mAb (B,E,H). Экспрессия ТФ в состоянии покоя (D-F) и после стимуляции АДП (G-I) количественно измеряется меткой αCD142/HTF1 mAb (зелёные точки). Представлены репрезентативные гистограммы отрицательных (C) и положительных (F,I) образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6: Влияние различных центрифугных сил на подготовку PRP. (A-C) Анализ потоковой цитометрии популяции тромбоцитов в цельной крови, PRP, подготовленный при 100 x g и при 350 x g. Эталонный диапазон популяции тромбоцитов на FSC-H/SSC-H обозначен пунктирными линиями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7: Оценка экспрессии ТФ в тромбоцитах и лейкоцитах с помощью визуализации потоковой цитометрии. Показаны репрезентативные изображения каналов яркого поля (BF, серый), фактора ткани (TF, зелёный), αCD61 (красный), αCD45 (серый), окрашивание ядер Hoechst (пурпурная) и составное изображение (слияние), полученное при 60-кратном увеличении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Идентификатор пробирки	Фикс/химическая завивка цельной крови (μL)	αCD142-PE (μL)	αCD61-PerCP (μL)
FMO	100	-	15
TF	100	5	15

Таблица 1: Протокол окрашивания для анализа внутриклеточной экспрессии ТФ проточной цитометрией.

Идентификатор пробирки	Фикс/химическая завивка цельной крови (μL)	αCD142-PE (μL)	αCD61-PerCP (μL)
Без пятен	100	-	-
αCD142-PE	95	5	-
αCD61-PerCP	85	-	15

Таблица 2: Одиночное окрашивание для компенсационной матрицы внутриклеточной экспрессии ТФ.

Идентификатор пробирки	PBS 1x (мкл)	αCD142 (мкл)	ADP (μL)	Свежая цельная кровь (μL)	PFA 1% (мкл)
FMO	95	-	-	5	300
Отдых	87.5	7.5	-	5	300
Активация ADP	82.5	7.5	5	5	300

Таблица 3: Протокол окрашивания для анализа экспрессии поверхностной TF проточной цитометрии.

Идентификатор пробирки	PBS 1x (мкл)	Alexa Fluor 633 IgG (μL)	αCD41-PE (μL)
FMO	90	5	5
Отдых	90	5	5
Активация ADP	90	5	5

Таблица 4: Протокол вторичного окрашивания антител для поверхностно-ассоциированного анализа ТФ.

Идентификатор пробирки	PBS 1x (мкл)	αCD142 (мкл)	ADP (μL)	Свежая цельная кровь (μL)	PFA 1% (мкл)
Без пятен	90	-	5	5	300
TF + Alexa Fluor 633 IgG	82.5	7.5	5	5	300
αCD41-PE	90	-	5	5	300

Таблица 5: Подготовка компенсационной матрицы для внутриклеточного анализа ТФ.

Идентификатор пробирки	PBS 1x (мкл)	Alexa Fluor 633 IgG (μL)	αCD41-PE (μL)
Без пятен	100	-	-
TF + Alexa Fluor 633 IgG	95	5	-
αCD41-PE	95	-	5

Таблица 6: Подготовка компенсационной матрицы для анализа ТФ, ассоциированных с поверхностью.

Обсуждение

В этой рукописи изложены подробные протоколы оценки тромбоцитов, положительных к ТФ, с помощью цитометрии полного кровотока, с учётом анализа белка, экспрессируемого как внутри, так и на поверхности тромбоцитов.

За последние 20 лет наличие TF в тромбоцитах человека было хорошо^{установлено на} 1,2,3,4,5,17,18. Подмножество тромбоцитов, составляющее 20%–30% от общей популяции циркулирующих^{тромбоцитов 2}, экспрессирует белок, укрепляя концепцию гетерогенности тромбоцитов, которая становится всё более актуальной в области^19,20. Стоит отметить, что TF-положительные тромбоциты имеют высокий средний объём тромбоцитов, как ранее показала высокочувствительная цитометрия потока^{визуализации 2}. Крайне важно учитывать эту особенность, особенно когда экспрессия TF необходимо анализировать в тромбоцитах, выделенных из других компонентов кровяных клеток. Действительно, возможно, что этап центрифуга, используемый для выделения тромбоцитов, может привести к потере крупных^{тромбоцитов 2}. Этот преданалитический вопрос, вероятно, является одной из главных причин спора — который длился до нескольких лет назад — по поводу присутствия TF в тромбоцитах^{7, 12, 13}. Цитометрия цельного кровотока — чрезвычайно полезный подход в этом отношении, позволяющий анализировать все подмножества тромбоцитов без необходимости их выделения.

Второй причиной, побудившей обсуждение наличия ТФ в тромбоцитах, был выбор антитела к ТФ, использовавшегося для анализа. Существует множество коммерчески доступных антител, которые использовались для оценки тромбоцитарно-ассоциированных ТФ и распознают различные эпитопы белка. Некоторые антитела, такие как TF9-10H10 ^3,21,22 и клоны^{VIC7 1,3}, связываются с нефункциональной областью TF, не влияя на связывание FVII/FVIIa. Другие антитела, включая клоны^{VD8 1,2,3} и^{HTF1 18} — последние используемые в текущих протоколах — распознают катализаторный участок белка, конкурируя с FVII/FVIIa за связывание с TF, тем самым блокируя его прокоагулянтную функцию. Важно отметить, что в зависимости от гликозилирования внеклеточного домена и конформации каталитического участка^{TF 23}, который может быть модифицирован при определённых условиях (например, активации клеток или заболеваниях), некоторые из этих антител могут дифференцированно распознавать с помощью проточной цитометрии поверхностную экспрессию тромбоцитно-ассоциированного ТФ. Кроме того, условия окрашивания, то есть свежий, фиксированный и/или пермеабилизированный образец, могут влиять на конформацию эпитопа и, следовательно, на связывание антигена^{и антител 14}.

Ещё одним важным моментом является выбор фторохрома, привязанного к антителу. Поскольку ТФ экспрессируется только у 20%–30% популяции тромбоцитов, низкоэмиссионные фторохромы вместе с использованием низкочувствительных потоковых цитометров могут быть неподходящими для различия низкоуровневых положительных сигналов. По этой причине предпочтительнее использовать антитела с яркими флуорохромами, такие как PE или APC. Однако важно отметить, что большой размер фторохрома, такого как ПЭ, может препятствовать связыванию меченого антитела с^{белком 24}. Для преодоления этой проблемы в настоящем протоколе поверхностное окрашивание TF проводилось в виде косвенного маркировки с неконъюгированным αCD142/HTF1 mAb, а затем выявлено с помощью вторичного антитела. Препятствие ПЭ-стерического вмешательства не влияет на связывание αCD142/HTF1 mAb с ТФ, хранящимися внутриклеточно, где каталитический сайт более доступен для связывания антител. Очевидно, что оценка поверхностной экспрессии тромбоцитно-ассоциированного ТФ с помощью прямой маркировки, по сравнению с косвенной, предпочтительнее, если возможно, для сокращения времени обработки образца. Однако этот подход должен учитывать критические вопросы, упомянутые выше и связанные с связывающей способностью нескольких коммерчески доступных антител к тромбоцитарным ТФ, обусловленными конформацией самого белка, условиями окрашивания, а также стерическими препятствиями различных используемых фторхромов. Поэтому, чтобы избежать ложноотрицательных результатов, прямое маркирование поверхностно-экспрессируемых тромбоцитов TF требует обязательного тщательного процесса оптимизации. Эти аспекты являются предметом текущего исследования, направленного на оценку эффективности прямого окрашивания с использованием различных коммерчески доступных клонов антител, маркированных универсальными флуорохромами.

Несколько исследований показали, что экспрессия ТФ повышена при различных патологических состояниях, характеризующихся высоким тромботическим^риском 8,9,10,11,17. В последнее время были представлены доказательства того, что уровни тромбоцитов-положительных к TF, точно количественно оценённых с помощью анализа потоковой цитометрии, могут выявлять сердечно-сосудистых пациентов, которые, несмотря на оптимальный ответ на лечение аспирином и антагонистами P2Y₁₂, сохраняют высокий тромботический^{риск 25}. Действительно, тромбоцитарно-ассоциированный ТФ функционально активен и, следовательно, потенциально способен поддерживать тромбиновое поколение ^1,3,4. В этом контексте возможность проведения анализа проточной цитометрии нескольких микролитров крови является значительным преимуществом, позволяющим расширить анализ ТФ, ассоциированный с тромбоцитами, в клиническую практику. В связи с этим стоит отметить, что валидация измерения ТФ, ассоциированных с тромбоцитами, с помощью потоковой цитометрии, была целью международного проекта, который мы недавно координировали при поддержке Международного общества гемостаза и тромбоза для предоставления методологических рекомендаций для его оценки.

В отличие от других классических маркеров активации тромбоцитов, таких как P-селектин и тромбоцитарно-лейкоцитные агрегаты, которые необходимо анализировать сразу после анализа крови для предотвращения артефактов, экспрессия ТФ гораздо более стабильна. Фактически, образец крови может быть обработан в течение нескольких часов после отмены без значительных изменений экспрессии тромбоцитов-ТФ; Кроме того, возможность фиксации образца и последующего маркировки/обработки делает этот анализ подходящим для многих больниц и лабораторий. Примечательно, что, хотя протокол, описанный в этой рукописи, относительно прост в выполнении, техника потоковой цитометрии всё же требует специализированной технической подготовки. По этой причине технологии движутся к разработке всё более простых цитометров, предназначенных для точечных анализов.

В заключение, предлагаемый протокол предлагает методы правильного анализа тромбоцитарно-ассоциированного ТФ, подчёркивая преимущества метода анализа проточной цитометрии для её определения. Кроме того, он выделяет преданалитические переменные, которые могут влиять на анализ этого белка, с акцентом на меры для их предотвращения.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Аденозин 5'-дифосфат (ADP)	Сигма-Олдрич	A-2754	Агонист тромбоцитов
Alexa Fluor 633 козёл и альфа-мышь IgG	Инвитроген	A21052	Вторичные антитела
Biotube 10 мл	Biosigma	BSP048	Для коллекции PRP
Бабочка Игла G19	Решение PIC	02044019030010	Для отмены крови
Программное обеспечение CytExpert	Бекман Коултер		Анализ данных потоковой цитометрии
Cytoflex S	Бекман Коултер		Потоковый цитометр
Трубки Эппендорфа 1,5 мл	Эппендорф	1,20,086	Фиксация крови
ImageStreamX Mk II	Cytek Biosciences		Цитометр потока визуализации
Kaluza Software	Бекман Коултер		Анализ данных потоковой цитометрии
Параформальдегид	Антибиотики и даш; Divisione Carlo Erba Reagenti	387507	Чтобы исправить кровь и тромбоциты
PerCP-и альфа; CD45	BD	345809	Маркер популяции лейкоцитов
PerCP-и альфа; CD61	BD	347408	Маркер пуляции тромбоцитов
PE-и альфа; CD142	BD	550312	Антитела к античеловеческому тканевому фактору
PE-и альфа; CD41	Бекман Коултер	A07781	Маркер пуляции тромбоцитов
Фосфатный буферный физиологический раствор (PBS) 1 раз без кальция и магния	Gibco	10010-015	Для антител и разбавления образца
Наконечники пипетов 10 и микро; L	Gilson	F161630	Для подготовки образцов
Наконечники пипетов 1000 и микро; L	Гилсон	F161670	Для подготовки образцов
Наконечники пипетов 200 и микро; L	Гилсон	F161930	Для подготовки образцов
Трубка с круглым дном объёмом 5 мл	Корнинг	352052	Для сбора потокового цитометра
Хлорид натрия 0,9 %	BD	306575	Чтобы промыть игольчатую канюлю после отмены крови
Sysmex XN-450	Дасит		Анализатор кровяных клеток
Triton X-100	Карло Эрба Реагенти	9002-93-1	Для проницаемости мембраны кровяных клеток
Вакутейнер цитратные трубки размером 0,129 М	BD	363079	Для сбора крови
Лампы Vacutainer K2 EDTA	BD	368857	Для сбора крови
Vacutainer multi sample luer адаптер	BD	367300	Для отмены крови
Vacutainer для одноразового держателя	BD	364815	Для отмены крови
Набор для захвата антител Versacomp	Бекман Коултер	B22804	Титрование антител
α CD142 (клон HTF-1)	Инвитроген	16-1429-82	Антитела к античеловеческому тканевому фактору