Методическая статья

Интерференция личиночной РНК у шелкопряда Bombyx mori через доставку наночастиц хитозана/дцРНК

2.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67360

⸱

4 октября 2024 г.

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Guangzhou University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлен протокол доставки наночастиц хитозана/дцРНК в личинки тутового шелкопряда Bombyx mori с целью индуцирования сайленсинга генов при проглатывании.

Аннотация

Шелкопряд, Bombyx mori, является важным экономическим насекомым с тысячелетней историей в Китае. Между тем, шелкопряд является модельным насекомым чешуекрылых с хорошим накоплением фундаментальных исследований. Это также первое насекомое из семейства чешуекрылых, полный геном которого секвенирован и собран, что обеспечивает прочную основу для изучения функциональности генов. Несмотря на то, что РНК-интерференция (РНК-интерференция) широко используется в исследовании обратной функциональности генов, она является рефрактерной у шелкопрядов и других видов чешуекрылых. Предыдущие успешные исследования, связанные с РНК-интерференцией для доставки двухцепочечной РНК (дцРНК), проводились только путем инъекций. О доставке дцРНК через питание никогда не сообщается. В этой статье мы описываем пошаговые процедуры получения наночастиц хитозана/дцРНК, которые скармливаются личинкам тутового шелкопряда при приеме внутрь. Протокол включает в себя (i) выбор правильной стадии личинок тутового шелкопряда, (ii) синтез дцРНК, (iii) получение наночастиц хитозана/дцРНК и (iv) кормление личинок тутового шелкопряда наночастицами хитозана/дцРНК. Представлены репрезентативные результаты, включая подтверждение транскриптов генов и наблюдение за фенотипом. Кормление дцРНК является простым методом получения РНК-интерференции у личинок тутового шелкопряда. Поскольку личинки тутового шелкопряда просты в выращивании и достаточно велики для работы, это является хорошей моделью для демонстрации личиночной РНК-интерференции у насекомых. Кроме того, простота этого метода стимулирует более активное участие студентов в исследованиях, что делает личинок тутового шелкопряда идеальной генетической системой для использования в классе.

Введение

Шелкопряд, Bombyx mori, является насекомым, одомашненным более 5000 лет назад в Китае. Благодаря своей способности производить шелк, шелкопряд является важным экономическим насекомым в китайском сельском хозяйстве и шелководстве. Шелкопряд уступает только плодовой мухе в качестве модельного насекомого. В качестве образцового насекомого у чешуекрылых, шелкопряда легко выращивать, он имеет большой размер тела и большое количество мутантов. Между тем, шелкопряд является первым чешуекрылым насекомым с секвенированным полнымгеномом1. Также доступно множество баз данных, предоставляющих информацию о геноме2, транскриптоме3, метке экспрессированной последовательности (EST)4, некодирующей РНК5 и микросателлите6 . Вышеперечисленные факты делают шелкопряда идеальной моделью для генетических исследований.

РНК-интерференция (РНК-интерференция) — это клеточный процесс, при котором молекулы двухцепочечной РНК (дцРНК) связываются и разрезают комплементарную матричную РНК (мРНК), тем самым достигая эффекта сайленсинга гена-мишени. Этот механизм естественным образом присутствует у бактерий для защиты от вторжения вирусов7. Позже было обнаружено, что РНК-интерференция сохраняется у животных, растений и микробов. Благодаря своему мощному эффекту сайленсинга, специфичному для определенной последовательности, РНК-интерференция используется в фундаментальных исследованиях для манипулирования экспрессией генов и изучения их функций. РНК-интерференция достигается за счет доставки дцРНК в клетки.

У насекомых существует три распространенных способа доставки дцРНК: микроинъекция, кормление и замачивание8. В настоящее время успешные сообщения о РНК-интерференции у шелкопрядов через доставку голой дцРНК осуществляются путем введения дцРНК9. Преимуществами микроинъекций являются немедленная доставка дцРНК в гемолимфу и точный контроль количества дцРНК. Однако существуют и определенные недостатки микроинъекций. Например, это трудоемко, и для этого требуются деликатные устройства. Также важно оптимизировать инъекционные иглы, объем инъекций и количество дцРНК. Поэтому становится необходимым альтернативный способ доставки дцРНК к шелкопрядам. Поскольку экзоскелет насекомого представляет собой водонепроницаемый барьер, состоящий из хитина, о замачивании личинок насекомых для получения РНК-интерференции сообщается редко, что не является хорошим вариантом для РНК-интерференции у насекомых. Кормление дцРНК является трудоемким, экономичным и простым в выполнении10. Этот метод также применим для высокопроизводительного скрининга генов11. Тем не менее, было обнаружено, что неспецифическая нуклеаза ДНК/РНК, а именно BmdsРНКаза, присутствует в средней кишке и соке средней кишки личинок тутового шелкопряда12. Показано, что эта нуклеаза переваривает дцРНК, предпочтительно13. Таким образом, скармливание тутового шелкопряда голой дцРНК для подавления экспрессии генов представляется сложной задачей.

Недавно было доказано, что дцРНК, защищенная наночастицами, является хорошей альтернативой для повышения эффективности РНК-интерференции за счет кормления14. Хитозан является недорогим, нетоксичным и биоразлагаемым полимером, который может быть получен путем деацетилирования хитина, природного и второго по распространенности биополимера после целлюлозы15. Поскольку аминогруппа в хитозане заряжена положительно, а фосфатная группа на основе дцРНК заряжена отрицательно, наночастицы хитозана/дцРНК могут быть образованы путем самосборки поликатионов16. Наночастицы хитозана/дцРНК эффективны в достижении РНК-интерференции за счет питания личинок комаров Aedes aegypti и Anopheles gambiae17, хлопчатникового пятнистого коробочного червя Earias vittella18 и карминного паутинного клеща Tetranychus cinnabarinus19.

Чтобы разработать методологию доставки дцРНК путем кормления шелковичных червей для достижения успешной эффективности РНК-интерференции, в этом отчете основное внимание уделяется описанию пошаговых процедур получения наночастиц хитозана/дцРНК и скармливания наночастиц личинкам тутового шелкопряда. Эта методология относительно недорога, трудосберегательна и проста в использовании, которая может быть адаптирована для исследований подавления генов у других насекомых. Мы стремимся предоставить более простой протокол для метода доставки дцРНК чешуекрылых с более высокой эффективностью РНК-интерференции.

Протокол

1. Виды и выращивание тутового шелкопряда

  1. Вырастите не менее 120 только что вылупившихся личинок шелкопряда1-го возраста штамма B. mori P50 со свежими листьями шелковицы при температуре 25 ± 1 °C, фотопериоде 12 ч Свет: 12 ч в темноте и относительной влажности 75% ± 5%.

2. Отбор личинок тутового шелкопряда

  1. Выберите день 1 личинки5-го возраста для эксперимента с РНК-интерференцией; Личинки шелкопряда быстро растут после 3-го дня5-го возраста, что идеально подходит для сравнения различий во внешнем виде личинок.
    Примечание: В качестве альтернативы, более молодые стадии, такие как3-й или4-й возраст, могут быть использованы для эксперимента с РНК-интерференцией. Тем не менее, она требует постоянной обработки дцРНК до5-го возраста, что относительно дорого и требует материальных затрат.

3. Синтез дцРНК

  1. Идентификация фрагмента-мишени дцРНК: выберите кодирующую последовательность гена-мишени и выровняйте ее с другими гомологичными генами для определения консервативной области. Спроектируйте ген-специфичные праймеры в неконсервативном участке для последующей амплификации фрагмента-мишени дцРНК. Для экспериментов с РНК-интерференцией у насекомых типичный фрагмент-мишень дцРНК обычно составляет 400-600.н. Минимальный размер может составлять 200.о.
    Примечание: Для повышения эффективности и успешности экспериментов с РНК-интерференцией для разработки мишени дцРНК можно использовать некоторые веб-инструменты, такие как dsRNA Engineer (https://dsrna-engineer.cn/).
  2. Шаблон продукта для производства ПЦР: Добавьте промотор РНК-полимеразы T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') на 5'-конец любого праймера, разработанного выше. Проведите стандартную ПЦР для амплификации фрагмента-мишени дцРНК. Запустите 1% агарозный гель в 1x TAE, чтобы проверить один продукт ПЦР ожидаемого размера. После этого очистите продукт ПЦР с помощью очистительного набора (Table of Materials) и используйте его для последующей транскрипции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для длительного хранения целевого ПЦР-продукта и получения высоких урожаев рекомендуется лигировать ПЦР-продукт до плазмиды. Плазмида должна быть линеаризирована перед реакцией ПЦР.
  3. Генерация дцРНК: Используйте систему T7 RNAi (Таблица материалов) для генерации дцРНК. Настройте реакцию, добавив компоненты при комнатной температуре в соответствии с инструкциями производителя. Осторожно перемешайте реакцию с помощью пипетки и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для максимального увеличения выхода инкубация при 37 °C может быть продлена до 2-6 часов. Для матриц, содержащих вторичную структуру или богатых GC, инкубацию можно проводить при температуре 42 °C для увеличения выхода дцРНК.
  4. Отжиг с образованием дцРНК: Инкубировать реакцию при 70 °C в течение 10 минут, затем медленно охладить до комнатной температуры (~20 минут). Это приведет к отжигу дцРНК.
  5. Обработка ДНКазы и РНКазы: пипетка 1 мкл подаваемого раствора РНКазы в 199 мкл воды, не содержащей нуклеаз, чтобы получить свежеразведенный раствор РНКазы. Добавьте 1 мкл свежеразведенного раствора РНКазы и 1 мкл поставляемой ДНКазы, не содержащей RQ1 РНКазы, на 20 мкл реакционного объема, аккуратно перемешайте и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут. Одноцепочечная РНК (ссРНК) и матричная ДНК в реакции будут удалены после этой обработки.
  6. Осаждение спирта: Добавьте в реакцию 1 объем изопропанола или 2,5 объема 95% этанола вместе с 0,1 объема 3 М ацетата натрия (pH 5,2). Перемешайте реакцию путем вортекса и инкубируйте на льду в течение 5 минут до образования мутной массы. Вращайте на максимальной скорости в центрифуге в течение 10 минут, чтобы собрать белую гранулу на дне пробирки. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу 0,5 мл холодного 70% этанола, чтобы удалить остатки соли. Удалите этанол после стирки. Дайте гранулам высохнуть на воздухе при комнатной температуре в течение 15 минут. Ресуспендировать гранулу в воде, не содержащей нуклеаз, в 2-5 раз больше исходного объема реакции. Хранить при температуре -20 °C или -70 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулу дцРНК не следует чрезмерно сушить, так как это может затруднить ее полную ресуспендацию. Для обеспечения достаточной ресуспензии необходимо минимум 2 объема.
  7. Проверка количества и качества дцРНК: Разведите дцРНК в воде, не содержащей нуклеаз, в соотношении от 1:100 до 1:300. Определяют концентрацию дцРНК с помощью микрообъемного спектрофотометра (Table of Materials) в соответствии с инструкцией производителя. Чтобы количественно определить дцРНК, умножьте концентрацию на объем. Для оценки качества дцРНК используют электрофорез в агарозном геле. Приготовьте 1% агарозный гель в 1x TAE и разбавьте дцРНК в соотношении 1:50 водой, не содержащей нуклеаз. Используйте 5 мкл разведенной дцРНК на линию и окрашивайте гель в 0,5 мг/мл бромида этидия в течение не менее 15 минут для визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: дцРНК мигрирует медленнее, чем дцДНК.

4. Получение наночастиц хитозана/дцРНК

  1. При комнатной температуре сделайте 100 мМ ацетата натрия (0,1 М NaC2H3O2 и 0,1 М уксусной кислоты, pH 4,5 в деионизированной воде) и 100 мМ сульфата натрия (100 мМ Na2SO4 в деионизированной воде).
  2. Растворить коммерчески проданный хитозан (из панцирей креветок, ≥75% деацетилированный; Таблица материалов) в 100 мМ буфере из ацетата натрия для получения 0,02% (мас./об.) раствора хитозана.
  3. Растворите 20 мкг дцРНК в 50 мкл воды, не содержащей нуклеаз, и добавьте ее к 50 мкл буфера из 100 мМ сульфата натрия, чтобы получить 100 мкл раствора дцРНК.
  4. Добавьте 100 мкл раствора хитозана к 100 мкл раствора дцРНК. Одновременно готовят контроль, добавляя 100 мкл раствора хитозана к 100 мкл 50 мМ сульфата натрия. Перемешайте и нагрейте смеси при температуре 55 °C в течение 1 минуты.
  5. Немедленно окуните смесь в вихрь с помощью высокоскоростного вихря в течение 30 с, чтобы обеспечить образование наночастиц.
  6. Центрифугируйте смесь при 13 000 х г при комнатной температуре в течение 10 минут до получения белой гранулы. Перенесите надосадочную жидкость в свежую пробирку объемом 1,5 мл. Дайте гранулам высохнуть на воздухе при комнатной температуре в течение 10 минут.
  7. Определяют концентрацию дцРНК в надосадочной жидкости с помощью микрообъемного спектрофотометра (Таблица материалов). Используйте надосадочную жидкость из контроля в качестве заготовки. Умножьте концентрацию на объем, чтобы рассчитать общее количество дцРНК, оставшееся в надосадочной жидкости. Рассчитайте процентное содержание дцРНК, инкапсулированной в наночастицах, на оставшееся в надосадочной жидкости количество, деленное на начальное количество дцРНК.
    Примечание: Несмотря на то, что наночастицы можно хранить при температуре от 4 до 37 °C в течение не менее 15 дней перед использованием14, рекомендуется использовать наночастицы как можно скорее.

5. Кормление личинок тутового шелкопряда наночастицами хитозана/дцРНК

  1. Выберите только что линявших личинок шелкопряда5-го возраста (т.е. 1-й день5-го возраста) того же размера для эксперимента по кормлению. Поместите личинки по отдельности в каждую лунку 6-луночного планшета перед закрытием крышки и голодайте в течение 24 часов.
  2. Свежие листья шелковицы промойте деионизированной водой и обсушите чистой кухонной бумагой. Листья шелковицы должны быть сухими без капель воды. Разрежьте на 1 см х 1 см листовые диски шелковицы.
  3. Перед использованием растворите наночастицы хитозана/дцРНК в воде без нуклеаз в концентрации 500 нг/мкл. Разбавьте контрольные наночастицы хитозана (полученные в 4.4) тем же объемом воды, не содержащей нуклеаз. Приготовьте голую дцРНК до 500 нг/мкл в воде, не содержащей нуклеаз.
  4. Используйте наночастицы хитозана/дцРНК для эксперимента по нокдауну РНК-интерференции, контрольные наночастицы хитозана в качестве пустого/отрицательного контроля. Используйте голую дцРНК для сравнения различий с наночастицами хитозана/дцРНК.
  5. Покрытие 10 мкл наночастиц хитозана/дцРНК, хитозана и голой дцРНК на поверхности каждого диска листа соответственно. Раствор наночастиц и раствор дцРНК высушить на воздухе на листовых дисках при комнатной температуре в течение 5 минут.
  6. Кормите каждую личинку одним листовым диском, покрытым наночастицами или дцРНК, в день. Подарите личинкам листовые диски, покрытые наночастицами или дцРНК, непрерывно в течение 5 дней. Свежие листья шелковицы могут быть предоставлены после того, как покрытый покрытием диск листьев будет полностью съеден личинками каждый день.
  7. На 6 день обезболить личинок на льду до тех пор, пока они не перестанут двигаться, и препарировать личинок для взятия пробы. Отрежьте грудную клетку ножницами на чистой чашке Петри. Вытащите среднюю кишку пинцетом. Удалите содержимое из средней кишки и промойте среднюю кишку в другой чашке Петри, наполненной водой, не содержащей нуклеаз. Храните среднюю кишку в пробирке объемом 1,5 мл и держите при температуре -70 °C.

6. Подтверждение сайленсинга генов

  1. Выполните количественную ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) для расчета количественного определения относительного транскрипта. Для каждой биологической реплики требуется не менее трех биологических реплик и трех технических реплик. Для нормализации относительного транскрипта рекомендуется использовать как минимум два референсных гена. Тестируется ген Bombyx Toll9-2 (BmToll9-2). Оцените эффективность подавления экспрессии генов путем сравнения среднего значения относительного транскрипта с контрольной группой и переведите его в проценты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Условия амплификации qRT-PCR, информацию о праймерах и расчет относительного транскрипта можно найти в нашей недавней публикации20.
  2. Проанализируйте фенотип РНК-интерференции для оценки эффекта сайленсинга генов. Наблюдайте за размерами личинок и коконов. Ежедневно делайте фотографии, чтобы запечатлеть свои выступления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: РНК-интерференция может влиять на морфологию, метаморфоз, физиологию и поведение. Наблюдение за фенотипами, связанными с РНК-интерференцией, зависит от целевых генов.

Результаты

Для оценки эффективности РНК-интерференции для анализа был выбран иммунный ген, нацеленный на BmToll9-2 . Ген BmToll9-2 хорошо охарактеризован в лаборатории, а подавление экспрессии генов путем инъекции дцРНК приводит к получению более легких и мелких личинок в нашей недавней публикации20. Для подтверждения эффективности РНК-интерференции при проглатывании через наночастицы хитозана/дцРНК наночастицы хитозана использовали в качестве контроля, и в то же время сравнивали голую дцРНК.

По сравнению с контролем, наночастицы хитозана без дцРНК, голая дцРНК, нацеленная на ген BmToll9-2 , не проявляет эффекта сайленсинга. Кормление наночастицами хитозана/дцРНК в шелкопряде значительно ингибирует транскриптов, с 79% нокдауном (рис. 1). Ингибирование относительного транскрипта указывает на то, что ген BmToll9-2 был успешно подавлен путем приема хитозана/дцРНК.

Нокдаун гена BmToll9-2 существенно влияет на рост шелкопряда. При наблюдении за личинками молчащие личинки BmToll9-2-2 меньше контрольных личинок (рис. 2A). При сравнении коконов коконы с глушителем BmToll9-2 также меньше (рис. 2B). Наночастицы хитозана/дцРНК демонстрируют успешные эффекты РНК-интерференции как в транскрипте, так и в фенотипе у шелкопряда.

figure-results-1
Рисунок 1: Относительный транскрипт BmToll9-2 после поглощения наночастиц хитозана/dsBmToll9-2 личинками5-го возраста B. mori. Относительные уровни мРНК BmToll9-2 в личинках, получавших наночастицы хитозана в качестве контроля, голую дцРНК и наночастицы хитозан/дцРНК. Данные были представлены в виде средних значений ± стандартного отклонения трех биологических репликаций. Для каждой биологической репликации было три технические репликации. Разные буквы на столбцах указывают на существенные различия на основе одностороннего анализа ANOVA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Наблюдение за фенотипом после кормления наночастицами хитозана/dsBmToll9-2. Наночастицы хитозана используются в качестве контроля. (А) Появление личинок тутового шелкопряда после попадания в организм наночастиц. (Б) Появление коконов тутового шелкопряда после попадания в организм наночастиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Для наблюдения за фенотипом РНК-интерференции важен правильный этап, в зависимости от целевых генов. Наши предварительные результаты показали, что Toll9-2 участвует в росте шелкопряда. Размер и масса личинок тутового шелкопряда быстро увеличиваются в5-м возрасте21. Таким образом, личинки5-го возраста выбраны в качестве стадии для эксперимента по кормлению наночастицами хитозана/дцРНК. Также можно выбрать личинки3-го или4-го возраста для экспериментов по кормлению и наблюдать различия в развитии на5-м возрасте. Тем не менее, эксперименты с кормлением наночастицами требуют непрерывногоежедневного кормления 14. Кормление личинок на более молодой стадии требует большего количества подготовки дцРНК, что относительно дороже. По вышеуказанным причинам мы предлагаем выбрать в качестве отправной точки эксперимента по кормлению наночастицами только что линяющих личинок тутового шелкопряда5-го возраста.

Также важна оптимизация параметров подачи наночастиц. Постоянная подача наночастиц в течение 5-7 дней для достижения эффективной РНК-интерференции распространена в текущих исследованиях 14,18,22,23. Поскольку дцРНК является самым дорогим ингредиентом в экспериментах с РНК-интерференцией, наночастицы можно скармливать личинкам через день, что может помочь снизить вдвое стоимость получения дцРНК. Еще один способ сократить расходы — оптимизировать количество дцРНК, используемых в питании. В этом протоколе на каждую личинку используется 5 г наночастиц хитозана/дцРНК, что является универсальной дозой для инъекции дцРНК в лаборатории. Учитывая, что 5 мкг дцРНК является высокой дозой и ингибирование подачей наночастиц является значительным. В эксперименте предлагается уменьшить количество дцРНК. Тем не менее, влияние этих двух параметров на эффективность РНК-интерференции необходимо оценить в будущих экспериментах.

Соотношение хитозана и дцРНК может быть оптимизировано. В этом протоколе 20 мкг хитозана в 100 мкл ацетата натрия смешивают с 20 мкг дцРНК в 100 мкл сульфата натрия. В первом отчете о наночастицах хитозана/дцРНК 20 мкг хитозана в 100 мкл ацетата натрия смешивают с 32 мкг дцРНК в 100 мкл сульфата натрия16. В некоторых других отчетах 1 мкг хитозана в 100 мкл ацетата натрия смешивают с 1 мкг дцРНК в 100 мкл сульфата натрия18,23. Таким образом, количество хитозана и дцРНК может быть оптимизировано для достижения наилучшей эффективности загрузки наночастиц и оптимального эффекта сайленсинга РНК-интерференции.

Необходимо учитывать хранение наночастиц хитозана/дцРНК. Наночастицы хитозана/дцРНК подготавливаются перед экспериментом по кормлению, и рекомендуется использовать их немедленно. Недавнее исследование показало, что наночастицы хитозана/дцРНК хранятся при температурах 4 °C, 24 °C и 37 °C в течение 15 дней и остаются стабильнымипри 19 днях. Таким образом, наночастицы хитозана/дцРНК могут быть приготовлены заранее и храниться при температуре 4 °C в холодильнике, поскольку дцРНК более стабильна при низких температурах.

Помимо дцРНК, некоторые малые РНК, такие как малая интерферирующая РНК (миРНК) и короткая шпильчатая РНК (шРНК), могут быть использованы для подготовки наночастиц для экспериментов с РНК-интерференцией. Например, наночастицы миРНК повышают устойчивость растений к Pseudomonas syringae24. Доставка наночастиц shRNA вызвала успешный эффект РНК-интерференции у неотропического коричневого клопа-вонючки Euschistus heros25. Таким образом, наночастицы могут быть применены к любым молекулам РНК, используемым в эксперименте с РНК-интерференцией.

Сообщается, что эффективность РНК-интерференции у чешуекрылых, включая шелкопрядов, является рефрактерной26. Доставка дцРНК осуществляется только путем инъекции у тутового шелкопряда, что является трудоемким и трудоемким процессом. При использовании этого метода доставки наночастиц хитозана/дцРНК наблюдается значительный эффект сайленсинга либо в транскрипте, либо в фенотипе у личинок и коконов тутового шелкопряда, что возможно из-за меньшей деградации дцРНК под действием защиты хитозана19. Этот метод является трудосберегающим и простым в исполнении, который можно адаптировать к другим насекомым. Простота этого протокола может быть применена не только в научных исследованиях, но и в преподавании, демонстрации и практике в классе. Метод доставки наночастиц является новым направлением для будущего биоконтроля и борьбы с вредителями27.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование финансировалось Национальным фондом естественных наук Китая (31501898), Научно-технической программой Гуанчжоу (202102010465), Проектом по повышению качества преподавания и реформе преподавания в высшем образовании Гуанчжоу (2022JXGG057) и Исследовательским проектом Руководящего комитета открытых онлайн-курсов университетов провинции Гуандун (2022ZXKC381).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл центрифужная пробиркаSangonF601620для реакции дцРНК или наночастиц
10 мкм; l дозаторEppendorfP13473Gдля аспирации или ресуспензии жидкости
100 мкм; l пипеткаEppendorfQ12115Gдля аспирации или ресуспендирования жидкости
2,5 мкм; l пипеткаEppendorfP20777Gдля аспирации или ресуспензии жидкости
20 мкм; l дозаторEppendorfH19229Eдля аспирации или ресуспензии жидкости
200 мкм; l пипеткаEppendorfH20588Eдля аспирации или ресуспензии жидкости
6-луночный Прозрачный TC-обработанный многолуночный планшетCostar3516для выращивания шелкопряда
индивидуально Уксусная кислотаАладдинA116165для изготовления TAE
Agarose MBBI Life SciencesA610013для агарозного геля электрофос
Аналитические весыSartoriusBSA224Sна вес ингредиентов
Центрифуга SartoriusCentrisart A-14Cдля центрифугирования с образованием дцРНК или наночастиц
ХитозанSigma-AldrichC3646для объединения с дцРНК для получения наночастиц
ЭДТАСангонA500895для получения ТАЭ
ЭтанолАладдинE130059получения ТАЭ, или для осаждения дцРНК
Морозильная камераSiemensiQ300для хранения дцРНК или наночастицы
GoTaq Green Master MixPromegaM712для реакции ПЦР
GoTaq qPCR Master MixPromegaA6002для реакции qRT-PCR
Isopropanol АладдинI112011для осаждения дцРНК
NanoDrop Microvolume UV-Vis спектрофотометрThermoFisherOneдля определения концентрации дцРНК
ph-метрSartorius  ПБ-10для приготовления буферов
SanPrep Column PCR Product Purification KitSangonB518141для очистки ПЦР продукта
Sodium acetateSigma-AldrichS2889для получения 100 мМ буфера из ацетата натрия
Sodium sulfate Sigma-Aldrich239313для изготовления 100 мМ буфера сульфата натрия
T7 RiboMAX Express RNAi SystemPromegaP1700для синтеза дцРНК
ThermoMixerEppendorfCдля генерации дцРНК или нагрева наночастиц
TrisSangonA501492для создания TAE
Vortex IKAVortex 3для получения наночастиц хитозана/дцРНК
для

Ссылки

  1. Xia, Q., et al. A draft sequence for the genome of the domesticated silkworm (bombyx mori). Science. 306 (5703), 1937-1940 (2004).
  2. Kawamoto, M., Kiuchi, T., Katsuma, S. Silkbase: An integrated transcriptomic and genomic database for bombyx mori and related species. Database (Oxford). 2022, (2022).
  3. Yokoi, K., Tsubota, T., Jouraku, A., Sezutsu, H., Bono, H. Reference transcriptome data in silkworm bombyx mori. Insects. 12 (6), (2021).
  4. Mita, K., et al. The construction of an est database for bombyx mori and its application. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14121-14126 (2003).
  5. Zhou, Q. Z., Zhang, B., Yu, Q. Y., Zhang, Z. Bmncrnadb: A comprehensive database of non-coding rnas in the silkworm, bombyx mori. BMC Bioinformatics. 17 (1), 370(2016).
  6. Prasad, M. D., et al. Silksatdb: A microsatellite database of the silkworm, bombyx mori. Nucleic Acids Res. 33 (Database issue), D403-D406 (2005).
  7. Ding, S. W. Rna-based antiviral immunity. Nat Rev Immunol. 10 (9), 632-644 (2010).
  8. Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: An overview and future directions. Insect Sci. 20 (1), 4-14 (2013).
  9. Liang, Y., et al. Silencing of the immune gene bmpgrp-l4 in the midgut affects the growth of silkworm (bombyx mori) larvae. Insect Mol Biol. 32 (4), 340-351 (2023).
  10. Tian, H., et al. Developmental control of a lepidopteran pest Spodoptera exigua by ingestion of bacteria expressing dsrna of a non-midgut gene. PLoS One. 4 (7), e6225(2009).
  11. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific rna-mediated interference through ingested double-stranded rna in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002(2001).
  12. Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. Molecular characterization of a cdna encoding extracellular dsrnase and its expression in the silkworm Bombyx Mori. Insect Biochem Mol Biol. 37 (2), 176-183 (2007).
  13. Liu, J., Swevers, L., Iatrou, K., Huvenne, H., Smagghe, G. Bombyx mori DNA/rna non-specific nuclease: Expression of isoforms in insect culture cells, subcellular localization and functional assays. J Insect Physiol. 58 (8), 1166-1176 (2012).
  14. Christiaens, O., et al. Increased rnai efficacy in Spodoptera exigua via the formulation of dsrna with guanylated polymers. Front Physiol. 9, 316(2018).
  15. Dass, C. R., Choong, P. F. The use of chitosan formulations in cancer therapy. J Microencapsul. 25 (4), 275-279 (2008).
  16. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect Mol Biol. 19 (5), 683-693 (2010).
  17. Zhang, X., et al. Chitosan/interfering rna nanoparticle mediated gene silencing in disease vector mosquito larvae. J Vis Exp. (97), e52523(2015).
  18. Sandal, S., et al. Nanoparticle-shielded dsrna delivery for enhancing rnai efficiency in cotton spotted bollworm Earias vittella (lepidoptera: Nolidae). Int J Mol Sci. 24 (11), 9161(2023).
  19. Zhou, H., et al. Chitosan/dsrna polyplex nanoparticles advance environmental rna interference efficiency through activating clathrin-dependent endocytosis. Int J Biol Macromol. 253 (Pt 4), 127021(2023).
  20. Liu, J., et al. Immunological function of bombyx toll9-2 in the silkworm (Bombyx mori) larval midgut: Activation by escherichia coli/lipopolysaccharide and regulation of growth. Arch Insect Biochem Physiol. 116 (4), e22130(2024).
  21. Cheng, L., et al. Characterization of silkworm larvae growth and properties of silk fibres after direct feeding of copper or silver nanoparticles. Mater Design. 129, 125-134 (2017).
  22. Wang, K., et al. Comparison of efficacy of rnai mediated by various nanoparticles in the rice striped stem borer (Chilo suppressalis). Pestic Biochem Physiol. 165, 104467(2020).
  23. Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Chitosan nanoparticles help double-stranded rna escape from endosomes and improve rna interference in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda. Arch Insect Biochem Physiol. 104 (4), e21677(2020).
  24. Qi, J., et al. Rational design of ros scavenging and fluorescent gold nanoparticles to deliver sirna to improve plant resistance to Pseudomonas syringae. J Nanobiotechnol. 22 (1), 446(2024).
  25. Laisney, J., Loczenski Rose, V., Watters, K., Donohue, K. V., Unrine, J. M. Delivery of short hairpin rna in the neotropical brown stink bug, Euschistus heros, using a composite nanomaterial. Pestic Biochem Physiol. 177, 104906(2021).
  26. Terenius, O., et al. Rna interference in Lepidoptera: An overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. J Insect Physiol. 57 (2), 231-245 (2011).
  27. Kolge, H., Kadam, K., Ghormade, V. Chitosan nanocarriers mediated dsrna delivery in gene silencing for Helicoverpa armigera biocontrol. Pestic Biochem Physiol. 189, 105292(2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Lepidoptera

Похожие статьи