Измерение ферментативной активности деубиквитилирующих ферментов, связанных с нарушением развития нервной системы, с помощью анализа расщепления убиквитиновой цепи in vitro

Intisar Koch; Matthew J. Schellenberg; Francisco Bustos

doi:10.3791/67367

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение ферментативной активности деубиквитилирующих ферментов, связанных с нарушением развития нервной системы, с помощью анализа расщепления убиквитиновой цепи in vitro

1.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67367

⸱

27 сентября 2024 г.

Intisar Koch¹ , Matthew J. Schellenberg² , Francisco Bustos¹^,³

¹Pediatrics and Rare Diseases Group, Sanford Research, ²Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic, ³Department of Pediatrics, Sanford School of Medicine, University of South Dakota

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе объясняется, как измерить влияние генетической изменчивости, связанной с нарушениями развития нервной системы, на активность деубиквитилирующего фермента путем комбинации очистки рекомбинантного белка с анализами расщепления убиквитиновой цепи.

Аннотация

Нарушения развития нервной системы (НДР) связаны с нарушениями функции нервной системы, но часто остаются плохо изученными на молекулярном уровне. Дискретные расстройства, вызванные отдельными генами, обеспечивают модели для исследования механизмов, управляющих атипичным нейроразвитием. Варианты генов, кодирующих белки семейства деубиквитилирующих ферментов (DUB), связаны с несколькими NDD, но существует необходимость в определении патогенетических механизмов нарушений, вызванных этими вариантами генов. Влияние вариантов генов на активность DUB может быть экспериментально определено с помощью независимого от субстрата анализа расщепления убиквитина in vitro . Этот анализ не требует знания субстратов для непосредственного измерения каталитической активности. В данной работе протокол определения влияния вариантов генов на ферментативную активность моделируется с использованием DUB Ubiquitin Specific Protease 27, X-linked (USP27X), которая мутировала при X-сцепленной умственной инвалидности 105 (XLID105). Этот экспериментальный конвейер может быть использован для уточнения механизмов, лежащих в основе нарушений развития нервной системы, вызванных вариантами в генах DUB.

Введение

Нарушения развития нервной системы (НДР) возникают в результате различных этиологий с экологическими или генетическими детерминантами, которые стимулируют атипичное развитие нервной системы¹. Генетическое тестирование секвенирования нового поколения связывает растущее число вариантов генов, связанных с системой убиквитина, с генетическими NDD². Система убиквитина катализирует лигирование небольшого белкового модификатора убиквитина в первую очередь до остатков лизина в белковых субстратах, что приводит к изменениям в клеточном поведении, включая локализацию, стабильность, белок-белковые ....