Методическая статья

Измерение ферментативной активности деубиквитилирующих ферментов, связанных с нарушением развития нервной системы, с помощью анализа расщепления убиквитиновой цепи in vitro

DOI:

10.3791/67367

⸱

27 сентября 2024 г.

 ,  , 
1Pediatrics and Rare Diseases Group, Sanford Research, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic, 3Department of Pediatrics, Sanford School of Medicine, University of South Dakota

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе объясняется, как измерить влияние генетической изменчивости, связанной с нарушениями развития нервной системы, на активность деубиквитилирующего фермента путем комбинации очистки рекомбинантного белка с анализами расщепления убиквитиновой цепи.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нарушения развития нервной системы (НДР) связаны с нарушениями функции нервной системы, но часто остаются плохо изученными на молекулярном уровне. Дискретные расстройства, вызванные отдельными генами, обеспечивают модели для исследования механизмов, управляющих атипичным нейроразвитием. Варианты генов, кодирующих белки семейства деубиквитилирующих ферментов (DUB), связаны с несколькими NDD, но существует необходимость в определении патогенетических механизмов нарушений, вызванных этими вариантами генов. Влияние вариантов генов на активность DUB может быть экспериментально определено с помощью независимого от субстрата анализа расщепления убиквитина in vitro . Этот анализ не требует знания субстратов для непосредственного измерения каталитической активности. В данной работе протокол определения влияния вариантов генов на ферментативную активность моделируется с использованием DUB Ubiquitin Specific Protease 27, X-linked (USP27X), которая мутировала при X-сцепленной умственной инвалидности 105 (XLID105). Этот экспериментальный конвейер может быть использован для уточнения механизмов, лежащих в основе нарушений развития нервной системы, вызванных вариантами в генах DUB.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нарушения развития нервной системы (НДР) возникают в результате различных этиологий с экологическими или генетическими детерминантами, которые стимулируют атипичное развитие нервной системы1. Генетическое тестирование секвенирования нового поколения связывает растущее число вариантов генов, связанных с системой убиквитина, с генетическими NDD2. Система убиквитина катализирует лигирование небольшого белкового модификатора убиквитина в первую очередь до остатков лизина в белковых субстратах, что приводит к изменениям в клеточном поведении, включая локализацию, стабильность, белок-белковые взаимодействия или активность3. Убиквитилирование опосредовано ферментами Е1, Е2-конъюгирующими и Е3-лигазой4и обратимым благодаря активности деубиквитилирующих ферментов (ДАБ), которые катализируют расщепление и удаление убиквитина из белковых субстратов5. Убиквитин может быть лигирован к субстрату в виде мономера (моноубиквитилирование) или полимерных цепей (полиубиквитилирование), которые образуются на любом из семи остатков лизина (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) или остатке убиквитина M1. Эти различные топологии убиквитиновых цепей и их комбинации создают сотовый код, который является ключевым для передачисигнала.

DUB, такие как USP27X, USP7, USP9X, USP48, STAMBP, OTUD4, OTUD6B и OTUD5, были связаны с NDD 2,7,8,9,10,11. Для большинства NDD молекулярные механизмы, которые управляют патогенезом, остаются экспериментально неопределенными. Некоторые из ДАБ, вызывающих недавно описанные расстройства, плохо изучены и не имеют известных клеточных показаний, которые можно было бы использовать для оценки влияния генетической изменчивости на функцию белка. Анализы расщепления цепи убиквитина in vitro преодолевают это ограничение, поскольку независимые от субстрата показания активности DUB могут измерять влияние вариантов генов на ферментативную активность12.

Анализы на расщепление убиквитина in vitro используются с 1980-х годов. Эти анализы с использованием радиоактивно меченых субстратов позволили открыть первые DUBs, включая изопептидазу, идентифицированную по ее способности деубиквитировать гистон H2A13, и убиквитинкарбоксил-концевую гидролазу (UCH), идентифицированную по ее способности гидролизовать убиквитин из различных химических конъюгатов 14,15,16 . Кроме того, радиоактивно меченные полиубиквитилированные полноразмерные белки или пептиды были использованы для идентификации изопептидазы Т и нескольких UCH и убиквитин-специфических протеаз (UBP) из эритроцитов и скелетных мышц соответственно 17,18,19,20. Убиквитиновые цепи определенной длины и типа связи (K48-связанный тетраубиквитин) впервые были использованы для измерения активности DUB изопептидазы T21. С тех пор этот анализ стал золотым стандартом для измерения активности DUB в мутационных анализах 22,23. Усовершенствование этого анализа в настоящее время позволяет визуализировать расщепление убиквитина с помощью электрофореза и обычных гелевых красителей, таких как синий цвет Кумасси, оранжевый SYPRO, рубиновый и серебряный красители, а также флуоресцентное или иммуноблоттинговое обнаружение12,24. Молекулярные аспекты активности DUB, такие как минимальная длина цепи и специфичность связывания 25,26,27,28, могут быть уточнены с использованием убиквитиновых цепей различной длины (например, ди-, три-, тетра-убиквитин) и связей (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63, линейных) в функциональных анализах. NDD-ассоциированные варианты могут приводить к дефектам активности DUB, которые специфичны для убиквитинового типа сцепления цепи11.

Анализ расщепления диубиквитина с использованием очищенных рекомбинантных белков DUB может напрямую измерить влияние вариантов NDD на активность DUB. USP27X, который мутировал в NDD X-сцепленном умственном расстройстве инвалидности 105 (XLID105)7,28, моделирует процесс, представленный здесь. Этот подход позволяет определить, как активность DUB нарушается вариантами генов в существующих и неизвестных DUB-ассоциированных NDD.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следующий протокол может быть адаптирован для рекомбинантных белков с использованием различных аффинных меток, экспрессируемых в различных штаммах компетентных клеток. В зависимости от экспрессируемого белка, условия культивирования и ночной экспрессии могут потребовать оптимизации OD600 по индукции экспрессии, времени экспрессии, температуре экспрессии и концентрации IPTG. Обзор протокола проиллюстрирован на рисунке 1. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Трансформация компетентных клеток Rosetta 2 E. coli с рекомбинантной экспрессирующей плазмидой GST-USP27X

ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания стерильности бактериальной культуры выполняйте действия, когда контейнеры со средой открыты под пламенем горелки Бунзена. Чтобы обеспечить оптимальный перенос кислорода, выполняйте встряхивание бактериальных культур в настольном вибростенде с регулируемой температурой и орбитой от 19 мм до 50 мм и скоростью 200 об/мин29.

  1. Разморозьте 20 мкл химически компетентных клеток Rosetta 2 E. coli на льду непосредственно перед применением. Добавьте 1-10 нг экспрессирующей плазмиды pGEX6P1-USP27X (кодирующей N-концевую глутатион-S-трансферазу (GST)30 с меткой USP27X и содержащей резистентность к ампициллину) и инкубируйте 5 минут на льду.
  2. Тепловой шок в течение 30 с при 42 °C в сухой ванне. Выдерживать на льду в течение 2 минут.
  3. Добавьте 80 μл среды SOC комнатной температуры (RT). Инкубировать в течение 60 минут при температуре 37 °C при вращении 200 об/мин в 19-миллиметровом настольном вибростенде с регулируемой температурой.
  4. Планшет 50 мкл культуры на агаровой пластине LB с добавлением 25 мкг/л хлорамфеникола и 50 мкг/л ампициллина. Инкубировать в течение 20 часов при температуре 37 °C крышкой вниз в инкубаторе с регулируемой температурой.

2. Ночная бактериальная экспрессия рекомбинантного белка из экспрессии плазмиды

ПРИМЕЧАНИЯ: Для поддержания стерильности бактериальной культуры выполняйте действия, когда контейнеры со средой открыты под пламенем горелки Бунзена. Чтобы обеспечить оптимальный перенос кислорода, выполняйте встряхивание бактериальных культур в настольном вибростенде с регулируемой температурой и орбитой от 19 мм до 50 мм и скоростью 200 об/мин29. Измерьте наружный диаметр культуры600 с помощью спектрофотометра.

  1. Приготовьте 1 л среды Terrific Bulth (TB), добавив 47,6 г порошка TB к 1 л сверхчистой воды с 0,4% глицерина в колбе с перегородкой культуры объемом 2 л. Автоклав в среду 30 мин и охладить до температуры температуры.
  2. Выберите одну колонию трансформированных бактерий и добавьте к 10 мл стерильной LB-среды с добавлением 25 мкг/л хлорамфеникола и 50 мкг/л ампициллина. Инкубировать в течение 20 часов при температуре 37 °C при вращении 200 об/мин в 19-миллиметровом орбитальном настольном вибростенде с регулируемой температурой.
  3. Добавьте 10 мл посева на ночь к 1 л туберкулезной среды с добавлением 25 мкг/л хлорамфеникола и 50 мкг/л ампициллина (соотношение исходной культуры к культуре экспрессии 1:100). Инкубируйте при 37 °C с вращением 200 об/мин в 19-миллиметровом настольном вибростенде с регулируемой температурой до тех пор, пока внешний диаметркультуры 600 не составит 0,5-0,6.
  4. Добавьте 50 мкМ IPTG в культуру для стимуляции экспрессии, охладите до 16 °C и инкубируйте в течение 20 часов при 16 °C при вращении 200 об/мин.
  5. Пеллетные клетки из культуры экспрессии методом центрифугирования в течение 20 мин при ≥3000 x g и 4 °C. Хранить гранулы при температуре -80 °C не менее 1 часа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе эксперимент может быть приостановлен и возобновлен позже (желательно на той же неделе). Пеллеты могут храниться в течение длительного времени при температуре -80 °C.

3. Очистка белка гравитационно-проточной аффинной колонной

ПРИМЕЧАНИЕ: Смола, связующие, промывные, элюирующие и накопительные буферы, подходящие для каждой очистки, будут зависеть от очищаемого рекомбинантного белка. Соберите образцы из клеточных гранул, надосадочной жидкости, проточных, промывочных фракций и фракций элюирования в буфере SDS-PAGE. Проведите окрашивание образцов методом SDS-PAGE и Coomassie, чтобы оценить успешность очистки. Проведите очистку при 4 °C и обработайте фракции на льду. Расщепление белковых меток может быть выполнено на колонке или за ее пределами с использованием соответствующей протеазы для нацеливания на соответствующий протеазно-специфический сайт расщепления.

  1. Закрепите пустую колонну гравитационного потока в ретортной стойке и заполните ее глутатион-агарозной смолой. Используйте 2-3 мл смолы для очистки клеточной гранулы, собранной из 1 л культуры экспрессии.
  2. Промыть колонку одним слоем смолы объемом 20% этанола. Промыть колонку 3 раза одним объемом смоляного слоя буфера MS500 (20 мМ Tris pH 7,5, 500 мМ NaCl, 0,5 мМ TCEP). Остановите колонну, чтобы смола оставалась покрытой буфером, чтобы предотвратить высыхание во время приготовления гранул ячейки.
  3. Разморозьте гранулу ячейки при 4 °C. Добавьте в размороженную гранулу 30 мл буфера MS500 (20 мМ Tris pH 7,5, 500 мМ NaCl, 0,5 мМ TCEP, 60 мг лизоцима и одну таблетку ингибитора протеазы). Лизируйте в течение 30 минут при температуре 4 °C с мягким вращением из конца в конец.
  4. Лизированные ультразвуком клетки помещайте в центрифужную пробирку объемом 50 мл или металлический стакан на льду до тех пор, пока лизат не будет свободно течь при дозировании с наконечника пипетки. Центрифуга в течение 30 минут при 4 °C и ≥20 000 x g для очистки надосадочной жидкости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Определите настройки ультразвуковой обработки опытным путем. Установите ультразвуковой аппарат таким образом, чтобы общего времени 120 с было достаточно, чтобы вязкий лизат превратился в сыпучую и прозрачную жидкость.
  5. Сцедите надосадочную жидкость в стакан и загрузите очищенный лизат в колонку. Пропустите лизат через колонну под действием силы тяжести, собирая при этом поток. Загрузите столбец с собранным потоком и пропустите его через столбец.
  6. Промыть колонку не менее чем двумя объемами смоляного слоя промывочного буфера MS500 (20 мМ по Трису pH 7,5, 500 мМ NaCl, 0,5 мМ по TCEP) 5 раз. Соберите промывочный поток в фракции по 5 мл. Добавьте по 1 мкл каждой фракции в 100 мкл реагента Bradford для визуальной проверки наличия белка. Мойте до тех пор, пока в последней стирке не перестанет присутствовать связанный белок, при необходимости добавляя дополнительные этапы стирки.
  7. Восстановите белок, пропустив элюирующий буфер MS500 (буфер MS500 с добавлением 10 мМ глутатиона и 10 мМ NaOH) через колонку, собрав 5 мл элюирующих фракций. Проверьте наличие белка, добавив 1 мкл элюата к 100 мкл реагента Bradford. Прекратите сбор фракций, когда реагент Брэдфорда больше не указывает на присутствие белков.
  8. Выполнение буферного обмена путем осаждения и центрифугирования. Осадите белок, добавив в элюат 2 объема 4 М сульфата аммония, осторожно переворачивая до мутности, а затем центрифугируя в течение 30 мин при 4 °C и ≥20 000 х г и снова в течение еще 5 мин. Удаляйте надосадочную жидкость после каждого центрифугирования, не нарушая белковую гранулу.
  9. Повторно растворите и сохраните белок в MS500 с добавлением 25% глицерина. Храните протеиновые гранулы или протеин в буфере для хранения при температуре -80 °C.

4. Анализ расщепления цепи убиквитина in vitro

Примечание: Выбирайте длину убиквитиновой цепи и типы сцепления на основе специфичности DUB, описанной в предыдущих отчетах31 , или определяемой опытным путем. При необходимости этот протокол может быть использован для тестирования активности представляющего интерес DUB дикого типа на панели коммерчески доступных убиквитиновых цепей определенной длины и типа связи. В качестве отправной точки для анализа27 можно использовать диубиквитиновую цепь в количестве 375-750 нг и концентрацию DUB 1-2 мкМ.

  1. Приготовьте 10x активационный буфер DUB (500 мМ Tris-HCl pH 7,5, 500 мМ NaCl и 100 мМ TCEP).
  2. Для каждого временного момента для каждого DUB приготовьте 10 μL в общей сложности 2 μM очищенного GST-USP27X в 1x буфере для активации DUB (смесь DUB). Подготовьте мастер-миксы и разбейте их на временные точки.
  3. Инкубируйте смесь DUB в течение 10 минут при RT.
  4. Добавьте 7 мкл загрузочного буфера SDS-PAGE в момент времени 0 перед добавлением убиквитиновых цепей, чтобы предотвратить начало реакции деубиквитилирования.
  5. В каждый момент времени для каждого DUB добавьте 375 нг диубиквитиновых цепей K-63, разведенных в 10 мкл 1x буфера для активации DUB. Общий объем составляет 20 мкл на одну реакцию.
  6. Инкубируйте пробирки при температуре 30 °C, останавливая каждый момент времени с помощью 7 мкл загрузочного буфера SDS-PAGE.
  7. Выполните SDS-PAGE с градиентным гелем 4%-12% и иммуноблоттингом 7,32 для убиквитина и USP27X, чтобы проанализировать изменение присутствия моноубиквитина в выбранные временные точки.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Схема дизайна исследования. (A) Трансформация компетентных клеток E. coli в плазмиду с экспрессией рекомбинантных белков. (B) Ночная бактериальная экспрессия рекомбинантного белка деубиквилазы. (C) Белковая очистка рекомбинантной деубиквилазы с использованием аффинной колонки с гравитационным потоком. (D) Анализ расщепления цепи убиквитина in vitro для оценки деубиквитилирующей активности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы определить влияние XLID105-ассоциированных вариантов на каталитическую активность USP27X, из бактерий были очищены белки USP27X дикого типа USP27X, помеченные GST, и XLID105-ассоциированный вариант F313V, Y381H и S404N USP27X. Эти варианты расположены в каталитической области USP USP27X (рис. 2A). Поскольку ранее сообщалось, что USP27X расщепляет убиквитиновые цепи31 K63, USP27X дикого типа и XLID105-ассоциированный вариант белков F313V, Y381H и S404N USP27X инкубировали с K63-связанными диубиквитиновыми цепями в течение 1 ч. Эти образцы были разделены с помощью SDS-PAGE32, а белки убиквитина и USP27X были проанализированы с помощью иммуноблоттинга. USP27X дикого типа индуцирует расщепление ди-убиквитина, генерируя моноубиквитин (Рисунок 2B и дополнительный Рисунок 1). XLID105-ассоциированные белки варианта F313V, Y381H и S404N USP27X не расщепляли эти цепи. Поскольку варианты F313V, Y381H и S404N нарушают каталитическую активность USP27X, функциональное нарушение USP27X, по-видимому, является основным механизмом, лежащим в основе XLID1057. Ранее сообщалось о дополнительных количественных и дополнительных экспериментах7.

figure-results-1
Рисунок 2: Влияние XLID105 вариантов на деубиквитилирующую активность USP27X. (A) Диаграмма структуры белка USP27X человека, показывающая количество остатков и расположение XLID105 вариантов, оцененных в домене USP (фиолетовый). (B) Варианты USP27X дикого типа с маркировкой GST и XLID105 (F313V, Y381H и S404N) инкубировали с диубиквитиновыми цепями K63 в указанное время. Иммуноблоттинг проводили с использованием антител к GST (USP27X) и убиквитина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный рисунок 1: Необрезанные блоты на рисунке 2B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье представлен протокол экспрессии и очистки рекомбинантных USP27X DUB и анализ расщепления убиквитиновой цепи in vitro для сравнения деубиквитилирующей активности USP27X дикого типа и NDD-ассоциированных вариантов. Этот анализ показал, что XLID105-ассоциированные варианты нарушают каталитическую активность USP27X7. Это механистическое понимание помогло нам определить XLID105 как расстройство функционального нарушения USP27X.

Этот протокол может быть адаптирован к другим DUB, которые связаны с генетическими заболеваниями с плохо изученными молекулярными механизмами. Оптимизация протокола экспрессии и очистки для конкретного интересующего вас DUB имеет решающее значение. Если для данного интересующего нас DUB не было описано никаких конкретных протоколов, описанный здесь метод может выступать в качестве отправной точки. При оптимизации протокола экспрессии и очистки белка важнейшие шаги включают выбор соответствующих параметров для (1) системы экспрессии (например, штаммов бактерий, клеток насекомых или клеток млекопитающих), (2) векторов экспрессии, (3) используемой смолы метки и аффинности, (4) условий выращивания, (5) количества культуры и (6) потребности в дальнейшей очистке (например, с помощью исключения из размера или ионообменной хроматографии). Конкретные рекомендации по этим и другим аспектам метода были обсуждены33.

Анализ расщепления убиквитиновой цепи in vitro является простым способом измерения деубиквитилирующей активности дикого типа или мутантных DUB. Нестационарный анализ расщепления убиквитина может дать представление о влиянии генетической изменчивости на ферментативную кинетику DUB, позволяя определить такие параметры, как Km и Vmax. Это позволило бы различать дефекты в активном центре DUB, которые ухудшают катализ (снижение Vmax), и дефекты, которые ухудшают распознавание субстрата (увеличениеKm). Универсальность этого анализа обусловлена разнообразием убиквитиновых цепей, которые могут быть использованы для получения четкой механистической информации об интересующем нас ДАБ. Убиквитиновые цепи различной длины и топологии связи коммерчески доступны, что делает этот анализ доступным для неспециалистов. Специфические DUB обладают уникальными свойствами ферментативной кинетики, распознавания сцепления и спайности. Важнейшие шаги для этого анализа включают в себя: (1) определение рабочей концентрации DUB, (2) определение оптимального времени реакции, (3) выбор типа и длины звенья убиквитиновой цепи и (4) выбор метода детектирования.

Анализы расщепления убиквитиновой цепи измеряют влияние вариантов NDD на активность DUB 7,11, помогая идентифицировать варианты, которые нарушают активность DUB и стимулируют атипичное развитие. Этот анализ может быть использован в ряде ситуаций, когда генетическая изменчивость приводит к патологии, включая рак и нейродегенерацию. Поскольку анализ не зависит от субстрата, предварительная идентификация специфического субстрата убиквитилированного белка не требуется. Тем не менее, анализ ограничен измерением изменений активности расщепления убиквитиновой цепи и не может оценить влияние вариантов на функции DUB, такие как белок-белковые взаимодействия, субклеточная локализация и посттрансляционные модификации. Идентификация широких сигнальных путей, в которых действует представляющий интерес DUB, необходима для разработки конкретных анализов, чтобы выяснить, как эти варианты управляют дискретными NDD.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была профинансирована стартап-фондами Sanford Research для FB и грантом NIH R01CA233700 для MJS. Работа над картиной была выполнена Фелипе Г. Серрано (www.illustrative-science.com). Мы благодарим доктора Грега Финдли (Университет Данди) за плазмиду GST-USP27X.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Amersham Protran 0,45 NC 200 мм × 200 мм 25/PKЦитива10600041
сульфат аммонияFisher ScientificAC205872500
ампициллинFisher ScientificBP1760 25
Анти-убиквитин (мышиный моноклональный)BiolegendCat# 646302, RRID:AB_1659269(WB: 1:1000)
Анти-GST (Овцы поликлональные)MRC-PPU Реактивы и услугиCat# S902A Третье кровотечение(WB: 1:1000) https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/
Колбы для культуры с перегородками 2 лFisher Scientific10-042-5N
Bradford РеагентMillipore SigmaB6916-500ML
ХлорамфениколГолд БиотехнологияC-105-25
Complete, таблетки ингибитора протеазыMillipore Sigma
Econo-Column 1,5 и 5 смBio-Rad7371507
Eppendorf ThermoMixer F1.5 Eppendorf5384000020
ExcelMicrosofthttps://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
GlycerinGenesee Scientific18-205
IllustratorAdobehttps://www.adobe.com/products/illustrator.html
Image StudioLI-COR Bioscienceshttps://www.licor.com/bio/image-studio/
InkscapeInkscapehttps://inkscape.org/
Invitrogen 4-12% NuPAGE 1mm 12 луночный гельThermo Fisher ScientificNP0322BOX
IPTG (Isopropyl-b-D-Thiogalactopyranoside)Genesee Scientific20-109
IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG Secondary AntibodyLI-COR BiosciencesCat# 926-32214(WB: 1:10000)
IRDye 800CW Donkey Anti-Mouse IgG Вторичное антителоLI-COR BiosciencesCat# 926-32212(WB: 1:10000)
Isotemp Digital Dry BathFisher Scientific88860022
K63 Di-UbiquitinSouth Bay Bio LLCSBB-UP0072
LB AgarGenesee Scientific11-119
LB БульонGenesee Scientific11-118
ЛизоцимГолд БиотехнологияL-040-100
MaxQ 4000 Настольный орбитальный шейкерThermo Fisher ScientificSHKE4000-7
MES-SDS Беговой буферBoston Bioproducts IncBP-177
Мини-трубка вращательFisher Scientific88-861-051
NuPage LDS Буфер для образцов 4xThermo Fisher ScientificNP0007
Одиссея  Fc ImagerLI-COR Biosciences43214
PageRuler Plus LadderThermo Fisher Scientific26620
pGEX6P1 human USP27XMRC-PPU Реагенты и услугиDU21193https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/
pGEX6P1 human USP27X F313VAddgene225715Koch et at 2024 (PMID: 38182161)
pGEX6P1 human USP27X S404NAddgene225717Koch et at 2024 (PMID: 38182161)
pGEX6P1 human USP27X Y381HAddgene225716Koch et at 2024 (PMID: 38182161)
Pierce GlutathioneAgarose Thermo Fisher Scientific16100
PMSF (Phenylmethylsulfonylfluoride)Gold BiotechnologyP-470-10
Polysorbate 20 (Tween 20)Fisher ScientificAC233360010
Rosetta 2 Компетентные клеткиMillipore Sigma71402-M
SimplyBlue SafeStainThermo Fisher ScientificLC6060
SmartSpec 3000Bio-Rad170-2501
SOC mediumThermo Fisher Scientific15544034
хлорид натрияGenesee Scientific18-216
Сонификатор 250Branson100-132-135
Sorvall RC 6 Plus ЦентрифугаThermo Fisher Scientific46910
TCEP (трис-(карбоксиэтил) фосфина гидрохлорид)Gold BiotechnologyTCEP10
Потрясающий бульон ПорошокGenesee Scientific18-225
Tris BaseGenesee Scientific18-146
Мини-ячейка XCell SureLock и модуль XCell II Blot Thermo Fisher ScientificEI0002
5056489001

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morris-Rosendahl, D. J., Crocq, M. -A. Neurodevelopmental disorders: the history and future of a diagnostic concept. Dialogues Clin Neurosci. 22 (1), 65-72 (2020).
  2. Ebstein, F., Küry, S., Papendorf, J. J., Krüger, E. Neurodevelopmental disorders (NDD) caused by genomic alterations of the ubiquitin-proteasome system (UPS): the possible contribution of immune dysregulation to disease pathogenesis. Front Mol Neurosci. 14, 733012(2021).
  3. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67 (10), 425-479 (1998).
  4. Pickart, C. M. Mechanisms underlying ubiquitination. Annu Rev Biochem. 70 (1), 503-533 (2001).
  5. Komander, D., Clague, M. J., Urbé, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 550-563 (2009).
  6. Yau, R., Rape, M. The increasing complexity of the ubiquitin code. Nat Cell Biol. 18 (6), 579-586 (2016).
  7. Koch, I., et al. USP27X variants underlying X-linked intellectual disability disrupt protein function via distinct mechanisms. Life Sci Alliance. 7 (3), e202302258(2024).
  8. Hao, Y. -H., et al. USP7 acts as a molecular rheostat to promote WASH-dependent endosomal protein recycling and is mutated in a human neurodevelopmental disorder. Mol Cell. 59 (6), 956-969 (2015).
  9. Fountain, M. D., et al. Pathogenic variants in USP7 cause a neurodevelopmental disorder with speech delays, altered behavior, and neurologic anomalies. Genet Med. 21 (8), 1797-1807 (2019).
  10. Santiago-Sim, T., et al. Biallelic variants in OTUD6B cause an intellectual disability syndrome associated with seizures and dysmorphic features. Am J Hum Genet. 100 (4), 676-688 (2017).
  11. Beck, D. B., et al. Linkage-specific deubiquitylation by OTUD5 defines an embryonic pathway intolerant to genomic variation. Sci Adv. 7 (4), eabe2116(2021).
  12. Cho, J., Park, J., Kim, E. E., Song, E. J. Assay systems for profiling deubiquitinating activity. Int J Mol Sci. 21 (16), 1-16 (2020).
  13. Matsui, S., Sandberg, A. A., Negoro, S., Seon, B. K., Goldstein, G. Isopeptidase: A novel eukaryotic enzyme that cleaves isopeptide bonds. Proc Natl Acad Sci USA. 79 (5), 1535-1539 (1982).
  14. Rose, I. A., Warms, J. V. B. An enzyme with ubiquitin carboxy-terminal esterase activity from reticulocytes. Biochemistry. 22 (18), 4234-4237 (1983).
  15. Wilkinson, K. D., Cox, M. J., Mayer, A. N., Frey, T. Synthesis and characterization of ubiquitin ethyl ester, a new substrate for ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase. Biochemistry. 25 (21), 6644-6649 (1986).
  16. Pickart, C. M., Rose, I. A. Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase acts on ubiquitin carboxyl-terminal amides. J Biol Chem. 260 (13), 7903-7910 (1985).
  17. Hadari, T., Warms, J. V. B., Rose, I. A., Hershko, A. A ubiquitin C-terminal isopeptidase that acts on polyubiquitin chains: Role in protein degradation. J Biol Chem. 267 (2), 719-727 (1992).
  18. Woo, S. K., et al. Multiple ubiquitin C-terminal hydrolases from chick skeletal muscle. J Biol Chem. 270 (32), 18766-18773 (1995).
  19. Woo, S. K., et al. Purification and characterization of a new ubiquitin C-terminal hydrolase (UCH-1) with isopeptidase activity from chick skeletal muscle. J Biochem. 121 (4), 684-689 (1997).
  20. Baek, S. H., et al. Molecular cloning of a novel ubiquitin-specific protease, UBP41, with isopeptidase activity in chick skeletal muscle. J Biol Chem. 272 (41), 25560-25565 (1997).
  21. Wilkinson, K. D., et al. Metabolism of the polyubiquitin degradation signal: Structure, mechanism, and role of isopeptidase T. Biochemistry. 34 (44), 14535-14546 (1995).
  22. Hu, M., et al. Crystal structure of a UBP-family deubiquitinating enzyme in isolation and in complex with ubiquitin aldehyde. Cell. 111 (7), 1041-1054 (2002).
  23. Hu, M., et al. Structure and mechanisms of the proteasome-associated deubiquitinating enzyme USP14. EMBO J. 24 (21), 3747-3756 (2005).
  24. Gorka, M., Magnussen, H. M., Kulathu, Y. Chemical biology tools to study deubiquitinases and UBL proteases. Semin Cell Dev Biol. 132, 86-96 (2022).
  25. Faesen, A. C., et al. The differential modulation of USP activity by internal regulatory domains, interactors, and eight ubiquitin chain types. Chem Biol. 18 (12), 1550-1561 (2011).
  26. Mevissen, T. E. T., et al. OTU deubiquitinases reveal mechanisms of linkage specificity and enable ubiquitin chain restriction analysis. Cell. 154 (1), 169-184 (2013).
  27. Kwasna, D., et al. Discovery and characterization of ZUFSP/ZUP1, a distinct deubiquitinase class important for genome stability. Mol Cell. 70 (1), 150-164.e6 (2018).
  28. Hu, H., et al. X-exome sequencing of 405 unresolved families identifies seven novel intellectual disability genes. Mol Psychiatry. 21 (1), 133-148 (2016).
  29. Hartmann, I. Shaker Orbit - Revolving in Space Around the Samples? Eppendorf Lab Academy. Eppendorf Lab Academy. , at https://www.eppendorf.com/us-en/lab-academy/lab-solutions/others/shaker-orbit-revolving-in-space-around-the-samples (2020).
  30. Smith, D. B., Johnson, K. S. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene. 67 (1), 31-40 (1988).
  31. Ritorto, M. S., et al. Screening of DUB activity and specificity by MALDI-TOF mass spectrometry. Nat Commun. 5, 4763(2014).
  32. Bustos, F., Bustos, F. Immunoblotting using precast gels. , protocols.io (2024).
  33. Wingfield, P. T. Overview of the purification of recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci. 80, 6.1.1-6.1.35 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

USP27Xin vitroSDSK63

Похожие статьи