Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Модель заживления ожоговых ран мышей на основе цифрового нагревательного устройства

2.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67375

⸱

27 декабря 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Center for Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

В этой статье

Краткое содержание

Представлен оптимизированный протокол для создания модели заживления ожоговых ран у мышей с использованием цифрового нагревательного устройства. Созданные на коже экспериментальные участки, похожие на шахматную доску, облегчают дальнейший функциональный анализ для анализа заживления ран.

Аннотация

Тяжелые ожоговые травмы являются одними из самых травматических и физически изнурительных состояний, поражая почти все системы органов и приводя к значительной заболеваемости и смертности. Учитывая их сложность и вовлеченность нескольких органов, были созданы различные животные модели для воспроизведения различных аспектов ожоговой травмы. Методы, используемые для получения обожженных поверхностей, различаются в зависимости от экспериментальных моделей на животных. В этом исследовании описывается простая, экономичная и удобная в использовании модель ожога мышью для создания последовательных ожогов по всей толщине с помощью цифрового нагревательного устройства. Наконечник этого устройства прикладывался к тыльной стороне мышей в течение 10 с при температуре 97 °C для установления ожога, похожего на шахматную доску, и изучения заживления раны при обработке экспериментальной повязкой. Образцы кожи были собраны для гистологического анализа, включая окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) и окрашивание по Массону. Заживление раны оценивали с помощью анализа области раны и микроскопического исследования воспалительной инфильтрации, реэпителизации и образования грануляционной ткани. Модель ожоговой травмы мыши может служить фундаментальным инструментом в изучении патофизиологии термических травм и оценке терапевтических вмешательств.

Введение

Ожоги считаются одной из критических травм кожи, вызванных воздействием тепла, электричества, химических материалов, а также радиационного облучения 1,2. Его можно классифицировать на четыре степени в зависимости от глубины травмы, начиная от эпидермиса и заканчивая полной толщиной кожи, и даже мышцами и костями. Небольшие ожоги могут привести к образованию рубцов и увеличить риск инфицирования. Большая площадь ожоговой травмы не только вызывает местное повреждение, но и стимулирует нарушения работы сердца, почек и других органов или систем организма посредством тяжелого и длительного воспаления и иммунных реакций, что приводит к серьезным системным последствиям и высокой заболеваемости3. У большинства выживших после ожоговых травм отмечаются длительные физические недостатки, эмоциональный стресс и снижение качества жизни 4,5. Поэтому важно изучать патологический процесс ожогов и механизмы регенерации обожженных тканей.

Участвующие в иммунных реакциях, регенерации тканей и систематическом гомеостазе, исследования in vitro не смогли всесторонне изучить патологический процесс заживления ожоговых ран. Таким образом, за последние два десятилетия для изучения потенциальных терапевтических вмешательств были разработаны различные животные модели заживления ожоговых ран, чтобы воспроизвести различные особенности ожоговой травмы 6,7. Ожоговые раны обычно образуются на тыльной поверхности свиней, крыс, мышей, кроликов и других животных после удаления шерсти. Время горения может составлять от 3 до 30 секунд для образования термических повреждений от частичной до полной толщины с диапазоном от 5% до 30% общей площади поверхности тела (TBSA)8. В настоящее время не существует стандартизированных моделей этих методов в исследованиях на ожоговых животных из-за высокой вариативности используемых методов. Методы, используемые для получения обожженных поверхностей, различаются в зависимости от экспериментальных моделей на животных, включая газовое пламя9, горящую ванну с этанолом10, предварительно нагретую одиночную металлическую пластину/стержень11,12, кипячение или горячую воду13,14. Тем не менее, техника нанесения ожога и глубина полученного ожога часто противоречивы и плохо описаны в предыдущих исследованиях, что имеет решающее значение при определении тяжести ожога и метода лечения ожога.

Данное исследование направлено на разработку простой, экономически эффективной и удобной в использовании модели животного для создания последовательных ожогов на всю толщину в смоделированных клинических сценариях. В этом протоколе мы использовали удобное цифровое нагревательное устройство, чтобы контролировать глубину ожога путем регулировки температуры, наносимой на кожу. Наконечник этого устройства может быть изменен на различные размеры, чтобы вызвать термические ожоги с различными диапазонами TBSA. Это позволяет создать на спине мыши ожоговую рану, похожую на шахматную доску, что позволяет сравнивать несколько экспериментальных и контрольных методов лечения у одного и того же животного. Мы наблюдали и записывали процесс закрытия раны. Образцы кожи собирали для гистологической оценки (окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) и трихромное окрашивание по Массону) на разных стадиях заживления ран. Такой подход сокращает количество животных, используемых в эксперименте, и, следовательно, снижает экономические затраты, будучи при этом более совместимым с этикой животных. Это исследование предоставит исследователям необходимые инструменты для содействия разработке новых методов лечения ожоговой травмы и выявления патофизиологических механизмов заживления ожоговых ран.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры на животных в этом исследовании были рассмотрены и одобрены Этическим комитетом Западно-Китайской школы стоматологии Сычуаньского университета (WCHSIRB-D-2024-499). В настоящем исследовании были использованы двадцать четыре восьминедельные мыши C57BL/6 (самки, масса тела 25-30 г). Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка оборудования и мыши к ожоговой травме

  1. Приобретите животных и поместите их в клетки на 7 дней по прибытии, чтобы они могли акклиматизироваться к окружающей среде.
  2. Простерилизуйте рабочую зону, распылив и протерев 70% этанолом (v/v). Накройте операционный стол стерильными хирургическими абсорбирующими прокладками.
  3. Отрегулируйте температуру цифрового нагревательного прибора до 97 °C. Нагревательное устройство состоит из трех частей (рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Температуру в диапазоне от 50 до 450 °C можно регулировать с помощью регулятора температуры (Рисунок 1A). Основание подставки используется для установки наконечника (Рисунок 1B), который можно демонтировать (Рисунок 1C) для замены инструментов разных размеров. Продезинфицируйте наконечник йодофором или спиртом.
  4. Обезболивайте мышь 5% изофлураном в 100% кислороде в индукционной камере в течение 3 мин (скорость потока: 4 л/мин) до тех пор, пока дыхание не замедлится. Оцените глубину анестезии с помощью теста с щипцом ноги.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вдыхание изофлурана может привести к сонливости и нанести вред сердечно-сосудистой системе. Важно носить защитное снаряжение и обращаться с ним в вытяжном шкафу в хорошо проветриваемом помещении.
  5. Как только мышь будет глубоко обезболивая, перенесите ее на подогретую подушку в положении лежа, чтобы сохранить тепло и предотвратить переохлаждение во время восстановления после анестезии. Уменьшите изофлуран до 1. 5% кислорода для обслуживания через носовой обтекатель.
  6. Нанесите смазывающий гель на оба глаза мыши с помощью ватного тампона, чтобы предотвратить высыхание роговицы.

2. Причинение ожоговой травмы на всю толщину

ПРИМЕЧАНИЕ: Общий процесс индукции и анализа горения показан на рисунке 2.

  1. Выбрейте кожу мыши с помощью электробритвы на участке длиной примерно 5 см и шириной 4 см от шеи до хвоста. Работайте осторожно, чтобы не травмировать кожу во время бритья (рисунок 3C).
  2. С помощью ватного аппликатора нанесите крем для депиляции на выбритую кожу на 3 минуты (Рисунок 3D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте нанесения крема для депиляции на другие части мыши, чтобы предотвратить ожоги, которые может быть трудно обнаружить. Крем вызывал кожные высыпания при использовании более 5 минут. Точная продолжительность для достижения оптимальной эффективности варьируется в зависимости от продукта и должна определяться оператором.
  3. Сотрите крем с помощью влажной марли до тех пор, пока крем и волосы не будут обнаружены. Продезинфицируйте операционную область с помощью скраба с хлоргексидином, а затем добавьте 70% этанол (v/v) три раза. Очистите и высушите участок стерильной марлей.
  4. Используйте стерилизованный наконечник пипетки объемом 1 мл диаметром 9 мм (рис. 3A), смоченный в стерилизованных чернилах, чтобы точно определить желаемые места ран. Спинная кожа мыши характеризуется неровным рельефом. Определение области раны отдельно от спинного мозга мышей имеет важное значение для обеспечения повторяемости.
  5. Накройте кожу предварительно обрезанной стерильной простыней, оставив операционную область свободной (рисунок 3). Наденьте термостойкие перчатки и проверьте температуру цифрового нагревательного прибора. До и после индукции горения продезинфицируйте наконечник устройства с помощью 70% этанола (v/v).
  6. Приложите наконечник нагревательного устройства к центру расположенных участков раны (97 °C в течение 10 с) для создания шести круглых ран диаметром 4 мм (рисунок 3В). Интервал между соседними ожогами составляет 0,5-1 см. Определите количество ожогов в соответствии с планом эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожог вызван в основном теплопроводностью; Поэтому нет необходимости оказывать давление на стержень, т. е. удерживать его в контакте с кожей под действием силы тяжести во время индукции ожога. Для экспериментального проекта было проведено шесть включений. Это максимальное количество ожоговых ран, которое можно построить в соответствии с используемым нами устройством и площадью тыльной поверхности мыши. На этой основе можно получить множественные повторения одной и той же экспериментальной группы.

3. Уход и измерение после ожога

  1. Приложите лед к ожоговой ране на 5 минут, чтобы уменьшить потенциальную боль и справиться с болью (Рисунок 3G).
  2. Выключите изофлуран, а после ожоговой травмы удалите носовой конус. Переложите мышь на грелку до тех пор, пока мышь не будет двигаться нормально (например, не приседать и не дрожать).
  3. Поместите каждую мышь в клетку для восстановления, чтобы они не поцарапали друг друга. Размягчите некоторые гранулы корма, добавив 5-10 капель питьевой воды в каждую гранулу, и положите их на пол клетки, чтобы облегчить кормление.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизация клеток путем распыления и протирания 70% этанолом (об/об.). Подстилку следует регулярно менять, чтобы мыши оставались в тепле и впитывали мочу.
  4. Вводите бупренорфин (0,1 мг/кг) подкожно в каудальную область два раза в сутки в общей сложности 3 дня, обеспечивая интервал между инъекциями не менее 8 часов.
  5. Промойте все раны стерильной марлей, смоченной физиологическим раствором, через 24 ч после индукции ожога. Промокните кожу марлей и нанесите небольшое количество антибактериального геля (гидрогеля TKH) с помощью шприца, чтобы покрыть ожоговую рану12,14. Повторите эту процедуру на 3, 7 и 10 день после этого.
  6. Используйте дышащую прозрачную повязку, чтобы закрыть раны. Размер повязки должен покрывать около 1 см вокруг раны и не должен закрывать область без эпиляции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Меняйте повязку на рану не реже одного раза в 2 дня. Длительное использование повязки без замены может привести к инфицированию раны с образованием гноя, что приводит к замедлению заживления раны.
  7. На протяжении всего периода наблюдения измеряйте вес каждые 2-3 дня. Как правило, мыши, которые теряют 15-20% от своей первоначальной массы тела, должны быть принесены в жертву и исключены из эксперимента.

4. Сбор ран

  1. Через 0, 3, 7, 10 и 14 дней отметьте рану кончиком стерильного наконечника пипетки объемом 1 мл и запишите это на цифровую камеру.
  2. Усыпляйте мышей путем передозировки анестезии и вывиха шейки матки (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны во время вывиха шейного отдела, чтобы избежать чрезмерного вытягивания, которое может повредить тыльную рану.
  3. С помощью ножниц изолируйте место раны и окружающую кожу, включая нижележащую мускулатуру (1 см х 1 см). Подготовьте не менее трех образцов для каждой группы.
  4. Зафиксируйте образцы кожи в 4% параформальдегиде (PFA) на 24 часа и храните при температуре 4 °C. Объем фиксатора должен быть в 30 раз больше объема тканив 15,16 раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PFA опасен. Убедитесь, что работа ведется в хорошо проветриваемом помещении и используйте соответствующие средства защиты.

5. Оценка заживления ран

  1. Дважды промойте ткань раны PBS и намажьте ее фильтровальной бумагой, которую следует обрезать до соответствующего размера (рисунок 2H). Благодаря наличию некоторого слизистого содержимого в слое подкожной клетчатки, он прилипает к поверхности фильтровальной бумаги без движения или скручивания тканей.
    1. Поместите фильтровальную бумагу и образец в тканевую кассету для обезвоживания парафина, чтобы получить относительно гладкие образцы ткани, а затем заделайте ткань15,16. Хранить образцы при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимально растягивайте ткань и избегайте складок, так как эти складки станут постоянными после фиксации.
  2. Разрежьте залитые парафином образцы на срезы толщиной 5 мкм и нанесите на предметные стекла с помощью H&E и трихрома Массона для оценки степени грануляционной ткани, формирования ангиогенеза и отложения коллагена, что позволило получить доказательства для оценки различных стадий и прогрессирования заживления ран17,18.
  3. Получение изображений всех образцов с помощью микроскопа с 40-кратным объективом.
  4. Используйте совместимое программное обеспечение для анализа окрашенного участка кожи, включая эпидермис, дерму, подкожную клетчатку и состояние мышц.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом протоколе с помощью цифрового нагревательного устройства создавались ожоговые раны, похожие на шахматные доски, с продолжительностью ожога 10 с при температуре 97 °C (рис. 1). Наконечник устройства изготовлен из чистой меди, которая известна своей отличной теплопроводностью и способностью к быстрому нагреву. Рукоятка, которую держит экспериментатор, изготовлена из поликарбонатного материала, что обеспечивает термостойкость и негорючесть. По сравнению с предварительно нагретой одиночно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для исследований ожогов модели in vitro обычно сосредоточены на ингибирующем действии местных антимикробных агентов или антибиотиков на бактерии, связанные с ожогами, таких как золотистый стафилококк и синегнойная палочка 19, а также на воздействии различных биоматериалов (таких как эластин, шелк и гидрогелевые повязки)) на воспалительных клетках после ожога (таких как нейтрофил...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Сычуаньской научно-технической программой (23ZYZYTS0120), грантами Западно-Китайской стоматологической больницы Сычуаньского университета (RD-03-202011) и Сычуаньской научно-технической программой (2022NSFSC0614). Фигурки были созданы с помощью BioRender. com.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 мл наконечник для пипеткиKIRGEN,СШАKG1333Используется для локализации ожоговых ран
3 M Tegaderm пленка3M,США1624WCN 6 см x 7 смДля индукции раны после ожога
4% параформальдегид (PFA)Biosharp, КитайBL539AИспользуется для фиксации образцов кожи
БупренорфинСигма-Олдрич,СШАPHR8955-50MGДля обезболивания мышей
C57BL / 6 мышейChengdu Dashuo экспериментальная компания по животноводству, КитайнетДля создания модели ожога
крем для депиляцииVeet, Китай—Для удаления волос на тыльной стороне мышей
Цифровое нагревательное устройствоShenzhen Kapper Technology Company, КитайNo.936DДля индукции ожогов мышей
Электрическая бритваAUX, КитайAUX-A5Для удаления волос на тыльной стороне мышей
Фильтровальная бумага——Используется для разворачивания образцов кожи
Программное обеспечение GraphPad—GraphPad prism 9.5.0Для анализа ожоговой области раны
Термостойкие перчатки——Используется для удержания наконечника цифрового нагревательного устройства
Набор для окрашивания гематоксилином и эозиномSolarbio, КитайG1120Для гистологического анализа предметных стекол
программное обеспечение ImageJ—ImageJ 1.54fДля анализа области ожоговой раны
IsofluraneRWD, КитайR510-22-10Для анестезии мышей
Masson's Trichrome Stain KitSolarbio, КитайG1340Для гистологического анализа предметных стекол
МикроскопOlympus, Япония VS200 ASWИспользуется для сканирования H& E и Masson окрашенные слайды
Тканевая кассетаCITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD,Китай31050102WДля обезвоживания парафина в ткани и встраивания парафина

Ссылки

  1. Mofazzal Jahromi, M. A., et al. Nanomedicine and advanced technologies for burns: Preventing infection and facilitating wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 123, 33-64 (2018).
  2. Burgess, M., Valdera, F., Varon, D., Kankuri, E., Nuutila, K. The immune and regenerative response to burn injury. Cells. 11 (19), 3073(2022).
  3. Arbuthnot, M. K., Garcia, A. V. Early resuscitation and management of severe pediatric burns. Sem Pediatr Surg. 28 (1), 73-78 (2019).
  4. Smolle, C., et al. Recent trends in burn epidemiology worldwide: A systematic review. Burns. 43 (2), 249-257 (2017).
  5. Jeschke, M. G., et al. Burn injury. Nat Rev Dis Primers. 6, 11(2020).
  6. Nomellini, V., Gomez, C. R., Gamelli, R. L., Kovacs, E. J. Aging and animal models of systemic insult: Trauma, burn, and sepsis. Shock. 31 (1), 11-20 (2009).
  7. Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. J Biomed Biotechnol. 2011, 969618(2011).
  8. Abdullahi, A., Amini-Nik, S., Jeschke, M. G. Animal models in burn research. Cell Mol Life Sci. 71 (17), 3241-3255 (2014).
  9. Katakura, T., Yoshida, T., Kobayashi, M., Herndon, D. N., Suzuki, F. Immunological control of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) infection in an immunodeficient murine model of thermal injuries. Clin Exp Immunol. 142 (3), 419-425 (2005).
  10. Dai, T., et al. Animal models of external traumatic wound infections. Virulence. 2 (4), 296-315 (2011).
  11. Tavares Pereira, D. D. S., Lima-Ribeiro, M. H. M., De Pontes-Filho, N. T., Carneiro-Leão, A. M. D. A., Correia, M. T. D. S. Development of animal model for studying deep second-degree thermal burns. J Biomed Biotechnol. 2012, 460841(2012).
  12. Gong, Y., et al. Exudate absorbing and antimicrobial hydrogel integrated with multifunctional curcumin-loaded magnesium polyphenol network for facilitating burn wound healing. ACS Nano. 17 (22), 22355-22370 (2023).
  13. Dahiya, P. Burns as a model of sirs. Front Biosci. 14 (13), 4962-4967 (2009).
  14. Yergoz, F., et al. Heparin mimetic peptide nanofiber gel promotes regeneration of full-thickness burn injury. Biomaterials. 134, 117-127 (2017).
  15. Rao, G., et al. Rat burn model to study full-thickness cutaneous thermal burn and infection. J Vis Exp. (186), e64345(2022).
  16. Yampolsky, M., Bachelet, I., Fuchs, Y. Reproducible strategy for excisional skin-wound-healing studies in mice. Nat Protoc. 19 (1), 184-206 (2024).
  17. Wang, C., et al. Engineering bioactive self-healing antibacterial exosomes hydrogel for promoting chronic diabetic wound healing and complete skin regeneration. Theranostics. 9 (1), 65-76 (2019).
  18. Papp, A., et al. The progression of burn depth in experimental burns: A histological and methodological study. Burns. 30 (7), 684-690 (2004).
  19. Barrett, J. P., et al. An in vitro study into the antimicrobial and cytotoxic effect of Acticoat dressings supplemented with chlorhexidine. Burns. 48 (4), 941-951 (2022).
  20. Lou, P., et al. Injectable self-assembling peptide nanofiber hydrogel as a bioactive 3D platform to promote chronic wound tissue regeneration. Acta Biomater. 135, 100-112 (2021).
  21. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
  22. Bielefeld, K. A., Amini-Nik, S., Alman, B. A. Cutaneous wound healing: Recruiting developmental pathways for regeneration. Cell Mol Life Sci. 70 (12), 2059-2081 (2013).
  23. Yildiz, S. C., Demir, C., Ayhanci, A. Examination of the effects of kefir on healing factors in a mice burn model infected with E. coli, S. aureus and P. aeruginosa using qRT-PCR. Burns. 49 (2), 425-431 (2023).
  24. Wang, Y., et al. Burn injury: Challenges and advances in burn wound healing, infection, pain and scarring. Adv Drug Deliv Rev. 123, 3-17 (2018).
  25. Chen, Y., et al. Research advances in smart responsive-hydrogel dressings with potential clinical diabetic wound healing properties. Mil Med Res. 10 (1), 37(2023).
  26. Ito, M., et al. Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis. Nat Med. 11 (12), 1351-1354 (2005).
  27. Ito, M., et al. Wnt-dependent de novo hair follicle regeneration in adult mouse skin after wounding. Nature. 447 (7142), 316-320 (2007).
  28. Chen, K., et al. Pullulan-collagen hydrogel wound dressing promotes dermal remodeling and wound healing compared to commercially available collagen dressings. Wound Repair Regen. 30 (3), 397-408 (2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Модель ожога у мышейполнослойные ожогианализ площади раныгистологический анализвоспалительная инфильтрациягрануляционная тканьреэпителизацияпептидный гидрогель
Модель заживления ожоговых ран мышей на основе цифрового нагревательного устройства
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.