Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мышиная модель геморрагической трансформации, индуцированной острой гипергликемией в сочетании с транзиторной фокальной ишемией

1.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67371

⸱

15 ноября 2024 г.

 ,  ,  , 
1Hubei Key Laboratory of Cognitive and Affective Disorder, Institute of Biomedical Sciences, School of Medicine, Jianghan University

* These authors contributed equally

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

В данном исследовании представлен протокол создания высоковоспроизводимой животной модели геморрагической трансформации (ГТ) с использованием окклюзии/реперфузии средней мозговой артерии (MCAO/R) у мышей C57BL/6 с острой гипергликемией.

Аннотация

Геморрагическая трансформация (ГТ) является серьезным осложнением, которое может возникнуть в результате тромболитической терапии после ишемического инсульта (ИИ), и накладывает значительные ограничения на клиническое применение рекомбинантного тканевого активатора плазминогена (ОТ-ПА). К сожалению, в настоящее время в клинической практике не существует эффективных вмешательств по поводу ГТ. Таким образом, существует острая потребность в стабильных и надежных экспериментальных моделях на животных для выяснения патогенеза ГТ и разработки эффективных стратегий вмешательства. В этом исследовании был представлен протокол создания мышиной модели ГТ, индуцированной острой гипергликемией в сочетании с транзиторной фокальной ишемией (тМЦАО). Самцам мышей C57BL/6J вводили 30% глюкозы для индуцирования гипергликемии, а затем подвергали 60 мин tMCAO с реперфузией. Объем инфаркта, целостность гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и степень внутричерепного кровоизлияния оценивали через 24 ч после МКАО. Результаты показали, что введение глюкозы приводило к транзиторной гипергликемии (14,3-20,3 ммоль/л), что значительно увеличивало как объем инфаркта, так и частоту ГТ. Окрашивание гематоксилин-эозином (H&E) указывало на значительные геморрагические поражения в зоне инфаркта у мышей с гипергликемией. Кроме того, у мышей с гипергликемией наблюдалось отягощенное нарушение ГЭБ, о чем свидетельствует более сильная утечка синего Эванса (БЭ) и ФИТК-декстрана. В заключение следует отметить, что острая гипергликемия надежно и последовательно приводила к макроскопической ГТ в мышиной модели tMCAO. Эта воспроизводимая модель предлагает ценный инструмент для исследования патологических механизмов ГТ и разработки соответствующих терапевтических вмешательств.

Введение

Инфаркт головного мозга является основной причиной инвалидности и второй по значимости причиной смерти среди взрослого населения во всем мире1. Острая фаза играет решающую роль в прогрессировании инфаркта головного мозга, служа поворотным моментом для лечения заболевания. Раннее и своевременное восстановление кровотока в области полутени имеет важное значение для предотвращения дальнейшей гибели клеток головного мозга, при этом тромболизис и интервенционная терапия являются основой лечения острого инфаркта головного мозга (ОАС). Тем не менее, геморрагическая трансформация (ГТ) представляет собой значительное осложнение после тромболизиса и интервенционной терапии, возникающее у 15-30% пациентов с ишемическим инсультом, тем самым в некоторой степени ограничивая их применение 2,3. Возникновение ГТ значительно повышает риск смертности и инвалидности, влияя на прогноз ИАП. Поэтому исследование патологических механизмов ГТ и выявление эффективных терапевтических мишеней имеет большое клиническое значение.

В настоящее время окклюзия средней мозговой артерии (MCAO), индуцированная нитевой эмболией, часто используется в качестве модели ГТ у грызунов4. Длительная обструкция может привести к массивному инфаркту головного мозга с вовлечением коры и стриатума, что потенциально может привести к вторичной ГТ. Нитевая МЦАО не требует трепанации черепа, обладает высокой воспроизводимостью и вызывает очаговое повреждение головного мозга и ГТ, подобно инсульту человека. Тем не менее, эта механическая модель имеет некоторые явные недостатки, в том числе высокие показатели ранней смертности и низкие долгосрочные показатели выживаемости5. Другой часто используемой моделью ГТ является модель тромболизиса, в которой образование тромба сначала индуцируется в целевом сосуде, а затем используется тромболитические препараты (например, РТ-ПА, варфарин) для растворения тромба, имитируя клинический процесс ГТ при ишемическом инсульте 6,7. Несмотря на то, что патологический процесс клинической тромболитической терапии в значительной степени воспроизводится, животные модели ГТ, индуцированные ОТ-ПА или варфарином, сложны в реализации и связаны с высокой смертностью животных, а также с различной частотой и локализацией кровотечений. Для продвижения фундаментальных и клинических трансляционных исследований ГТ после инфаркта головного мозга важно создать воспроизводимую животную модель ГТ, которая проста в эксплуатации и обладает высокой стабильностью.

Гипергликемия является значимым фактором развития ГТ после ишемии/реперфузии головного мозга (В/Р)8. В нескольких ретроспективных исследованиях были проанализированы клинические данные пациентов, перенесших механическую тромбэктомию, и было выявлено, что повышенный уровень глюкозы в крови при поступлении связан с более высокой частотой спонтанной ГТ3. У пациентов с диабетическим инсультом гипергликемия значительно повышает риск развития ГТ и приводит к более тяжелому неврологическому дефициту 9,10. Исследователи разработали модели HT, индуцируя церебральный I/R у животных моделей с диабетом с помощью MCAO. Тем не менее, модель диабета-MCAO имеет длительную продолжительность эксперимента, сложную процедуру и высокую стоимость11,12. Надежная модель ГТ может быть создана путем индуцирования острой гипергликемии путем внутрибрюшинного введения глюкозы и ее интеграции с моделью мозгового I/R, созданной методом наложения швов. Этот метод легко выполняется при постоянном положении кровотечения и эффективно имитирует клинические особенности постинсультной гипергликемии. Тем не менее, существуют значительные различия в критических состояниях, таких как время ишемии и концентрация глюкозы; Кроме того, стабильность модели и частота ГТ не согласуются в различных литературных источниках.

Наша исследовательская группа широко использовала метод острой гипергликемии (MCAO) для создания модели HT. Кроме того, мы провели комплексную серию экспериментов для изучения взаимосвязи между ишемическим временем, концентрацией глюкозы в крови, уровнем заболеваемости ГТ и смертностью животных. Эти эксперименты в конечном итоге привели к выявлению оптимальных условий для создания модели ГТ после инфаркта головного мозга. В этом исследовании представлен подробный протокол для создания модели острой гипергликемии-индуцированной ГТ с использованием внутрибрюшинного введения 30% глюкозы в сочетании с эмболической MCAO.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол эксперимента был одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию Цзянханьского университета (JHDXLL2024-080) и проведен в соответствии с Этическими рекомендациями по экспериментальным животным, выпущенными Центром по контролю за заболеваниями Китая. В исследовании использовались взрослые самцы мышей C57BL/6J массой 21–26 г. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Группировка животных и индуцирование острой гипергликемии

  1. Разместите мышей в центре лабораторных животных Цзянханьского университета в 12-часовом контролируемом цикле свет/темнота (20–22 °C, влажность 50–55%) с пищей и водой в неограниченном количестве.
  2. Случайным образом разделите мышей на четыре группы: Шам + физиологический раствор (n = 12), Шам + глюкоза (n = 12), MCAO + физиологический раствор (n = 12) и MCAO + глюкоза (n = 20).

2. Предоперационная подготовка

Примечание: Все экспериментальные мыши голодали в течение 12 часов перед операцией.

  1. Проведение системной анальгезии (мелоксикам, 5 мг/кг подкожно) и местной анестезии в месте разреза (бупивакаин, 2 мг/кг подкожно) периоперационно.
  2. Стерилизуйте все хирургические инструменты, ватные палочки и хирургические шовные материалы путем автоклавирования при температуре 121 °C и 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 30 минут.
  3. Протрите операционную платформу и окружающую рабочую зону 75% этанолом и включите выключатель обогрева с температурой 37 °C.
  4. Обезболите мышь газовой смесью 3% изофлурана и 20% кислорода в индукционной камере анестезии. Затем оцените рефлекс защемления пальца ноги, чтобы проверить глубину анестезии.
  5. Переместите мышь на хирургическую платформу в положение лежа и быстро вставьте нос мыши в носовой конус. Откройте поток газа к носовому конусу, перекрыв поток в индукционную камеру анестезии. Отрегулируйте пропорцию изофлурана до 2% и установите расход газовой смеси на 0,4 мл/мин для поддержания анестезии.
  6. Нанесите глазной гель на глаза мыши, чтобы сохранить влажность во время операции.
  7. Сбрейте шерсть в области шеи с помощью машинки для стрижки животных. Очистите и продезинфицируйте кожу, чередуя нанесение с йодом и 70% этанолом с помощью дезинфицирующей ватной палочки.
  8. Накройте шею стерильной марлей и вырежьте отверстие, чтобы обнажить операционную область.

3. Базовое измерение мозгового кровотока

  1. Сбрейте волосы в области кожи головы с помощью машинки для стрижки животных. Очистите и продезинфицируйте кожу головы, чередуя нанесение йода и 70% этанола с помощью дезинфицирующей ватной палочки.
  2. Сделайте разрез по средней линии длиной 1,0 см на коже над лобной областью, чтобы обнажить черепной родничок. Держите череп влажным с помощью обычного физиологического раствора.
  3. Подготовьте инструмент лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) и держите наконечник зонда ЛДФ перпендикулярно поверхности левого теменного черепа (1 мм сзади и 5 мм латерально от брегмы); как только FLUX стабилизируется, и запишите базовое значение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Единицей измерения для FLUX являются перфузионные единицы (PU) с диапазоном измерения от 0 до 1000 PU. Идеальным базовым НБВ на лазерной доплеровской флоуметрии является >600 ПУ. Непрерывный период в 5 секунд с диапазоном колебаний менее 10% считается действительным показанием FLUX.
  4. Сшивайте мышцы и кожу отдельно с помощью рассасывающегося шва 5.0 PGA. Нанесите на рану гель диклофенак натрия и мазь мупироцин.

4. Хирургическая процедура MCAO

ПРИМЕЧАНИЕ: MCAO выполняется с использованием модифицированного метода нитевой окклюзии, как ранее было описано Chiang et al.13.

  1. Осторожно переверните мышь в лежачее положение и введите мышам внутрибрюшинно 30% глюкозы (7,2 мл/кг) или физиологический раствор за 15 минут до хирургической процедуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши из групп Sham + glucose и MCAO + glucose получали внутрибрюшинные инъекции глюкозы. Мыши из групп Шам + физраствор и MCAO + солевой раствор получали внутрибрюшинные инъекции обычного физиологического раствора.
  2. Сбрейте шерсть в области шеи с помощью машинки для стрижки животных. Очистите и продезинфицируйте кожу, чередуя нанесение с йодом и 70% этанолом с помощью дезинфицирующей ватной палочки. Накройте шею стерильной марлей и вырежьте отверстие, чтобы обнажить операционную область.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что разрез остается прямым, чтобы добиться оптимальной визуализации сонной артерии.
  3. Сделайте разрез по средней линии размером 1,5 см на вентральной стороне шеи с помощью скальпеля. Раздвиньте подкожную клетчатку и поверхностную фасцию с помощью хирургического пинцета.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что разрез остается прямым, чтобы добиться оптимальной визуализации сонной артерии.
  4. Под поверхностной фасцией расположите подчелюстную железу и перевернутый треугольник, образованный тремя мышцами: грудиноягодиной, расположенной по средней линии над трахеей; заднее брюшко двужелудочной мышцы, узнаваемое по блестящей белой сухожильной части; и, наконец, грудино-сосцевидная мышца.
  5. Выполните тупое рассечение в пределах перевернутого треугольника, чтобы определить и отделить левую общую сонную артерию (ОСА).
  6. Рассеките блуждающий нерв, прилегающий к ОЦА, и слизистую ткань, окружающую кровеносные сосуды, с помощью офтальмологических щипцов. Сделайте рингер на CCA с помощью рассасывающегося шовного материала 5,0 полигликолевой кислоты (PGA), но держите шов ненатянутым.
  7. При выделении вверх по ОСА можно наблюдать разветвление «Y», разделяющее ОСА на наружную сонную артерию (ЭКА) и внутреннюю сонную артерию (ВСА).
  8. Отделите бифуркацию, чтобы полностью обнажить ECA и ICA. Зафиксируйте и плотно завяжите рассасывающийся шов 5.0 PGA вокруг ECA дистально от разветвления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте достаточное расстояние между местом постоянной перевязки и разветвлением сосудов, чтобы предотвратить смещение нити во время вращения ЭХА.
  9. Временно зажмите ОСА и ВСА с помощью двух легких микросеррафинных артериальных зажимов размером 8 мм x 2 мм, чтобы перекрыть кровоток от ОСА к ВСА.
  10. Растяните завязку шва на дистальном отделе ЭХА и ОСА, чтобы выпрямить сегмент ЭХА.
  11. С помощью микроножниц сделайте небольшой разрез между двумя шовными завязками на ECA.
  12. Вставьте монофиламентный шовный материал с силиконовым покрытием (длиной 30 мм, силиконовым покрытием 3–4 мм) в ECA. Зафиксируйте и слегка завяжите второй рассасывающийся шовный материал 5.0 PGA на ECA рядом с разветвлением, чтобы предотвратить отступление монофиламентного шва.
  13. Полностью разрежьте ЭХА дистальнее постоянной лигации и снимите зажим артериальных щипцов с ВСА.
  14. Отведите шов до разветвления ОСА, затем аккуратно втяните и поверните культю ЭКА. Отрегулируйте направление введения шовной нити и медленно вводите ее, примерно на 9,0–10,0 мм от разветвления CCA в ICA, чтобы окклюзировать MCA.
  15. Затяните второй рассасывающийся шов PGA вокруг ECA и снимите артериальный зажим с CCA.
  16. Сшивайте мышцы и кожу отдельно с помощью рассасывающегося шва 5.0 PGA. Нанесите на рану гель диклофенак натрия и мазь мупироцин.
  17. Аккуратно переверните мышь в положение лежа и повторите шаг 3.4. для записи кровотока после окклюзии MCA.
    Мыши, у которых наблюдалось снижение кровотока менее чем на 40% от исходного значения после MCAO, были исключены из исследования14.
  18. Включите выключатель обогрева каркаса восстановления с температурой 37°C. Поместите мышь в клетку для восстановления в период после окклюзии (60 минут).

5. Удаление и реперфузия моноволокна

  1. Повторно обезболите мышь, как описано ранее, непосредственно перед окончанием периода окклюзии.
  2. Зажмите CCA с помощью артерного зажима microclip.
  3. Частично втяните мононить из ICA до тех пор, пока наконечник с силиконовым покрытием не станет виден через ICA.
  4. Поместите еще один зажим артерии с микрозажимом на ВСА над наконечником с силиконовым покрытием.
  5. Полностью извлеките монофиль и плотно зажмите пень ЭХА.
  6. Снимите артерный зажим микроклипсы с ВСА и ОСА соответственно.
  7. Сшивайте мышцы и кожу слой за слоем с помощью рассасывающегося шовного материала 5.0 PGA.
  8. Поместите мышь в камеру восстановления и наблюдайте за всеми мышами, пока они полностью не придут в себя. Применяйте мелоксикам (5 мг/кг, подкожно) для облегчения боли каждые 12 ч в течение 24 ч.

6. Измерение уровня глюкозы в крови

Примечание: Уровень глюкозы в крови измеряли в следующие временные моменты: (1) непосредственно перед операцией MCAO (исходный уровень), (2) сразу после введения моноволокна (через 15 минут после введения глюкозы), (3) сразу после удаления моноволокна сразу после введения моноволокна (через 75 минут после введения глюкозы).

  1. Протрите хвост мыши спиртовым ватным тампоном, чтобы сделать жилу на хвосте полностью гиперемичной.
  2. Отрежьте кончик хвоста на 1–2 мм с помощью хирургических ножниц.
  3. Аккуратно сожмите вдоль корня хвоста до кончика хвоста, способствуя оттоку крови из разреза.
  4. Расположите резервуар для абсорбции образца тестовой бумаги на краю капли крови.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кровь будет втянута в тестовую бумагу из-за эффекта сифона.
  5. Считайте показания глюкометра и запишите результат.
    Примечание: Исключите мышей, у которых уровень глюкозы в крови не поднимался выше 10 ммоль/л после 15 минут инъекции глюкозы.
  6. Удалите излишки крови с помощью ватного тампона и надавите, чтобы остановить кровотечение.

7. Окрашивание 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (ТТХ)

  1. Усыпите мышь путем внутрибрюшинного введения передозировки пентобарбитала (300 мг/кг).
  2. Как только мышь перестанет дышать, немедленно обездвижьте ее в положении лежа на спине.
  3. Вскройте грудную клетку с помощью ножниц, и вырежьте диафрагму, чтобы обнажить сердце.
  4. Введите инъекционную иглу 23 G в левый желудочек мыши и разрежьте ножницами ушной аппендикс.
  5. Принимайте 15 мл физиологического раствора до тех пор, пока жидкость, вытекающая из ушного аппендикса, не станет чистой и прозрачной.
  6. Обезглавите мышь и разрежьте скальп с помощью ножниц, чтобы полностью обнажить череп. Вставьте кончик ножниц на 2 мм немного впереди коронкового шва черепа, чтобы поддеть его.
  7. С помощью пинцета удалите неповрежденную мозговую ткань мыши.
  8. Поместите мозговую ткань в матрицу мозга грызуна и разрежьте ее на корональные срезы диаметром 2 мм.
  9. Переложите ломтики в 24-луночный планшет и инкубируйте их с 2% раствором TTC при 37 °C в течение 15 минут.
  10. Запустите программное обеспечение для сканирования и установите для параметра разрешение 1200 dpi и формат JPG для анализа изображений.
  11. Отрежьте срезы ткани от 24-луночного планшета изогнутыми щипцами и расположите срезы на стеклянной сканирующей пластине.
  12. Отсканируйте срезы тканей, а затем экспортируйте изображения для анализа измерений.
  13. Измерьте площадь инфаркта, скорректировав отек тканей. Вычесть неинфарктную область ипсилатеральной стороны из площади контралатеральной стороны с помощью программного обеспечения ImageJ15. Оценивайте размер инфаркта в процентах от контралатерального полушария. Для получения дополнительной информации об анализе площади инфаркта см. Friedländer et al.16.

8. НаблюдениеГросса

  1. Повторите шаги 7.1–7.8.
  2. Вырежьте срезы ткани из матрисы мозга изогнутыми щипцами и расположите срезы на стеклянной сканирующей пластине.
  3. Отсканируйте корональные срезы головного мозга, как описано в шагах 7.10 и 7.12.

9. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)

  1. Повторите шаги 7.1–7.4. Медленно перфузируйте 15 мл нормального физиологического раствора с последующей перфузией примерно 15 мл параформальдегида (PFA).
  2. Повторите шаги 7.6–7.7. Зафиксируйте мозговую ткань 4% PFA на 24 ч при комнатной температуре.
  3. Поместите неподвижную ткань мозга в автоматический дегидратор тканей для обезвоживания, витрификации и погружения в воск.
  4. Погрузите ткань в парафин и разрежьте ткань мозга на корональные срезы толщиной 5 мкм с помощью микротома.
  5. Очистите ломтик от воска, погрузив его в ксилол три раза, каждое погружение длится 8 минут. Затем постепенно погружайте срез в растворы этанола с убывающей концентрацией (100%, 95%, 90%, 80%, 70%), а затем дистиллированную воду, причем каждый этап длится 5 минут.
  6. Срез окрасить раствором гематоксилина на 3 мин. Затем дифференцируйте его, погрузив в 5% спирт соляной кислоты на 5 секунд.
  7. Инкубируйте срез с раствором эозина в течение 1 минуты, затем обезвожьте и гиалинизируйте его градиентным раствором этанола (90%, 95%, 100%) и ксилолом.
  8. Смонтируйте секцию с помощью нейтральных смол.
  9. Получите изображения окрашенных H&E срезов мозга под ярким полем с помощью флуоресцентной микроскопии.

10. Определение лекаге Эванс Блю (EB)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации об этой процедуре, пожалуйста, обратитесь к Wang et al.17.

  1. Введите 2% (w/v) раствор Evans Blue (EB) (2 мл/кг) через хвостовую вену через 23 ч после MCAO.
  2. Повторите шаги 7.1–7.7 через час после инъекции БЭ и сделайте фотографию всего мозга.
  3. Поместите мозг в мозговую матрицу грызуна и разрежьте его коронально на ломтики диаметром 2 мм. Отсканируйте корональные срезы головного мозга, как описано в шагах 7.10–7.12, чтобы выявить утечку БЭ.
  4. Разделите ломтики на правую и левую части и положите каждый в центрифужную пробирку.
  5. Гомогенизируйте каждый срез мозговой ткани в 50% трихлоруксусной кислоте, в соотношении 100 мг мозговой ткани к 0,4 мл трихлоруксусной кислоты.
  6. После инкубации при 4 °C в течение ночи гомогенат центрифугирует в течение 30 минут при 10 000 x g (при 4 °C).
  7. Переложите надосадочную жидкость в другую центрифужную пробирку и разбавьте ее этанолом в четыре раза.
  8. Измерьте поглощение надосадочной жидкости на длине волны 620 нм с помощью спектрофотометра.
  9. Преобразуйте значения поглощения в концентрацию EB с помощью стандартной кривой EB в этаноле (например, при 31,25, 62,5, 125 и 250 мкг/мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Результат представлен в виде микрограмма EB на грамм мозговой ткани.

11. Определение утечки FITC-Dextran

  1. Введите FITC-декстран (10 кДа, 6 мг/мл, разведенный в 0,01M PBS; 4 мл/кг) в хвостовую вену через 24 ч после MCAO, позволяя ему циркулировать в крови в течение 10 минут.
  2. Повторите шаги 7.1–7.7, чтобы выполнить перфузию и удалить неповрежденную ткань мозга.
  3. Зафиксируйте мозговую ткань в 4% PFA на 24 часа при комнатной температуре в темноте.
  4. Перенесите неподвижную мозговую ткань в раствор сахарозы с градиентными концентрациями 10%, 20% и 30% (разведенный в 0,01М PBS) для обезвоживания.
  5. Внедрите мозговую ткань с помощью компаунда оптимальной температуры резки (ОКТ) и разрежьте на участки мозговой ткани толщиной 30 мкм. Перенесите срезы на предметное стекло микроскопа с помощью петли для инокуляции и убедитесь, что они прилипают к поверхности предметного стекла.
  6. Смонтируйте срезы ткани мозга с помощью монтажной среды, содержащей 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI).
  7. Запустите лазерную конфокальную микроскопию и управляющее программное обеспечение.
  8. Закрепите предметное стекло микроскопа на предметном столике и найдите область инфаркта под 200-кратным окуляром.
  9. Установите разрешение на 1024 x 1024 и отрегулируйте значение усиления и время экспозиции, чтобы получить максимально четкое изображение.
  10. Получение изображений окрашенной области инфаркта головного мозга FITC-Dextran с длиной волны возбуждения 488 нм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Экспериментальная методика данного исследования проиллюстрирована на рисунке 1. В течение 60 мин мышам проводили индуцированную окклюзией нитью MCAO с последующей реперфузией. Глюкозу (30% в нормальном физиологическом растворе, 7,2 мл/кг массы тела) вводили внутрибрюшинно за 15 минут до MCAO. Уровень глюкозы в крови измеряли на исходном уровне (до инъекции глюкозы), сразу после MCAO и в момент реперфузии. Через 24 ч после реперфузии мышей усыпляли, а ткани мозга собирали для...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Настоящий протокол разработан для создания надежной животной модели геморрагической трансформации после ишемического инсульта, которая может воспроизводить вредные эффекты реваскуляризации сосудов в условиях гипергликемии. Среди различных факторов риска ишемического инсульта уровень глюкозы в крови в течение 24 ч после начала инсульта положительно коррелирует с обострением черепно-мозговой травмы и повышенной смертностью 3,18. Мн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет противоречащих друг другу интересов, которые можно было бы раскрыть.

Благодарности

Рисунок 1 был создан с помощью программного обеспечения BioRender (https://www.biorender.com/). Это исследование было поддержано грантами руководящего проекта Фонда естественных наук провинции Хубэй (No 2022CFC057).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2,3,5-трифенилтетразолия хлорид (ТТС)Sigma-Aldrich108380Краситель для окрашивания ТТС
24-луночный культуральный планшетCorning IncorporatedCLS3527Сосуд для окрашивания ТТС
30% глюкоза для инъекцийKelun PharmaceuticalH42021188Индукция острой гипергликемии
4% параформальдегидWuhan Servicebio Technology
Co., Ltd. 		G1101Фиксация тканей
5.0 Рассасывающийся шовный материал с полигликолевой кислотойJinhuan Medical Co., LtdKCR531Оборудование для хирургии
96-луночный культуральный планшетCorning IncorporatedCLS3596Измерение содержания ЭБ
Анестезиологический аппаратMidmark CorporationVMRАнестезия для животных
Antifade Монтажная среда с DAPIBeyotime BiotechP0131Крепление для срезов тканей
Automation-tissue-dehydrating 
машина		Leica BiosystemsTP1020Обезвоживание тканей
Конфокальная микроскопияLeica BiosystemsSTELLARIS 5Получение изображений
Диклофенак натриевый гельMaYinglong PharmaceuticalH10950214Анальгезия для животных
Раствор для окрашивания эозинаServicebio TechnologyG1001Краситель для H& E окрашивание
Evans BlueAladdinE104208EB окрашивание
Гель для глазGuangzhou PharmaceuticalH44023098Материал для хирургии
Fitc-dextanSigma-Aldrich60842-46-8BBB оценка проницаемости
Флуоресцентный микроскопOlympusBX51Получение изображений
Замороженный микротомLeica BiosystemsCM1900Использование для замороженных срезов
ГлюкометрYuWell580Измерение уровня глюкозы в крови
Окрашивание гематоксилина РастворServicebioG1004Краситель для H& Е окрашивание
ЙодЛиркон20020059Материал для хирургии
ИзофлуранRwd Life ScienceR510-22-10Анестезия для животных
Лазерный допплеровский измеритель кровотокаMoor InstrumentsmoorVMSМониторинг кровотока
MCAO Шовные материалыRwd Life Science907-00023-01Материал для хирургии
МелоксикамBoehringer-IngelheimJ20160020Анальгезия для животных
Набор микрохирургических инструментовRwd LifeScience SP0003-MОборудование для хирургии
МикротомThermo Fisher ScientificHM325Производство срезов тканей
Микротомное лезвиеLeica Biosystems819Производство срезов
тканей Мупироцин мазьGlaxoSmithKlineH10930064Противоинфекционный для животных
Нейтральный бальзамAbsin Bioscienceabs9177Seal для H& E окрашивание
Центр встраивания парафинаThermo Fisher ScientificEC 350Производство парафиновых блоков
Пентобарбитал натрияSigma-AldrichP3761Эвтаназия для животных
Фосфат буферизованный физиологический растворBeyotime BiotechC0221AОполаскиватель для среза ткани
СканерEPSONV330Бритва
для сканирования тканейШэньчжэнь Кодос Электроприборы Лтд.CP-9200Оборудование для хирургии
СпектрофотометрThermo Fisher Scientific1510-02362Измерение содержания
EB Раствор сахарозыShanghai Macklin Biochemical57-50-1Обезвоживание для тканей
Fabric-Tek O.C.T. СоединениеSakura4583Среда для встраивания тканей
Трихлоруксусная кислотаSigma-AldrichT6399EB Измерение содержимого

Ссылки

  1. Patel, P., Yavagal, D., Khandelwal, P. Hyperacute management of ischemic strokes: JACC focus seminar. J Am Coll Cardiol. 75 (15), 1844-1856 (2020).
  2. Goncalves, A., et al. Thrombolytic tPA-induced hemorrhagic transformation of ischemic stroke is mediated by PKCβ phosphorylation of occludin. Blood. 140 (4), 388-400 (2022).
  3. Adebayo, O. D., Culpan, G. Diagnostic accuracy of computed tomography perfusion in the prediction of hemorrhagic transformation and patient outcome in acute ischaemic stroke: A systematic review and meta-analysis. Eur Stroke J. 5 (1), 4-16 (2020).
  4. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  5. Knight, R. A., et al. Prediction of impending hemorrhagic transformation in ischemic stroke using magnetic resonance imaging in rats. Stroke. 29 (1), 144-151 (1998).
  6. Orset, C., et al. Combination treatment with U0126 and rt-PA prevents adverse effects of the delayed rt-PA treatment after acute ischemic stroke. Sci Rep. 11 (1), 11993(2021).
  7. Kwon, I., et al. Hemorrhagic transformation after large cerebral infarction in rats pretreated with dabigatran or warfarin. Stroke. 48 (10), 2865-2871 (2017).
  8. Mi, D., et al. Correlation of hyperglycemia with mortality after acute ischemic stroke. Ther Adv Neurol Disord. 11, 1756285617731686(2018).
  9. Seners, P., Turc, G., Oppenheim, C., Baron, J. C. Incidence, causes and predictors of neurological deterioration occurring within 24 following acute ischaemic stroke: A systematic review with pathophysiological implications. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 86 (1), 87-94 (2015).
  10. Reshi, R., et al. Hyperglycemia in acute ischemic stroke: Is it time to re-evaluate our understanding. Med Hypotheses. 107, 78-80 (2017).
  11. Graham, M. L., Schuurman, H. J. Validity of animal models of type 1 diabetes, and strategies to enhance their utility in translational research. Eur J Pharmacol. 759, 221-230 (2015).
  12. Rehni, A. K., Liu, A., Perez-Pinzon, M. A., Dave, K. R. Diabetic aggravation of stroke and animal models. Exp Neurol. 292, 63-79 (2017).
  13. Chiang, T., Messing, R. O., Chou, W. H. Mouse model of middle cerebral artery occlusion. J Vis Exp. 48, e2761(2011).
  14. Ma, F., Sun, P., Zhang, X., Hamblin, M. H., Yin, K. J. Endothelium-targeted deletion of the miR-15a/16-1 cluster ameliorates blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke. Sci Signal. 13 (621), eaay5686(2020).
  15. Wanson, R. A., et al. A semiautomated method for measuring brain infarct volume. J Cereb Blood Flow Metab. 10 (2), 290-293 (1990).
  16. Friedländer, F., et al. Reliability of infarct volumetry: Its relevance and the improvement by a software-assisted approach. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (8), 3015-3026 (2017).
  17. Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, 6588(2014).
  18. Wang, C., et al. Association between red blood cell distribution width and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke patients. Cerebrovasc Dis. 48 (3-6), 193-199 (2019).
  19. Zhu, B., et al. Stress hyperglycemia and outcome of non-diabetic patients after acute ischemic stroke. Front Neurol. 10, 1003(2019).
  20. Won, S. J., Tang, X. N., Suh, S. W., Yenari, M. A., Swanson, R. A. Hyperglycemia promotes tissue plasminogen activator-induced hemorrhage by increasing superoxide production. Ann Neurol. 70 (4), 583-590 (2011).
  21. Zhang, F. H., et al. Rosiglitazone attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation after transient focal ischemia in rats. Neuroscience. 250, 651-657 (2013).
  22. Soejima, Y., et al. Hyperbaric oxygen preconditioning attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation after transient MCAO in rats. Med Gas Res. 2 (1), 9(2012).
  23. Chen, C., Ostrowski, R. P., Zhou, C., Tang, J., Zhang, J. H. Suppression of hypoxia-inducible factor-1alpha and its downstream genes reduces acute hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation in a rat model of cerebral ischemia. J Neurosci Res. 88 (9), 2046-2055 (2010).
  24. Lin, Y., et al. Docosahexaenoic acid attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation after transient focal cerebral ischemia in rats. Neuroscience. 301, 471-479 (2015).
  25. MacDougal, E. L., Herman, W. H., Wing, J. J., Morgenstern, L. B., Lisabeth, L. D. Diabetes and ischaemic stroke outcome. Diabet Med. 35 (9), 1249-1257 (2018).
  26. Yang, C., Hawkins, K. E., Doré, S., Candelario-Jalil, E. Neuroinflammatory mechanisms of blood-brain barrier damage in ischemic stroke. Am J Physiol Cell Physiol. 316 (2), C135-C153 (2019).
  27. Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Curr Protoc Neurosci. 79, 9.58.1-9.58.15 (2017).
  28. Ahishali, B., Kaya, M. Evaluation of blood-brain barrier integrity using vascular permeability markers: Evans Blue, Sodium Fluorescein, Albumin-Alexa Fluor conjugates, and Horseradish Peroxidase. Methods Mol Biol. 2367, 87-103 (2021).
  29. Kovács, K. B., Bencs, V., Hudák, L., Oláh, L., Csiba, L. Hemorrhagic transformation of ischemic strokes. Int J Mol Sci. 24 (18), 14067(2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Исправление


Formal Correction: Erratum: A Mouse Model of Hemorrhagic Transformation Induced by Acute Hyperglycemia Combined with Transient Focal Ischemia
Posted by JoVE Editors on 1/06/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/67371

Больше статей

Модель мышей с гипергликемиейокклюзия средней мозговой артериигематоэнцефалический барьеробъем церебрального инфарктапроницаемость для бризового синегоутечка FITC-декстранаокрашивание гематоксилином и эозиномлазерная допплерометрия кровотока
Мышиная модель геморрагической трансформации, индуцированной острой гипергликемией в сочетании с транзиторной фокальной ишемией
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.