Методическая статья

Окрашивание живых/мертвых для количественного определения жизнеспособных, но не поддающихся культивированию клеток ранообразующих бактерий, обработанных медом манука

DOI:

10.3791/67398

⸱

25 апреля 2025 г.

 ,  , 
1Department of Biology, Eastern Washington University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленный протокол описывает процедуру количественного определения жизнеспособных, но не культивируемых клеток (VBNC) в бактериальных культурах, обработанных медом манука.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Устойчивость к антибиотикам и толерантность бактерий представляют собой значительную угрозу для глобального здравоохранения. Механизмы, способствующие устойчивости и толерантности к антибиотикам, включают генетические мутации и приобретение генов устойчивости, а также переход к жизнеспособным, но не культивируемым (VBNC) и другим состояниям покоя соответственно. Несмотря на то, что генетически они идентичны своим неустойчивым к антибиотикам аналогам, клетки VBNC уклоняются от воздействия антибиотиков, оставаясь метаболически неактивными. Антибиотики эффективны только тогда, когда активны их целевые процессы, такие как репликация ДНК или транскрипция. Поскольку стрессоры окружающей среды, особенно антибиотики, могут приводить бактерии в спячку, необходимы альтернативные противомикробные препараты, чтобы свести к минимуму или предотвратить эту реакцию. Антимикробный мед манука (MH) эффективен против многих бактерий с редким развитием резистентности. Его многогранные антимикробные механизмы делают его ценным средством для лечения бактериальных инфекций. В этом исследовании изучалась устойчивость MH к развитию устойчивости к антибиотикам, проверяя гипотезу о том, что MH индуцирует меньше клеток VBNC, чем обычные антибиотики. Чтобы исследовать это, был разработан протокол лечения раневых бактерий Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa минимальными ингибирующими концентрациями MH или обычными антибиотиками тобрамицином или меропенемом, который затем использовал количество жизнеспособных пластин для идентификации метаболически активных культивируемых клеток и окрашивание живых/мертвых для идентификации всех жизнеспособных клеток. Количество клеток VBNC равнялось числу жизнеспособных клеток за вычетом числа культивируемых клеток. В некоторых экспериментах число культивируемых клеток было выше, чем количество жизнеспособных клеток, что давало отрицательное количество клеток VBNC; таким образом, номера ячеек VBNC напрямую не сравнивались. Вместо этого сравнивали количество культивируемых и жизнеспособных клеток для каждого лечения. Только P. aeruginosa, обработанная тобрамицином, имела значительно меньше культивируемых клеток, чем жизнеспособных, что указывает на большее количество клеток VBNC. Этот протокол является быстрым и простым и может быть использован для оценки индукции МГ клеток VBNC у других патогенных бактерий.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бактерии, находящиеся в состоянии покоя жизнеспособных, но не культивируемых (VBNC), выживают при лечении антибиотиками и вызывают повторяющиеся, а иногда и смертельно опасные инфекционные заболевания 1,2,3. Более привычной для нас является устойчивость к антибиотикам, которая возникает через наследственные генетическиеизменения4. Генетическое изменение обеспечивает устойчивость к конкретному антибиотику с помощью нескольких механизмов, включая ограничение поглощения антибиотика, увеличение оттока антибиотика, модификацию мишени антибиотика или инактивацию антибиотика. Напротив, бактерии в состоянии покоя демонстрируют более широкую и ненаследуемую толерантность к антибиотикам за счет снижения их метаболизма 2,3. Антибиотики нацелены на специфические метаболические процессы, включая репликацию ДНК и синтез клеточной стенки, и неэффективны против метаболически неактивных клеток VBNC4. Клетки VBNC существуют стохастически в небольшом количестве вместе со своими генетически идентичными чувствительными к антибиотикам братьями и сестрами в большинстве бактериальных популяций5. Тем не менее, стрессоры окружающей среды, в том числе воздействие антибиотиков, побуждают восприимчивые бактериальные клетки переходить в антибиотечно-толерантное состояние VBNC 3,6. Лечение антибиотиками убивает чувствительные к антибиотикам клетки в популяции, в то время как спящие клетки VBNC остаются. Как следует из названия, клетки VBNC не могут культивироваться на средах, подходящих для роста их метаболически активных братьев и сестер. Тем не менее, их мембраны и генетический материал не повреждены, и они могут размножаться 7,8. При удалении антибиотиков требуются специфические стимулы, такие как питательные вещества, температура или факторы хозяина, чтобы вывести клетки VBNC из состояния покоя и восстановить рост 3,9. Клетки VBNC были зарегистрированы у многих патогенных видов бактерий, включая P. aeruginosa и S. aureus, основных этиологических агентов раневых инфекций10,11.

Мед издавна используется в медицинских целях, в том числе для лечения ран, из-за его антибактериальных свойств12. Мед манука (MH), полученный из цветков куста манука (Leptospermum scoparium), был отмечен своей бактерицидной активностью широкого спектра действия (обзор см.в 13,14,15). Он успешно убивает большинство протестированных бактерий, вызывающих инфекции человека, включая штаммы бактерий, такие как метициллин-резистентный золотистый стафилококк и ванкомицин-резистентный энтерококк, которые демонстрируют наследственную устойчивость к традиционным антибиотикам16,17. Кроме того, индуцированная бактериальная резистентность к MH встречается редко, она обнаруживается только в биопленках P. aeruginosa, подвергшихся воздействию меда, и Escherichia coli, культивируемых в возрастающих концентрациях подгруппы тестируемого меда 18,19,20,21. Это говорит о том, что антимикробные механизмы МН отличаются от обычных антибиотиков и могут индуцировать меньшее количество клеток VBNC или вообще не вызывать их. Эта гипотеза была проверена путем определения того, как MH влияет на популяции VBNC по сравнению с обычными антибиотиками.

Клетки VBNC следует отличать от их метаболически активных культивируемых собратьев и сестер и мертвых клеток. Культивируемые клетки подсчитывают с использованием метода подсчета жизнеспособных планшетов, при котором клетки переносят в обычные питательные среды и инкубируют в течение периода, достаточного для достаточного количества делений клеток, чтобы привести к наблюдаемым колониям. Разработано несколько методов отличия VBNC-клеток от мертвых клеток, основанных на их интактных мембранах и низкоуровневой транскрипции. Поглощение субстрата и флуоресцентного красителя в сочетании с микроскопией или проточной цитометрией позволяет проводить прямой подсчет клеток с помощью микроскопии или проточной цитометрии с цветом, указывающим на интактные мембраны22,23. Анализы дыхания, которые требуют, чтобы цепь переноса электронов присутствовала в интактной клеточной мембране, также использовались для различения жизнеспособных и мертвых клеток24. Также были разработаны методы количественной ПЦР (кПЦР) в сочетании с ДНК-модифицирующими красителями, предотвращающими амплификацию; только ДНК из жизнеспособных клеток будет амплифицирована, так как неповрежденные мембраны исключают краситель25. Несмотря на то, что клетки VBNC находятся в спящем состоянии, они все еще транскрибируют гены на низком уровне, и это также может быть использовано для отличия их от мертвых клеток с помощью ПЦР26 с обратной транскрипцией.

В этой работе был разработан анализ для количественного определения клеток VBNC в двух раноопасных патогенных бактериях, S. aureus и P. aeruginosa, обработанных MH. В ней описывается лечение бактерий с помощью MH и обычных антибиотиков, а также использование подсчета жизнеспособных пластин и окрашивания живых/мертвых для обнаружения культивируемых и жизнеспособных клеток. Этот простой и недорогой протокол позволит проанализировать способность МГ индуцировать устойчивые к антибиотикам клетки VBNC у многих бактериальных патогенов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поскольку P. aeruginosa (ATCC9721) и S. aureus (ATCC29213) классифицируются как агенты уровня биобезопасности 2, помещения, в которых проводятся работы, должны иметь ограниченный доступ и быть оборудованы шкафом биобезопасности для манипуляций, которые могут создать брызги или аэрозоли, таких как перемешивание и центрифугирование культур. На всех этапах этого протокола надевайте средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая лабораторный халат, защитные очки и перчатки. Все реагенты и оборудование, использованные в экспериментах, перечислены в Таблице материалов.

1. Приготовление стерильных бульонных и агаровых питательных сред

  1. Приготовьте Luria Bertani и Mueller Hinton, NaCl (0,85%), антибиотики и стеклянную посуду.
    1. Приготовьте отварную среду согласно инструкции производителя, добавив порошок агара до 1,5% для агаровой среды. Добавьте 0,85 г NaCl к 100 мл dH20 для приготовления 0,85% NaCl. Наклейте автоклавную ленту на сосуды, поместите их в контейнер, безопасный для автоклава, и запустите автоклавный цикл в жидком цикле, соответствующем используемым объемам.
    2. Когда цикл автоклава завершится, охладите агар примерно до 60 °C, прежде чем разлить его в стерильные чашки Петри.
  2. Приготовьте 100 мкг/мл стоковых растворов антибиотиков тобрамицина и меропенема в dH2O для разведения и лечения бактерий. Запасы антибиотиков простерилизовать с помощью стерильного шприца объемом 5 мл, подключенного к стерильному фильтру 0,2 мкм.
    1. Храните стерилизованные запасы антибиотиков при температуре -20 °C в нескольких небольших аликвотах, чтобы предотвратить потерю активности из-за многократных циклов замораживания-размораживания.

2. Извлечение архивных штаммов Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa при температуре от -80 °C (день 1)

  1. Соберите материалы для нарезки небольшой аликват замороженных штаммов бактерий из флаконов морозильной камеры при температуре 80 °C в агар Luria Bertani (LB). Это включает в себя несколько стерильных деревянных палочек и пластину с агаром LB с этикеткой с микроорганизмом и датой.
  2. Откройте морозильную камеру при температуре -80 °C, быстро извлеките интересующие флаконы и закройте дверцу морозильной камеры. Откройте каждый флакон последовательно и с помощью стерильной палочки соскребите небольшое количество замороженных бактерий на пластину с соответствующей маркировкой LB. Установите на место крышку флакона и быстро верните его в морозильную камеру при температуре -80 °C.
  3. Инкубировать инокулированные агаровые планшеты LB агаровой стороной вверх при температуре 37 °C в аэробных (атмосферных) условиях в течение 18-24 часов. После инкубационного периода запечатайте инокулированные пластины из агара LB прививочной лентой и храните их при температуре 4 °C не дольше одной недели. При необходимости еженедельно заквашивайте свежие бактериальные культуры из замороженного сырья при температуре -80 °C.

3. Подготовка S. aureus и P. aeruginosa для лечения медом манука (МН) и антибиотиком (День 2)

  1. Соберите материалы, необходимые для начала культивирования LB-бульона каждого штамма, включая небольшие стерильные пробирки, 5 мл серологических пипеток, стерильный LB-бульон и инокуляционную петлю. Кроме того, возьмите ручную или электрическую дозатор для использования с серологическими пипетками, горелку Бунзена и встряхивающий инкубатор.
  2. Работая рядом с пламенем горелки Бунзена, с помощью серологической пипетки переведите 2 мл бульона LB в две стерильные пробирки. Простерилизуйте инокуляционную петлю в пламени горелки Бунзена, а затем перенесите четверть петли, заполненную бактериями, из агаровых пластин LB в соответствующую пробирку с бульоном LB.
    1. Инкубировать пробирку в аэробных условиях в встряхивающем (~250 об/мин) инкубаторе при температуре 37 °С в течение 18-24 ч.

4. Приготовление МГ и организация лечения МГ и антибиотиками S. aureus и P. aeruginosa (T = 0) (день 3)

  1. Соберите материалы, необходимые для эксперимента, в том числе бульон Мюллера-Хинтона и агаровые планшеты, бактериальные культуры бульона LB со второго дня, стерильные пробирки, запасы антибиотиков на льду, пипетки (P20, P200 и P1000) и наконечники, пробирки объемом 15 мл, серологические пипетки и пипеттор, а также микрофуговые пробирки.
    1. Приготовьте свежие исходные растворы 25% и 50% MH в день проведения эксперимента. Исходя из плотности MH (1,47 г/мл), взвесьте соответствующее количество MH в стерильной пробирке объемом 15 мл и добавьте соответствующее количество стерильного бульона Мюллера-Хинтона. Восстановите суспендию MH, поместив трубки в теплую воду и перевернув их по мере необходимости.
  2. Приготовьте разведение в соотношении 1:1000 (приблизительно10 6 КОЕ/мл) ночных бактериальных культур в стерильных пробирках объемом 15 мл, добавив 10 мкл бактериальной культуры к 10 мл бульона Мюллера-Хинтона.
    1. С помощью разведенных культур готовят три образца для каждого вида бактерий: необработанный контроль, образец, обработанный MH (в минимальной ингибирующей концентрации, MIC), и образец, обработанный антибиотиками (тобрамицин для S. aureus или меропенем для P. aeruginosa, в MIC).
    2. Добавьте разведенную бактериальную культуру, МН и соответствующий антибиотик к образцам в объемах, указанных в Таблице 1 и Таблице 2.
  3. Перенесите 0,1 мл и 0,5 мл необработанного образца в стерильные микроцентрифужные пробирки для подсчета жизнеспособных планшетов (шаг 5) и окрашивания живыми/мертвыми (шаг 6) соответственно для образцов T = 0.
    1. Инкубируйте необработанные контрольные, обработанные МГ и обработанные антибиотиками (тобрамицин или меропенем) образцы в аэробных условиях при 37 °C в встряхивающем инкубаторе (250 об/мин) в течение 24 ч. Проведите методы подсчета жизнеспособных планшетов (шаг 5) и окрашивания живых/мертвых (шаг 6) на необработанных образцах T= 0.

5. Определение культивируемых клеток в образцах методом подсчета жизнеспособных планшетов (день 3 - 5)

  1. На 4-й день, после 24-часовой инкубации образцов, соберите 0,1 мл и 0,5 мл каждого образца в микроцентрифужные пробирки для подсчета жизнеспособных планшетов и окрашивания живых/мертвых (шаг 6) соответственно. Это будут образцы T = 24 ч.
  2. Проведите подсчет жизнеспособных пластин на образцах T = 0 и T = 24 ч в день их сбора, приготовив 10-кратное разведение образцов с жизнеспособным количеством пластин в бульоне LB для получения счетного количества клеток (~25-150).
    1. Распределите по 50 мкл каждого разведенного образца на 1/2 агаровой пластины LB. Инкубировать агаровые планшеты LB в аэробных условиях при температуре 37 °C в течение 24 часов.
  3. На следующий день извлеките агаровые планшеты LB из инкубатора и определите пластину для разведения, которая имеет ~25-150 колоний. Подсчитайте точное количество колоний на планшете и используйте формулу колониеобразующих единиц (КОЕ) (КОЕ/мл= # колоний подсчитано/ (объемная пластина, мл) (используемое разведение)) для определения количества культивируемых клеток на мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образец T = 0 будет нанесен на покрытие в 3-й день и проанализирован в 4-й день; образцы T = 24 ч будут покрыты на 4-й день и проанализированы на 5-й день.

6. Определение жизнеспособных клеток в образцах с помощью окрашивания живых/мертвых и флуоресцентной микроскопии (день 3 или 4)

  1. Соберите материалы, необходимые для окрашивания живых/мертвых, в том числе 0,85% стерильный NaCl для поддержания благоприятной осмотической среды для клеток, пипетки (P20, P200 и P1000) и стерильные наконечники пипеток, набор для окрашивания живых/мертвых бактерий и одноразовый гемоцитометр. Получите доступ к флуоресцентному микроскопу с фильтром флуоресцеина изотиоцианата (FITC) для обнаружения красителя SYTO 9, который окрашивает живые клетки.
  2. Добавьте 0,5 мл 0,85% NaCl к 0,5 мл каждого из следующих живых/мертвых образцов: все неразбавленные образцы T = 0, неразбавленные T = 24 ч MH и обработанные антибиотиками образцы, а также 1:1000 разведение T = 24 ч необработанного контрольного образца.
    1. Обязательно умножьте окончательное количество живых клеток во всех образцах на два и умножьте разбавленный T = 24 ч необработанного контроля на 1000. Соедините 1,5 мкл SYTO 9 и 1,5 мкл йодида пропидия на образец, а затем добавьте по 3 мкл смеси в каждый образец. Инкубируйте образцы при температуре 21 °C в темноте в течение 15 минут.
  3. Перенесите 6 μл каждого окрашенного, аккуратно перемешанного образца в одноразовый гемоцитометр и просмотрите его с помощью флуоресцентного микроскопа с фильтром FITC и 40-кратной линзой объектива. Сделайте фотографию, на которой видны как линии сетки гемоцитометра, так и живые зеленые клетки.
    1. Подсчитайте зеленые ячейки в шести полях для каждого образца, отмечая размеры сетки, чтобы можно было рассчитать количество зеленых ячеек на объем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размеры поля в настоящих экспериментах составляют 1,05 мм x 0,6 мм x 0,1 мм, что соответствует 0,063 мм3 или 6,3 x 10-5 мл. Чтобы получить количество жизнеспособных клеток на мл, разделите подсчитанное число живых клеток на 6,3 х 10-5 мл, а затем умножьте их на два (или 2000, если это контроль T = 24 ч без лечения).

7. Определение количества жизнеспособных, но не поддающихся культивированию клеток (VBNC)

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте культивируемые номера клеток, полученные в результате подсчета жизнеспособных пластин, и количество жизнеспособных клеток, полученное в результате окрашивания живых/мертвых клеток, для определения количества VBNC.

  1. Рассчитайте VBNCs/мл, вычитая количество культивируемых клеток/мл из числа жизнеспособных клеток на мл.
  2. Используйте тест Вилкоксона на пары для сравнения VBNCs/мл или культивируемых клеток/мл с жизнеспособными клетками/мл для каждого лечения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Жизнеспособные, но не культивируемые (VBNC) бактериальные формы жизни индуцируются стрессорами, включая лечение антибиотиками, и вызывают рецидивирующие инфекции из-за их толерантности к антибиотикам. Поскольку MH является противомикробным препаратом широкого спектра действия, устойчивость к которому редко обнаруживается, была выдвинута гипотеза, что MH индуцирует меньше VBNC, чем обычные антибиотики. Описанный здесь метод был использован для количественного определения VBNC, образованных двумя бактериями, вызывающими ра...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный здесь протокол позволяет обнаруживать популяции клеток VBNC у ранообразующих бактерий, обработанных минимальными ингибиторными концентрациями (MICs) MH и обычными антибиотиками. Важнейшие шаги в протоколе включали подготовку разведений MH в день эксперимента, предотвращение потери образца во время окрашивания живыми/мертвыми и правильный расчет анализируемого объема. В этом и других исследованиях были экспериментально определены МПК MH для S. aureus и P. aeruginosa...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была профинансирована двумя грантами Университета Восточного Вашингтона: грантом факультета исследований и творческих работ для A.R.C и грантом на студенческие исследования и творческую деятельность для L.T.B. Билл и Конни Кросс пожертвовали средства EWU на покупку инвертированного флуоресцентного микроскопа Leica DMIL с цифровой камерой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Бульон Мюллера ХинтонаБиореагенты ФишераB12322
Бульон Лурия Бертани (LB)Биореагенты FisherBP142602
BD Difco AgarFisher ScientificDF0812-07-1
натрияхлорид Sigma S3014-500g
меропенемTargetMolT0224
тобрамицинSelleck ChemicalsS2514
Staphylococcus aureus ATCCATCC29213
  Pseudomonas aeruginosaATCCATCC9721
встряхивающий инкубаторEppendorfM13520000
инкубаторBenchmark ScientificH2200-H 
Manukaguard Manuka HoneyAmazonNA
DMIL инвертированный флуоресцентный микроскоп Leica Microsystems11521265
цифровой фотоаппаратLeica Microsystems12730522
соколиные трубки объемом 15 млGenesee Scientific28-103
серологические пипеткиDiagnocineDP-LB0100005, DP-LB010010
Pipet Aid PipettorDrummond Scientific Company4-000-101
Bunsen горелкаFisher Scientific S48108
Rainin пипеткиPipette.comL-20, L-200, L-1000
балансMettler ToledoXS603S
96-луночный планшетFalcon351172
инокуляционная петляFisher Scientific13-104-5
изопропанолFisher ScientificBP2618-1
стакан разбрасывательсамодельныйнабор для
Live deadInvitrogenL7012
микрофуге пробиркиBiologix Research CompanySKU 80-1500/P80-1500
жестяная фольгаCostcoNA
Программное обеспечение для изготовления фигурGraphPadNAGraphPad Prism использовалось для изготовления фигур и проведения статистического анализа.
окрашивания бактерий NA

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Spoering, A., Lewis, K. Biofilms and planktonic cells of Pseudomonas aeruginosa have similar resistance to killing by antimicrobials. J Bacteriol. 183 (23), 6746-6751 (2001).
  2. Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J Bacteriol. 192 (23), 6191-6199 (2010).
  3. Li, L., Mendis, N., Trigui, H., Oliver, J. D., Faucher, S. P. The importance of the viable but non-culturable state in human bacterial pathogens. F Microbiol. 5, 00258(2014).
  4. Reygaert, W. C. An overview of the antimicrobial resistance mechanisms of bacteria. AIMS Microbiol. 4 (3), 482-450 (2018).
  5. Ayrapetyan, M., Williams, T. C., Baxter, R., Oliver, J. D. Viable but nonculturable and persister cells coexist stochastically and are induced by human serum. Infect Immun. 83 (11), 4194-4203 (2015).
  6. Cabral, D. J., Wurster, J. I., Belenky, P. Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions. PHARH2. 11 (1), 11010014(2018).
  7. Heidelberg, J. F., et al. Effect of aerosolization on culturability and viability of gram-negative bacteria. Appl Environ Microbiol. 63 (9), 3585-3588 (1997).
  8. Cook, K. L., Bolster, C. H. Survival of Campylobacter jejuni and Escherichia coli in groundwater during prolonged starvation at low temperatures. J Appl Microbiol. 103 (3), 573-583 (2007).
  9. Xu, H. S., et al. Survival and viability of nonculturable Escherichia coli and Vibrio cholerae in the estuarine and marine environment. Microbl Ecol. 8 (4), 313-323 (1982).
  10. Qi, Z., Huang, Z., Liu, C. Metabolism differences of biofilm and planktonic Pseudomonas aeruginosa in viable but nonculturable state induced by chlorine stress. Sci Total Environ. 821, 153374(2022).
  11. Li, Y., et al. Study on the Viable but Non-culturable (VBNC) state formation of staphylococcus aureus and its control in food system. F Microbiol. 11, 599739(2020).
  12. Oryan, A., Alemzadeh, E., Moshiri, A. Biological properties and therapeutic activities of honey in wound healing: A narrative review and meta-analysis. J Tissue Viability. 25 (2), 98-118 (2016).
  13. Lusby, P. E., Coombes, A. L., Wilkinson, J. M. Bactericidal Activity of different honeys against pathogenic bacteria. Arch Med Res. 36 (5), 464-467 (2005).
  14. Mandal, M. D., Mandal, S. Honey: Its medicinal property and antibacterial activity. Asian Pac J Trop. Biomed. 1 (2), 154-160 (2011).
  15. Carter, D. A., et al. Therapeutic Manuka Honey: No longer so alternative. F Microbiol. 7, 00569(2016).
  16. Cooper, R. A., Molan, P. C., Harding, K. G. The sensitivity to honey of Gram-positive cocci of clinical significance isolated from wounds. J Appl Microbiol. 93 (5), 857-863 (2002).
  17. George Narelle May, C., Keith, F. Antibacterial Honey: In-vitro activity against clinical isolates of MRSA, VRE, and other multiresistant Gram-negative organisms. HMP Global Learning Network. , https://www.hmpgloballearningnetwork.com/site/wounds/article/7751 (2007).
  18. Blair, S. E., Cokcetin, N. N., Harry, E. J., Carter, D. A. The unusual antibacterial activity of medical-grade Leptospermum honey: Antibacterial spectrum, resistance and transcriptome analysis. Eur Soc Clin Microbiol. 28 (10), 1199-1208 (2009).
  19. Cooper, R. A., Jenkins, L., Henriques, A. F. M., Duggan, R. S., Burton, N. F. Absence of bacterial resistance to medical-grade manuka honey. Eur Soc Clin Microbiol. 29 (10), 1237-1241 (2010).
  20. Lu, J., et al. Honey can inhibit and eliminate biofilms produced by Pseudomonas aeruginosa. Sci Rep. 9 (1), 18160(2019).
  21. Bischofberger, A. M., Pfrunder Cardozo, K. R., Baumgartner, M., Hall, A. R. Evolution of honey resistance in experimental populations of bacteria depends on the type of honey and has no major side effects for antibiotic susceptibility. Evol Appl. 14 (5), 1314-1327 (2021).
  22. Cunningham, E., O'Byrne, C., Oliver, J. D. Effect of weak acids on Listeria monocytogenes survival: Evidence for a viable but nonculturable state in response to low pH. Food Control. 20 (12), 1141-1144 (2009).
  23. Kogure, K., Simidu, U., Taga, N. A tentative direct microscopic method for counting living marine bacteria. Can J Microbiol. 25 (3), 415-420 (1979).
  24. Albertini, M. C., et al. Use of multiparameter analysis for Vibrio alginolyticus viable but nonculturable state determination. Cytom J Int Soc Anal Cytol. 69 (4), 260-265 (2006).
  25. Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiol Lett. 291 (2), 137-142 (2009).
  26. Trevors, J. T. Viable but non-culturable (VBNC) bacteria: Gene expression in planktonic and biofilm cells. J Microbiol Methods. 86 (2), 266-273 (2011).
  27. Ankley, L. M., Monteiro, M. P., Camp, K. M., O'Quinn, R., Castillo, A. R. Manuka honey chelates iron and impacts iron regulation in key bacterial pathogens. J App Microbiol. 128 (4), 1015-1024 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Staphylococcus aureusPseudomonas aeruginosa

Похожие статьи