Методическая статья

Сравнительный анализ кариотипов популяций травы Lycoris aurea с использованием флуорохромного бандинга и 45S и 5S рДНК-FISH

DOI:

10.3791/67363

⸱

29 ноября 2024 г.

 ,  , 
1Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province, Huaihua University, 2College of Biological and Food Engineering, Hunan University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе исследуется распределение гетерохроматина в восьми популяциях травы Lycoris aurea (L'Her) с использованием комбинированного окрашивания хромосом PI и DAPI, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с областями гена 18S-5,8-26S рРНК (участки 45S рДНК) и зондами 5S рибосомальной ДНК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы понять вариации кариотипов в восьми популяциях, были тщательно установлены подробные кариотипы с использованием хромосомных измерений, флуоресцентных полос и сигналов рДНК FISH. Количество сайтов 45S рДНК колеблется от одной до пяти пар в популяции, при этом наиболее распространенным числом на кариотип является четыре пары. Локус 45S рДНК преимущественно расположен в коротких плечах и концевых областях хромосом, в то время как локус 5S рДНК обнаружен в основном в коротком плече и терминальной или проксимальной областях. Популяции HBWF, HNXN, HBBD и HNZX показали сходное распределение сайтов 45S рДНК, как и GXTL, HBFC и SCLS, что указывает на тесную связь между популяциями с аналогичным распределением сайтов 45S рДНК. Кариотипы всех изученных популяций симметричны, состоят из стабильных и метастабильных центромер или исключительно стабильных центромер. Диаграммы рассеяния MCA и CVCL эффективно различают их кариотипические структуры. Анализ включает в себя шесть количественных параметров (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI). Кроме того, результаты указывают на то, что PCoA, основанный на этих шести параметрах, является надежным методом определения биологических отношений кариотипов среди восьми популяций. Число хромосом в популяциях Lycoris составляет x = 6-8. Основываясь на современных исследованиях и литературе, геномная дифференцировка этих популяций обсуждается с точки зрения размера генома, гетерохроматина, сайтов 45S и 5S рДНК и асимметрии кариотипа.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ликорис – это семейство, включающее в себя несколько важных садовых растений1. Lycoris aurea (L'Hér.) Трава. – традиционное китайское лекарственное растение с многовековой историей. Фитохимический анализ показал, что Lycoris aurea (L'Her.) Трава содержит галантамин и другие алкалоиды, которые могут повышать чувствительность к ацетилхолину и имеют потенциал для лечения болезни Альцгеймера в качестве ингибиторов холинэстеразы2.

Для высших растений анализ кариотипов имеет решающее значение для интеграции генетических и физических карт, что имеет значительные практические последствия для биологии растений. Этот анализ позволяет охарактеризовать геном на хромосомном уровне, прояснить клеточные таксономические отношения между популяциями, выявить генетические аберрации и понять тенденции хромосомной эволюции 3,4,5. Как правило, описание кариотипа включает число хромосом, абсолютную и относительную длину хромосом, места первичного и вторичного сужения, распределение гетерохроматических фрагментов, количество и расположение сайтов рДНК и другие характеристики последовательности ДНК, а также асимметрию кариотипа 6,7,8. Среди параметров кариотипа асимметрия определяется вариациями длины хромосом (межхромосомная асимметрия) и положения центромеры (внутрихромосомная асимметрия). Асимметрия кариотипа является важным признаком, отражающим морфологию хромосом, и широко используется в таксономии растительных клеток 9,10,11,12.

Часто отсутствие хромосомных маркеров ограничивает анализ кариотипа и затрудняет идентификацию отдельных хромосом. В последние годы окрашивание по Гимзе, флуоресцентное полосование и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) стали популярными в хромосомном анализе растений. Двойные методы флуоресцентного окрашивания, такие как окрашивание CMA (хромомицин A3) / DAPI (4, 6-диамино-2-фенилиндол) и окрашивание PI (пропилйодид) / DAPI (известное как окрашивание CPD), выявляют GC-богатые и богатые AT-богатыми гетерохроматическими областями на хромосомах 4,13. Во время метафазы или пахитена митоза растений повторяющиеся последовательности ДНК или длинные сегменты ДНК могут генерировать специфические сигналы в популяциях растений посредством гибридизации FISH 14,15,16.

Флуоресцентные полосы и сигналы FISH обеспечивают полезные маркеры для идентификации хромосом. Измеряя длину хромосом, анализируя характеристики флуоресцентной полосы и сравнивая различия сигналов FISH, можно получить подробные молекулярные цитогенетические кариотипы различных зародышевых плазм растений или популяций. Эти кариотипы эффективно отображают морфологию хромосом в различных зародышевых плазмах или популяциях, что позволяет сравнивать распределение гетерохроматина и локализацию последовательностей ДНК и стимулирует дальнейшие исследования 4,8,17. Сравнение молекулярно-цитогенетических кариотипов может дать ценную информацию о филогенетических отношениях и хромосомной эволюции родственных популяций 8,14,18,19.

Род Lycoris, разнообразная и интригующая группа в семействе Амариллисовые, известен своими многолетними луковицами. Состоящий из примерно 20 видов, 15 из которых являются эндемиками Китая, он демонстрирует богатое биоразнообразие. Этот род встречается исключительно в теплых умеренных и субтропических регионах Восточной Азии, включая юго-западный Китай, южную Корею и Японию, с несколькими популяциями, простирающимися до северной Индии и Непала. Ранние цитогенетические исследования в основном включали подсчет хромосом для установления основного числа хромосом рода и описания морфологии хромосом в конкретных популяциях, уделяя основное внимание Lycoris radiata21. Общее число хромосом, наблюдаемое в этом роде, колеблется от 12 до 33 или 44, представляя диплоидный, аномальный диплоидный, триплоидный, тетраплоидный и анеуплоидный уровни соответственно. Основные числа хромосом, x, 6, 7, 8 и 11.

Lycoris aurea (L'Hér.) Трава, известный вид из рода Lycoris , широко распространена по всему Китаю22. Он процветает в спокойной, влажной среде и размножается с помощью небольших луковиц. Эти луковицы, содержащие ликорин и галантамин – два ключевых лекарственных соединения – использовались в традиционной китайской медицине на протяжении веков. Lycoris aurea также очаровывает садоводов своими яркими красными цветами осенью и вечнозелеными листьями зимой. Тем не менее, морфологическое сходство у всех изученных Lycoris aurea (L'Hér.) Популяции трав представляют собой значительную проблему для хромосомной идентификации с использованием традиционных цитологических методов.

Клонирование FISH, фосмида или BAC (бактериальных искусственных хромосом) с повторяющимися последовательностями ДНК и олигонуклеотидными зондами на метафазных или пахидерматозных хромосомах использовалось для анализа кариотипов23,24,25, сравнительного цитогенетического анализа26,27, построения цитогенетической карты28,29 и хромосомно-специфических анализов30. Недавно метод FISH был применен для хромосомного анализа популяций Lycoris 31. Несмотря на то, что число хромосом и кариотип варьируются в популяциях Lycoris, общее число хромосом остается постоянным, при этом наблюдаются три основных типа: центральная центромерная хромосома (M-), дистальная центромерная хромосома (T-) и проксимальная центромерная хромосома (A-). Кроме того, различные формы и размеры хромосом наблюдаются в природных популяциях32.

Флуоресцентная РНК-гибридизация in situ (FISH) полезна для обнаружения хромосомных изменений, таких как слияние центромер, инверсия, амплификация генов и делеция фрагментов. Технология флуоресцентной гибридизации in situ (RNA-FISH) позволяет проводить визуальный анализ хромосом с высоким разрешением для обнаружения и идентификации множественных сложных изменений, включая слияние центральных областей хромосом, образование новых хромосомных структур, инверсию хромосомных областей, амплификацию генов или фрагментов генов, а также потерю последовательности генов наопределенных участках хромосом.. Пять из 500 клонов показали сильные сигналы FISH в области центромеры центральной центромеры хромосомы (M-), но не в дистальном отделе центромеры хромосомы (T-)34. Уникальная картина распределения сигнала FISH на каждой хромосоме позволила идентифицировать отдельные хромосомы, что ранее было сложно в популяциях Lycoris при использованиитрадиционных методов окрашивания. В настоящее время существует несколько исследований по молекулярной цитогенетике Lycoris aurea (L'Hér.) Херб, подчеркнув острую необходимость дальнейших исследований в этой области.

В этом исследовании были исследованы восемь хорошо дифференцированных метафазных хромосом Lycoris aurea (L'Hér.) Популяции трав готовили с использованием методов ферментной иммерсии и огневой сушки (ЭМП). Для идентификации FISH использовали окрашивание CPD и зонды 45S и 5S рДНК. Детальные молекулярно-цитогенетические кариотипы этих популяций были построены с использованием комбинированных данных хромосомных измерений, флуоресцентных полос и сигналов 45S и 5S рДНК FISH. Для каждой популяции были рассчитаны шесть различных индексов кариотипической асимметрии, чтобы выявить кариотипические отношения между ними. Оценка данных молекулярного цитогенетического кариотипа позволила получить значительное представление о геномной дифференцировке и эволюционных отношениях восьми популяций, потенциально изменив понимание хромосом Lycoris .

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Реагенты и оборудование, использованные в этом исследовании, подробно описаны в Таблице материалов, а используемые зонды представлены в Дополнительном файле 1.

1. Препарирование апикальных хромосом

  1. Приживаются при помощи гидропоники. После удаления надземной части луковицы поместите ее в коническую бутылку, наполненную водой, заменяя воду каждые 3 дня, следуя методу, описанному в Song et al.35.
  2. Вырезайте активно растущие кончики корней, когда они достигнут примерно 1,0-2,0 см в длину, и обработайте их насыщенным α-бромнафталином при температуре 28 °C в течение 1,0 ч.
  3. Обрежьте кончики корней примерно до 1 см и поместите их в свежеприготовленную смесь метанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1 при комнатной температуре (около 20-25 °C) на 2-3 часа. Затем храните их в холодильнике при температуре 4 °C, как описано в She et al.36.
  4. Неподвижные кончики корней (2-3 мм) тщательно промойте в воде двойной дистилляции.
  5. Приготовьте смесь целлюлазы и пектингидролазы в 0,01 мМ буфере цитрата лимонной кислоты и натрия при рН 4,5, с целлюлазой и пектингидролазой по 1%. Поместите в смесь предварительно обработанные кончики корней и варите при температуре 28 °C в течение 1,0-1,5 ч.
  6. Вываренные кончики корней промойте дважды дистиллированной водой, переложите их на предметное стекло и тщательно разомните фиксатором с помощью тонкозаостренных щипцов.
  7. Сушите горки над пламенем спиртовой лампы до тех пор, пока водяной туман просто не исчезнет. Под фазово-контрастным микроскопом выберите предметные стекла с более чем пятью расщепленными фазами и без перекрывающихся хромосом. Храните предметные стекла при температуре -20 °C для дальнейшего использования.

2. Окрашивание CPD

  1. Приготовьте раствор CPD, добавив PI и DAPI в антифлуоресцентный аттенюатор с 30% (v/v), где концентрация PI составляет 0,6 мкг·мл-1 , а концентрация DAPI — 3 мкг·мл-1.
  2. Высушите предметное стекло хромосомой при температуре 65 °C в течение 30 минут.
  3. Добавьте 100 мкл разбавителя РНКазы А (раствор для хранения РНКазы А, разбавленный в 100 раз 2x SSC (цитратом натрия физиологического раствора), в результате чего конечная концентрация составит 100 мкг/мл) на предметное стекло хромосомы. Накройте предметное стекло крышкой и прогрейте его во влажной камере при температуре 37 °C в течение 30-60 минут.
  4. Промойте предметное стекло с помощью 2x SSC при комнатной температуре в течение трех интервалов по 5 минут каждый.
  5. Промойте предметное стекло хромосомы при комнатной температуре в течение 1-2 минут.
  6. Добавьте 200 мкл разбавителя пепсина (раствор для хранения пепсина, разбавленный в 100 раз 0,01 Н HCl для достижения конечной концентрации 5 мкг/мл) на предметное стекло хромосомы. Накройте предметное стекло и выдержите его во влажной камере при температуре 37 °C в течение 5-20 минут.
  7. Промыть участки хромосомы ультрачистой водой комнатной температуры в течение 2 мин с последующей промывкой 2 xSSC при комнатной температуре в течение двух интервалов по 5 мин каждый.
  8. Зафиксируйте предметные стекла раствором метанола: ледяной уксусной кислоты (3:1) на 10 мин.
  9. Умыть 2x SSC при комнатной температуре в течение трех интервалов по 5 минут каждый.
  10. Обработайте 70%, 95% и 100% этанолом при температуре -20 °C в течение 5 минут каждый, затем высушите при комнатной температуре.
  11. Возьмите обработанные и высушенные предметные стекла хромосомы, добавьте 30 μл раствора для окрашивания CPD на каждое предметное стекло, накройте покровным стеклом размером 24 мм x 50 мм и задержите в темноте более 30 минут. Обширный хромосомный материал следует окрашивать на ночь.
  12. Наблюдайте за предметными стеклами хромосом под флуоресцентным микроскопом, используя зеленый фильтр возбуждения (WG) для окрашивания PI и ультрафиолетовый фильтр (UV) для окрашивания DAPI. Делайте снимки с помощью совместимого программного обеспечения.
    1. Отрегулируйте время экспозиции с помощью двух фильтров, чтобы добиться одинаковой интенсивности красной и синей флуоресценции во время съемки. Изображение CPD получается из изображений в оттенках серого, окрашенных PI и DAPI. Измерения хромосом и обработка изображений проводились с помощью программного обеспечения Adobe Photoshop.

3. Флуоресцентная гибридизация in situ

  1. Приготовьте гибридный раствор: FAD (10 μL), ssDNA (2 μL), 20× SSC (2 μL), 5S рДНК (1 μL), 45S рДНК (1 μL) и 50% сульфат глюкана (4 μL). После приготовления центрифугируйте гибридный раствор (2500 х г, 5-10 минут, при комнатной температуре) и поместите его на лед.
  2. Поместите отсканированные предметные стекла в духовку при температуре 65 °C на 30-60 минут.
  3. Снимите обожженные предметные стекла, добавьте 100 μл 70% раствора для денатурации FAD, накройте покровным стеклом и денатурируйте в печи для молекулярной гибридизации при температуре 85 °C в течение 2,5 минут.
  4. Снимите покровное стекло и немедленно погрузите предметные стекла в 70%, 90% и 100% холодный этанол, последовательно обезвоживая на 5 минут каждая.
  5. Снимите предметные стекла и дайте им высохнуть при комнатной температуре более 30 минут.
  6. Добавьте в предметное стекло 20 μл гибридного раствора, аккуратно поместите сверху покровное стекло до полного распыления жидкости и оставьте при комнатной температуре на 10 минут, чтобы увлажнить покрытую область предметного стекла.
  7. Поместите предметные стекла в гибридную посуду, пропитанную 2× SSC (гибридная чашка должна быть большой чашкой Петри с крышкой, обернутой в фольгу, чтобы облегчить работу вдали от света) и выдерживайте при температуре 37 °C в течение ночи (не менее 6 часов).
  8. Уравновесьте хромосомы, добавив в них 3 мкг·мл-1 DAPI в 30% (v/v) раствор Vectashield H-100. Захватите изображение с помощью совместимого программного обеспечения, при этом синяя флуоресценция DAPI возбуждается фиолетовым светом фильтра, а красная флуоресценция PI — зеленым светом, соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гибридизацию FISH проводили с использованием зондов 45S и 5S рДНК на ранее окрашенных CPD предметных стеклах, следуя методу, описанному в She et al.36.

4. Анализ кариотипов

  1. Выберите пять метафазных митотических клеток для каждой популяции, в которой хромосомы хорошо диспергированы (без перекрытия) и умеренно конденсированы (хромосомы не должны быть максимально агрегированы, но и концы не должны быть сгруппированы), следуя методологии, описанной She et al.4.
  2. Определите абсолютную длину каждой хромосомы, выбрав пять хромосом с наибольшей концентрацией во время деления клетки.
  3. Тщательно и точно измерьте длину длинного плеча (L) и короткого плеча (S) каждой хромосомы, а также размер каждой флуоресцентной пигментной полосы на хромосоме.
  4. Рассчитайте следующие параметры: (1) относительная длина хромосомы (RL, гаплоидный процент); (2) отношение рук (AR = L/S, длинная рука/короткая рука); (3) общая длина гаплоидной хромосомы (TCL; длина кариотипа); (4) средняя длина хромосомы (С); (5) размер флуоресцентной полосы (процентное соотношение флуоресцентной полосы к длине хромосомы); (6) расстояние от центромеры до сайта рДНК; (7) средний индекс центромеры (ДИ, рассчитываемый как деление длины короткой руки каждой хромосомы на общую длину этой хромосомы, а затем усреднение этих значений); (8) четыре различных показателя асимметрии кариотипа, включая индекс центромеры (CVCI), коэффициент вариации (CV), коэффициент вариации длины хромосомы (CVCL), средний коэффициент асимметрии центромеры (MCA) и категорию асимметрии Стеббинса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к методам Paszko10 и Peruzzi et al.11 для расчета индекса асимметрии. Классифицируйте хромосомы с различными соотношениями плеч в соответствии с пятью методами классификации Левана. Расположить хромосомы Lycoris aurea (L'Hér.) Трава в порядке убывания длины, как описано в протоколе Han et al.37.
  5. Обеспечьте точность и аккуратность методики путем построения шаблонов хромосомного кариотипа на основе данных измерений хромосом в сочетании с информацией о флуоресцентной полосе, а также о положении и размере рДНК-FISH.
  6. Визуализация асимметричных отношений кариотипа восьми популяций является ключевым шагом, который дает четкое понимание. Это достигается за счет двумерных диаграмм рассеяния, которые используются для получения их MCA и CVCL.
  7. Выполните анализ главных координат (PCoA) с использованием коэффициента подобия Гауэра, являющегося важнейшей составляющей, в соответствии с методами Ше и др.38.
  8. Рассчитайте шесть количественных параметров (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI) для определения цитогенетических кариотипов восьми популяций.
  9. Проводите статистический анализ с помощью программы анализа и визуализации данных для создания дендрограммы на основе UPGMA и диаграммы рассеяния PCoA.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С помощью тщательного метода ферментной иммерсии и пламенной сушки (EMF) были получены рассеянные и хорошо дифференцированные метафазные хромосомы Lycoris aurea (L'Hér.) Была получена трава и сконструирован цитогенетический хромосомный кариотип Lycoris aurea (рис. 1). Метафазные хромосомы с самой высокой степенью конденсации непригодны для анализа кариотипов из-за уменьшенных морфологических различий. Однако, поскольку общая длина гаплоидных хромосом (ТКЛ) сопоставима между популяциями, дифференциация кариотипов разных популяций Lycoris aurea возможна путем сравнения различий в значениях ТКЛ. Характеристики кариотипа и содержание ядерной ДНК восьми популяций Lycoris aurea представлены в таблице 1. Распределение полос флуоресценции и расположение сайтов 45S и 5S рДНК представлены в таблице 2. На рисунке 2 показаны измерения хромосом вместе с характеристиками флуоресцентной полосы, а также расположение и размер сигналов 45S и 5S рДНК FISH.

Цифры диплоидных хромосом следующие: 2n = 16 = 8m + 8t для GXTL, 2n = 14 = 8m + 6t для HBFC, 2n = 14 = 8m + 6t для GZDS, 2n = 16 = 6m + 10t для HNZX, 2n = 14 = 8m + 6t для HBBD, 2n = 14 = 8m + 6t для HNXN, 2n = 16 = 6m + 10t для HBWF, и 2n + 1 = 15 = 7m + 8t для SCLS (Таблица 1). Как описано в протоколе She et al.4, метафазные хромосомы восьми популяций L. aurea невелики, со средней длиной хромосом от 1,01 мкм (HNZX) до 2,08 мкм (GZDS) и TCL от 16,14 мкм (HNZX) до 29,13 мкм (GZDS). TCL восьми популяций коррелируют с зарегистрированным содержанием ядерной ДНК (табл. 1). Наименьший диапазон относительных длин (RRL) наблюдается у HNXN (1,52-3,81), в то время как наибольший наблюдается у GZDS (2,73-5,86). Популяции HNXN и GZDS показали наименьшую и наибольшую вариацию длины хромосом соответственно. Средний индекс центромеры (ДИ) генома варьировал от 61,02 ± 5,63 (популяционный HBWF) до 70,70 ± 4,63 (популяционный HBWF). Популяция HBFC показала наименьшее изменение индекса центромеры, тогда как популяция HBWF продемонстрировала наиболее обширные изменения.

Кариотипы состоят из метацентрических (m) и телоцентрических (t) хромосом (табл. 1; Рисунок 2), представляющий наиболее распространенные формы хромосом среди восьми изученных популяций. Восемь различных индексов асимметрии кариотипа представлены в таблице 1. Среди этих индексов коэффициент вариации индекса центромеры (CVCI) и средняя центромерная асимметрия (MCA) характеризуют внутрихромосомную асимметрию, в то время как коэффициент вариации длины хромосомы (CVCL) измеряет межхромосомную асимметрию. Диапазоны для CVCI и MCA следующие: CVCI = от 10,97 (HBBD) до 18,25 (HBWF), а MCA = от 28,85 (HNZX) до 39,30 (HBWF). Эти значения неизменно указывают на то, что HBBD имеет самую низкую, а HBWF — самую высокую внутрихромосомную асимметрию. Диапазон для CVCL составляет от 14,98 (GZDS) до 23,32 (HBWF), что позволяет предположить, что GZDS демонстрирует наименее асимметричный кариотип, в то время как HBWF демонстрирует наиболее асимметричный кариотип среди восьми популяций. Согласно принципам классификации Стеббинса9, эти кариотипы относятся к классу 1В, что указывает на то, что все изученные популяции имеют относительно симметричные кариотипы.

Отношения асимметрии кариотипа среди восьми видов Lycoris aurea (L'Hérit.) Популяции трав проиллюстрированы с помощью двумерных диаграмм рассеяния CVCI в сравнении с CVCL и MCA в сравнении с CVCL (рис. 3). Структура кариотипа этих популяций, как показывают три пары параметров — CVCI, CVCL и MCA, — имеет значительные последствия. Эти параметры демонстрируют сходную асимметрию кариотипа. Результаты диаграмм рассеяния подчеркивают потенциальное влияние исследования, показывая, что популяция HNXN имеет наиболее симметричный кариотип, в то время как популяции HBFC и HBWF демонстрируют наибольшую внутрихромосомную и межхромосомную асимметрию соответственно (рис. 3).

В этом исследовании восемь популяций Lycoris aurea были тщательно классифицированы на три основные группы на основе древовидной диаграммы UPGMA с пятью параметрами кариотипа (рис. 4). Первый кластер, представленный популяцией SCLS, образует самостоятельную кладу. Вторая группа состоит из HNXN и HBWF. Третий кластер разделен на две подгруппы: одна содержит только популяцию HBWF, в то время как другая включает популяции HBWF, GZDS и GXTL, при этом популяции HBBD и GZDS кластеризуются в более мелкой ветви. Кариологические взаимосвязи между исследуемыми популяциями, выявленные с помощью анализа главных координат (PCoA), проиллюстрированы на рисунке 5. Диаграмма рассеяния PCoA показывает, что восемь популяций можно разделить на две группы с уровнем достоверности 68,36%. Первая группа включает HBWF, HBBD и GXTL, причем первые три популяции тесно концентрируются вместе. Вторая группа состоит из HBFC, HNXN, HNZX и SCLS, где HBFC занимает среднее положение между двумя группами, а SCLS расположен наиболее изолированно (рис. 5).

Обратное окрашивание CPD (комбинация йодида пропидиума и DAPI) и DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол) являются стандартными методами, используемыми для наблюдения за структурой ядра и распределением хроматина. Результаты этого исследования выявили очевидные гетерохроматиновые явления среди восьми популяций Lycoris aurea (L'Hérit.) Трава (Рисунок 1 и Рисунок 2; Таблица 2). Результаты гибридизации FISH для каждой популяции показали, что все хромосомные участки соответствуют локусам 45S и 5S рДНК. Характеристики полос CPD проиллюстрированы на рисунке 1A, C, E, G, I, K, M, O.

В популяциях HBFC и HBBD полосы CPD наблюдались в центромерных и перицентромерных областях (рис. 1G,K; Рисунок 2D, F). Тем не менее, некоторые хромосомы не демонстрировали полосы CPD: 3-я и 8-я хромосомы в SCLS, 1-я хромосома в HNXN, 1-я хромосома в HNZX, 1-я хромосома в HBWF, 2-я хромосома в GZDS и 2-я хромосома в GXTL (рис. 1A,C,E,I,J,M,O; Рисунок 2A-C,E,G,H). Примечательно, что полосы CPD также были обнаружены на концах коротких плеч хромосомных пар 5, 6 и 7 у SCLS и HNXN, на парах 4, 5, 6, 7 и 8 у HNZX и на парах 5, 6 и 7 у HBFC. Кроме того, полосы CPD присутствовали на концах коротких плеч хромосом 4, 5, 6, 7 и 8 у HBWF, на концах коротких плеч хромосом 5, 6 и 7 у HBBD и на концах коротких плеч хромосом 5, 6, 7 и 8 у GXTL (рис. 1A и рис. 2A).

После FISH-гибридизации методом обратного окрашивания DAPI образовались яркие флуоресцентные полосы вокруг центрических частиц хромосом 5, 6 и 7 в GZDS. Эти полосы, называемые полосами DAPI+ после FISH, указывают на то, что эти гетерохроматиновые области содержат большое количество пар оснований A-T (рис. 2G). Диапазон (пери)центромерных полос CPD, наблюдаемых в восьми популяциях, составлял от 25,00% до 57,14% (Таблица 2), в то время как общее количество терминальных полос CPD варьировалось от 40,00% до 71,43% (Таблица 2). В популяционных GZDS полосы после FISH DAPI+ коррелировали с длиной кариотипа, составляя 42,86% от общего числа. Размеры полос CPD рДНК, полос CPD без рДНК и полос DAPI+ после FISH значительно различались среди различных пар хромосом Lycoris aurea (L'Hérit). Трава (Рисунок 2; Таблица 2).

Метод FISH был использован для вставки зондов 45S и 5S рДНК в хромосомы, окрашенные CPD, как показано на рисунке 1. Краткая информация о количестве и расположении сайтов 45S и 5S рДНК в восьми популяциях Lycoris aurea (L'Hérit.) Трава представлена в таблице 2 и изображена на рисунке 2. Примечательно, что значительные различия в количестве, размере и расположении локусов рДНК среди восьми популяций подчеркивают важность этих результатов. В общей сложности было 30 локусов 45S рДНК в восьми популяциях. Из них 4 локуса (13,33%) были расположены в центральной области центромеры, 9 (30,00%) — в ближней центральной области центромеры и 17 (56,67%) — в терминальных областях соответствующих хромосомных плеч (рис. 2; Таблица 2).

В популяции GXTL один сигнал локуса 45S рДНК был обнаружен в области центромеры короткого плеча хромосомы 4, в то время как четыре дополнительных сигнала были расположены в области центромеры длинных плеч хромосом 5, 6, 7 и 8 (рис. 1P; Рисунок 2G). В популяции HBFC один локус 45S рДНК был расположен в области центромеры на коротком плече хромосомы 4, а три локуса были обнаружены в перицентромерных гетерохроматиновых областях на коротких плечах хромосом 5, 6 и 8 (рис. 1H; Рисунок 2D). В популяции GZDS локус 45S был расположен в области центромеры короткого плеча метацентрической хромосомы 4 (рис. 1N; Рисунок 2G). У HNZX пять локусов 45S рДНК наблюдались в терминальных областях коротких плеч хромосомных пар 4, 5, 6, 7 и 8 (рис. 1H; Рисунок 2D). Распределение сайтов 45S в HBBD (рис. 1J; Рисунок 2E) и HNXN (рис. 1L; Рисунок 2F) был аналогичным, с одним локусом в области центромеры короткого плеча хромосомы 4 и тремя локусами в области центромеры коротких плеч хромосом 5, 6 и 7.

При HBWF пять сигналов локусов 45S рДНК появлялись в центромерных областях короткого плеча хромосомных пар 4, 5, 6, 7 и 8 (рис. 1N; Рисунок 2G). При SCLS один сигнал локуса 45S рДНК был обнаружен в центромерных областях с короткими плечами хромосомных пар 1 и 2, а также в перицентромерных областях коротких плеч хромосомных пар 5 и 6 (рис. 1P; Рисунок 2H). Для локусов 5S рДНК было идентифицировано в общей сложности девять по восьми таксонам, из которых 3 (33,33%) расположены в проксимальных областях, 3 (33,33%) в перицентромерных областях и 3 (33,33%) в терминальных областях соответствующих хромосомных плеч (рис. 2; Таблица 2). В GXTL один сигнал локуса 5S рДНК появился вблизи конечного конца длинного плеча хромосомной пары 6 (рис. 1P; Рисунок 2G). Распределение сайтов 5S было аналогичным при ГБФУ (рисунок 1H; Рисунок 2D) и GZDS (рисунок 1N; Рисунок 2G), оба содержат по одному локусу 5S рДНК в проксимальной области короткого плеча хромосомы 7. У HNZX локус 5S рДНК был обнаружен вблизи конечного конца длинного плеча хромосомы 8 (рисунок 1H; Рисунок 2D), в то время как при HBBD локус 5S рДНК был идентифицирован в хромосоме 7 (рисунок 1J; Рисунок 2E). В HBWF два локуса 5S рДНК появились вблизи конечного конца длинных плеч хромосом 4 и 8, еще два в длинном плече хромосомы 7, один в области центромеры и один ближе к концу (рисунок 1N; Рисунок 2G).

Комбинация сигналов 45S и 5S рДНК FISH, наряду с характеристиками терминального сегмента CPD, эффективно дифференцировала все митотические хромосомы из разных популяций Lycoris aurea (L'Hérit). Трава. В популяциях SCLS, HBFC, HBBD, GZDS и GXTL хромосома 1 демонстрировала сильные сигналы CPD в центромерной области. Хромосома 2 демонстрировала сильные сигналы CPD в центромерной области, за исключением GZDS и GXTL. Хромосома 3 показала сильный сигнал CPD в центромерной области, за исключением SCLS. Хромосома 4 последовательно демонстрировала сильные сигналы CPD в центромерной области. Для хромосом 5, 6 и 7 сильные сигналы CPD наблюдались на концах коротких плеч. Хромосома 4 также показала сильные сигналы 45S рДНК на конце короткого плеча, в то время как хромосомы 5 и 6 имели сильные сигналы 45S в своих концевых областях, за исключением GZDS. Примечательно, что сильный сигнал DAPI присутствовал в популяции GZDS. Кроме того, слабый сигнал 5S рДНК появлялся в проксимальном отделе хромосомы 7 в популяциях HBFC, HBWF, HBBD и GZDS.

figure-results-1
Рисунок 1: Митотические хромосомы восьми Lycoris aurea (L' Hér.) Популяции трав. Исследование митотических метафазных хромосом из восьми различных Lycoris aurea (L' Herit.) Показаны популяции трав, включая популяцию SCLS (A,B), популяцию HNXN (C,D), популяцию HNZX (E,F), популяцию HBFC (G,H), популяцию HBWF (I,J) и популяцию HBBD (K,L). Гибридизацию GZDS (M,N) и GXTL (O,P) проводили с использованием FISH с зондами 45S, меченными биотином, и 5S рДНК, меченными дигоксином, после окрашивания CPD. Полученные изображения хромосом после окрашивания CPD отображают сигналы 45S (зеленый) и 5S (красный) рДНК. Общая ДНК была перекрашена красителем DAPI, в результате чего получила синий цвет. Масштабные линейки = 10 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Диаграммы хромосомного кариотипа восьми Lycoris aurea (L' Hér.) Популяции трав. Диаграмма хромосомного рисунка для восьми популяций Lycoris aurea (L' Herit.) Herb раскрывает характеристики флуоресцентной полосы, а также расположение и размер сигналов 45S и 5S рДНК FISH. Популяции SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS и GXTL представлены (A-H) соответственно. Ординатная шкала указывает на относительную длину хромосомы (процентное соотношение этой хромосомы в гаплоидном геноме), а число вверху указывает на порядковый номер хромосомы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Диаграммы рассеяния для восьми Lycoris aurea (L' Hér.) Популяции трав основаны на трех параметрах кариотипа. (A) Индекс CVCI строится относительно индекса CVCL. (B) Индекс MCA строится относительно индекса CVCL. Обозначены популяции SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS и GXTL. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Дендрограмма UPGMA восьми Lycoris aurea (L' Hér.) Популяции трав. Дендрограмма UPGMA основана на параметрах x, 2n, TCL, MCA, CVCL и CVCI для восьми Lycoris aurea (L' Hér.) Популяции трав: SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS и GXTL. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: PCoA восьми Lycoris aurea (L' Hér.) Травянистые сорта основаны на шести параметрах кариотипа. PCoA основан на параметрах x, 2n, TCL, MCA, CVCL и CVCI, представляющих SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS и GXTL. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Названия восьми Lycoris aurea (L' Hér.) Популяции трав. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Распределение флуорохромных полос и сайтов рДНК в восьми Lycoris aurea (L' Hér.) Популяции трав. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный файл 1: Зонды, использованные в этом исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Приготовление Lycoris aurea (L'Hér.) Хромосомы корней трав включают в себя несколько важнейших этапов: (1) культивирование корней с помощью гидропоники, (2) обработка кончиков корней насыщенным α-бромонафталином, (3) фиксация корней с помощью спирто-уксусного раствора, (4) выполнение ферментативного гидролиза кончиков корней с помощью ферментного раствора и (5) тщательное раздавливание переваренных корней и сушка стекол на пламени спиртовой лампы.

Точное измерение хромосом имеет важное значение для анализа кариотипа в цитогенетических исследованиях. Хромосомы должны демонстрировать заметную конденсацию и четко очерченные границы; В противном случае точный расчет параметров хромосом становится сложной задачей5. Предыдущие цитогенетические исследования показали, что морфологическая дифференцировка митотических хромосом зависит от степени конденсации 4,36. Когда конденсация недостаточна, концы плеч хромосом все еще могут быть деагглютинированы, что приводит к неясным границам хромосом. Однако, когда хромосомы достигают максимальной конденсации, морфологические различия между хромосомами уменьшаются. Таким образом, выбор хромосом с умеренной конденсацией имеет решающее значение для идентификации и измерения хромосом, особенно в популяциях с меньшим количеством хромосом.

Зондовая маркировка имеет решающее значение для успешной гибридизации FISH in situ, особенно для зондового решения 5S рДНК. Из-за короткой последовательности 5S рДНК концентрация последовательностей-мишеней, меченных методом ПЦР, обычно низкая, что приводит к слабым сигналам гибридизации. Однако прямой синтез меченых флуоресцеином зондов дает более сильные сигналы гибридизации и упрощает процесс. Для зондового раствора 45S рДНК частичные последовательности из 5,8S, 18S и 25S рРНК, кодирующих участки Arabidopsis thaliana , были помечены на 5' и 3' концах 6-карбоксил-тетраметилролрамином (TAMRA) и затем смешаны. Раствор зонда флуоресцеина 5S рДНК был получен с использованием последовательностей нуклеотидов 1-59 и 60-118 из кодирующей области гена 5S рРНК Arabidopsis , причем каждая последовательность была помечена на 5'-конце 6-карбоксильным флуоресцеином (6-FAM), а затем смешана.

В этом исследовании мы использовали различия между красителями DAPI и PI в связывании ДНК и объединили их для получения четких флуоресцентных полос. Красители PI (йодид пропидия) могут проникать через клеточные мембраны и связываться с молекулами ДНК внутри клеток. Напротив, DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол) преимущественно связывается с областями ДНК, богатыми АТ, обеспечивая прозрачное высококонтрастное окрашивание. Благодаря этим взаимодополняющим свойствам, DAPI и PI часто используются вместе, что известно как окрашивание CPD, для одновременного сбора информации как о ядре, так и о цитоплазме. Различия в наличии, расположении и размере полос CPD и DAPI+ выявили значительную дифференцировку гетерохроматина в восьми популяциях Lycoris aurea. Окрашивание CPD показало участки гетерохроматина, богатые содержанием GC как в центромерной и перицентромерной областях, так и в телоцентрических хромосомах.

Изучение асимметрии кариотипа является популярным, доступным и широко используемым цитогенетическим таксономическим подходом, который включает в себя ряд параметров и показателей, включая как качественные, так и количественные показатели, параметры классификации Стеббинса и различные количественные показатели (например, Paszko10; Peruzzi et al.11). Среди них отношение R и CVCL используются для измерения хромосомной асимметрии, в то время как CVCI и MCA представляют собой ключевые показатели хромосомной асимметрии. Примечательно, что CVCL считается надежным статистическим параметром для оценки межхромосомной асимметрии10, а метрика хромосомной асимметрии (MCA) признана эффективной мерой для оценки внутрихромосомной асимметрии11. Чтобы наилучшим образом представить асимметрию кариотипов между популяциями, рекомендуется использовать двумерную диаграмму рассеяния с двумя оценками асимметрии, размещенными на осях x и y, соответственно, где каждая выборка представлена в виде точки11,12. Результаты показали, что двумерные диаграммы рассеяния CVCL в зависимости от CVCI, а также MCA vs. CVCL, эффективно иллюстрируют отношения асимметрии кариотипа между восемью различными популяциями Lycoris aurea (L'Herit.) Herb, поддерживая надежность этих индексов при оценке хромосомной асимметрии.

Для сравнения кариотипов и реконструкции кариологических отношений между восемью популяциями в данном исследовании применялась методология, предложенная Peruzzi et al.11, с использованием параметров x, 2n, TCL, MCA, CVCL и CVCI. Полученные данные показали, что популяции HBWF, GZDS, HBBD и GXTL тесно связаны, причем HBFC находится между этими группами. Следовательно, PCoA, основанный на этих шести параметрах, оказался высокоэффективным методом дифференциации отношений между восемью популяциями. Тем не менее, некоторые сложные паттерны также возникли из построенного молекулярного эволюционного дерева. Например, в то время как HNZX оказался тесно связанным с HBWF в молекулярном филогенетическом дереве, он был более отдаленным родственником на диаграмме рассеяния PCoA. Такая сложность подчеркивает важность использования нескольких количественных подходов для прогнозирования тенденций эволюции кариотипов в Lycoris, дополняя характеристики молекулярной классификации.

Образцы растений для этого исследования были взяты из центрального и западного Китая, включая уезд Тяньлинь, провинция Гуанси (GXTL), уезд Фан, провинция Хубэй (HBFC), уезд Душань, провинция Гуйчжоу (GZDS), уезд Цзысин, провинция Хунань (HNZX), уезд Бадун, провинция Хубэй (HBBD), уезд Синьнин, провинция Хунань (HNXN), уезд Уфэн, провинция Хубэй (HBWF) и уезд Лушань провинции Сычуань (SCLS). Образец ваучера сохранился в гербарии Университета Хуайхуа. Это исследование показало, что комбинация сигналов 45S и 5S рДНК FISH и характеристик терминального сегмента CPD эффективно отличает все митотические хромосомы из разных популяций Lycoris aurea (L'Herit). Трава. Представленный здесь протокол направлен на исследование распределения гетерохроматина среди различных популяций Lycoris aurea (L'Herit.) Трава. Обратное окрашивание CPD (комбинация PI и DAPI) и DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол) являются установленными методами наблюдения за структурой ядра и распределением хроматина. Прямое флуоресцентное мечение участков гена 18S-5,8-26S рРНК (участки 45S рДНК) и 5S рибосомальной ДНК для гибридизации хромосом FISH является простым и обеспечивает надежные сигналы гибридизации. Это качественное различие будет становиться все более ценным при анализе различных популяций.

Этот метод лучше всего подходит для видов растений, способных к быстрой культивации кончика корня, так как культура кончика корня нужна во время активного митоза. Из-за короткой последовательности 5S в качестве зонда 5S рДНК использовалась последовательность нуклеотидов 1-118.н. области, кодирующей ген 5S рРНК Arabidopsis thaliana . Из-за своей короткой последовательности и слабого сигнала этот метод эффективен только для идентификации видов с относительно консервативными основаниями в области 1-118.о. гена 5S рРНК. Выбор метафазных хромосом с умеренной конденсацией имеет решающее значение для успеха метода. Конденсация хромосом тесно связана со сроками сбора корней, продолжительностью предварительной обработки и обжигом в огне. Таким образом, методика требует точного контроля над каждым этапом, чтобы обеспечить успех эксперимента.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Фондом естественных наук Китая (32070367).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АлкогольСангон Биотех (Шанхай) Ко., Лтд.A500737-0005(70%,  90%,  100%)
1&раз; TNTSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481081×, 10×
2&раз; SSCSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481092×, 20×
45S  рДНКСангон Биотех (Шанхай) Ко., Лтд.TAMRA добавляется на оба конца (5'- и 3'-концы)
4'6-диамидино-2-фенилиндол(DAPI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E60730320мл
5S  рДНКСангон Биотех (Шанхай) Ко., Лтд.5 'end plus 6-FAM(FITC)
Программное обеспечение Adobe PhotoshopAdobe Systems IncorporatedCS6
Alpha бром-нафталинSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A602718Сатурирующий
агент против выгоранияSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Vectashield H-100010 мл
Биохимический инкубаторShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTDLRH-70
CellulaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42606810 г
лимонной кислотыSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A50170210 г
деионизированного формамида (FAD)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600211-05000,7
Декстрана сульфатSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42822910 мл
Прибор для флуоресцентной гибридизации in situAbbott ThermoBriteS500-24
Olympus  Китай  Co.ltdBX60
Ледяная уксусная кислотаSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A501931500 мл
HClРеагент Аладдин Co. Ltd. (Шанхай)H399657500 мл
ЛьдогенераторDan Ding Shanghai International Trade Co., Ltd.ST-70
Биологический микроскоп LeicaГермания Leica Instrument Co., LTDDM6000B
Метиловый спиртSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A601617500 мл
программного обеспечения MetMorphМолекулярные приборыверсии 7.35
ПечьThermo Scientific™ Heratherm™THM#51028152
PectinaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A00429710 г
PepsinSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.1.07185100 г
Пропидиум йодид(PI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A4252591 г
РНКазыASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.R464210 мг
ДНК спермы лосося(ssDNA)Реагент Аладдин Co. Ltd. (Шанхай)D1198711 г
цитрата натрияРеагент Аладдин Co. Ltd. (Шанхай)S18918310 г
Statistica для Windows 10.0 для статистического анализа
США/Флуоресцентный микроскоп

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heywood, V., Casas, A., Ford-Lloyd, B., Kell, S., Maxted, N. Conservation and sustainable use of crop wild relatives. Agric Ecosyst Environ. 121 (3), 245-255 (2007).
  2. Rong, W., Sun, J., Zhang, H., Wang, H., Liu, H. Cloning and characterization of a tyrosine decarboxylase involved in the biosynthesis of galanthamine in Lycoris aurea. PeerJ. 7, e6729(2019).
  3. Guerra, M. Cytotaxonomy: The end of childhood. Plant Biosyst. 146 (3), 703-710 (2012).
  4. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Karyotype analysis of Lablab purpureus (L.) Sweet using fluorochrome banding and fluorescence in situ hybridization with rDNA probes. Czech J Genet Plant Breed. 51 (3), 110-116 (2015).
  5. Kadluczka, D., Grzebelus, E. Using carrot centromeric repeats to study karyotype relationships in the genus Daucus (Apiaceae). BMC Genomics. 22 (1), 508(2021).
  6. Levin, D. A. The role of chromosomal change in plant evolution. , Oxford Univ Press. 49-52 (2002).
  7. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Molecular cytogenetic characterization and comparison of the two cultivated Canavalia varieties (Fabaceae). Comp Cytogenet. 11 (4), 579-600 (2017).
  8. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Comparative molecular cytogenetic characterization of five wild Vigna varieties (Fabaceae). Comp Cytogenet. 14 (2), 243-264 (2020).
  9. Stebbins, G. L. Chromosomal evolution in higher plants. , Addison-Wesley. London. (1971).
  10. Paszko, B. A critical review and a new proposal of karyotype asymmetry indices. Plant Syst Evol. 258 (1-2), 39-48 (2006).
  11. Peruzzi, L., Eroglu, H. Karyotype asymmetry: Again, how to measure and what to measure. Comp Cytogenet. 7 (1), 1-9 (2013).
  12. Dehery, S. K., Tavakkoli, A., Jafari, M. Karyotype and chromosome pairing analysis in some Iranian upland cotton (Gossypium hirsutum). Nucleus. 64 (2), 167-179 (2021).
  13. Schweizer, D. Reverse fluorescent chromosome banding with chromomycin and DAPI. Chromosoma. 58 (4), 307-324 (1976).
  14. Moscone, E. A., Debat, H. J., Salguero, N. Quantitative karyotyping and dual color FISH mapping of 5S and 18S-25S rDNA probes in the cultivated Phaseolus varieties (Leguminosae). Genome. 42 (6), 1224-1233 (1999).
  15. Hasterok, R., Sliwinska, E., Kwasniewski, M. Ribosomal DNA is an effective marker of Brassica chromosomes. Theor Appl Genet. 103 (4), 486-490 (2001).
  16. Koo, D. H., Han, Y., Lee, H. Molecular cytogenetic mapping of GXTL and C. melo using highly repetitive DNA sequences. Chromosome Res. 18 (3), 325-336 (2010).
  17. De Moraes, A. P., Ferreira, J. P., Marques, R. Karyotype diversity and the origin of grapefruit. Chromosome Res. 15 (1), 115-121 (2007).
  18. Weiss-Schneeweiss, H., Kiefer, C., Schneider, H. Karyotype diversification and evolution in diploid and polyploid South American Hypochaeris (Asteraceae) inferred from rDNA localization and genetic fingerprint data. Ann Bot. 101 (7), 909-918 (2008).
  19. Siljak-Yakovlev, S., Peruzzi, L. Cytogenetic characterization of endemics: Past and future. Plant Biosyst. 146 (3), 694-702 (2012).
  20. Miaohua, Q., Wang, Y., Zheng, Y. Reciprocal natural hybridization between Lycoris aurea and Lycoris radiata (Amaryllidaceae) identified by morphological, karyotypic, and chloroplast genomic data. BMC Plant Biol. 24 (1), 14-27 (2024).
  21. Shi, S., Wang, Y., Yu, J. Phylogenetic relationships and possible hybrid origin of Lycoris varieties (Amaryllidaceae) revealed by its sequences. Biochem Genet. 44, 198-208 (2006).
  22. Yumai, J., Wang, Y., Zheng, H. Characterization, validation, and cross-species transferability of EST-SSR markers developed from Lycoris aurea and their application in genetic evaluation of Lycoris species. BMC Plant Biol. 20 (1), 522-528 (2020).
  23. Koo, D. H., Shin, D., Lee, J. Karyotype analysis of a Korean cucumber cultivar (Cucumis sativus L. cv. Winter Long) using C-banding and bicolor fluorescence in situ hybridization. Molecules Cells. 13 (3), 413-418 (2002).
  24. Waminal, N. E., Kim, H. H. Dual-color FISH karyotype and rDNA distribution analyses on four Cucurbitaceae species. Hortic Environ Biotechnol. 53 (1), 49-56 (2012).
  25. Xie, W. J., Yang, X., Wang, F. Localization of 45S and 5S rDNA sequences on chromosomes of 20 varieties of Cucurbitaceous plants. J South China Agric Univ. 40 (6), 74-81 (2019).
  26. Han, Y., Zhang, H., Zhu, C. Centromere repositioning in cucurbit varieties: Implication of the genomic impact from centromere activation and inactivation. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (35), 14938-14941 (2009).
  27. Li, K. P., Yao, S., Li, Y. Cytogenetic relationships among Citrullus varieties in comparison with some genera of the tribe Benincaseae (Lycoris aurea (L' Hér.) Herb) as inferred from rDNA distribution patterns. BMC Evol Biol. 16, 85(2016).
  28. Ren, Y., Huang, H., Zhang, Z. An integrated genetic and cytogenetic map of the cucumber genome. PLoS One. 4 (6), e5795(2009).
  29. Han, Y., Wang, H., Liu, B. An integrated molecular cytogenetic map of Cucumis sativus L. chromosome. BMC Genet. 12, 18(2011).
  30. Han, Y., Zhang, H., Yu, C. Chromosome-specific painting in Cucumis varieties using bulked oligonucleotides. Genetics. 200 (3), 771-779 (2015).
  31. Liu, M. S., Zhang, S., Liu, Q. Chromosomal variations of Lycoris varieties revealed by FISH with rDNAs and centromeric histone H3 variant associated DNAs. PLoS One. 16 (9), e0258028(2021).
  32. Hayashi, A., Murota, K., Murata, J. Genetic variations in Lycoris radiate var. radiate in Japan. Genes Genet Syst. 80, 199-221 (2005).
  33. Nima, R. Fluorescence in situ hybridization: Methods and application in cancer diagnosis. Cancer Immunol. 2, 711-728 (2020).
  34. Liu, K., Yang, X., Wang, J. Cytogeography and chromosomal variation of the endemic East Asian herb Lycoris radiate. Ecol Evol. 9, 6849-6859 (2019).
  35. Song, Y. C., Zhang, L., Yan, B. Comparisons of G-banding patterns in six species of the Poaceae. Hereditas. 121, 31-38 (1994).
  36. She, C. W., Zhou, M., Zhang, L. CPD staining: An effective technique for detection of NORs and other GC-rich chromosomal regions in plants. Biotechnic Histochem. 81 (1), 13-21 (2006).
  37. Han, Y. H., Kim, J., Yoon, M. Distribution of the tandem repeat sequences and karyotyping in cucumber (Cucumis sativus L.) by fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Genome Res. 122 (1), 90-98 (2008).
  38. Chao-Wen, S., Chen, Z., Wang, S. Comparative karyotype analysis of eight Cucurbitaceae crops using fluorochrome banding and 45S rDNA-FISH. Comp Cytogenet. 17, 31-58 (2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

45S5S
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи