Несмотря на значительные усилия по лечению хронических ран, успех был ограниченным. Клеточные и молекулярные процессы, которые нарушают нормальное заживление и способствуют возникновению и развитию хронических ран, недостаточно изучены. В результате разработка эффективных методов лечения этих ран оказалась сложной задачей. В первую очередь это связано с отсутствием животных моделей, которые имитируют хронические раны у людей, а также с тем, что эксперименты на людях с хроническими ранами ограничены. Ранее мы опубликовали мышиную модель для изучения хронических ран, которые имеют много общих характеристик с диабетическими хроническими ранами у людей. Эта модель включает в себя наличие биопленок, образующихся естественным образом из бактерий, обнаруженных в микробиоте кожи и окружающей среде, без необходимости введения внешних бактерий в раны. Таким образом, эта модель потенциально может продвинуть фундаментальное понимание того, как раны становятся хроническими. Здесь мы представляем обновление исходного протокола для разработки этой модели мыши. Мы сосредоточились на снижении смертности мышей с ~30% до ~5%. Мы также описываем, как эта модель была использована для понимания инициации и прогрессирования хронизации раны с использованием транскриптомных подходов нового поколения, выяснения динамики бактериальной популяции во время инфекции и развития биопленки, а также демонстрации ценности тестирования эффективности лечения, включая малые молекулы. На данный момент это единственная модель хронической раны, которая не заживает без вмешательства.
Методическая статья
Протокол по созданию хронических ран у мышей с диабетом - обновление опубликованного протокола
В этой статье
Аннотация
Введение
Это обновление существующей статьи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть оригинальную версию.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ОБНОВЛЕНИЯ:
Это обновление протокола, представленного ранее1
Все эксперименты были проведены в соответствии с федеральными нормами и политикой и процедурами Калифорнийского университета, одобренными Калифорнийским университетом в Риверсайде IACUC.
1. Животное
Добавьте следующее примечание к Шагу 1.1:
ПРИМЕЧАНИЕ: Если гомозиготные мыши с диабетом приобретаются напрямую у поставщиков, поместите мышей в обычный виварий, чтобы обеспечить колонизацию кожи нормальной флорой кожи. Можно использовать как самцов, так и самок.
Добавьте следующий раздел после Шага 1.3:
1.4. Выполнение генотипирования
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте генотипирование после разведения животного, как описано ранее, до шага 1.31. Приведенный ниже протокол был изменен по сравнению с ранее опубликованной процедурой2. Как самцы, так и самки мышей могут быть генотипированы уже на 14-21 день после отъема.
1.4.1. Экстракция сырой ДНК
1.4.1.1. Соберите биопсию ушной пункции у мыши и поместите образец ткани в микроцентрифужную пробирку.
1.4.1.2. Добавьте 180 мкл 50 мМ NaOH, обеспечивая погружение пробы.
1.4.1.3 Образец инкубировать при температуре 95°С в течение 10 мин, сбрасывая давление и делая вихревые колебания пробирки каждые 5 мин.
1.4.1.4. Образец охладить на льду не менее 1 мин.
1.4.1.5. Добавьте 20 мкл 1 М Tris HCl при pH 8,0 и вихре.
1.4.1.6. Хранить образцы при температуре -20 °C до использования.
1.4.2. Полимеразная цепная реакция
1.4.2.1 Соберите следующую смесь грунтовок в микроцентрифужную пробирку (Таблица грунтовок).
ПРИМЕЧАНИЕ: Праймеры амплифицируют область вокруг точечной мутации LepR.
1.4.2.2. Организовать 20 мкл полимеразной цепной реакции в ПЦР-пробирках. Добавьте 10 мкл мастер-смеси 2x Taq-полимеразы (которая содержит Taq DNA полимеразу, dNTPs, MgCl2 и KCI), 1 мкл смеси праймеров (см. Таблицу праймеров), 4 мкл экстракта сырой ДНК и 5 мкл H2O.
1.4.2.3. Настроить параметры термоциклирования следующим образом: 94 °C в течение 2 мин; 40 циклов при температуре 97 °C в течение 30 с, 52 °C в течение 45 с и 72 °C в течение 45 с; затем 72 °C в течение 2 минут и 10 °C для бесконечной выдержки.
1.4.2.4. После завершения ПЦР добавить 4 мкл 6x ДНК загружающего красителя в продукты ПЦР и разделить на 2% агарозный гель (рис. 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая реакция ПЦР генерирует 3 продукта ПЦР: 610.н. обычного продукта, 406.н. мутантного аллеля T и 264.н. аллеля G дикого типа. Генотип дикого типа состоит из продуктов 610.о. и 264.о., генотип гетерозиготы состоит из всех трех продуктов, а генотип db/db состоит из продуктов 610.о. и 406.о.
2. Виварий и животноводство
Замените шаг 2.1 следующим шагом и примечанием:
2.1 Размещение мышей db/db в обычном виварии (не в помещении, свободном от барьерных/специфических патогенов) таким образом, чтобы микрофлора могла закрепиться на коже мышей db/db . Для конкретного моделирования людей, страдающих хроническими ранами, не принимайте специальных мер предосторожности для предотвращения воздействия естественных патогенов, обнаруженных в мышиной среде, так как основные патогены исследования могут быть потеряны при более строгих условиях очистки вивария.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку эти мыши очень большие и диабетические, лучше всего разместить до 3 мышей дБ/дБ в клетке, прежде чем использовать их для экспериментов с хроническими ранами.
3. Требования к развитию хронических ран
Добавьте следующий шаг после шага 3.2
3.3. Во избежание пересыхания тканей раны всегда держите накрытой прозрачной пленочной повязкой.
5. Настройка реагентов
Добавить после пункта 5.2 следующее примечание:
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ATZ только от компании, указанной в Таблице материалов. АТЗ других компаний не совместима с этой моделью и увеличит смертность.
6. Хирургия
6.1. Лечение и обезболивание
ПРИМЕЧАНИЕ: Обновленный режим анестезии описан ниже.
6.1.5. В открытой системе ввести мышке 5% изофлуран, доставляемый сО2 , со скоростью потока (2-3,5 л/мин) для индуцирования анестезии. Непрерывно контролируйте состояние мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как только мышь потеряет сознание или больше не будет двигаться, поместите ее на белую хирургическую подушечку и прикрепите голову к носовому конусу, который прикреплен к испарителю, чтобы обеспечить непрерывное введение изофлурана во время операции.
6.1.6. В открытой системе вводить 1% изофлуран с той же скоростью потока во время операции и регулировать поток изофлурана для поддержания глубины анестезии.
6.3. Ранения
6.3.5. Прекратить введение 1% изофлурана мыши по окончании процедуры.
7. Послеоперационное лечение и восстановление
Замените Шаг 7.1 в исходном протоколе следующим шагом и обратите внимание:
7.1. После наложения прозрачной пленочной повязки сразу после операции с помощью инсулинового шприца нанести MSA местно на верхнюю часть раны, образовавшейся на тыльной стороне мыши, путем проникновения иглой в прозрачную пленочную повязку. Используйте 150 мг/кг MSA в стерильном растворе PBS в течение 10 минут после операции. Эта концентрация была определена после обширного поиска литературы, как объяснялось ранее 3,4.
ПРИМЕЧАНИЕ: MSA имеет тенденцию к выпадению в осадок, если его постоянно не перебалтывать. Перед нанесением на рану убедитесь, что MSA полностью растворен в растворе, чтобы доставить рассчитанную дозу мыши.
Замените шаг 7.4 в исходном протоколе следующим шагом:
7.4. Ввести вторую дозу Бупренекса через 6 ч после операции. Затем периодически вводите дозы мышам в соответствии с местными правилами IACUC в течение первых 48 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не рекомендуется использовать препараты анальгетиков с пролонгированным высвобождением, которые необходимо вводить подкожно в данной модели мыши. Связанный с липидами бупренорфин может быть суспендирован в масле триглицеридов жирных кислот (MCT) со средней длиной цепи. В то время как эффект масла MCT был протестирован на очень молодых мышах db/db, влияние MCT на более старых или гериатрических мышах с ожирением db/db не было проверено 5,6. Учитывая вес мышей, большие объемы анальгетиков, вводимых подкожно рядом с раной, могут существенно повлиять на клеточные и молекулярные процессы заживления ран и зарождения и развития хронической раны. Кроме того, это обезболивающее растворяется в высоком уровне жира у этих мышей и, следовательно, может быть неэффективным в устранении боли и может стать токсичным.
8. Сбор данных, обращение с мышами после ранения, стратегии выживания и дополнительные советы
8.1 Сбор данных
Добавьте следующие шаги после Шага 8.1.3.
8.1.4. Убедитесь, что ткань, собранная для анализа, должна включать только ткань, которая находится на расстоянии 2 мм от края раны как в контрольной, так и в хронической ране. Раны могут быть собраны путем иссечения уже через 1-2 часа после применения MSA.
8.1.5. Собрать лишнюю жидкость, скопившуюся из раны, или раневой экссудат, стерильным шприцем, проколов проточную пленочную повязку. Хранить при температуре -20 °C для бактериальных исследований или при -80 °C для химических и молекулярных исследований.
8.1.6 Для сбора целых тканей раны, включая биопленку, через 10 дней нанести на рану 4% PFA в PBS местно в течение 10 минут перед иссечением щипцами и ножницами. При удалении ткани добавьте дополнительный раневой край 5-10 мм, чтобы раневая ткань поддерживалась дополнительной нормальной тканью. Продолжайте фиксацию в 4% PFA в PBS и последующие промывки и подготовку к встраиванию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хронические раны через 10 дней после операции могут стать слишком хрупкими, чтобы их можно было собрать для гистологии.
8.5. Стратегии выживания
8.5.1. Обеспечьте дополнительную гидратацию: Проверьте, не становятся ли мыши вялыми и не перестают активно есть или пить, потому что хирургическое вмешательство и образование хронических болезней являются стрессом. Вводите теплый (35-38 °C) физиологический раствор подкожно или внутрибрюшинно в объеме 0,25 мл на 10 г массы тела в течение первых 48-72 ч после операции. Гидратационная поддержка может потребоваться до 2-3 раз в день, в зависимости от того, насколько вялыми являются мыши. Кроме того, пищевые гранулы и водяные гели могут быть помещены в подстилку для легкого доступа, хотя может потребоваться более частая смена клетки.
8.5.2. Обеспечьте дополнительную поддержку тепла: Выживаемость после операции значительно увеличивается, если сразу после операции и при нахождении в виварии мышей помещают в клетки на подушку, согреваемую циркуляцией воды (93 °C). Поместите клетку на 1/2 и на 1/2 от подушки, чтобы животное могло отойти от тепла, если ему станет слишком жарко, и переместиться на верхнюю часть подушки, если ему станет холодно.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 1: Генотипирование для идентификации гетерозигот для создания селекционеров. Пример геля показывает результаты 8 неизвестных образцов мышей. Образцы 2 и 5 являются гетерозиготами, так как они содержат 3 полосы (610.о., 406.о. и 264.о.). Образцы 1, 3, 4, 6, 7 и 8 являются дикими типами, поскольку они содержат только 2 полосы (610.о. и 264.о.).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Результаты с использованием данной модели хронических ран:
Эта модель была использована для проведения нескольких исследований в попытке понять клеточные и молекулярные механизмы инициации и прогрессирования хронической раны. Было показано, что путем ингибирования антиоксидантных ферментов у мышей db/db могут возникать хронические раны. Первоначально раны содержали полимикробное сообщество, которое со временем было отобрано для специ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Ушной пробойник 1 мм | Fisherbrand | 13812201 | диаметр отверстия 2 мм |
| 3-Амино-1,2,4-триазол (ATZ) | TCI | A0432 | |
| 70% этанол | |||
| Acu Punch 7 мм прокол для биопсии кожи | Acuderm Inc. | P750 | |
| агароза | |||
| В6. BKS(D)-Leprdb/J | Лаборатория Джексона | 00697 | Гомозиготы и гетерозиготы в наличии |
| Бупренекс (бупренорфин гидрохлорид | Henry Stein Animal Health | 059122 | 0,3 мг/мл, Класс 3 |
| Гелевый краситель, фиолетовый (6X) | Перчатки New England Biolabs | B7024S | |
| Перчатки | |||
| Лосьон для снятия волос с успокаивающим алоэ и ланолином | Наир | химическая депиляторная | |
| тепловая терапия (вода) Насос HTP-1500 | Adroit MedicalSystems | ||
| Грелка | Conair | Влажная сухая грелка | |
| Адаптеры для шланга | Adroit MedicalSystems | ||
| BD | 329461 | 0,35 мм (28G) x 12,7 мм (1/2") | |
| Изофлуран | Henry Schein Animal Health | 029405 | NDC 11695-6776-2 |
| Испаритель изофлурана | JA Baulch & Партнеры | ||
| Kimwipes | |||
| Maxi-Therm Одеяло для гипергипотермии | Cincinnati Sub-Zero | Cat No. 247 | 22" х30" Многоразовая прокладка HeavyDuty Pad |
| Меркаптоянтарная кислота (MSA) | Конус | ||
| Кислородный | баллон должен быть совместим с системой испарения | ||
| Фосфатный буферный раствор (PBS) | автоклав стерилизованные | ||
| острые хирургические ножницы | |||
| Гидроксид натрия | |||
| Так 2X Master Mix | Биолаборатории Новой Англии | M0270L | |
| Tegaderm | 3M | Ref: 1624W | Повязка из прозрачной пленки (6 см x 7 см) |
| Тонкий металлический шпатель | |||
| Tri-HCl | |||
| Трубка | |||
| Пинцет | |||
| Wahl машинка для стрижки волос | Wahl | Lithium Ion Pro |
Ссылки
- Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. J Vis Exp. (151), e57656(2019).
- He, J. -F., Tan, T., Zhu, H. A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice). Acta Pharmacol Sin. 39 (1), 117-123 (2018).
- Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. J Diabetes Res. 2014 (562625), (2014).
- Kim, J., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nat Protoc Exch. , (2016).
- Martínez-Carrillo, B. E., et al. Changes in metabolic regulation and the microbiota composition after supplementation with different fatty acids in db/db mice. Int J Food Sci. , (2022).
- Zhang, Y., et al. Medium-chain triglyceride activated brown adipose tissue and induced reduction of fat mass in C57BL/6J mice fed high-fat diet. Biomed Environ Sci. 28 (2), 97-104 (2015).
- Basu, P., Kim, J. H., Saeed, S., Martins-Green, M. Using systems biology approaches to identify signalling pathways activated during chronic wound initiation. Wound Repair Regen. 29 (6), 881-898 (2021).
- Basu, P., Martins-Green, M. Signaling pathways associated with chronic wound progression: a systems biology approach. Antioxidants. 11 (8), 1506(2022).
- Kim, J. H., et al. High levels of OS and skin microbiome are critical for initiation and development of chronic wounds in diabetic mice. Sci Rep. 9 (1), 19318(2019).
- Kim, J. H., et al. High levels of OS create a microenvironment that significantly decreases the diversity of the microbiota in diabetic chronic wounds and promotes biofilm formation. Front Cell Infect Microbiol. 10 (259), (2020).
- Kim, J. H., et al. Pseudomonas aeruginosa activates quorum sensing, antioxidant enzymes and type VI secretion in response to OS to initiate biofilm formation and wound chronicity. Antioxidants. 13 (6), 655(2024).
- Kim, J. H., et al. Skin microbiota and its role in health and disease with an emphasis on wound healing and chronic wound development. , Elsevier eBooks. 297-311 (2022).
- Kim, J. H., et al. Targeting anaerobic respiration in Pseudomonas aeruginosa with chlorate improves healing of chronic wounds. Adv Wound Care. 13 (2), 53-69 (2024).
- Jabbari, P., et al. Chronic wound initiation: single-cell RNAseq of cutaneous wound tissue during initiation of chronic wound development. Antioxidants. 14 (2), 214(2025).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешениеТеги
