Платформа с многоэлектродной матрицей для моделирования эпилепсии с использованием ассамблоидов мозга человека, полученных из плюрипотентных стволовых клеток

Summary

Этот протокол направлен на стабильное латирование дорсально-вентральных сросшихся ассамблоидов на многоэлектродных решетках для моделирования эпилепсии in vitro.

Abstract

Органоиды человеческого мозга представляют собой трехмерные (3D) структуры, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека (ПСК), которые повторяют аспекты развития мозга плода. Слияние дорсальных и вентральных регионально специфичных органоидов мозга in vitro приводит к образованию ассамблоидов, которые имеют функционально интегрированные микросхемы с возбуждающими и тормозными нейронами. Благодаря своей структурной сложности и разнообразной популяции нейронов, ассамблоиды стали полезным инструментом in vitro для изучения аберрантной сетевой активности. Записи с помощью многоэлектродной матрицы (MEA) служат методом захвата потенциалов электрического поля, спайков и динамики продольной сети от популяции нейронов без ущерба для целостности клеточной мембраны. Тем не менее, приклеивание сборок к электродам для длительной записи может быть сложной задачей из-за их большого размера и ограниченной площади контактной поверхности с электродами. Здесь мы демонстрируем метод нанесения ассамблоидов на пластины MEA для регистрации электрофизиологической активности в течение 2 месяцев. Хотя в текущем протоколе используются органоиды коры головного мозга человека, он может быть широко адаптирован к дифференцированным органоидам для моделирования других областей мозга. Этот протокол устанавливает надежный, продольный, электрофизиологический анализ для изучения развития нейронной сети, и эта платформа имеет потенциал для использования в скрининге лекарств для терапевтических разработок при эпилепсии.

Introduction

Органоиды мозга человека, полученные из плюрипотентных стволовых клеток (hPSC), представляют собой пространственно самоорганизованные 3D-структуры, отражающие архитектуру тканей и траектории развития in vivo. Они состоят из нескольких типов клеток, включая прогениторы (нейроэпителиальные клетки, радиальные глии, нейрональные предшественники, глиальные предшественники), нейроны (корковоподобные возбуждающие нейроны и тормозные интернейроны) и глиальные клетки (астроциты и олигодендроциты)^1,2. Ассамблоиды представляют собой следующее поколение органоидов мозга, способных интегрировать несколько областей мозга и/или клеточных линий в 3D-культуре. Они предоставляют полезный инструмент для моделирования связей между различными областями мозга, напоминающих аналоги in vivo, улавливания взаимодействий между нейронами и астроцитами для лучшей имитации зрелых и сложных нейронных сетей, а также для изучения сборки нейронных цепей. Таким образом, ассамблоиды становятся широко используемым инструментом для обобщения отличительных признаков патофизиологии эпилепсии, в которых необходимы функциональные меры для исследования аберрантных нейронных сетей, которые могут лежать в основе причины заболевания 3,4,5,6.

Чтобы смоделировать взаимодействия между корковыми глутаматергическими нейронами и ГАМКергическими интернейронами, несколько групп разработали отдельные органоиды, напоминающие дорсальный и вентральный мозг, а затем объединили их в многозонный ассамблоид 7,8,9,10. Здесь был применен ранее описанный протокол культивирования ассамблоидов с регионально специфичными нейронными подтипами⁹. Тем не менее, существенным барьером является отсутствие воспроизводимых функциональных анализов для мониторинга активности нейронной сети во время развития нервной системы. Многие функциональные тесты сетей в органоидах дают результаты, которые имеют высокую вариабельность среди партий дифференцировок и клеточных линий. Методы, включающие в себя срезы или диссоциацию органоидов, изменяют присущие им сети, разрывая синаптические связи^.

Многоэлектродные матрицы (MEA) обеспечивают крупномасштабное представление активности сети с течением времени с высоким временным разрешением для характеристики электрофизиологических свойств органоидов без нарушения условий культивирования или целостности клеточной мембраны¹¹. По сравнению с электрофизиологией пластыря, MEA обеспечивает высокопроизводительный сбор данных на основе больших популяций нейронов, а не отдельных клеток. Платформы MEA различаются по плотности электродов, удовлетворяя различные потребности в исследованиях органоидов мозга¹². Широко используемые системы, как показано в этом протоколе, регистрируют от 8 до 64 электродов на лунку 13,14,15. МЭА высокой плотности с количеством электродов до 26 400 на скважину обеспечивают повышенное пространственное и временное разрешение, количественную оценку скорости распространения потенциала действия, а также комбинацию с оптогенетической стимуляцией 14,16,17. Таким образом, MEA служит мощным инструментом для моделирования эпилепсии in vitro и трансляционной парадигмой для скрининга противосудорожных препаратов.

Одной из основных проблем является стабилизация ассамблоидов большого размера на гидрофобной металлической поверхности для длительной записи. В этом протоколе изложена подробная методология нанесения интактных ассамблоидов на пластины MEA для долгосрочной продольной регистрации вместе с фармакологическими анализами. К уникальным преимуществам протокола относятся стабильное прикрепление ассамблоидов к поверхности электрода без потери электрической активности, использование коммерчески доступных нейрофизиологических базальных сред для ускорения созревания функциональной сети после нанесения покрытия, возможность проведения последующих функциональных анализов, таких как медикаментозное лечение, и широкое применение к органоидам, полученным с помощью других региони-специфичных протоколов.

Цель состоит в том, чтобы обеспечить функциональный анализ с высоким временным разрешением для исследования сетевой активности, изучения специфических для заболевания изменений и тестирования препаратов с терапевтическим потенциалом при эпилепсии. Приведены видеоинструкции по наиболее сложным этапам этого протокола, показывающие методы нанесения ассамблоидов на пластины MEA, а также репрезентативные записи из этих культур.

Protocol

Все экспериментальные процедуры, представленные ниже, были проведены в соответствии с этическими рекомендациями Наблюдательного совета Медицинской школы Мичиганского университета и Комитета по надзору за исследованиями плюрипотентных стволовых клеток человека. Линии iPSC, использованные в этом протоколе и репрезентативных экспериментах, были получены из фибробластов крайней плоти человека, полученных из коммерческого источника. Подробная информация о клеточных линиях, реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Получение органоидов мозга, специфичных для судьбы, из ИПСК

ПРИМЕЧАНИЕ: Данный протокол содержит информацию для подготовки 3 лунок в микролуночном планшете из 5 сливающихся (~85%) лунок 6-луночного планшета. Протокол обслуживания iPSC варьируется в зависимости от клеточных линий.

1. Приготовьте отдельные среды для культивирования клеток с использованием состава, подробно описанного в таблице 1. Хранить в защищенном от света месте при температуре 4 °C до 2 недель.
2. Промойте все лунки, которые будут использоваться в планшете для микролунок, 1 мл DMEM/F-12 один раз. Добавьте 1 мл/лунку mTeSR plus + 50 μM Y-27632 и вращайте пластину при 2000 x g в течение 5 минут при комнатной температуре, чтобы удалить пузырьки воздуха из микролунок. Храните планшет в инкубаторе с 5% CO₂ при температуре 37 °C.
3. Очистите участки дифференцированных иПСК стерильным наконечником для пипетки P10 под микроскопом в ламинарном проточном чистом стенде. Остатки клеток смыть с монослоя с помощью PBS 1 мл/лунка без кальция или магния.
4. Диссоциируйте монослой на отдельные клетки, добавив 1 мл/лунку предварительно нагретого реагента для диссоциации клеток, и поместите планшет в инкубатор с 5% CO₂ при температуре 37 °C на 4-7 минут (в зависимости от характеристик и слияния клеточных линий) до тех пор, пока большинство клеток не оторвется, с легким перемешиванием каждые 2-3 минуты.
5. Добавьте по 4 мл DMEM/F-12 в каждую лунку, чтобы разбавить реагент для диссоциации клеток, и умеренно растирайте с помощью серологической пипетки объемом 10 мл. Соберите клеточную суспензию из всех лунок одной линии в коническую пробирку объемом 50 мл.
6. Вращайте при 200 x g в течение 4 минут при комнатной температуре, отсасывайте надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки объемом 10 мл и ресуспендируйте клетки в 2 мл mTeSR плюс + 50 μM Y-27632. Извлеките суспензию клеток объемом 10 мкл, смешайте 1:1 (v/v) с трипановым синим и подсчитайте клетки с помощью автоматического счетчика клеток.
7. Пластина 3 х 10^{по 6} живых клеток в лунку, по 3 лунки на линию. Добавьте дополнительно mTeSR plus + 50 μM Y-27632 по мере необходимости, чтобы довести общий объем до 2 мл/лунку. Закрутите тарелку при 100 х г в течение 3 минут при комнатной температуре и поставьте обратно в инкубатор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используемый здесь планшет для микролунок содержит 300 микролунок на лунку, поэтому покрытие 3 x 10⁶ клеток дает 10 000 клеток на микролунку.
8. На следующий день выполните половинную замену среды, аккуратно удалив 1 мл среды и медленно добавив 1 мл среды mTeSR plus (без Y-27632) с помощью наконечника для дозатора P1000. Держите кончик у поверхности среды и аспирируйте как можно медленнее, чтобы не нарушить агрегирующие клетки на дне.
9. Проверьте под перевернутым микроскопом через день после смены среды, и вы сможете увидеть четкие контуры каждого агрегата. Удалите исходный носитель из каждой лунки с помощью наконечников для дозатора P1000.
10. Умеренно распылите 0,5 мл нейроиндукционной среды (NIM) с дорсоморфином (DM) и SB-4321542 (SB) в каждую лунку стерильными, отрезанными наконечниками P1000. Сразу же аккуратно отпижьте взвешенные в среде агрегаты и перенесите их в стерильную 10-сантиметровую чашку для взвеси для культуры. Повторяйте до тех пор, пока не будут перенесены все агрегаты. НЕ растирать.
11. При необходимости добавляйте дополнительные NIM + SB/DM, чтобы довести общий объем до 10 мл на чашку. Поместите чашку на орбитальный шейкер в инкубатор с 5%_CO2 при температуре 37 °C, чтобы предотвратить самопроизвольное слияние агрегатов. Отметьте дату переноса как День 0 культивирования органоидов.
12. С первого дня и до конца следуйте рецепту мультимедиа, приведенному в таблице 1 , и временной шкале изменения мультимедиа⁹ на рисунке 1. Примечательно, что органоиды разделены на две чашки для суспензии, обозначенные как «дорсальные» и «брюшные» на 4-й день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько ключевых временных точек, которые следует иметь в виду: экспансия органоидов начинается на 6-й день, когда среда переключается на среду нейронной дифференцировки (NDM) с EGF/FGF. Дифференцировка нейронов поддерживается, начиная с 25-го дня, с помощью NDM + BDNF/NT3, а органоиды поддерживаются в NDM без факторов роста, начиная с 46-го дня.

2. Вирусное мечение и генерация ассамблоидов

Вирусное мечение ^7,9 рекомендуется для распознавания идентичности каждого регионально-специфичного органоида в ассамблоиде и распределения электрофизиологической активности от специфических электродов к ассамблоидным областям. Оптимально, если для каждой скважины MEA будет нанесено покрытие только по одному органоиду. Этот протокол также может применяться к одиночной органоидной оболочке.

1. Рассчитайте объемы используемого вирусного сырья и разбавляющих сред: для каждого маркируемого органоида требуется 200 мкл среды с вирусом. Дорсальные органоиды мечаются pAAV1-CAG-tdTomato, как правило, в соотношении разведения 1:1000 (v/v), или примерно 2 x^{10 vg} /мл. Для вентральных органоидов используется вирус 1:300 (v/v) или 2 x 10¹¹ vg/мл pAAV1-mDLX-GFP.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разведения должны быть титрованы до желаемого эффекта и подвержены влиянию титра вируса.
2. Прогрейте соответствующее количество среды до 37 °C. Разморозьте вирусный запас, хранящийся при -80 °C на льду. Маркируйте достаточное количество 48-луночных планшетов, чтобы вместить все помеченные органоиды.
3. Положите в капюшон стакан, содержащий 10% отбеливателя. Изгоняйте в стакан любые материалы, контактирующие с вирусами. Полностью размороженные вирусы развести в питательных средах в отдельных конических пробирках объемом 15 мл, помеченных как «дорсальные» и «вентральные».
4. Переместите органоиды 56-го дня из тарелок для культур в 48-луночные тарелки. Рекомендуется использовать один органоид на лунку для предотвращения спонтанного слияния в статической культуре. Удалите как можно больше остаточных питательных сред.
5. Добавьте по 200 мкл вирусно-медиа смеси в каждую лунку соответственно. Поместите планшеты обратно в инкубатор с температурой 37 °C 5%_CO2 . Наклоните планшеты на стерильной пустой пластине, чтобы сконцентрировать вирусные частицы на дне лунки и оптимизировать эффективность трансдукции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусные частицы имеют тенденцию опускаться на дно конической пробирки объемом 15 мл, поэтому частое переворачивание трубки для смешивания вирусов с средой перед добавлением их в каждую лунку очень важно для обеспечения равномерной эффективности трансдукции для всех органоидов.
6. На следующий день (день 57) добавьте еще 800 мкл питательной среды в каждую лунку, чтобы довести общий объем до 1 мл/лунку.
7. Через три дня (день 60) проведите полную смену среды для помеченных органоидов. Отбеливайте любые материалы, контактирующие с вирусными частицами.
8. Через три дня (день 63) проверьте экспрессию флуоресценции под эпифлуоресцентным инвертированным микроскопом. Если сигнал сильный, начните генерацию ассамблоидов (см. шаг 2.9).
9. Промойте все меченые органоиды с помощью PBS 1 мл/лунка дважды, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение оставшимися вирусными частицами во время слияния органоидов. С помощью отрезанного наконечника пипетки P1000 перенесите по одному вентральному органоиду в каждую дорсальную лунку (или наоборот) и соответствующим образом перемаркируйте пластину сборки. Наклоните пластины, как в шаге 2.5 для лучшего сплавления.
10. Осторожно выполнить половинную смену среды через 3 дня после процедуры сращивания (66-й день), не прерывая сборки. Обычно для формирования стабильных ассамблоидов требуется около недели (70-й день).

3. Размещение ассамблоидов на предварительно обработанных пластинах MEA

ПРИМЕЧАНИЕ: Для завершения процедур подготовки поверхности пластин MEA перед нанесением покрытий на сборки требуется не менее 4 дней. Для экономии времени слияние дорсальных и вентральных органоидов (т.е. шаг 2.9) и предварительная обработка МЭА могут выполняться параллельно.

1. Подготовьте реагенты для предварительной обработки поверхности и нанесения покрытия.
   1. Для приготовления 1% раствора моющего/энзимного средства растворите 0,5 г порошка фермента/моющего средства в 50 мл деионизированной воды. Тщательно перемешайте до полного растворения порошка. Стерилизуйте раствор с помощью стерильного вакуумного фильтра с верхней трубкой в шкафу биобезопасности перед добавлением его в лунки MEA. Готовьте свежий перед каждым использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Моющее средство/фермент стерилизует поверхность MEA, удаляет любые остатки масел из производственного процесса MEA и гарантирует, что поверхность достаточно гидрофильна, чтобы способствовать взаимодействию с гидрофильным соединением полиэтиленимином (PEI)¹⁸.
   2. Чтобы приготовить 0,07% раствор PEI¹⁹, начните с приготовления бульона 7% раствора PEI путем смешивания 1 мл 50% раствора PEI в конической пробирке объемом 15 мл с 6 мл 1x боратного буфера. Разведите 1 мл стокового 7% раствора PEI в 99 мл 1x боратного буфера до достижения конечной рабочей концентрации. Для стерилизации перед использованием профильтруйте через фильтрующий блок 0,22 μм в шкафу биобезопасности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PEI, положительно заряженный полимер, используется в процессе нанесения первичного покрытия для облегчения присоединения отрицательно заряженного вторичного покрытия к матрице базальной мембраны (BMM) и ассамблоидам²⁰. Выньте 1 мл 50% PEI, налив вместо пипетирования в коническую трубку, так как исходный раствор очень вязкий. Необходимое количество можно легче измерить, взвесив его в коническую пробирку, а 50% раствор PEI имеет плотность 1,08 г/мл. 7% исходный раствор PEI можно хранить в 1 мл аликвот при температуре -20 °C до месяца. Все последующие действия проведите в шкафу биобезопасности.
2. Учитывая размер каждого сбора, для размещения одного ассамблоида на лунку используются 6-луночные пластины MEA с 64 электродами на лунку. Рассчитайте количество планшетов MEA, необходимых для проведения экспериментов, чтобы обеспечить достаточное количество биологических реплик.
3. Добавьте 1 мл 1% раствора моющего/ферментного средства в каждую лунку стерильной пластины MEA. Будьте осторожны, чтобы не повредить электроды наконечником пипетки. При использовании вакуумного аспиратора для промывки не допускайте соприкосновения наконечника с электродной решеткой. Инкубировать в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 2 ч.
4. Удалите моющее средство/фермент и промойте каждую лунку пять раз 1,5 мл стерильной деионизированной воды. Поскольку моющее средство/фермент не является биосовместимым, важно убедиться, что оставшиеся химикаты полностью смыты.
5. Заполните каждую лунку 1 мл питательной среды для предварительного кондиционирования. Поставьте пластины обратно на 37 °C 5%_CO2 в инкубатор на 2 дня. Воздействие на поверхность МЭА условий клеточной культуры способствует прикреплению клеток.
6. Удалите питательную среду и нанесите на электроды MEA в каждой лунке 50 мкл 0,07% раствора PEI для первичного покрытия. Выдерживать при 37 °C в течение 1 ч.
7. Полностью аспирировать раствор PEI. Промойте каждую лунку 1 мл стерильной деионизированной воды. Всего выполните 3 быстрых стирки. Высушите пластины при комнатной температуре в течение 15 минут в шкафу биобезопасности с закрытой крышкой.
8. Покройте область электрода в каждой лунке 50 мкл 1:20 (v/v) BMM, разведенным в питательных средах для вторичного покрытия. Поместите планшеты MEA обратно в инкубатор с температурой 37 °C на ночь. Добавьте стерильную воду в отсеки вокруг лунок, чтобы обеспечить достаточную влажность на протяжении всего процесса покрытия.
9. На следующий день аспират разбавляют BMM вакуумом, оставляя тонкий слой на поверхности. Если образовался толстый слой, с усилием распылите питательную среду на контактную зону электрода с помощью наконечника для пипетки P1000. Мойте столько раз, сколько необходимо, чтобы удалить толстые куски.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Остаточный толстый BMM может препятствовать контакту электродов с элементами.
10. Соберите ассамблоид с широко разрезанным наконечником P1000 и поместите его поверх электродов в лунку, перенося при этом как можно меньше среды.
11. В ламинарном проточном колпаке под зондом для вскрытия осторожно протолкните ассамблоид стерильной иглой для рассечения или наконечником Р20 в нужное место, где как дорсальные, так и вентральные органоиды могут быть в основном покрыты электродами. Используйте наконечник P20 для удаления жидкости вокруг сборки. Повторите это для всех ассамблоидов или подмножества, что можно сделать в течение нескольких минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь НЕ прикасаться и не царапать поверхность MEA наконечником и/или иглой пипетки. Старайтесь НЕ тыкать и не рвать ассамблоид наконечниками пипетки. Закончите нанесение покрытия как можно быстрее, чтобы избежать полного высыхания органоида.
12. Инкубировать ассамблоиды при температуре 37 °C в течение 10 мин (без среды). Переложите планшеты из инкубатора в ламинарный проточный колпак и нанесите 2-3 небольшие капли 1:50 BMM, разведенные в питательных средах, поверх ассамблоидов под зоной диссекции. Выдерживать при температуре 37 °C еще 30 минут.
13. Осторожно добавьте 3 капли питательных сред близко к ассамблоидам под зоной диссекции. Это сохраняет органоиды увлажненными. Выдерживать при 37 °C в течение 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если сборка перемещается или плавает на любых последующих этапах, покрытие следует начать заново с шага 3.11.
14. Каждый час осторожно добавляйте 20-50 мкл среды для клеточных культур в каждую лунку под зондоскопом для вскрытия. Это можно сделать в течение дня. Цель состоит в том, чтобы достичь общего объема не менее 250 μL в конце дня.
15. На следующий день проверьте, все ли ассамблоиды осели и стабилизировались ли они под областью вскрытия. Добавьте дополнительно 750 мкл питательной среды, чтобы получить общий объем 1 мл на лунку. Оставьте тарелки в покое не менее чем на 2 дня.
16. Осторожно проводите еженедельную смену среды, вынимая 500 мкл питательных сред и добавляя 700 мкл нейрофизиологической базальной среды. Дополнительный объем добавляемого фильтрующего материала учитывает испарение и может быть отрегулирован в зависимости от того, насколько сильно испаряется используемая пластина MEA. При необходимости добавляйте стерильную воду вокруг лунок, чтобы свести к минимуму испарение из лунок MEA.

4. Регистрация и анализ данных MEA

1. Начните запись МЭА примерно через неделю после перехода на нейрофизиологические базальные среды (обычно примерно на 78-й день).
2. Подождите, пока записывающая камера достигнет заданной температуры (обычно 37 °C). Перенесите пластину на устройство и дайте ей уравновеситься не менее 5 минут до начала записи.
3. Настройки оборудования в реальном времени
   1. Установите частоту дискретизации, т. е. скорость, с которой записываются исходные данные о напряжении. Рекомендуется использовать настройку по умолчанию (12,5 кГц).
   2. Укажите аналоговый режим (обычно Neural Spikes, как в данном случае) для настройки аппаратной пропускной способности и усиления для конкретных приложений. Для визуального контроля активности во время записи используйте модули Spike Detector и Burst Detector .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аналоговые настройки влияют на то, как записываются исходные данные о напряжении, и не могут быть изменены после записи данных.
   3. (Дополнительный) Примените аппаратный цифровой фильтр к данным записи. Варианты фильтра нижних частот включают окно Кайзера 2 кГц или 3 кГц. Настройки по умолчанию можно изменить после выбора Аналоговых настроек.
   4. Установите значение Ссылка по медиане (по умолчанию), что настоятельно рекомендуется для нейронной записи, как в данном случае. Система сравнения улучшает качество сигналов с низкой амплитудой за счет уменьшения шумовых помех, характерных для групп каналов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеуказанные параметры могут быть скорректированы по мере необходимости в зависимости от активности, наблюдаемой в ассамблоидах, но должны оставаться неизменными для всех записей в данном эксперименте.
4. Добавьте карты табличек и описания (при необходимости). Импортируйте карту номерных знаков из предыдущей записи для той же пластины, чтобы обеспечить согласованность и упростить пакетную обработку данных. Убедитесь, что файлы названы правильно.
5. Если сигналы выглядят хорошо (минимальный шум и артефакты), запишите необработанные данные. Как правило, для репрезентативной выборки достаточно 2-5 минут записи.
6. Продольно регистрируйте электрическую активность один или два раза в неделю, в течение 5-15 минут, в зависимости от плана эксперимента. Подождите не менее 24 часов после каждой смены носителя, прежде чем начинать следующий раунд записи, так как электрическая активность падает сразу после каждой смены носителя.
7. (Дополнительный) Если необходимо локализовать электрическую активность и различить дорсальные и вентральные органоиды, или если необходимо проанализировать активность каждого электрода отдельно, после каждой записи получите изображение каждого ассамблоида в условиях яркого поля и эпифлуоресценции (рис. 2B).
8. При анализе данных примените конфигурацию анализа, включающую детектор пиков/всплесков и компилятор статистики. Используйте адаптивный порог, установленный на 5,5–6 стандартных отклонений от базового уровня для обнаружения пиков. Определите всплески как активность с пиками ≥5 за 100 мс¹³. Определение сетевой активности, когда более 25% от общего числа активных электродов сгорает в течение 100 мс с минимум 50 пиками на сетевой всплеск^13,14.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры модулируются в зависимости от характеристик срабатывания конкретного эксперимента. Чтобы повысить чувствительность к пикам низкой амплитуды, адаптивный порог обнаружения спайков может быть снижен. Для обнаружения всплесков могут быть использованы различные методы, а параметры могут быть адаптированы для обнаружения всплесков всплесков, которые существенно отличаются от фоновой активности. Параметры активности сети могут быть модулированы в сторону меньшего процента электродов, особенно когда ассамблоиды не покрывают все поле электродов. Все параметры должны оставаться неизменными на протяжении всего эксперимента, чтобы можно было проводить продольные сравнения.
9. Запустите модуль Компилятор статистики для пакетной обработки во время воспроизведения записанных данных. Экспортируйте расширенные метрики и/или выходные файлы пиков для расширенного анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выходные данные расширенных метрик содержат файл с .csv электродами, средними значениями скважин и групп для средних значений срабатывания, разрыва и синхронности. Вывод спайков (файл .spk) включает в себя кривые осциллограмм для всех спайков, которые можно импортировать на другие платформы для расширенного анализа, например, сортировки спайков.

5. Фармакологический анализ конечной точки и переработка планшетов

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализы лечения лекарственными препаратами могут быть проведены после того, как ассамблоиды достаточно созреют и электрическая активность достигнет пика. Запись исходного уровня/активности до обработки и активности после обработки должна проводиться в один и тот же день.

1. Добавьте 1-10 μL раствора препарата прямо поверх ассамблоида и аккуратно покрутите пластину, чтобы обеспечить однородную смесь. В некоторых случаях рекомендуется более длительное время инкубации в лекарственных средах, содержащих наркотики, например, при анализах лечения препаратами, связанными с синапсами, агонистами/антагонистами глутамата/рецепторов ГАМК (рис. 2E) (подробнее см. раздел «Результаты»).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление небольшого количества раствора препарата в каждую лунку рекомендуется для достижения окончательной рабочей концентрации, поскольку большое изменение объема временно снижает электрическую активность в целом. Важно следить за тем, чтобы добавление носителя, в котором растворяются интересующие препараты, не провоцировало существенных изменений электрофизиологических параметров.
2. Проведите достаточное количество промываний PBS (обычно 3) и вымывайте лекарства после записи после лечения. Проведите дополнительную запись на следующий день после вымывания препарата, чтобы увидеть, возвращается ли электрическая активность к исходному уровню.
3. Необязательно, принудительно пипетируйте среды для отделения ассамблоидов от пластины MEA в конце записи для проведения дальнейших экспериментов, например, визуализации в реальном времени, фиксации 4% параформальдегидом для иммуноокрашивания всего массива или лизиса для экстракции РНК или белка.
4. Для целей анализа используйте не менее трех технических и биологических репликатов для каждого состояния. Экспрессируйте электрофизиологические данные в виде среднего значения n ≥ 3 репликации.
5. Чтобы утилизировать пластину в конце экспериментов, отсасывайте оставшиеся среды после удаления прикрепленных сборок. Один раз постирайте стерильным PBS. Полностью покройте металлическую область 200 μл/лунка 0,25% трипсин-ЭДТА и поместите планшет обратно в инкубатор с температурой 37 °C на ночь.
6. На следующий день аспирировать трипсин, промыться дважды 70% стерильным этанолом и трижды стерильной деионизированной водой.
7. Высушите тарелку на воздухе в шкафу биобезопасности в течение 15 минут при снятой крышке или до полного высыхания. Запечатайте очищенную тарелку в полиэтиленовый пакет и храните его при комнатной температуре до дальнейшего использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошо очищенную пластину MEA можно использовать повторно три раза без существенной потери качества записи.

Results

Дорсально-вентральные ассамблоиды человека были нанесены на 6-луночную пластину MEA (n = 6 на дифференцировку, 3 дифференцировки), причем каждая лунка содержала 64 электрода (рис. 2A). Девять из десяти ассамблоидов, запланированных для продольной регистрации, были прочно прикреплены к электродам в течение более 50 дней in vitro (рис. 2D). 6 из 8 ассамблоидов, предназначенных для фармакологических анализов, были успешно урегулированы в фазе вымывания с развитием активности сети, соответствующей стадии (рис. 2E). Показаны фазово-контрастные и флуоресцентные изображения из одной репрезентативной лунки (рис. 2B), в которых легко различимы дорсальные органоиды, меченные AAV-CAG-tdTomato, и вентральные органоиды, меченные AAV-mDLX-GFP ^7,9.

Активность нейронов на MEA может быть проанализирована для оценки общей возбудимости клеток и сетевой активности с помощью различных параметров. Общая частота возбуждения в культуре дает информацию о возбудимости клеток и сетей, в то время как частота синхронизированных всплесков на нескольких электродах указывает на диапазон синаптически активных сетей нейронов. Множественные повторяющиеся всплески, происходящие на пространственно различных электродах в течение короткого периода времени (разрыв сети), могут служить биологическим коррелятом судорожной активности, хотя ассамблоиды на МЭА остаются ограниченными по сравнению с целым организмом, который может испытывать настоящие судороги. На рисунке 2C показаны паттерны разрыва сети ассамблоидов, культивируемых в коммерчески доступных нейрофизиологических базальных средах на 84-й и 91-й дни, с увеличенной продолжительностью разрыва в более поздний момент времени, вероятно, из-за функционального созревания нейронов. В этом случае клеточная и сетевая активность постепенно возрастает со дня, когда ассамблоиды покрываются, обычно достигая пика на 92-й день и почти затухая на 125-й день (рис. 2D). Повышенное созревание на более поздней стадии, вероятно, способствует увеличению продолжительности синхронизированной серии в более поздней точке времени.

Бикукулин, антагонист рецепторов ГАМК_А , усиливает синхронизированную сетевую активность ассамблоидов, о чем свидетельствуют значительно более высокие частоты срабатывания и частоты (сетевых) всплесков после добавления препарата на 108-й день (рис. 2E). Это похоже на то, что было ранее продемонстрировано в записях электрофизиологии^{одиночных клеток 21}. Анализ мощности фармакологического анализа проводился с использованием базы G*Power3 с величиной эффекта 0,94 и альфа 0,05. Общая выборка из 15 ассамблоидов с тремя равноразмерными группами n = 5 потребовалась для достижения степени 0,8 (рис. 2E). Управление транспортным средством включено для проверки того, что реакция является истинным сигнальным событием, а не просто изменением интенсивности сигнала, которое может возникнуть в результате добавления небольшого количества среды (рис. 2E).

Рисунок 1: Обзор исследования. Протокол генерации и нанесения двойных меченых ассамблоидов на МЭА временной шкалы протокола дифференцировки с подробным описанием критических стадий и соответствующих низкомолекулярных добавок (дополнительную информацию о составе см. в таблице 1 и таблице материалов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Регистрация ассамблоидов на MEA. (A) Тепловая карта средней активности обжига с одной пластины MEA (n = 6 скважин) на 82-й день, т.е. на 10-й день после нанесения покрытия. Все лунки представляют культуры одного состояния и генотипа. (B) Репрезентативные фазово-контрастные и конфокальные изображения ассамблоида, с дорсальным ассамблоидом, помеченным красным цветом, и вентральным зеленым. Белые стрелки указывают на мигрировавшие ГАМКергические интернейроны с вентральной на дорсальную сторону. Масштабная линейка = 500 мкм. (C) Репрезентативные растровые графики за 120 секунд времени записи из одной скважины. Сетевые всплески выделены фиолетовым прямоугольником. Демонстрируются две отдельные временные точки: День 78 (через 1 неделю после нанесения покрытия, день начала записи) и День 92 (через 3 недели после нанесения покрытия, также когда активность достигает пика). (D) Количественная оценка средней скорости срабатывания, частоты срабатывания и частоты разрывов сети с 78-го по 127-й день (n = 3 дифференцировки, 3 ассамблоида/дифференцировки). Каждая кривая указывает на одну отдельную сборку, составленную из 3 дифференциаций (с цветовой кодировкой). Красная кривая показывает среднее значение. (E) Количественная оценка результатов бикукулинового анализа (n = 6 ассамблоидов на состояние). Гистограмма отображалась как среднее значение ± SEM. Каждая точка представляет собой одну сборку, составленную из 3 партий дифференцировки (с цветовой кодировкой). Был проведен непараметрический тест Фридмана. **p < 0,01; ns, не существенно. MEA, многоэлектродные матрицы. Тепловая карта и растровые графики генерируются с помощью аналитического программного обеспечения Neural Metric Tool. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Компоненты сред на различных стадиях дифференцировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Discussion

Методы на основе MEA для электрофизиологической регистрации сетевой активности в ассамблоидах, полученных из iPSC, были использованы для моделирования эпилепсии in vitro ^22,23. Эта предложенная платформа, объединяющая возбуждающие и тормозящие синаптические связи, обладает потенциалом для рассмотрения механизмов гипервозбудимости нейронов и роли корковых интернейронов в процессе эпилептогенеза. Кроме того, эта платформа позволяет стабилизировать ассемблоиды и собирать продольные электрофизиологические данные в течение примерно 50 дней in vitro, даже в присутствии фармакологических возмущений, тем самым обеспечивая подход к тестированию соединений с потенциальными терапевтическими мишенями.

Стабилизация зрелых, относительно крупных ассамблоидов на гидрофобной поверхности в течение длительного периода in vitro была технически сложной задачей. Чтобы преодолеть это препятствие, применяется стратегия двойного нанесения покрытия с помощью противоположно заряженных химических веществ, чтобы облегчить кратковременное и долгосрочное сцепление органоидов с поверхностью электрода. Этот протокол оптимизирует ранее использованный способ²⁴ путем переключения реагентов для покрытия пластин с поли-L-орнитина (PLO)/ламинина на PEI/BMM, что позволяет получить твердое прикрепление с высокими показателями успеха и низкой токсичностью. Кроме того, эта стабилизированная система долгосрочного культивирования обладает потенциалом для получения данных с высокой пропускной способностью. Например, предварительная маркировка двойными вирусами может дополнить сортировку шипов отдельными электродами для локализации и сравнения активности из разных регионов. Предложенная платформа также обеспечивает стабильный инструмент для регистрации потенциалов локального поля, который имеет большое значение для функции интернейронов без нарушения интактной структуры ассамблоид²⁵. Основным ограничением этого протокола является то, что сборки сплющиваются после нанесения покрытия, что вызывает опасения по поводу того, сохраняются ли первоначальные 3D-структуры или нет. Выращивание органоидов вокруг электродов с использованием более совершенных платформ MEA, которые обволакивают органоид электродами²⁶ , потенциально может преодолеть это ограничение.

Одним из основных препятствий для методов электрофизиологической регистрации органоидов на основе МЭА является вариабельность и воспроизводимость экспериментальных результатов в протоколах дифференцировки и даже в партиях дифференцировки. Предыдущие исследования показывают, что сетевая активность нейронов, измеряемая с помощью MEA, зависит от статуса созревания нейронов как дорсальных, так и вентральных органоидов^. Запись с ассамблоидов в более поздний момент времени с относительно зрелыми нейронами и цепями является одним из способов улучшения согласованности. Кроме того, выбор многоскважинных систем MEA, генерирующих данные с высокой пропускной способностью, позволит проводить статистические сравнения в свете экспериментальной изменчивости. Если электрофизиологическая активность культуры не соответствует тому, что ожидается в данный момент времени, сбор интактной культуры с функциональной платформы для проведения мероприятий по контролю качества, включая иммуноцитохимический и транскриптомный анализ, будет важным и полезным.

Первостепенное значение для предлагаемой платформы имеет функциональная интеграция регионально специфичных возбуждающих корковых нейронов на дорсальной стороне и тормозных интернейронов на вентральной стороне. Протоколы генерации органоидов, специфичных для областей мозга, найденные в литературе, сильно различаются в зависимости от условий среды, времени культивирования, урожайности и профилей созревания, а также других факторов²⁸. В то время как этот протокол специфичен для коры и ганглионарного возвышения в своей способности генерировать возбуждающие нейроны и ГАМКергические интернейроны, хорошо зарекомендовавшие себя методы дифференцировки могут быть использованы для генерации нейронов, производных от iPSC, проявляющих другие идентичности, таких как моторные нейроны²⁹ и клетки Пуркинье³⁰. Таким образом, предложенная платформа обладает потенциалом для моделирования нейронных цепей между корой головного мозга и спинным мозгом/мозжечком. После некоторой оптимизации, связанной со временем нанесения покрытия и визуализацией типов клеток с вирусным мечением, этот метод может быть перенесен на другие модели заболеваний, помимо эпилепсии, такие как боковой амиотрофический склероз (БАС)¹⁷.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 см Corning Чашки для культуры без обработки ТС	Corning	08-772-32	Для суспензионной культуры на шейкере
100 мл Стакан	Fisher Scientific	FB100100
100% этанол	Fisher Scientific	BP28184-4 л
2-меркаптоэтанол (β-ME)	Thermo Fisher	21985023	рабочей концентрацией 100 мкм; M
48-луночный планшет для клеточных культур	Fisher Scientific	50-202-140
6-луночный планшет для клеточных культур	Fisher Scientific	07-200-83
Aggrewell 800	Fisher Scientific	501974754
Allegra X-14R Охлаждаемая центрифуга	Beckman Coulter	BE-AX14R
Аллопрегнанолон	Cayman	16930	Суспендировано 5 мг в ДМСО для получения 1 мМ исходного раствора. Аликвот и заморозка при &минус; 80 °C. Разбавьте до 1:10 000 для использования. Рабочая концентрация 100 нМ.
Автоматизированный счетчик клеток	Thermo Fisher	AMQAX2000
Axion CytoView MEA 6-луночные планшеты	Axion Biosystems	M384-tMEA-6B
Axion Maestro MEA платформа	Axion Biosystems	Maestro	С температурным контролем окружающей среды
добавка B-27 (обычная, с витамином А)	Thermo Fisher	21985023
добавка B-27 (без витамина А)	Thermo Fisher	12587010
матрица базальной мембраны - Geltrex	Thermo Fisher	A1569601
Бисерная ванна	Fisher Scientific	10-876-001	Isotemp
Настольный инвертированный микроскоп	Olympus	CKX53	Выдерживается в ламинарном потоке чистый скамейка
Bicuculline	Sigma-Aldrich	14340	Рабочая концентрация 10 μ M
Bleach	CLOROX	67619-26
Боратный буфер 20x	Thermo Fisher	28341	Рабочая концентрация при 1x
BrainPhys media	StemCell Technologies	5790
Реагент для диссоциации клеток (StemPro Accutase)		Thermo Fisher
Celltron	HT-Infors	И69222
Детергент/фермент (Terg-A-Zyme)	Sigma-Aldrich	Z273287	Рабочая концентрация 1% м/в
DMEM/F12 + HEPES/L-глютамин	Thermo Fisher	113300
DMSO	Sigma-Aldrich	67685
Дорсоморфин	Sigma-Aldrich	P5499	Растворите 5 мг в ДМСО, чтобы получить 10 мМ стокового раствора. Аликвот и заморозка при &минус; 20 °C. Разбавьте до 1:2000 для использования. (рабочая концентрация 5 мкм; M)
D-PBS без кальция или магния	Thermo Fisher	14190144
Глиальная клеточная линия, полученная из нейротрофических (GDNF)	Peprotech	450-10	Dissolve 100 μ g в 1 мл PBS до 100 мкм; г/мл. Аликвот и заморозка при &минус; 20 °C. Разбавьте до 1:5000 для использования. (рабочая концентрация 20 нг/мл).
Добавка GlutaMAX	Thermo Fisher	35050061
Гемацитометр	для выборов Микроскопия Науки	63510-20
HEPES	Thermo Fisher	15630080
Heraguard ECO Clean Bench	Thermo Fisher	51029692
Инкубатор для клеточных культур с контролируемой влажностью	Thermo Fisher	370	установлен на 37 градусов; C, 5% CO2
IWP-2	Selleckchem	S7085	Aliquot и заморозить при &минус; 80 °С. Он выпадет в осадок, если оттаять при комнатной температуре. Замороженные аликвоты следует поместить непосредственно в 37 градусов; C перед использованием.
Нокаут-заменитель сыворотки (KOSR)	Thermo Fisher	10828010
mTeSRplus (среда + добавки)	StemCell Technologies	100-0276	cGMP, стабилизированная среда без питательных веществ для клеток iPSC человека
N2 добавка Thermo	Fisher	17502048
Neurobasal A	Thermo Fisher	21103049
заменимые аминокислоты (NEAA)	Thermo Fisher	11140050
NT3	Peprotech	450-03	растворить 100 μ g в 1 мл PBS до 100 мкм; г/мл. Аликвот и заморозка при &минус; 20 °C. Разбавьте до 1:5000 для использования. (рабочая концентрация 20 нг/мл).
NuFF Фибробласты неонатальной крайней плоти человека	MTI-GlobalStem	GSC-3002
Парапленка	PARAFILM	P7793
Пенициллин/Стрептомицин	Thermo Fisher	15140122
пипетка (P10, P200, P1000)	Eppendorf	EP4926000034	Автоклавная резка P1000 наконечники для сбора органоидов
Poly (этиленимин) (PEI)	Sigma-Aldrich	P3143	Развести бульон в стерильном боратном буфере. Рабочая концентрация 0,07%. Подробнее см. в рукописи.
Рекомбинантный эпидермальный фактор роста человека (EGF)	R& D Системы	236-EG-200	подвешены в PBS. Аликвоту и заморозьте при -20°С.
Рекомбинантный фактор роста фибробластов человека (FGF)-базовый	Пепротех	100-18Б	подвешен в PBS. Аликвоту и заморозьте при -20°С.
Рекомбинантный нейротрофический фактор человеческого мозга (BDNF)	Peprotech	450-02	незадолго до восстановления. Растворить 100 μ г в 1 мл PBS до 100 мкм; г/мл. Аликвот и заморозка при &минус; 20 °C. Разбавьте до 1:5000 для использования. (рабочая концентрация 20 нг/мл).
Ретиноевая кислота (РА)	Sigma-Aldrich	R2625	Растворите 100 мг в 3,3 мл ДМСО, чтобы получить 100 мМ исходного раствора. Аликвот на сток 100 μ L/tube и замораживание при − 80 °С. Возьмите 200 μ L 100 mM stock и разбавьте в 10 раз (добавьте 1,8 мл DMSO), чтобы получить 10 mM stock. Аликвот 50 μ Л/тюбик и хранить при &минус; 80 °C. Разбавить до 1:100 000 для использования. (рабочая концентрация 100 нМ).
ROCK ингибитор Y-27632	Tocris	1254	1:200 из 10 мМ запас
SAG (разглаженный агонист)	Selleckchem	S7779	Aliquot и заморозить при &минус; 80 °C. Концентрация запаса 1 мМ. Использовать при разведении 1:10 000 (рабочая концентрация 100 нМ).
SB-431542	Tocris	1614	Растворите 5 мг в 1,3 мл ДМСО, чтобы получить 10 мл исходного раствора. Аликвот и заморозка при &минус; 80 °C. Разбавьте до 1:1000 для использования. (рабочая концентрация 10 мкм; M)
Серологический наполнитель для пипеток	Fisher Scientific	14-387-166
Верхний фильтр вакуумной трубки Steriflip	Sigma-Aldrich	SE1M179M6
Стерильные колпаки для клеточных культур	Baker	Company SG-600
Трипан синий раствор (0,4%)	Thermo Fisher	15250061
Трипсин-ЭДТА (0,25%)	Thermo Fisher	25200056
Зум-стереомикроскоп	Olympus	SZ61/SZ51	Хранится в ламинарном потоке в чистоте