Методическая статья

Исследование дифференцировки CD4 Т-клеток мыши с помощью абляции генов, опосредованной комплексом рибонуклеопротеинов CRISPR-Cas9

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67380

⸱

20 июня 2025 г.

 ,  , 
1Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем высокоадаптивный подход к использованию абляции генов, опосредованной комплексом рибонуклеопротеинов CRISPR-Cas9, в мышиных CD4 Т-клетках для исследования функции генов в дифференцировке CD4 Т-клеток.

Аннотация

Широкая доступность технологии кластеризованных регулярных коротких палиндромных повторов (CRISPR)-Cas9 сделала нацеливание на гены в первичных клетках рутинным методом оценки функции генов в Т-клетках. Учитывая стоимость и ограниченную доступность нокаутных (KO) мышиных штаммов, проверка предварительных гипотез, связанных с функцией генов в Т-клетках, может быть непомерно сложной задачей с использованием генетически нацеленных животных моделей. Тем не менее, используя коммерчески доступные ресурсы, в том числе предварительно разработанные направляющие РНК (гРНК), исследователи могут удобно создавать наивные Т-клетки, нацеленные на гены, которые могут быть использованы для исследований активации и дифференцировки Т-клеток.

В данной статье мы описываем протокол использования рибонуклеопротеиновых комплексов (РНП) CRISPR-Cas9, доставляемых нуклеофекцией, для эффективного создания мышиных CD4 Т-клеток, наивных в гене KO, которые могут быть использованы для оценки функции гена в дифференцировке CD4 Т-клеток in vitro. Выделение наивных CD4 Т-клеток из вторичных лимфоидных органов мышей с последующей нуклеофекцией комплексами Cas9-гРНК гарантирует, что ген KO инициируется до последующей активации Т-клеток, что дает стратегическое преимущество по сравнению с ретровирусно-опосредованной доставкой гРНК, которая обычно требует предварительной активации Т-клеток, предотвращая оценку эффектов в наивных Т-клетках. Кроме того, этот метод, основанный на нуклеофекции, обходит потенциальные проблемы развития, связанные с животными с геном KO.

После доставки Cas9-гРНК мы описываем протоколы изучения дифференцировки CD4 Т-клеток в линии Th1, Th2, Th17 и Treg с использованием поляризации in vitro . Кроме того, этот протокол может быть адаптирован к использованию генно-целевых CD4 или CD8 Т-клеток для многочисленных последующих применений, включая другие исследования активации Т-клеток in vitro и исследования адоптивного переноса in vivo. Использование методов CRISPR-Cas9 упростило наши возможности по оценке функции генов в Т-клетках и позволяет проводить рутинный нокаут многих генов, представляющих интерес, освобождая исследователей от ограничений, связанных с изучением генных КО животных.

Введение

Использование кластеризованных технологий на основе коротких палиндромных повторов (CRISPR) изменило нашу способность манипулировать последовательностями геномной ДНК, значительно расширив наши возможности по изучению функций генов в бесчисленных биологических системах. Что касается CD4 Т-клеток, то были разработаны методы, использующие комплексы рибонуклеопротеинов (RNP) CRISPR-Cas9, способствующие эффективному нокауту генов (KO) в первичных наивных Т-клетках, которые могут быть использованы для исследований in vitro и in vivo 1,2,3,4. Идентификация новых предполагаемых генов, регулирующих дифференцировку CD4 Т-клеток, часто обусловлена транскриптомным и эпигеномным анализом, создавая новые мишени, для исследования которых может быть мало или трудно получить, особенно если ген влияет на несколько тканей и может потребовать оценки с использованием мышей, нацеленных на условные гены. Нацеливание на гены через ретровирусную трансдукцию гРНК 5,6 было использовано для оценки функции генов в Т-клетках, но требует активации Т-клеток для ретровирусной инфекции и не может быть использовано для нацеливания на гены в наивных Т-клетках. CRISPR-Cas9, доставляемый нуклеофекцией в наивных Т-клетках, предлагает относительно недорогой и быстрый альтернативный инструмент для проверки и исследования новых генов, представляющих интерес, прежде чем инвестировать в трудоемкие и дорогостоящие модели мышей.

В нашем протоколе, описанном здесь, CRISPR-Cas9-опосредованное редактирование генов осуществляется с использованием рекомбинантного белка Cas9 в комплексе с молекулами направляющей РНК (гРНК), которые доставляются в наивные CD4 Т-клетки посредством нуклеофекции. РНК состоит из двух отдельных компонентов: трансактивирующей CRISPR РНК (tracrRNA) и CRISPR RNA (crRNA). Функционально последовательности, полученные из тракрРНК, облегчают ассоциацию гРНК с Cas9, в то время как последовательности крРНК содержат специфичность для интересующих областей ДНК-мишеней. Комплексы Cas9-гРНК опосредуют целевые разрывы двухцепочечной ДНК (дцДНК), при этом гРНК опосредуют специфичность последовательности эндонуклеазной активности Cas9 7,8. Cas9-опосредованное расщепление дцДНК приводит к инактивации генов путем генерации мутаций инделов после негомологичного соединения концов в клетках-мишенях9. В этом протоколе мы рекомендуем использовать несколько гРНК, нацеленных на интересующие гены, чтобы обеспечить устойчивый KO в наивных CD4 Т-клетках.

Хелперные CD4 Т-клетки являются ключевыми игроками в иммунной системе, управляя иммунными реакциями через выработку различных цитокинов, которые модулируют функцию многих типов иммунных клеток. При стимуляции через Т-клеточный рецептор (TCR) в присутствии специфических цитокинов, наивные CD4 Т-клетки могут дифференцироваться в различные линии Т-хелперов (Th) CD4 Т-клеток, включая Th1, Th2, Th17 и регуляторные Т-клетки (Treg)10,11,12. Определением этих различных линий CD4 Т-клеток является экспрессия специфических факторов транскрипции (TFs) и цитокинов, определяющих линию (рис. 1). Дифференцировку CD4 Т-клеток можно смоделировать с помощью поляризации in vitro 13,14,15, с использованием наивных CD4 Т-клеток, активированных через TCR в присутствии цитокинов, способствующих развитию линии, и блокирующих антител, которые предотвращают ненадлежащее принятие линии.

Сочетание нацеливания на ген CRISPR-Cas9 в наивных CD4 Т-клетках с поляризацией CD4 Т-клеток in vitro обеспечивает надежную систему для оценки функции генов в этих клетках (рис. 2). Учитывая широкую доступность реагентов для оценки дифференцировки CD4 методом проточной цитометрии, ключевые аспекты дифференцировки CD4 Т-клеток, включая экспрессию TF и продукцию цитокинов, могут быть легко исследованы с использованием описанных здесь протоколов. Идентификация новых генов, регулирующих функцию CD4 Т-клеток, улучшает наше понимание этих клеток, а методы CRISPR-Cas9 в сочетании с поляризацией in vitro предлагают надежную модальность для оценки функции генов перед тем, как приступить к мышиным моделям гена KO.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Для всех описанных здесь процедур мы использовали мышей дикого типа (WT) C57/BL6J. Мышей содержали и лечили в специфических условиях, свободных от патогенов (SPF) в соответствии с руководящими принципами NIAID (протокол LISB-22E) и комитетами по уходу за животными и их использованию в NIH (Animal Welfare Assurance #A-4149-01).

1. Соображения перед началом работы

  1. Выбор реагентов на основе гРНК
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Таблицу материалов для получения предварительно разработанных реагентов гРНК, нацеленных на геном мыши, используемых в этом протоколе.
    1. Выполните поиск интересующего гена (Таблица материалов, Желаемые кРНК) и выберите три наиболее ранжированных предварительно разработанных кРНК (формат 2 нмоль). Кроме того, получить отрицательный контроль crРНК для параллельного использования (Таблица материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образование функциональных гРНК требует дуплексирования crRNA с tracrRNA; Получите реагент TracrRNA и выполните действия, описанные в разделе 3.
    2. Разрабатывайте пользовательские целевые последовательности гРНК.
      Примечание: Разработка пользовательских целевых последовательностей гРНК выходит за рамки данного протокола, но может быть выполнена с использованием общедоступных инструментов, таких как CRISPick (Table of Materials).
  2. Буферы, фильтрующие материалы и оборудование
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если не указано иное, используйте холодные (4 °C) буферы и реагенты.
    1. Перед началом процедуры подготовьте буфер MACS, буфер FACS, 0,5% буфер Triton X-100, 1x пермеабилизационный буфер, полную среду RPMI и полную среду IMDM (Таблица материалов) и храните при температуре 4 °C.
    2. Перед началом этой процедуры получите наивные наборы для выделения CD4 Т-клеток и микрогранул анти-FITC (Таблица материалов).
    3. Перед началом нуклеофекции (раздел 4) предварительно подогрейте (37 °C) 5 мл полной среды IMDM и приготовьте минимум 10 мл полной IMDM с добавлением IL-7 при 5 нг/мкл, подогретой до 37 °C (Таблица материалов). При необходимости отрегулируйте объем предварительно подогретой среды, чтобы учесть добавление 125 мкл на образец после нуклеофекции. При необходимости отрегулируйте объем IL-7-содержащего полного ИМДМ, исходя из количества нуклеофектированных клеток (раздел 4).
    4. Перед началом выделения антигенпрезентирующих клеток (АПК) приготовьте реагент митомицина С, добавив 4 мл стерильного H2O во флакон 2 мг митомицина С (исходная концентрация 0,5 мг/мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы в вытяжке для культуры тканей и используйте методы стерильной асептики.

2. Наивная изоляция CD4 Т-клеток

Наивные CD4 Т-клетки могут быть выделены с помощью магнитной изоляции или с помощью сортировки клеток. Чистота, полученная с помощью магнитной развязки, обычно составляет 97%, а жизнеспособность клеток очень высока, в то время как электронная сортировка может улучшить чистоту клеток за счет жизнеспособности клеток. Описанный здесь протокол будет использовать магнитную изоляцию, но может быть адаптирован к любому сценарию. Убедитесь, что столбцы LS подготовлены надлежащим образом (Таблица материалов).

  1. Выделите селезенку и лимфатические узлы (паховые, плечевые, аксиальные и шейные) от мышей (здесь использовались мыши WT C57BL/6J).
  2. Поместите сито размером 70 мкм в чашку диаметром 60 мм с 5 мл полного RPMI (Table of Materials) для каждой обрабатываемой ткани. Обрабатывайте лимфатические узлы и селезенку в разных посудах для увеличения выхода. Аккуратно протрите салфетки через фильтр с помощью поршня из шприца объемом 3 мл. Промойте фильтр 1-3 мл фильтрующего материала и перенесите одноклеточные суспензии в конические пробирки объемом 15 мл.
  3. Повторите шаг 2.2 для дополнительных лимфатических узлов и тканей селезенки, по мере необходимости.
  4. Центрифугирование одноклеточных суспензий при 500 × г в течение 5 мин при 4 °С.
  5. Приготовьтесь к подсчету ячеек следующим образом.
    1. Для образцов селезенки аспирируйте надосадочную жидкость, осторожно ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл буфера для лизиса ACK, инкубируйте в течение 2-5 минут при RT, затем добавьте 2 мл полного RPMI, уменьшите, повторно суспендируйте в 5 мл полного RPMI и подсчитайте клетки.
    2. Для клеток лимфатических узлов аспирируйте надосадочную жидкость, ресуспендируйте клеточную гранулу в 5 мл свежей полной RPMI и подсчитайте количество клеток.
  6. Для ввода в наивный набор для выделения CD4 смешайте спленоциты с клетками лимфатических узлов, чтобы получить желаемое количество клеток для выделения.
    Примечание: Как правило, 1 × 108 клеток лимфатических узлов и селезенки от мышей WT-B6 дают 2-8 × 106 наивных CD4 Т-клеток.
  7. Центрифугируйте объединенные клетки селезенки и лимфатических узлов в дозе 500 × г в течение 5 мин при 4 °C, удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в соответствующем объеме буфера MACS (Таблица материалов), как указано в протоколе производителя (наивный набор для выделения CD4 Т-клеток).
  8. Точно следовать протоколу производителя по выделению наивных CD4 Т-клеток методом отрицательного отбора (Таблица материалов) с использованием наивного коктейля антител к биотину CD4+ Т-клеток, микрогранул антибиотина и микрогранул CD44; Для этого используют колонки LS и собирают клетки в конические пробирки объемом 15 мл.
  9. После выделения центрифугируйте клетки при 500 × г в течение 5 мин, 4 °C, удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клеточную гранулу в 2 мл полной среды RPMI и подсчитайте клетки.
  10. Храните клетки при температуре 4 °C до тех пор, пока они не будут готовы к началу нуклеофекции.

3. Образование комплекса Cas9-гРНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте запасы крРНК с отрицательным контролем и специфичными для гена свойствами. Мы описываем использование одной уникальной кРНК для негативных контрольных состояний и трех уникальных кРНК для состояний, нацеленных на гены. Одновременное использование трех различных кРНК обеспечивает KO интересующих генов.

  1. Ресуспендируйте крРНК и тракрРНК до 100 мкМ исходных концентраций с помощью дуплексного буфера (Таблица материалов). Это составляет 10 мкл буфера на 1 нмоль РНК.
  2. Объедините отдельные кРНК с тракрРНК в соотношении 1:1 в стерильных пробирках для ПЦР и смешайте с помощью пипетирования. Нагрейте до 95 °C в течение 5 минут в термоамплификаторе. Затем дайте комплексам остыть до температуры RT на столе не менее 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дуплексы crRNA/tracrRNA с этого момента называются гРНК . Комплексы стабильны не менее 6 месяцев при хранении при температуре -20 °С. Обычно мы производим 6 мкл гРНК (3 мкл крРНК + 3 мкл тракрРНК) за один прогон, обеспечивая достаточно материала примерно для пяти образцов (1 мкл/образец).
  3. Для генно-нацеленных гРНК: В стерильные пробирки для ПЦР добавьте 3 мкл гРНК (по 1 мкл каждой из трех уникальных гРНК на мишень), 1 мкл белка Cas9 и 1 мкл дуплексного буфера (всего 5 мкл на образец). Аккуратно перемешайте с помощью пипетки и убедитесь, что весь материал находится на дне пробирки. Инкубировать при RT в течение 10 минут. Синхронизируйте время выполнения этого шага с нуклеофекцией (шаги 4.1-4.2).
  4. Для отрицательного контроля гРНК: В стерильные пробирки для ПЦР добавьте 1 мкл гРНК, 1 мкл белка Cas9 и 3 мкл дуплексного буфера (всего 5 мкл на образец). Аккуратно перемешайте с помощью пипетки и убедитесь, что весь материал находится на дне пробирки. Инкубировать при RT в течение 10 минут. Опять же, синхронизируем время этого шага с нуклеофекцией (шаги 4.1-4.2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 50 пмоль гРНК для отрицательного контроля (по сравнению с 3 x 50 пмоль для теста) является более экономичным и не влияет на результаты.

4. Нуклеофекция - Cas9-gRNA-опосредованная абляция гена

  1. Центрифуга 1-8 × 106 очищенных Т-клеток при 500 × г в течение 5 мин, 4 °C на образец нуклеофекции. Осторожно удалите как можно больше надосадочной жидкости.
  2. Ресуспендируйте клетки в 20 мкл буфера P3 (16,4 мкл P3 + 3,6 мкл добавки на образец; Nucleofector Kit, Table of Materials) и перенести суспензию в ПЦР-пробирки, содержащие комплексы Cas9-gRNA. Перемешайте и переведите в самостоятельные лунки 16-луночный нуклеокувет (Nucleofector Kit, Table of Materials). Убедитесь, что при переносе клеток в кювету не образовались пузырьки, так как это может негативно повлиять на эффективность нуклеофекции. Постучите кюветой по рабочей поверхности, чтобы убедиться, что весь материал находится на дне каждой лунки и на нем нет пузырей.
  3. Выполните нуклеофекцию с помощью программы DN100 референсного нуклеофэктора (Таблица материалов). Немедленно добавьте 125 мкл предварительно подогретой полной среды IMDM в нуклеокуветные лунки и перенесите ячейки в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Промойте каждую лунку еще один раз 125 мкл предварительно подогретой среды, чтобы обеспечить сбор всех клеток.
  4. Центрифугируйте элементы при 500 × г в течение 5 мин, 4 °C, удалите все среды и повторно суспендируйте в 200 мкл подогретого полного фильтрующего материала IMDM + 5 нг/мл IL-7 (Таблица материалов).
  5. Перенесите 200 μL клеток на планшет для культивирования и добавьте подогретую полную среду IMDM + 5 нг/мл IL-7, чтобы получить окончательный желаемый объем в соответствии с размером планшета следующим образом: 1-2 × 106 клеток на лунку на 48-луночный планшет (1 мл среды на лунку), 2-4 × 106 клеток на лунку на 24-луночный планшет (1,5 мл среды на лунку), 4-6 × 106 клеток на лунку на 12-луночном планшете (2 мл среды на лунку) и 6-10 ×10 6 клеток на лунку на 6-луночном планшете (4 мл среды на лунку). Культивировать клетки в инкубаторе при 37 °С, 5%СО2 в течение 3 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от оборота белка и последующего анализа, оптимизируйте этот период культивирования. Мы нашли оптимальный период покоя в 3 дня, но он может быть скорректирован в зависимости от целевого гена до 1-7 дней при использовании этих условий.
  6. После посева в полной среде IMDM + 5 нг/мл IL-7 ресуспендировать клетки путем пипетирования и собрать их в конические пробирки объемом 15 мл. Центрифугируйте клетки при 500 × г в течение 5 мин, 4 °C, удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл полной среды RPMI.
  7. Подсчитайте клетки, чтобы определить количество живых наивных CD4 Т-клеток, соответствующих представляющим интерес клеткам, содержащим гРНК-нуклеофекты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В процессе нуклеофекции ожидайте потери ~ 50% входных клеток в течение этого протокола и соответственно корректируйте количество используемых наивных CD4 Т-клеток. Кроме того, на этом этапе вы можете проверить эффективность нацеливания на ген в наивных CD4 Т-клетках с использованием различных методов (проточная цитометрия, вестерн-блоттинг, кПЦР или анализ T7EI).

5. Выделение антигенпрезентирующих клеток (АПК)

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что приготовлен реагент митомицин, который будет использоваться для обработки APC после выделения (Таблица материалов). Перед началом работы ознакомьтесь с протоколом производителя по защите микрогранул от FITC и убедитесь, что колонки LS подготовлены надлежащим образом (Таблица материалов).

  1. Изолируйте селезенку от мышей WT, предназначенных для выделения APC.
  2. Изготовьте суспензии для одиночных клеток, как описано выше (2.2, 2.5.1)-лизируйте эритроциты с буфером для лизиса ACK, ресуспендируйте клеточную гранулу в 5 мл полной RPMI (4 °C) и подсчитайте клетки.
    Примечание: После выделения APC ожидайте получить примерно половину количества входных клеток, например, 1 × 108 входных спленоцитов дадут ~40-50 × 106 APC. Подготовьте нужное количество спленоцитов для выделения.
  3. Центрифугируйте клетки при 500 × г в течение 5 мин, 4 °C, и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 800 мкл буфера MACS (Таблица материалов).
  4. Добавьте по 4 мкл FITC-конъюгированных анти-CD4 и анти-CD8 антител (Таблица материалов) к спленоцитам. Хорошо перемешайте и выдерживайте при температуре 4 °C в течение 15 минут.
  5. Центрифугируйте ячейки при 500 × г в течение 5 мин, 4 °C и удалите надосадочную жидкость. Следуя инструкциям производителя, ресуспендируйте элементы в рекомендуемом объеме буфера MACS и добавьте соответствующее количество микрогранул против FITC (Таблица материалов).
  6. Инкубируйте клетки при температуре 4 °C в течение 15 минут. Центрифугируйте клетки при 500 × г в течение 5 мин, 4 °C. Повторно суспендируйте клетки в 500 мкл буфера MACS и пропустите клетки через подготовленную колонку LS, как описано в протоколе производителя, собрав клетки в коническую пробирку объемом 15 мл.
  7. Центрифугируйте клетки при 600 × г в течение 5 мин, 4 °C, удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 2,7 мл стерильного 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: БТРы могут плохо; Используйте увеличенную скорость для центрифугирования.
  8. Добавьте 300 мкл раствора митомицина С в клетки, чтобы получить конечную концентрацию 50 мкг/мл. Хорошо перемешать и инкубировать при 37 °C на водяной бане в течение 30 мин или в течение 45 мин при 37 °C, 5%CO2 в инкубаторе.
  9. После инкубации центрифугируйте клетки при 600 × г в течение 5 мин, 4 °C, и промойте их 10 мл стерильного 1x PBS. Используйте вакуум, чтобы удалить как можно больше надосадочной жидкости. Повторите стирку 2 раза.
  10. Снова центрифугируйте клетки при 600 × г в течение 5 мин, 4 °C, удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 5 мл полной среды RPMI (4 °C). Посчитайте клетки. Храните АПК при температуре 4 °C до тех пор, пока они не будут готовы к проведению дифференцировки CD4 Т-клеток.

6. Дифференцировка CD4 Т-клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол настроен на культивирование клеток в формате 48-луночных планшетов -2 × 105 наивных CD4 + 1 × 106 APC на лунку в соотношении 1:5. Клетки культивируются в полной среде IMDM. Здесь мы предоставим условия для дифференцировки Th1, Th2, Th17 и Treg CD4 T-клеток; Тем не менее, индивидуальные условия происхождения могут быть выбраны в зависимости от направленности пользователя.

  1. Определите количество ячеек в 48-луночном планшете, которое будет использоваться, и рассчитайте количество ячеек, необходимое для каждого типа клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для 10 скважин потребуется 2 × 106 наивных CD4 и 10 × 106 БТР для поддержания соотношения 1:5. Если количество ячеек позволяет, рассчитайте достаточное количество ячеек для одной дополнительной лунки, чтобы учесть любую ошибку пипетирования при нанесении покрытия.
  2. Смешайте желаемое количество наивных CD4 и APC в соотношении 1:5, центрифугируйте клетки при 600 × г в течение 5 мин, 4 °C, удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 500 мкл полной среды IMDM на лунку (например, клетки, соответствующие 10 лункам в 5 мл среды).
  3. Планшет 500 мкл приращивает ячейки в лунки 48-луночного планшета, следя за тем, чтобы каждая лунка содержала 2 × 105 наивных CD4 + 1 × 106 APC.
  4. Для получения желаемых условий дифференцировки CD4 Т-клеток приготовьте 2 смеси цитокинов + антител в полном IMDM, как описано в таблице 1. Добавьте 500 мкл смеси 2x к ранее нанесенным 500 мкл приращениям клеток, чтобы получить конечную концентрацию реагентов 1x.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти примеры основаны на приготовлении 2,5 мл 2x препаратов, достаточно для пяти лунок для каждого состояния. Опять же, если позволяет количество реагентов, сделайте еще одно приращение смеси в 2 раза, чтобы учесть ошибку пипетирования.
  5. Добавьте 500 мкл 2x цитокин + антитела в 500 мкл лунок, содержащих CD4/APC клетки, чтобы получить конечную концентрацию реагентов в 1x.
  6. Поместите планшет на 48 лунок в инкубатор при температуре 37 °C с 5%CO2. Культивируйте клетки в течение 72 ч, чтобы обеспечить завершение поляризации CD4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Осмотрите пластину после периода культивирования, чтобы убедиться в устойчивом росте. После инкубации среда должна быть оранжевого цвета, при этом желтая среда указывает на потенциальный разрастание клеток.

7. Оценка влияния абляции гена на дифференцировку CD4 Т-клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех этапов окрашивания приготовьте мастер-смесь антител, добавленных в соответствующем разведении в требуемый буфер для окрашивания. Для каждого образца используется объем 50 мкл коктейля антитело/буфер. Корректируйте конкретные антитела, используемые на основе эксперимента. Пользователи должны выбирать панели антител, соответствующие их конкретным экспериментам; Здесь мы предоставляем шаблон, с помощью которого можно подойти к этому вопросу в контексте рассматриваемых здесь генов.

  1. После дифференцировки CD4 осторожно удалите 600 мкл надосадочной жидкости, затем повторно суспендируйте клетки в каждой лунке с помощью пипетирования.
  2. Удалите 200 мкл клеток из каждой лунки и добавьте их в маркированный 96-луночный планшет для окрашивания транскрипционного фактора. Гранулируйте образцы путем вращения при 500 × г в течение 5 минут при 4 °C, стряхните надосадочную жидкость и приступайте к окрашиванию поверхности (шаг 7.5).
  3. Для анализа цитокинов рестимулируйте оставшиеся 200 мкл клеток с помощью PMA (50 нг/мл), иономицина (500 нг/мл) и Golgi Stop (1/2000 разведения) в полном IMDM. Добавьте 200 мкл смеси для рестимуляции 2x в каждую лунку и инкубируйте при 37 °C, 5%CO2 в течение 4 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В 48-луночном планшете должно остаться 200 μL; следовательно, добавление 200 мкл 2-кратной смеси PMA (2x, 100 нг/мл), иономицина (2x, 1 мкг/мл) и Гольджи Стопа (2x, 1/1000) создаст конечную концентрацию 1x (Таблица материалов).
  4. Тем временем начните окрашивание транскрипционного фактора. Проводите окрашивание поверхностных антигенов путем ресуспендирования клеток в 50 мкл буфера FACS, содержащего желаемые фторохром-конъюгированные антитела на образец (Таблица 2). Выдерживать в темноте при температуре 4 °C в течение 30 минут.
  5. Добавьте 150 мкл буфера FACS в каждую лунку, чтобы смыть буфер для окрашивания. Центрифугируйте планшет при 500 × г в течение 5 мин при 4 °C. Стряхните надосадочную жидкость. Повторите в общей сложности два мытья.
  6. Зафиксировать клетки 100 мкл раствора фиксации Foxp3 (Таблица материалов) в темноте при ОТ на 25 мин.
  7. Через 25 мин добавьте по 100 мкл буфера FACS в каждую лунку, чтобы смыть фиксатор. Центрифугируйте планшет при 500 × г в течение 5 минут при 4 °C и стряхните надосадочную жидкость. Повторите в общей сложности два мытья.
  8. Проводите внутриклеточное окрашивание путем суспендирования клеток в 50 мкл 1x Foxp3 пермеабилизационного буфера, содержащего непосредственно конъюгированные антитела, специфичные для транскрипционного фактора, на образец (Таблица 2) в течение минимум 1 ч при 4 °C в темноте.
  9. После завершения внутриклеточного окрашивания добавьте в каждую лунку по 100 мкл буфера FACS. Центрифугируйте планшет при 500 × г в течение 5 минут при 4 °C и стряхните надосадочную жидкость. Повторите в общей сложности два мытья. Ресуспендируйте клетки в окончательном объеме 200 мл для проточной цитометрии.
  10. После рестимуляции PMA/иономицина/Гольджи Стопа ресуспендируйте клетки с помощью пипетирования и перенесите 400 мкл каждого образца цитокина в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Гранулируйте образцы в дозе 500 × г в течение 5 мин при 4 °C и удалите надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте образцы клеток в 100 мкл буфера FACS и перенесите их на 96-луночный планшет для окрашивания поверхности. Снова гранулируйте образцы, вращая при 500 × г в течение 5 минут при 4 °C, стряхните надосадочную жидкость.
  11. Приготовьте коктейль для окрашивания поверхности с буфером FACS, содержащим флуоресцентные антитела, направленные против поверхностных антигенов (табл. 2). Ресуспендируйте клетки в 50 мкл окрашивающего буфера на образец и инкубируйте в течение 30 минут при температуре 4 °C в темноте.
  12. Добавьте 150 мкл буфера FACS в каждую лунку, чтобы смыть буфер для окрашивания. Центрифугируйте планшет при 500 × г в течение 5 мин при 4 °C. Стряхните надосадочную жидкость. Повторите в общей сложности два мытья.
  13. Зафиксируйте элементы в 100 мкл 4% PFA (Таблица материалов) в темноте при RT на 25 минут.
  14. Добавьте 100 мкл буфера FACS в каждую лунку, чтобы смыть фиксатор. Центрифугируйте планшет при 500 × г в течение 5 мин при 4 °C. Стряхните надосадочную жидкость. Повторите в общей сложности два мытья.
  15. Проводят внутриклеточное окрашивание цитокинов путем суспендирования клеток в 50 мкл антицитокинового антитела, содержащего 0,5% буфера для окрашивания Triton X-100 на образец (Таблица 2) в течение не менее 1 ч при 4 °C в темноте.
  16. После завершения внутриклеточного окрашивания добавьте в каждую лунку по 100 мкл буфера FACS. Центрифугируйте планшет при 500 × г в течение 5 минут при 4 °C и стряхните надосадочную жидкость. Повторите в общей сложности два мытья. Ресуспендируйте клетки в окончательном объеме 200 мл для проточной цитометрии.
  17. Анализ транскрипционного фактора и образцов, окрашенных цитокинами, с помощью проточной цитометрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемые профили проточной цитометрии из очерченных окрашивающих панелей будут показаны в разделе репрезентативных результатов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы подтвердить, что чистая популяция наивных CD4 Т-клеток была получена с помощью нашего протокола (раздел 2), мы использовали проточную цитометрию для идентификации этих клеток до и после магнитной изоляции. Используя наш подход, мы получили высокочистую популяцию живых CD4+TCRb+CD25-CD44-CD62L+ наивных CD4 Т-клеток после выделения (рис. 3A). Кроме того, чтобы подтвердить, что комплексы Cas9-гРНК были успешно присоед...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Интеграция протоколов доставки комплексов CRISPR-Cas9 в наивные CD4 Т-клетки с методами изучения дифференцировки CD4 Т-клеток обеспечивает надежный инструмент для изучения новых генов, которые регулируют биологию CD4 Т-клеток. Здесь мы предоставляем исчерпывающее руководство по использованию коммерчески доступных реагентов Cas9 и гРНК, с которыми легко работать. Нуклеофекционно-опосредованная доставка комплексов Cas9-гРНК в наивные CD4 Т-клетки обеспечивает высокоэффективное редактирован...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Это исследование было поддержано Программой внутренних исследований NIAID, NIH.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,5 М ЭДТА, pH = 8,0IPM Scientific11005-016
16% параформальдегид, PFAЭлектронная микроскопия Sciences15710Разбавить PBS для получения 4% фиксирующего раствора PFA
1x eBioscience Buffer (1x буфер для пермеабилизации)Thermo Fisher Scientific00-5523-00Использовать пермеабилизационный буфер из набора для получения 1x раствора
1x PBS, pH = 7,4Качество Биологический114-058-101
2-меркаптоэтанол (1000x)Gibco21985-023
4D нуклеофекторный блок ядраLonzaAAF-1003B
4D нуклеофектор X блокLonzaAAF-1003X
60 мм тарелкаFalcon353002
70 &; m нейлоновое сетчатое фильтрFisherbrand22363548
ACK Лизирующий буферGibcoA10492-01
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X KitLonzaV4XP-3032Этот набор включает в себя: P3 Первичный клеточный раствор, добавку 1 и 16-луночные нуклеокуветные полоски
анти-FITC микрогранулыMiltenyi Biotec130-048-701Следуйте протоколу Miltenyi Anti-FITC Microbeads Protocol
антимышиный CD28 (37.51)bioXcellBE0015-1см. Таблицу 1 для стоковой концентрации
антимышиного CD3e (145-2C11)bioXcellBE0001-1см. Таблицу 1 для стоковой концентрации
антимышиного ИФН&гамма; (XMG1.2)bioXcellBE0055см. Таблицу 1 для стоковой концентрации
антимышиного IL-12p40 (C17.8)bioXcellBE0051см. Таблицу 1 для стоковой концентрации
антимышиного IL-4 (11B11)bioXcellBE0045см. Таблицу 1 для стоковой концентрации
BioLite 48-well MutlidishThermo Fisher Scientific130187
бычья сыворотка Альбумин, BSASigma Life ScienceA3059
Cas9 ферментIDT1081059Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 (10 мг/мл) - содержит ядерную локализацию
последовательности Complete IMDM + IL-7 MediaComplete IMDM с 5 нг/мл IL-7
Complete IMDM MediaIMDM+GlutMAX, 10% FBS, 1% L-глутамина, 1% Pen/Strep, 0,1% BME
Complete RPMI MediaRPMI-1640, 10% FBS, 1% L-глутамин, 1% Pen/Strep, 0,1% BME
CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
желаемые crRNAs IDTИспользовано с сайта IDT: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_PREDESIGN  
eBioscience FOXP3/Набор буферов для окрашивания транскрипционного фактораThermo Fisher Scientific00-5523-00Набор содержит три реагента: концентрат фиксации/пермеабилизации (4x), разбавитель фиксации/пермеабилизации и буфер для пермеабилизации (10x)
Буфер1x PBS, 1% FBS, 1 мМ ЭДТА
фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)VWR Seradigm Life Science97068-085Нагрейте и обезвредьте перед использованием (нагрейте до 56°С; C в течение 45 минут)
FITC anti-mouse CD4 (RM4-5)Biolegend1005101/200 разведение (0,5 мг/мл исходной концентрации)
FITC anti-mouse CD8α (53-6.7)Biolegend1007061/200 разведение (0,5 мг/мл стоковой концентрации)
Golgi StopBD Biosciences51-2092KZ1/2000 разведение
IMDM (1x) + GlutMAX-1 MediaGibco31980-030
Иономицин кальциевая соль из Streptomyces conglobatus (1 мг/мл)Sigma Aldrich10634Рекомендуемая конечная концентрация 500 нг/мл
L-глютамина 200 мМ (100x)Gibco25030-081
LS колонкиMiltenyi Biotec130-042-401
MACS Буфер1x PBS, 0,5% BSA, 1 мМ ЭДТА, фильтр стерилизованный
Митомицин C (0,5 мг/мл)Millipore SigmaM4287-2MG 
Мышь Naï ve CD4 T Cell Isolation KitMiltenyi Biotec130-104-453Follow Miltenyi Naï Протокол выделения CD4 Т-клеток. В этот набор входят Naï ve CD4+ T-Cell Biotin Антитела Коктейль, Антибиотиновые микрогранулы и CD44 Микрогранулы CD44
Отрицательный контроль crRNAIDT1072544альтернатива разработке собственного негативного контроля
Нуклеазный дуплексный буферIDT1072570
ПЦР пробирки полоскиСША Scientific1402-2700
Пенициллин стрептомицинGibco15140-023
Форбол 12-миристат 13-ацетат, PMA (100 &; г/мл)Sigma AldrichP8139Рекомендуемая конечная концентрация 50 нг/мл
ProSeries Высокопроизводительные центрифужные пробирки 15 млщелочные ScientificPS560015 мл конические пробирки
рекомбинантные человеческие (h) IL-2Peprotech200-02см. Таблицу 1 для исходных значений концентрации
рекомбинантного человека TGF-b1 (производный HEK293)Peprotech100-21см. Таблицу 1 концентрация
рекомбинантной мышиной ИЛ-12п70Пепротех210-12см. Таблицу 1 концентрации
рекомбинантной мыши ИЛ-4Пепротех214-14см. Таблицу 1 концентрации
рекомбинантной мышиной ИЛ-6Пепротех216-16см. Таблицу 1 концентрации
рекомбинантной мышиной ИЛ-7Пепротех217-17Готовить при концентрации 100 нг/мл
RPMI 1640 MediaGibco21870-076
ТермоамплификаторПрикладные биосистемы4375786Мы используем эту модель термоамплификатора, однако любое подобное оборудование будет хорошо работать в этом протоколе
tracrRNA Atto550 меченый IDT1075928Позволяет обнаруживать комплексы Cas9-гРНК после нукелоэфкции с использованием флуоресценции Atto550 в качестве считывания. Мы рекомендуем использовать этот реагент, если это возможно.
Triton-X1x PBS, 0,5% TritonX-100, 0,1% BSA
TritonX-100BioRad161-0407
немеченая тракрРНК IDT1072534Более экономичный вариант тракрРНК, но не позволяет оценить эффективность нукелофекции комплексов Cas9-гРНК
Veriti Thermal Cycler, 96-well FastThermo Fisher Scientific4375305Мы используем эту модель термоамплификатора, однако любое подобное оборудование будет хорошо работать в этом протоколе
FACS Буфер

Ссылки

  1. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. J Exp Med. 215 (3), 985-997 (2018).
  2. Nussing, S., et al. Efficient CRISPR/Cas9 gene editing in uncultured naive mouse T cells for in vivo studies. J Immunol. 204 (8), 2308-2315 (2020).
  3. Albanese, M., et al. efficient and activation-neutral gene editing of polyclonal primary human resting CD4+ T cells allows complex functional analyses. Nat Methods. 19 (1), 81-89 (2022).
  4. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein transfection for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Curr Protoc Immunol. 124 (1), e69(2019).
  5. Huang, B., Johansen, K. H., Schwartzberg, P. L. Efficient CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis in primary murine T lymphocytes. Curr Protoc Immunol. 124 (1), e62(2019).
  6. Huang, B., et al. In vivo CRISPR screens reveal a HIF-1α-mTOR network regulates T follicular helper versus Th1 cells. Nat Commun. 13 (1), 805(2022).
  7. Asmamaw, M., Zawdie, B. Mechanism and applications of CRISPR/Cas-9-mediated genome editing. Biologics. 15, 353-361 (2021).
  8. Li, T., et al. CRISPR/Cas9 therapeutics: progress and prospects. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 36(2023).
  9. Yang, H., et al. Methods favoring homology-directed repair choice in response to CRISPR/Cas9-induced double-strand breaks. Int J Mol Sci. 21 (18), (2020).
  10. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annu Rev Immunol. 28, 445-489 (2010).
  11. Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., Xia, B. CD4+ T cells: differentiation and functions. Clin Dev Immunol. 2012, 925135(2012).
  12. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  13. Rumble, J., Segal, B. M. In vitro polarization of T-helper cells. Methods Mol Biol. 1193, 105-113 (2014).
  14. Yang, W., Chen, X., Hu, H. CD4(+) T-cell differentiation in vitro. Methods Mol Biol. 2111, 91-99 (2020).
  15. Wang, W., Ai, X. Primary culture of immature, naive mouse CD4+ T cells. STAR Protoc. 2 (3), 100756(2021).
  16. Hsieh, C. S., et al. Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages. Science. 260 (5107), 547-549 (1993).
  17. Szabo, S. J., et al. A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
  18. Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene. J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).
  19. Zheng, W., Flavell, R. A. The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell. 89 (4), 587-596 (1997).
  20. Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
  21. Wan, Y. Y., Flavell, R. A. Regulatory T-cell functions are subverted and converted owing to attenuated Foxp3 expression. Nature. 445 (7129), 766-770 (2007).
  22. Williams, L. M., Rudensky, A. Y. Maintenance of the Foxp3-dependent developmental program in mature regulatory T cells requires continued expression of Foxp3. Nat Immunol. 8 (3), 277-284 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CRISPR Cas9in vitroTh1 Th2 Th17 Treg
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи