Методическая статья

Эффективный нокдаун генов в печени с помощью интраспленочной инъекции малой РНК, доставляемой аденоассоциированным вирусом серотипа 8 (AAV8)

1.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67376

⸱

1 ноября 2024 г.

 , 
1Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University Health Science Center, 2Department of Translational Medical Sciences, College of Medicine, Texas A&M University Health Science Center

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает, как интраспленочная инъекция малой РНК, доставляемой AAV8, достигает такой же эффективности нокдауна гена в печени, как и инъекция в воротную вену, представляя собой более простую процедуру с гораздо более низкой периоперационной и послеоперационной смертностью и осложнениями.

Аннотация

Печень является основным органом, выполняющим важнейшие метаболические функции. Разработка эффективного и безопасного метода подавления экспрессии генов в печени является важным инструментом для определения функции генов в патофизиологии печени. В этом исследовании мы описываем метод внутриселезеночного введения аденоассоциированного вируса серотипа 8 (AAV8), сконструированного для экспрессии небольшой шпильной РНК (шРНК) против целевого гена, представляющего интерес, нуклеостемина (NS). Внутриселезеночная инъекция AAV8, экспрессирующей NS-нацеленную shRNA (AAV8-shNS1), достигала той же эффективности нокдауна NS в печени, что и инъекция в воротную вену, по сравнению с инъекцией AAV8, экспрессирующей скремблированную последовательность shRNA (AAV8-shScr). Кроме того, инъекция вируса AAV8-shRNA вызывала минимальные воспалительные реакции в паренхиме печени. Самое главное, что этот протокол внутриселезеночного введения не был технически сложным и вызывал минимальное кровотечение в месте инъекции, что является основной причиной периоперационной и послеоперационной смертности при выполнении инъекции воротной вены. В этом исследовании сообщается об улучшенном и относительно безопасном методе достижения эффективного нокдауна генов в печени.

Введение

Печень является жизненно важным органом, который метаболизирует питательные вещества и химические вещества, но также находится под постоянным воздействием цитотоксических и канцерогенных воздействий. В то время как взрослая печень способна восстанавливаться после травмы, ее регенеративная способность серьезно снижаетсяк 1 году. На сегодняшний день единственным терапевтическим вариантом для пациентов с терминальной стадией хронических заболеваний печени или массивным острым поражением печени является трансплантация печени, которая сама по себе создает множествопроблем2. Чтобы лучше понять молекулярную патофизиологию печени путем изучения функций генов, представляющих интерес, были разработаны генетические манипуляции для применения in vivo , включая РНК-опосредованный нокдаун и целевую делецию с помощью рекомбиназы Cre в присутствии сайтов loxP3. Кассета Cre-экспрессии и конструкция шРНК могут доставляться вирусными носителями.

Аденоассоциированный вирус серотипа 8 (AAV8) является надежным вектором для доставки генов в отдельные типы тканей (например, печень, скелетные мышцы, сердце, мозг и поджелудочную железу) с высокой эффективностью и низкой воспалительной реакцией 4,5. Для воздействия на внутренние органы тела AAV8 обычно вводится путем инъекции в хвостовую вену, при которой вирусные частицы сначала проходят через легкие, прежде чем достичь системного кровообращения. Напротив, инъекция в воротную вену позволяет им сначала достичь печени, прежде чем циркулировать через легкие, что является потенциальным источником секвестрации и разведения. Тем не менее, инъекция воротной вены является технически сложной и часто осложняется кровотечением, вызванным операцией, и высоким уровнем смертности. Чтобы достичь эффективного нокдауна гена (KD) в печени и избежать проблемы высокой пери/послеоперационной смертности, мы протестировали метод внутриселезеночного введения AAV8, несущего сконструированную shRNA, нацеленную на нуклеостемин (NS) (AAV8-shNS1), и сравнили его эффективность с эффективностью инъекции AAV8-shNS1 через воротную вену.

NS — это белок, обогащенный стволовыми/прогениторными клетками, обнаруженный сначала в нейральных стволовых клетках, а затем в нескольких других типах стволовых клеток и раковых опухолях 6,7. Биологическое значение НС показано ранним эмбриональным летальным фенотипом мышей с нокаутом зародышевой линии (NSKO) in vivo 3,8 и индуцированным NSKD нарушением самообновления in vitro 9,10. У взрослых животных высокие уровни экспрессии NS обнаруживаются в яичках и нескольких тканях, подвергающихся регенерации, включая дедифференцированные эпителиальные клетки, пигментированные тритоном после лентэктомии и мышечные клетки после ампутации конечностей11, а также регенерирующие ткани млекопитающих, такие как кардиомиоциты мышей после повреждения сердца12 и гепатоциты после повреждения печени (например, CCl4) или хирургической резекции (например, частичная гепатэктомия)13,14. Кроме того, было показано, что НС играет важную роль в развитии опухолей молочной железы, печени и полости рта 15,16,17. Было показано, что НС способствует самообновлению, защищая реплицирующийся геном от повреждения ДНК18,19. Однако в связи с ранним эмбриональным летальным фенотипом зародышевой линии NSKO необходим экспериментальный метод временного введения NSKD после завершения развития тканей для дальнейшего определения его биологической активности во взрослых органах.

В этой статье мы используем NS в качестве примера, чтобы проиллюстрировать создание и тестирование in vivo метода гена печени KD, который является эффективным и имеет низкую смертность, вызванную процедурой.

Протокол

Все эксперименты на животных, завершенные в этом исследовании, были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Центре медицинских наук Техасского университета A&M в Хьюстоне (номер утверждения: 2021-0264-IBT) и выполнены в соответствии со всеми соответствующими нормативными и институциональными рекомендациями. Использовали самок мышей C57BL/6J (возраст 4-5 месяцев, масса тела 23-30 г). Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Разработка и производство AAV8-шРНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь к Sands et al.4 для получения подробной информации о процедуре.

  1. Дизайн-смысловые и антисмысловые олигонуклеотиды шРНК, нацеленные на длинную последовательность с 21 нуклеотидом в кодирующей области интересующего гена. В этом случае использовали мышиный NS (shNS1) и скремблированную последовательность из 21 нуклеотида в качестве отрицательного контроля (shScr) (рис. 1A, нижняя панель).
  2. Включите в структуру шпильки последовательность стеблевой петли TTCAAGAGA, 5' тупой конец, 3' XhoI-совместимый когезивный конец и ген-специфичную целевую сенсорную последовательность 5'-GAA CTA AAA CAG CAG CAG AAA-3' (shNS1) или скремблированную последовательность 5'-TCT CGC TTG GGC GAG AGT AAG-3' (shScr).
  3. Фосфорилируют и отжигают каждую пару олигонуклеотидов.
  4. Расщепляйте вектор переноса гена AAV, AV5-siRNA-GFP (рис. 1A, верхняя панель), с HpaI и XhoI, дефосфорилатом и гелем для очистки фрагмента вектора.
  5. Лигатируйте отожженные олигонуклеотиды в гель-очищенный вектор.
  6. Преобразуйте продукты лигированной ДНК в компетентные бактерии DH5α с эффективностью субклонирования.
  7. Выберите одиночные клоны по устойчивости к ампициллину и вырастите бактериальную культуру объемом 100 мл для мини-плазмиды. Подтвердите правильность клонирования с помощью секвенирования и подготовьте плазмиды с помощью коммерчески доступного набора без эндотоксинов (следуя инструкциям производителя).
  8. Упакуйте вирусы AAV8 путем трансфекции вектора переноса AV5, Rep/Cap серотипа 8 и хелперных плазмид AdF6 в клетки 293T с помощью реагента для трансфекции iMFectin. В общей сложности 40 × 15 см тарелок были перефицированы и собраны/переварены через 3 дня после трансфекции.
  9. Извлекайте клеточно-ассоциированный AAV8 путем лизиса клеток и осаждение секретируемого средой AAV8 с 40% ПЭГ. После разложения соединить вирусы AAV8 в клеточном лизате и среде, очистить на прерывистом градиенте йодиксанола и сконцентрировать в центрифугаторах с отсечкой по молекулярной массе (1 00 000 МВт).
  10. Количественно оценивайте титры AAV8 по абсолютной конечной точке qPCR с праймерами: WPRE-172 (5'- TTTATGAGGAGTTGTGGCCC-3') и WPRE-392 (5'- CAACACCACGGAATTGTCAG-3').

2. Внутриселезеночная инъекция AAV8 (рис. 1В, 1В) 

  1. Поместите мышей C57BL6/J в анестезиологическую камеру, заполненную 2% изофлураном и кислородом (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). После потери сознания перенесите мышей в асептическую операционную зону в правостороннее лежачее положение. Поддерживайте анестезию на уровне 2% изофлурана с подачей кислорода через носовой конус.
  2. Стерилизуйте место разреза 2% хлоргексидином, а затем 80% этанолом. С помощью медицинских ножниц диаметром 6,3 дюйма сделайте разрез диаметром 15 мм на левой верхней брюшной стенке, а затем разрез диаметром 10 мм на брюшине.
  3. Аккуратно обнажите селезенку с помощью щипцов и удерживайте ее на месте с помощью влажной марли, помещенной под орган.
  4. Осторожно перемешайте и введите вирусы AAV8 (50 μл) в течение 30 с в селезенку с помощью иглы 30 G, кончик которой расположен на глубине 3 мм ниже поверхности (рис. 1B). Накройте место укола кусочком ватного тампона и компрессируйте на 1 минуту.
  5. Сшить брюшину рассасывающимся хромовым кишечным швом 4-0.
  6. Закройте брюшную стенку и кожу шелковым швом 4-0.
  7. Поместите мышей в чистую клетку поверх электрической грелки и наблюдайте за ними до выздоровления.

3. Инъекция в воротную вену AAV8

  1. Обезболивайте мышей C57BL6/J путем ингаляции изофлурана (2%) в смеси с кислородом (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
  2. Выполнить лапаротомию 4,13 через разрез по средней линии (~1 дюйм) на коже, а затем в брюшину.
  3. Положите стерильную марлевую салфетку, смоченную в стерильном физрастворе, на левую сторону мыши и с помощью стерильного ватного тампона аккуратно вытащите толстую и тонкую кишку. Поместите кишечник поверх смоченной марли и накройте его салфеткой, чтобы избежать контакта с кожей или пересыхания.
  4. Ввести вирус AAV в воротную вену стерильной иглой 32 G в объеме 50 мкл. Введите иглу на 3-5 мм в портную вену под углом менее 5 градусов. Дайте крови течь мимо иглы в течение 5 секунд, чтобы избежать обратного потока.
  5. Поместите стерильный кончик ватного тампона поверх места инъекции с легким нажимом до полного закрытия вены и отсутствия кровотечения (около 5 минут), чтобы избежать кровотечения.
  6. Аккуратно поместите внутренние органы обратно в брюшную полость.
  7. Скройте брюшную стенку и кожу шелковым швом 4-0.

4. Анализ qRT-PCR

  1. Извлечь РНК из 50-100 мг ткани печени 4,13 с помощью коммерчески доступного реагента для выделения РНК в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
  2. Синтезировать кДНК1-й цепи из общих РНК с помощью случайных гексамеров и обратной транскриптазы M-MLV20,21.
  3. Определение значений ΔC(t) между геном-мишенью и референсными генами с помощью одноцветной системы детектирования ПЦР в реальном времени и зеленого реагента Supermix SYBR в соответствии с ранее опубликованными отчетами22,23.
  4. Измерьте значения ΔΔC(t) из четырех биологических реплик и трех технических повторов (n = 12). Установите Tm на 60 °C для всех реакций. Подтвердите результаты с помощью двух референсных генов, Rps3 и Rplp0.
  5. Проектируйте следующие последовательности грунтовок: Ns, 5'-gtc tga tct agt acc aaa gg-3' и 5'-ggg aaa cca atc act cca ac-3'; Rps3, 5'-atg gcg gtg cag att tcc aa-3' и 5'-cat tct gtg tcc tgg tgg c-3'; Rplp0, 5'-ctg aag tgc tcg aca tca ca-3' и 5'-agt ctc cac aga caa tgc ca-3'.

Результаты

Эффективность гена KD в печени при внутриселезеночном введении в сравнении с инъекция AAV8-shRNA в воротную вену
Вирусные запасы AAV8 разбавляли до рабочей концентрации 2E+12 копий генома (gc) на миллилитр (gc/мл). Отдельным мышам вводили 1E+11 gc AAV8-shNS1 или AAV8-shScr (50 μL) путем интраспленочной или портальной инъекции в вену. Через две недели после инъекции были собраны ткани печени для выделения РНК, синтеза кДНК 1st-нити и анализа количественной ПЦР. Результаты показали, что метод интраселезеночного введения достиг статистически такой же эффективности NSKD (20,8% ± 4,4%), как и метод инъекции воротной вены (16,3% ± 3,6%) с использованием Rsp3 и Rplp0 в качестве внутреннего эталона (рис. 2). Более того, процедура инъекции в селезенку могла быть завершена в течение 15 минут практически без смертельных исходов, в то время как метод инъекции воротной вены обычно требовал 25-30 минут при большой практике и был связан с более высоким уровнем смертности (~25%-30% смертности).

Воспалительная реакция тканей
Ткани печени были собраны у мышей, получавших инъекцию в воротную вену или внутриселезеночную инъекцию AAV8-shScr (рис. 3A) или AAV8-shNS1 (рис. 3B), и сравнивали с тканями контрольной группы мышей (рис. 3C). Воспалительные реакции изучали с помощью окрашивания H&E4. Результаты показали, что ни AAV8-shScr, ни AAV8-shNS1 не вызывали заметных воспалительных реакций в паренхиме печени по сравнению с PBS, вводимым методом интраспселезеночной инъекции (Spl) или инъекции воротной вены (PV) (Рисунок 3A-C).

figure-results-1
Рисунок 1: Иллюстрации дизайна AAV8-shRNA и процедуры интраспезеночной инъекции. (A) (Вверху) Диаграмма плазмиды AV5-siRNA-GFP, разработанной для создания аденоассоциированного вируса серотипа 8 (AAV8) для экспериментов по нокдауну in vivo . AV5-siRNA-GFP содержит последовательность shRNA, управляемую промотором ЦМВ, и EGFP. (внизу) Небольшие шпильковые РНК-интерференции, предназначенные для нацеливания на 21-нуклеотидные последовательности на мышиной NS (shNS1) или скремблированной 21-нуклеотидной последовательности (Scr). (B) Принципиальная схема рабочего процесса при внутриселезеночной инъекции AAV8. (C) Пошаговое представление хирургической процедуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Эффективность AAV8-shRNA-опосредованного нокдауна нуклеостемина (NS) в печени путем интраспленочной инъекции по сравнению с инъекцией в воротную вену. Анализ экспрессии НС методом ОТ-ПЦР в образцах печени, полученных от мышей через 2 недели после инъекции AAV8-shScr или AAV8-shNS1 во внутриселезеночную (Spl) или воротную вену (PV) (1E+11 gc). На графиках показаны результаты в отношении двух систем внутреннего контроля: Rps3 (A) и Rplp0 (B). Столбцы показывают среднее значение ± SEM четырех биологических репликатов, каждая из которых содержит три технических повтора ПЦР; *p < 0,01; **p < 0,001; p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Гистология тканей печени после интраспленочной инъекции или инъекции в воротную вену PBS, AAV8-shScr или AAV8-shNS1. Окрашивание тканей печени H&E через 2 недели после интраспезеночной инъекции (Spl) или инъекции воротной вены (PV) AAV8-shScr (A) или AAV8-shNS1 (B) по сравнению с контрольными образцами без введения AAV8 (C). Масштабные линейки: 100 μм. На правых панелях отображаются увеличенные виды вставок на левых панелях. Масштабные линейки: 50 μм. В каждой группе было исследовано от шести до девяти срезов от двух разных животных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Ген KD путем вирусной доставки либо экспрессирующей shRNA конструкции на фоне дикого типа24,25, либо рекомбиназ-экспрессирующей конструкции Cre на флоксированном фоне26 является мощным способом исследования функции гена in vivo индуцируемым, контролируемым по времени способом. Идеальный метод доставки генов KO/KD in vivo должен обеспечивать высокую эффективность KO/KD в интересующем органе, и, кроме того, сама процедура должна быть технически простой с минимальной пери/послеоперационной смертностью.

Для внутренних органов, таких как печень, вирусные частицы могут быть введены путем инъекции через хвостовую вену27 или воротную вену 28,29 или путем прямого введения в селезенку (интраселезеночная инъекция)30,31. Инъекции в воротную вену и интраселезенку вводят вирусные частицы в портальный кровоток, которые стекают в печень перед попаданием в нижнюю полую вену, а затем в легочный круг кровообращения. Напротив, вирусные частицы, вводимые через инъекцию в хвостовую вену, обходят портальный кровоток и попадают в легочный круг кровообращения, прежде чем достигнуть системного кровообращения. Для органов, получающих портальный кровоток, таких как печень, воротная вена и интраселезенка, инъекции имеют преимущество, заключающееся в доставке вирусных частиц непосредственно в эти органы без риска их секвестрации легкими или разбавления в системном кровотоке. Для органов, не получающих портального кровообращения, таких как мозг, инъекция в хвостовую вену может быть более полезной, поскольку вирусные частицы не попадают в печень до того, как они достигнут легочного кровообращения, а затем и системного кровообращения.

В этом исследовании мы вводили AAV8-shNS1 в дозировке 1E+11 gc на животное, что дало лучшую эффективность KD по сравнению с 1E+10 gc, но достигло того же эффекта KD, что и 5E+11 gc через внутрипортальную инъекцию (данные не показаны). При дозировке 1E+11 gc, сравнивая метод инъекции в воротную вену и метод интраселезеночного инъекции, не было обнаружено статистической разницы между этими методами в их эффективности NSKD в печени, при этом была достигнута эффективность 70%-80% KD. Эффект гена KD при введении AAV8 в печень через воротную вену может длиться до шести недель в зависимости от конструкции23. Следует отметить, что осложнения, связанные с процедурой, такие как кровотечение, вызванное операцией, и спайка сальника/брюшины, а также технические трудности, значительно меньше и ниже при методе инъекции в селезеночную вену по сравнению с методом инъекции в воротную вену. В результате инъекция в воротную вену выполняется один раз, в то время как инъекция в селезеночную среду может быть выполнена многократно32. Наконец, воспалительные реакции были незначительными или отсутствовали в паренхиме печени, получавших либо инъекцию в воротную вену, либо внутриселезеночную инъекцию AAV8-shScr или AAV8-NS1. Последнее открытие, однако, не исключает возможности того, что чрезвычайно высокие титры AAV все еще могут вызывать воспалительные реакции, которые ставят под сомнение экспериментальные результаты. Таким образом, оптимальная доза AAV должна быть эмпирически определена и сбалансирована между эффективностью KD и индуцированной AAV8 реакцией и может варьироваться в зависимости от различных генов-мишеней и/или последовательностей. В заключение можно сказать, что интраселезеночная инъекция AAV8-shRNA является высокоэффективным, относительно безопасным и простым методом достижения in vivo гена KD в печени.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана премией Исследовательского института профилактики рака Техаса (CPRIT) за индивидуальные исследования исследователя (RP200081) для RYT.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фильтрующие центрифугирующие установки AmiconMilliporeSigmaUFC9100Fast ultrafiltration
AV5-siRNA-GFP Addgene #124972Плазмидные
компетентные бактерии DH5&альфа Invitrogen#18265-017Химически компетентный штамм для клонирования 
HpaI New England BiolabsR0105Ререстрикционный фермент
iMFектин реагент для трансфекции GenDepotI7100-101
M-MLV обратная транскриптаза РНК-зависимая ДНК-полимеразаPromegaM1708
Одноцветная система обнаружения ПЦР в реальном времени MyiQ Bio-RadBUN9740RADqRT-PCR
Omega BioteckD6915-03Плазмидная ДНК midi prep 
Случайные гексамеры Инвитроген48190-011
Супермикс СИБР зеленый реактив Bio-Rad1708882ПЦР в реальном времени T4
DNA LigasePromegaM1801
TRIzol Reagent Life Technologies15596-018Выделение высококачественной общей РНК
XhoINew England BiolabsR0146Фермент рестрикции
  набор без эндотоксинов

Ссылки

  1. Wang, J., et al. Epigenome-wide analysis of aging effects on liver regeneration. BMC Biol. 21 (1), 30(2023).
  2. Jindal, A., Jagdish, R. K., Kumar, A. Hepatic regeneration in cirrhosis. J Clin Exp Hepatol. 12 (2), 603-616 (2022).
  3. Meng, L., et al. Nucleostemin deletion reveals an essential mechanism that maintains the genomic stability of stem and progenitor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11415-11420 (2013).
  4. Sands, M. S. Aav-mediated liver-directed gene therapy. Methods Mol Biol. 807, 141-157 (2011).
  5. Tenney, R. M., Bell, C. L., Wilson, J. M. AAV8 capsid variable regions at the two-fold symmetry axis contribute to high liver transduction by mediating nuclear entry and capsid uncoating. Virology. 454-455, 227-236 (2014).
  6. Tsai, R. Y., Mckay, R. D. A nucleolar mechanism controlling cell proliferation in stem cells and cancer cells. Genes Dev. 16 (23), 2991-3003 (2002).
  7. Tsai, R. Y., Meng, L. Nucleostemin: A latecomer with new tricks. Int J Biochem Cell Biol. 41 (11), 2122-2124 (2009).
  8. Zhu, Q., Yasumoto, H., Tsai, R. Y. Nucleostemin delays cellular senescence and negatively regulates trf1 protein stability. Mol Cell Biol. 26 (24), 9279-9290 (2006).
  9. Qu, J., Bishop, J. M. Nucleostemin maintains self-renewal of embryonic stem cells and promotes reprogramming of somatic cells to pluripotency. J Cell Biol. 197 (6), 731-745 (2012).
  10. Lin, T., Meng, L., Li, Y., Tsai, R. Y. Tumor-initiating function of nucleostemin-enriched mammary tumor cells. Cancer Res. 70 (22), 9444-9452 (2010).
  11. Maki, N., et al. Rapid accumulation of nucleostemin in nucleolus during newt regeneration. Dev Dyn. 236 (4), 941-950 (2007).
  12. Siddiqi, S., et al. Myocardial induction of nucleostemin in response to postnatal growth and pathological challenge. Circ Res. 103 (1), 89-97 (2008).
  13. Lin, T., Ibrahim, W., Peng, C. -Y., Finegold, M. J., Tsai, R. Y. A novel role of nucleostemin in maintaining the genome integrity of dividing hepatocytes during mouse liver development and regeneration. Hepatology. 58 (6), 2176-2187 (2013).
  14. Shugo, H., et al. Nucleostemin in injury-induced liver regeneration. Stem Cells Dev. 21 (16), 3044-3054 (2012).
  15. Lin, T., et al. Nucleostemin reveals a dichotomous nature of genome maintenance in mammary tumor progression. Oncogene. 38 (20), 3919-3931 (2019).
  16. Wang, J., et al. Nucleostemin modulates outcomes of hepatocellular carcinoma via a tumor adaptive mechanism to genomic stress. Mol Cancer Res. 18 (5), 723-734 (2020).
  17. Crawford, M., Liu, X., Cheng, Y. L., Tsai, R. Y. Nucleostemin upregulation and stat3 activation as early events in oral epithelial dysplasia progression to squamous cell carcinoma. Neoplasia. 23 (12), 1289-1299 (2021).
  18. Lin, T., Meng, L., Wu, L. J., Pederson, T., Tsai, R. Y. Nucleostemin and gnl3l exercise distinct functions in genome protection and ribosome synthesis, respectively. J Cell Sci. 127 (10), 2302-2312 (2014).
  19. Tsai, R. Y. Balancing self-renewal against genome preservation in stem cells: How do they manage to have the cake and eat it too. Cell Mol Life Sci. 73 (9), 1803-1823 (2016).
  20. Meng, L., Hsu, J. K., Tsai, R. Y. Gnl3l depletion destabilizes mdm2 and induces p53-dependent G2/m arrest. Oncogene. 30 (14), 1716-1726 (2011).
  21. Huang, G., Meng, L., Tsai, R. Y. P53 configures the G2/m arrest response of nucleostemin-deficient cells. Cell Death Discov. 1, e15060(2015).
  22. Liu, X., Wang, J., Wu, L. J., Trinh, B., Tsai, R. Y. L. IMPDH inhibition decreases TERT expression and synergizes the cytotoxic effect of chemotherapeutic agents in glioblastoma cells. Int J Mol Sci. 25 (11), 5992(2024).
  23. Liu, X., Wang, J., Li, F., Timchenko, N., Tsai, R. Y. L. Transcriptional control of a stem cell factor nucleostemin in liver regeneration and aging. PLoS One. 19 (9), e0310219(2024).
  24. Mayra, A., et al. Intraperitoneal AAV9-shRNA inhibits target expression in neonatal skeletal and cardiac muscles. Biochem Biophys Res Commun. 405 (2), 204-209 (2011).
  25. Cohen, A., et al. Virus-mediated shRNA knockdown of prodynorphin in the rat nucleus accumbens attenuates depression-like behavior and cocaine locomotor sensitization. PLoS One. 9 (5), e97216(2014).
  26. Jeon, Y., et al. Topbp1 deficiency causes early embryonic lethality and induces cellular senescence in primary cells. J Biol Chem. 286 (7), 5414-5422 (2011).
  27. Smith, T. A., et al. Adenovirus-mediated expression of therapeutic plasma levels of human factor IX in mice. Nat Genet. 5 (4), 397-402 (1993).
  28. Nakai, H., Iwaki, Y., Kay, M. A., Couto, L. B. Isolation of recombinant adeno-associated virus vector-cellular DNA junctions from mouse liver. J Virol. 73 (7), 5438-5447 (1999).
  29. Jung, S. C., et al. Adeno-associated viral vector-mediated gene transfer results in long-term enzymatic and functional correction in multiple organs of Fabry mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2676-2681 (2001).
  30. Hurford, R. K., Dranoff, G., Mulligan, R. C., Tepper, R. I. Gene therapy of metastatic cancer by in vivo retroviral gene targeting. Nat Genet. 10 (4), 430-435 (1995).
  31. Sarkar, R., Xiao, W., Kazazian, H. H. Jr A single adeno-associated virus (AAV)-murine factor viii vector partially corrects the hemophilia a phenotype. J Thromb Haemost. 1 (2), 220-226 (2003).
  32. Czekaj, P., et al. Optimization of methods for intrasplenic administration of human amniotic epithelial cells in order to perform safe and effective cell-based therapy for liver diseases. Stem Cell Rev Rep. 20 (6), 1599-1617 (2024).

Перепечатки и разрешения

Теги

AAV8
Эффективный нокдаун генов в печени с помощью интраспленочной инъекции малой РНК, доставляемой аденоассоциированным вирусом серотипа 8 (AAV8)
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.