Методическая статья

Плавучая лаборатория: стандартная операционная процедура сбора и фильтрации проб морской воды с действующих паромов для анализа ДНК в окружающей среде

DOI:

10.3791/67366

⸱

1 августа 2025 г.

 , 
1Department of Earth and Environmental Sciences, University of Milano-Bicocca, 2Marine Research and Higher Education Center (MaRHE Center), 3National Biodiversity Future Centre (NBFC)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы представляем новый протокол для извлечения морской эДНК путем сбора и фильтрации проб морской воды с действующих паромов и других коммерческих судов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Генетические инструменты для извлечения информации из следов ДНК окружающей среды хорошо зарекомендовали себя как для целенаправленной, так и для таксономически широкой характеристики биоразнообразия. Тем не менее, в морском контексте сбор образцов эДНК в труднодоступных районах, таких как абиссальные или прибрежные воды, все еще может быть ограничением. Использование регулярных паромов или коммерческих судов, пересекающих большие пространства открытого моря, может стать ценной оппортунистической платформой для сбора проб окружающей среды. Преимущества бесчисленны, от возможности сбора данных в любых погодных условиях и в любое время суток до повторяемости во времени, будучи постоянными маршрутами, и с полным снижением затрат и выбросов топлива. Предыдущая работа показала, что такой подход возможен и успешен. Тем не менее, процесс получения образцов из брюхов этих крупных морских судов может быть не мгновенным. Эта работа во всех подробностях иллюстрирует, как может быть подготовлен, организован и проведен сбор и фильтрация морской воды с больших судов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние десятилетия анализ экологической ДНК (эДНК), а именно обнаружение генетического материала, оставленного организмами в окружающей среде, быстро стал перспективным инструментом мониторинга сообществ пресноводных и морских животных. Этот молекулярный метод дает возможность одновременной идентификации нескольких таксонов в пределах одного образца (метабаркодировочный подход), позволяя обнаруживать биологические сообщества, населяющие или пересекающие исследуемый участок 1,2,3,4,5.

В настоящее время реальная проблема заключается в том, чтобы добраться до мест отбора проб, поскольку часто экономически и/или логистически нецелесообразно собирать пробы в больших географических масштабах, в результате чего пелагические районы обычно получают недостаточный отбор проб по сравнению с более доступными прибрежнымирайонами6. Использование паромов или других коммерческих судов позволяет получить хорошо воспроизводимые разрезы для отбора проб, поскольку они следуют по определенным судоходным маршрутам, которые обычно постоянны в течение сезона и охватывают большие площади 7,8. Кроме того, использование паромных маршрутов в качестве средства отбора проб позволяет собирать пробы в любое время суток и в любое время года, независимо от погодных и морских условий, а также дает множество других преимуществ (дополнительный рисунок 1). Предварительные исследования доказали как его целесообразность, так и точность для оценки индексов биоразнообразия 9,10. Пробы воды могут быть взяты из машинного отделения парома через деривационную трубу, перехватывающую воду для охлаждения судна перед двигателями. LIFE-CONCEPTU MARIS (Сохранение морских и пелагических морских вод в Средиземноморье: управление действиями по их восстановлению в условиях устойчивости) является первым проектом, в котором это доказательство концепции было применено на практике в широких масштабах: он направлен на сбор 500 образцов (в течение двух лет) и включает в себя привлечение не одной, а нескольких паромных компаний и нескольких перевозчиков. Это позволяет выявить любые критические проблемы и уточнить стратегии выборки, чтобы лучше адаптироваться к самым разнообразным контекстам, с которыми можно столкнуться на борту. Ниже мы описываем характеристики проекта в его компоненте, связанном с крупномасштабной коллекцией образцов ДНК морской среды (описание проекта см. в https://webgate.ec.europa.eu/life/publicWebsite/project/details/5707).

Решение о проведении кампании по отбору проб с использованием регулярного парома подразумевает некоторые действия, которые должны быть предприняты до фактического отбора проб, что является аспектом, непосредственно рассматриваемым в данной работе. Здесь мы кратко упомянем о действиях, которые должны предшествовать отбору проб на борту с любого коммерческого судна.

Это аспект, который не следует упускать из виду и который определяет успех кампании по сбору средств. Судоходные компании являются коммерческими, а не научно-исследовательскими организациями и, следовательно, не знакомы и не обязаны быть знакомыми с целями и задачами научных исследований, которые предполагается проводить на борту. Это подразумевает важную и деликатную начальную фазу, на которой цели предлагаемого научного проекта, которые могут быть междисциплинарными, должны быть переданы и мотивированы высшим руководством самой судоходной компании. В конкретном случае проекта CONCEPTU MARIS это стало возможным благодаря многолетним отношениям, в рамках которых судоходные компании уже участвовали в проектах визуального мониторинга (например, в области фиксированных линейных трансектов [FLT]7), что определило отношения взаимного уважения, необходимые для того, чтобы иметь возможность получить зеленый свет для доступа в машинные отделения, необходимые для подхода к отбору проб, охватываемого этой работой.

В рамках проекта CONCEPTU MARIS используется двоякий режим отбора проб: пробы отбираются как на стационарных станциях отбора проб (ФСС, см. ниже), так и в случае обнаружения «редких» китообразных. Они представляют собой виды, которые наименее заметны во время11-го сверхсветового разреза, а именно: обыкновенный дельфин (Delphinus delphis), клюворыл Кювье (Ziphius cavirostris), гринда (Globicephala melas), дельфин Риссо (Grampus griseus), кашалот (Physeter macrocephalus) и финвал (Balaenoptera physalus)). Дополнительная проба воды собирается только в том случае, если наблюдение редких видов, о которых сообщает группа визуальной переписи (команда FLT), происходит более чем за полчаса до или после одного из FSS. Выборки, проводимые в сочетании с наблюдениями, обязательно будут носить дневной характер.

Стационарные станции отбора проб (ФСС), географическое положение которых остается неизменным на протяжении рейсов, определяются заранее и согласовываются со всей рабочей группой. Географическое положение ФСС выбирается в соответствии с 1) наличием участка, представляющего биологический интерес, на основе данных предыдущих наблюдений/литературы; 2) приоритет отдается точкам, указывающим на изменение местообитаний на батиметрических картах (например, граница континентального шельфа); 3) равномерное покрытие обозначенных судоходных путей, при этом выбираются примерно равноудаленные друг от друга места отбора проб (около 35-45 морских миль друг от друга), чтобы не только охватить весь маршрут, но и предусмотреть сбор проб в ночное время.

Для того чтобы обеспечить забор соседних проб в разное время суток и наличие достаточного времени между двумя последовательными пробами для завершения обработки проб, рекомендуется отбирать пробы из соседних ФСС, одну при обратном пути и одну на обратном пути. Это означает, что если ФСС пронумерованы в соответствии с хронологическим порядком их выборки, они не будут отображаться на карте в последовательном порядке. Например, если выбрано 6 FSS, 3 будут отобраны на обратном пути и 3 на обратном пути. «Их порядок вдоль маршрута на карте будет следующим: PortAFSS1-FSS6-FSS2-FSS5-FSS3-FSS4-PortB, при этом три станции отбора проб, выделенные курсивом (FSS4, FSS5 и FSS6), будут обследованы на обратном пути (см. рисунок 1).

Каждая отдельная ФСС имеет уникальный идентификационный номер (т. е. ни одна из ФСС, идентифицированных на разных маршрутах, не имеет одного и того же идентификационного номера). Нумерация присваивается при первом отборе проб ФСС, после чего следует последовательная нумерация. Поэтому в конце проекта малочисленными ФСС будут те, которые тестировались в течение нескольких лет или по которым доступны самые старые данные.

Каждая проба состоит примерно из 13 л морской воды, собранной на каждой станции отбора проб. Морская вода сцеживается непосредственно из деривационной трубы парома в контейнеры «Bag-in-the-Box» (BiB), а именно в стерильные ламинированные пластиковые пакеты из фольги, до обработки образцов (см. ниже). Характеристики и преимущества системы отбора проб Bag-in-Box (BiBSS) подробно проиллюстрированы Valsecchi et al. (2021)9 , а также приведены на рисунке 2 для удобства.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка в лаборатории

  1. Контрольный список снаряжения
    1. Ознакомьтесь с контрольным списком, чтобы узнать, какие предметы следует взять с собой как для сбора проб, так и для фильтрации проб. Он показан в Дополнительном файле 1. Каждый предмет и его использование будут объяснены в разделах ниже.
    2. Распечатайте копию Дополнительного файла 1 и заполните его перед отъездом для участия в кампании по отбору проб.
  2. Подготовка системы отбора проб Bag-in-Box
    1. Подготовьте Bags-in-Box в лаборатории, по возможности под вытяжным шкафом, перед посадкой. Заклейте три отверстия (то, что на пакете, часть крышки, закрывающей пакет, и выходное отверстие из крана) герметизирующей пленкой (рис. 3, таблица материалов).
    2. Скатайте пакеты, плотно свернув крышку и запечатав ее, и закройте ее клейкой лентой, чтобы предотвратить повторное открытие во время транспортировки (Рисунок 3).
    3. Выполняйте эту операцию, следя за тем, чтобы воздух не попадал в пакет во время вышеупомянутого маневра запечатывания, как (i) чтобы избежать возможного загрязнения воздухом, попадающим внутрь пакета, так и (ii) чтобы сложенный пакет не стал громоздким (если он содержит воздух).

2. Подготовка на борту

  1. Координация с членами экипажа
    1. Как только вы окажетесь на борту, поделитесь выбранными точками отбора проб с капитаном и его экипажем, чтобы было указано время, когда паром будет ближе всего к каждой точке, выбранной в качестве «Стационарной станции отбора проб» (FSS).
    2. Запишите время выборки для каждой ФСС и текущую (или среднюю, если доступную) крейсерскую скорость парома на этом маршруте: это позволяет оценить протяженность (км) отобранного участка моря.
    3. Поскольку паром никогда не проходит точно в одной и той же точке, корректируйте координаты каждого сбора проб морской воды после фактического отбора проб.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точный интервал отбора проб является наиболее важными данными для точной идентификации фактически отобранного морского района; поэтому полезно распечатать карту приблизительных точек, где указаны фактические координаты отбора проб (например, в Дополнительном файле 2).
    4. Если компания предоставляет доступ в машинное отделение, попросите проводить вас в помещение.
    5. Надевайте средства индивидуальной защиты (СИЗ) перед входом в машинное отделение. Здесь обстановка негостеприимная (оглушительный шум и высокие температуры) и полна потенциально коварных точек (крутые лестницы, большие щели в полах). После получения разрешения на вход в машинное отделение вооружитесь всем необходимым оборудованием для обеспечения безопасности, таким как защитная обувь, шлем и наушники для защиты органов слуха.
    6. Если фильтрующая поверхность предоставлена транспортной компанией (обычно рекомендуется иметь собственный складной стол), убедитесь, что эту зону можно продезинфицировать между образцами с помощью 10% раствора отбеливателя.
  2. Обустройство в машинном отделении
    1. Поскольку на судах имеются различные входные отверстия для забортной воды, обратитесь к управляющему машинным отделением, который обеспечивает минимальный путь забора воды через судовые трубы, чтобы свести к минимуму загрязнение пробы воды веществами и организмами, которые могут быть обнаружены в трубах.
    2. После того, как будет определена наиболее подходящая точка/вход для сбора поступающей морской воды, спросите персонал, можно ли держать кран для сбора проб слегка открытым в течение всего круиза, чтобы постоянно промывать трубу, используемую для сбора проб, «местной» водой. Утилизируйте морскую воду, которая непрерывно течет из крана, в трюм.

3. Отбор проб воды (в машинном отделении)

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 4 показаны этапы отбора проб морской воды.

  1. Подготовка к сбору воды
    1. Принесите все необходимое оборудование (первая часть Дополнительный файл 1 контрольный список) в машинное отделение. Прибудьте в машинное отделение не менее чем за 15 минут до запланированного времени отбора проб, чтобы стерилизовать зону обработки BiB с помощью 10% раствора отбеливателя.
    2. Если специальный кран не был открыт в течение всего круиза, откройте его для сбора проб морской воды и дайте воде течь не менее 5 минут (вода сбрасывается в трюм) перед фактическим забором воды (Рисунок 4A).
    3. Подготовьте фильтрующую станцию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существует несколько мер по настройке фильтровальной станции, которые могут значительно повысить эффективность фильтрации (см. шаг 4.3): 1) Используйте вакуумные колбы большой емкости (2 л, 4 л или 5 л, в зависимости от объема, который необходимо оттянуть). Это, помимо экономии времени, необходимого для опорожнения колбы от 1 л до следующей, сводит к минимуму манипуляции с фильтрационным цилиндром и, следовательно, любое загрязнение; 2) можно использовать несколько последовательно расположенных фильтровальных колб, что позволяет одновременно фильтровать несколько проб (мешков). Эта мера рекомендуется при жестких режимах отбора проб, когда в противном случае существует риск не успеть успеть обработать мешки до прибытия в стыковочный порт.
    4. Используйте перманентный маркер для подготовки и маркировки BiB, написав на нем: 1) уникальный буквенно-цифровой идентификационный код образца с обеих сторон BiB (важно, особенно если BiB не обрабатываются сразу на борту и фильтруются на суше) 2) дату; 3) точное время начала заполнения нагрудника.
  2. Сбор воды
    1. Снимите уплотнительную пленку с отверстия нагрудника и начните заполнять его до полного заполнения (около 13 л) (рисунок 4В).
    2. Когда пакет почти заполнится, снимите герметизирующую пленку с крышки, но не с отверстия крана: держите герметизирующую пленку вокруг крана надежно защищенной (красный пластиковый язычок) до фильтрации (Рисунок 4C). Запечатайте нагрудник крышкой, плотно прижав ее до полного закрытия.
    3. Обратите внимание на точное время завершения сбора проб: это позволяет рассчитать общую продолжительность (минуты) сбора пробы.
  3. После сбора воды
    1. Напишите перманентным маркером на BiB точное время завершения сбора проб и сообщите все данные в форме для сбора/фильтрации проб (Дополнительный файл 2).
    2. Перенесите заполненный нагрудник в кладовую или в зону фильтрации (специальное пространство в самом машинном отделении или в каюте).
    3. Перенесите все данные в форму для сбора/фильтрации проб (Дополнительный файл 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнительном файле 2 указан лист для сбора/фильтрации проб, который должен быть заполнен на борту во всех его частях.
      1. Для части, относящейся к отбору проб (зеленым цветом), укажите время начала и окончания отбора проб морской воды из машинного отделения.
      2. Во-вторых, после консультации с членами экипажа или записи GPS, введите географические координаты относительно начала и конца отбора проб и крейсерской скорости. Это позволяет впоследствии рассчитать длину отбираемого морского сегмента.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Что касается части, относящейся к фильтрации (синий цвет), будет указано, происходит ли фильтрация на борту или позже на суше: время фильтрации будет указано для каждого из 3 фильтров.

4. Фильтрация проб морской воды

  1. Подготовка к фильтрации
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента процесс фильтрации может управляться в соответствии с различными протоколами, основанными на конкретных целях исследовательского проекта. Описанный здесь протокол позволяет эффективно фильтровать большое количество морской воды (более 10 литров) непосредственно на борту, избегая ограничений по объему, присущих другим широко используемым коммерческим комплектам или протоколам. По возможности фильтруйте пробы воды на борту: фильтрация может происходить либо в самом машинном отделении, либо в каюте, желательно расположенной рядом с машинным отделением. Всегда желательно фильтровать пробы морской воды сразу после сбора, как для ограничения деградации эДНК, так и для удобства, что позволяет избежать высадки с большими объемами морской воды, подлежащей обработке. Если это невозможно, образцы могут храниться в контейнерах Bag-in-Box и транспортироваться для последующей фильтрации.
    1. В специально отведенном для фильтрации пространстве на борту (в машинном отделении или отдельной каюте) подготовьтесь ко всему, что перечислено во второй части контрольного списка в дополнительном файле 1, и соберите систему фильтрации, как показано на рисунке 5.
    2. Подготовьте фильтрационный цилиндр (Таблица материалов), как показано на Рисунке 6 и Рисунке 7. Используйте новый цилиндр для каждой станции, новую пару одноразовых пинцетов или пару стерилизованных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Один цилиндр может использоваться несколько раз для фильтрации образцов из одного и того же места. Тем не менее, его необходимо стерилизовать 10% отбеливателем, а затем промыть пресной водой, прежде чем оставить сушиться на воздухе в лаборатории, а затем упаковать отдельно для хранения до следующей кампании.
    3. Перед началом фильтрации заполните журнал данных сбора/фильтрации проб (Дополнительный файл 2). Это необходимо как для отслеживания количества обработанных литров, так и для измерения времени фильтрации (показательного количества частиц в пробе). Как только вакуумный насос будет активирован, запустите таймер для измерения времени фильтрации.
  2. Фильтрация на борту
    1. Чтобы свести к минимуму риск загрязнения (особенно при одновременной обработке нескольких пакетов, см. ниже), изолируйте поток фильтруемой воды от окружающей среды, поместив изоляционный рукав - пластиковый пакет - между краном и фильтрующим цилиндром (см. Рисунок 7).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это важная мера предосторожности, поскольку чувствительность технологий, используемых для анализа ДНК окружающей среды, делает этот подход особенно восприимчивым к загрязнению окружающей среды (со стороны оператора или перекрестного загрязнения между образцами).
    2. Включите вакуумный насос и отфильтруйте до 4 л воды для каждого фильтра. Во время фильтрации держите цилиндр всегда полным, чтобы избежать попадания воздуха в систему и замедлить процесс фильтрации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Что касается выбора пористости мембраны, то это зависит от цели исследования, целевых таксономических групп и количества воды, которое предполагается обрабатывать. Этот вопрос уже рассматривался в предыдущих работах 9,12.  в которых сравнивались фильтры разной пористости. Для изучения позвоночных животных и выбора обработки 4 литров воды на фильтр оптимальным решением оказалась мембрана с пористостью 0,45 мкм, позволяющая обрабатывать большие объемы воды, не вызывая загромождения фильтра из-за насыщения пор.
    3. Когда уровень отфильтрованной воды внутри колбы достигнет отметки 4 л, выключите вакуумный насос и остановите таймер, сообщив значение времени фильтрации в журнал данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из каждого нагрудника объемом 12/13 л будут получены 3 технические реплики, по 4 л каждая (названные A, B и C).
    4. На этом этапе с помощью пинцета (и, при необходимости, стерильной зубочистки, которая поможет приподнять край фильтра) извлеките первый фильтр (фильтр А) из цилиндра, как показано на рисунке 8, избегая возможных повреждений фильтра.
    5. Сложите фильтр пополам (при этом сторона, которая сохранила биологический материал, сложенную на себя) и оберните его алюминиевой фольгой, сразу написав на обертке номер образца и ID реплицита фильтра (например, 15А). Храните его в морозильной камере на борту до высадки.
    6. Установите новый фильтр (фильтр B) внутрь фильтрующего цилиндра для обработки еще одной пробы объемом 4 л (Рисунок 9). Опорожните колбу и начните снова с фильтрации второй реплики до тех пор, пока 4 л полностью не будут отфильтрованы. Восстановите фильтр B, как описано выше, и повторите те же шаги для фильтра C.
  3. Передовая практика
    1. Чтобы сократить время фильтрации, используйте большую вакуумную колбу, способную вместить всю отфильтрованную воду, обработанную через один фильтр (следовательно, в этом случае емкость не менее 4 л).
    2. Значительное сокращение времени фильтрации за счет одновременной фильтрации нескольких рукавов путем параллельного расположения фильтрующих аппаратов (т. е. нескольких вакуумных колб, обслуживаемых одним насосом).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В рамках кампании CONCEPTU MARIS были приняты обе стратегии (Рисунок 10). Обратите внимание, что максимизация эффективности фильтрации очень важна, так как количество образцов, собранных вдоль маршрута, может быть большим. Поэтому необходимо обрабатывать мешки в сжатые сроки, чтобы избежать скопления образцов с риском необходимости выгрузки мешков, если времени для их обработки на борту недостаточно.
    3. Для того чтобы контролировать частоту ложноположительных результатов (заражения), включите в процедуру фильтрации, не реже одного раза за круиз, «холостой мешок», фильтруя параллельно с пробами пакет, наполненный питьевой водой, взятой из герметичных бутылок. Этот контрольный образец не требует репликации, и обрабатывайте его так же, как и остальные образцы, и включайте его в прогон NGS.
  4. Хранение и транспортировка фильтров
    1. После фильтрации все фильтры хранят при температуре от -4 °C до -20 °C до дальнейшей лабораторной обработки.
    2. Соберите образцы из бортового морозильника непосредственно перед высадкой и подготовьте их к транспортировке при низких температурах с помощью переносных охладителей, как показано на рисунке 11.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если пробы не были отфильтрованы на борту, пакеты с морской водой более безопасно транспортируются, если хранить их вертикально с крышкой, удерживаемой верхней стороной, поддерживаемой попарно внутри пакетов для покупок внутри пластиковых ящиков для облегчения транспортировки (Рисунок 12).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выполняя протокол, как описано, оператор собирает количество фильтров, равное количеству FSS, умноженному на 3 реплики. Каждый фильтр сохраняет биологические следы (ДНК окружающей среды) на одной из двух сторон. Аналитические шаги, следующие за экстракцией эДНК, в значительной степени зависят от вопроса, мишени и цели исследования. Например, в пилотном исследовании Valsecchi et al.9 описанный протокол сбора eDNA позволил разработать воспроизводимое и систематическое исследование морской мегафауны....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поскольку этапы протокола просты и понятны, есть некоторые важные соображения, которые следует учитывать при работе с коммерческими паромами. Труба для отвода охлаждающей воды обычно расположена в зоне машинного отделения, доступ к которой может быть ограничен или требовать предварительного разрешения. Поэтому крайне важно иметь такое разрешение, а также соответствующие средства индивидуальной защиты (Рисунок 4). Кроме того, сбор и фильтрация воды должны про...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы глубоко благодарны тем людям, которые позволили протестировать и развить представленный здесь метод, а именно Антонелле Арканджели (ISPRA), которая на протяжении десятилетий руководила проектом FLT, с помощью которого средиземноморские (и не средиземноморские) китообразные постоянно находятся под визуальным наблюдением, опираясь на плотную сеть паромов, и которые поверили в амбициозное предложение поиска ДНК на маршрутах, пересекаемых паромами; Кристина Пиццутти из Corsica and Sardinia Ferries, которая с энтузиазмом приняла вызов, оказав нам логистическую поддержку для первого тестирования методологии на перевозчике из своего флота (приветствуя также команду видеомейкеров, которые занимались съемками); Фульвио Маффуччи (Fulvio Maffucci) за взаимодействие с различными морскими компаниями с целью выдачи разрешений на забор проб на борту. Мы благодарим Роберто Ломбардо, чей магистерский диссертационный проект положил начало исследованию eDNA и паромов. Наконец, мы благодарим морские компании, которые позволили нам подняться на борт и взять образцы eDNA в рамках проекта LIFE-CONCEPTU MARIS, поскольку это дало нам возможность протестировать наш метод на нескольких различных судах в Средиземном море: Grimaldi Lines, Minoan Lines, Tirrenia, Balearia, Corsica и Sardinia Ferries, Grandi Navi Veloci (GNV). Текущий проект LIFE-CONCEPTU MARIS, финансируемый ЕС, обеспечивает доказательство концепции воспроизводимости подхода в широких масштабах, а также финансирование производства этой видео-публикации, которая позволит Стандартизированному операционному протоколу (СОП) стать широко распространенным среди более широкого научного сообщества и общественности. Мы благодарим Маттиа Ноччиолу и Франческо Томмазинелли (Triton Research) за предоставленные кадры протокола. Наконец, мы благодарим все команды, которые взаимодействовали с нами и помогали нам с отбором проб в течение последних 5 лет.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фильтрующие мембраны диаметром 4,7 смBiosigma S.p.A.https://www.biosigma.com/Фильтрующие мембраны 0,45 мкм; m пористость, индивидуально упакованные 
Вакуумные колбы 4/5 лDuranhttps://www.duran-bottle-system.com/5 л стеклянная колба с пробкой
Впитывающие бумажные прокладкиAdvantec MFS, Inc.https://www.advantecmfs.com/category/absorbent-pads-1Впитывающие прокладки из фильтровальной бумаги, размер 47 мм.
Bag-in-Box (BiB)G.M.V. Agricenter S.r.l.https://www.gmvagricenter.it/10 литров мешки в коробке с краном
Фильтрующие цилиндры Sartorius AGhttps://shop.sartorius.com/in/industrial-microbiology-filtration-devices/biosart-100-monitors/p/M_Biosart_100_Monitors#Biostart 100 Мониторные цилиндры, с 0,45 μ мембрана M в комплекте;
Уплотнительная пленкаMerckhttps://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/sigma/hs234526a?utm_source=bing&utm_medium=
cpc& utm_campaign=all+product_
dsa_WW_%28bing+ebizpfs%29&
utm_id=626946489& utm_content=
1166583023365595& msclkid=
d2b55b82440b1aef56fc3ca803c
6486f& utm_term=%2Fproduct%2F		4 дюйма x 125 футов рулон лабораторной герметизирующей пленки
Вакуумный насосKNF Grouphttps://knf.com/en/usпортативный вакуумный насос Laboport N. 96 

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Andruszkiewicz, E. A., et al. Biomonitoring of marine vertebrates in Monterey Bay using eDNA metabarcoding. PLoS One. 12 (4), e0176343(2017).
  2. Djurhuus, A., et al. Environmental DNA reveals seasonal shifts and potential interactions in a marine community. Nat Commun. 11 (1), 254(2020).
  3. DiBattista, J. D., et al. Environmental DNA can act as a biodiversity barometer of anthropogenic pressures in coastal ecosystems. Sci Rep. 10 (1), 8365(2018).
  4. Beng, K. C., Corlett, R. T. Applications of environmental DNA (eDNA) in ecology and conservation: Opportunities, challenges, and prospects. Biodivers Conserv. 29 (7), 2089-2121 (2020).
  5. He, X., et al. eDNA metabarcoding enriches traditional trawl survey data for monitoring biodiversity in the marine environment. ICES J Mar Sci. 80 (5), 1529-1538 (2023).
  6. Pawlowski, J., et al. The future of biotic indices in the ecogenomic era: Integrating (e)DNA metabarcoding in biological assessment of aquatic ecosystems. Sci Total Environ. 637 - 638, 1295-1310 (2018).
  7. Arcangeli, A., Marini, L., Crosti, R. Changes in cetacean presence, relative abundance and distribution over 20 years along a trans-regional fixed line transect in the central Tyrrhenian sea. Mar Ecol. 34 (1), 112-121 (2013).
  8. Matear, L., Robbins, J. R., Hale, M., Potts, J. Cetacean Biodiversity in the Bay of Biscay: Suggestions for environmental protection derived from citizen science data. Mar Policy. 103672, 109(2019).
  9. Valsecchi, E., et al. Ferries and environmental DNA: Underway sampling from commercial vessels provides new opportunities for systematic genetic surveys of marine biodiversity. Front Mar Sci. 8, 704786(2021).
  10. Boyse, E., Beger, M., Valsecchi, E., Goodman, S. J. Sampling from commercial vessel routes can capture marine biodiversity distributions effectively. Ecol Evol. 13 (2), e9810(2023).
  11. Arcangeli, A., et al. Testing indicators for trend assessment of range and habitat of low-density cetacean species in the Mediterranean Sea. Front Mar Sci. 10, 1116829(2023).
  12. Valsecchi, E., et al. Novel universal primers for metabarcoding environmental DNA surveys of marine mammals and other marine vertebrates. Environ DNA. 2 (4), 460-476 (2020).
  13. Hunter, M. E., et al. Improving eDNA yield and inhibitor reduction through increased water volumes and multi-filter isolation techniques. Sci Rep. 9 (1), 5259(2019).
  14. Capo, E., et al. Effects of filtration methods and water volume on the quantification of brown trout (Salmo trutta) and Arctic char (Salvelinus alpinus) eDNA concentrations via droplet digital PCR. Environ DNA. 2 (2), 152-160 (2020).
  15. Li, J., et al. The effect of filtration method on the efficiency of environmental DNA capture and quantification via metabarcoding. Mol Ecol Resour. 18 (5), 1102-1114 (2018).
  16. Collins, R. A., Wangensteen, O. S., O'Gorman, E. J., Mariani, S., Sims, D. W., Genner, M. J. Persistence of environmental DNA in marine systems. Commun Biol. 1, 185(2018).
  17. Kelly, R. P., Gallego, R., Jacobs-Palmer, E. The effect of tides on nearshore environmental DNA. PeerJ. 6, e4521(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи