Методическая статья

Трехмерная визуализация тканей аорты при атеросклерозе

1.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67400

⸱

25 октября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Vascular Surgery, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2Institute for Cardiovascular Prevention (IPEK), Ludwig-Maximilians-University, 3Institute of Precision Medicine, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 4German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich Heart Alliance

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье мы представляем оптимизированные протоколы очистки тканей для получения изображений аорты мыши в трех измерениях (3D). Мы описываем современные методы иммуноокрашивания, оптического клиринга и визуализации с целью определения анатомической близости периферической нервной системы с атеросклеротическими бляшками и адвентицией при атеросклерозе.

Аннотация

Недавние исследования продвинулись в понимании атеросклероза как трансмурального хронического воспалительного заболевания, затрагивающего все три слоя артериальной стенки, включая интимную бляшку, медиа и адвентицию, которая образует внешнюю соединительнотканную оболочку артерий. Наши недавние исследования показали, что адвентиция используется периферической нервной системой в качестве канала для доступа ко всем тканевым клеткам. Мы также обнаружили, что периферическая нервная система, то есть сенсорная и симпатическая нервная система, претерпевает серьезные процессы ремоделирования, включающие неогенез сетей аксонов, прилегающих к атеросклеротическим бляшкам. В этом контексте понимание структуры нейронной сети и ее взаимодействия с сосудистыми компонентами пораженных артерий открывает большие перспективы для лучшего понимания патогенеза сердечно-сосудистых заболеваний. Для достижения этих целей необходимы методы визуализации субклеточной архитектуры интактных здоровых и больных артерий вместе с окружающими их периваскулярными компартментами. Очистка тканей позволяет получить неповрежденную визуализацию глубоких тканей больших тканевых компартментов, которые в противном случае недоступны. Он позволяет проводить объемную визуализацию интактных артерий за счет интеграции инструментов маркировки, очистки, передовой микроскопической визуализации и обработки изображений. В данной работе мы описываем два различных, но дополняющих друг друга подхода к пассивному очищению тканей, а именно: очистку 2-тиодиотанола (TDE) на водной основе и трехмерную визуализацию очищенного растворителем органа (iDISCO) с помощью иммуномаркировки на основе растворителя для визуализации изолированных сегментов аорты или всей аорты in-situ у всей мыши.

Введение

Гистологические методы обеспечивают базовое понимание биологических образцов путем среза тканей/органов. Тем не менее, очертание сложных анатомических взаимодействий между клетками и тканью/тканью в трех димэншнах (3D) до недавнего времени было труднодостижимо. Эта неудовлетворенная потребность была особенно очевидна в контексте сердечно-сосудистой системы в здоровых и больных условиях. В прошлом визуализация неповрежденных тканей была сложной задачей из-за поглощения и рассеяния света, что делало их непрозрачными по своей сути. Очистка тканей делает неповрежденный биологический образец прозрачным, сводя к минимуму эти ограничения. Последние разработки в области методов очистки тканей позволяют проводить 3D-визуализацию неразрезанных прозрачных тканей с высоким разрешением, чтобы получить значительное представление о клеточной и структурной микроархитектуре целых органов с микрометровым разрешением, тем самым позволяя определять анатомические сети связи.

Атеросклероз включает в себя три слоя артериальной стенки, включая внутренний слой интимы, средний слой медиа и внешний слой соединительной ткани, который называется адвентицией. Атеросклеротические бляшки во внутреннем слое артерий были традиционной мишенью исследований на протяжении десятилетий 1,2. Тем не менее, слой адвентиции содержит кровеносные сосуды, лимфатические сосуды и нервные волокна периферической нервной системы. Кроме того, адвентиция связана с периваскулярной жировой тканью и компонентами нейрональной ткани, включая периферические нервы и периваскулярные ганглии 3,4. Известно, что периферические нервы используют адвентиции в качестве каналов для доступа к отдаленным тканям-мишеням и, по сути, к клеткам. Наши недавние исследования продвинули вперед в понимании многоуровневых взаимодействий основных биологических систем, включая иммунную систему, нервную систему и сердечно-сосудистую систему. Мы назвали эти взаимодействия нейроиммунно-сердечно-сосудистыми интерфейсами 6,7. Во время атерогенеза компоненты артериальной стенки претерпевают сильную реструктуризацию и ремоделирование. Например, наряду с прогрессированием атеросклеротических бляшек в интиме формируются агрегаты иммунных клеток, а в адвентиции аорты мышей происходит неогенез аксонов нейронов 6,8,9. По мере прогрессирования атеросклероза агрегаты иммунных клеток развиваются в хорошо структурированные артерийные третичные лимфоидные органы (АТЛО) с различными участками Т-клеток, В-клеток и плазматических клеток10. Тем не менее, для того, чтобы очертить эти изменения в 3D, визуализация интактной ткани с высоким разрешением была сложной задачей из-за недостаточной проницаемости мембраны и присущего ей рассеяния света11. Подходы к очищению тканей преодолели основные ограничения традиционных гистологических подходов 11,12,13,14,15 с усиленным проникновением антител глубоко в интактные ткани или органы путем равномерной регулировки показателя преломления (RI), что приводит к получению изображений микрометрового разрешения с большей глубиной визуализации в вокселях. RI образцов могут быть сопоставлены либо с глицерином (RI 1,46), либо с иммерсионным маслом (RI 1,52), что значительно снижает рассеяние света и сферические аберрации, обеспечивая высокое разрешение. Последние достижения в методах очистки всего органа или всего тела, такие как 2,2-тиодиотанол на водной основе (TDE) и 3D-визуализация органов, очищенных растворителем (iDISCO), соответственно, вместе с методами объемной визуализации (включая конфокальную, многофотонную и световую микроскопию) позволили реконструировать микроанатомию сосудистой архитектуры путем построения атласа их связей11,16. Визуализация этих клеточных и структурных связей в 3D может дать новое понимание и ответить на биологические вопросы, на которые до сих пор не было ответа.

Протокол

Настоящее исследование было выполнено в соответствии с рекомендациями местного и национального комитета по использованию и уходу за животными. В настоящем исследовании были использованы гиперлипидемические самцы мышей Apoe-/- на фоне C57BL/6J, которые находились на стандартной диете грызунов, у которых спонтанно развивается атеросклероз с возрастом.

1. Визуализация изолированной аорты целиком и очистка TDE

  1. Подготовка тканей
    1. Приготовьте анестетик в дозе 150 мг/кг кетамина и 30 мг/кг ксилазина (см. Таблицу материалов) на каждую мышь. Глубоко обезболить мышей путем внутрибрюшинного введения и подтвердить это отсутствием реакции на глубокий болевой тест.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация и объем инъекции следующие: Кетамин 100 мг/мл; Ксилазин 20 мг/мл; Объем инъекции 50:50 по объему смеси кетамина и ксилазина в концентрации 3 мкл/г.
    2. Поместите мышь на поролоновую пластину, застеленную хирургическими бумажными полотенцами, и зафиксируйте руки и ноги в лежачем положении скотчем. Продезинфицируйте грудную клетку 75% этанолом (см. Таблицу материалов) и возьмите кровь через левый желудочек с помощью одноразового шприца объемом 1 мл для удаления крови для лучшей перфузии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно использовать забор сердечной крови с помощью торакотомии.
    3. Сделайте разрез по средней линии на грудной клетке, чтобы обнажить сердце, и небольшой разрез в правом предсердии, чтобы обеспечить транссердечную перфузию. Перфузируйте мышь через левый желудочек 10 мл 5 мл этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА; см. Таблицу материалов) в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 5 минут, а затем 20 мл PBS в течение 5-10 минут, пока кровь не будет вымыта. Наконец, перфузируйте 10 мл 4% параформальдегида (PFA) в течение 20 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры могут быть выполнены с помощью перистальтического перфузионного насоса с давлением 100-125 мм рт.ст. при комнатной температуре (ОТ). Перфузионная игла вводится в сердце мыши через то же отверстие, что и при заборе крови.
    4. Удалите внутренние органы, включая селезенку, печень, легкие, желудочно-кишечный тракт и репродуктивные органы, с помощью хирургических инструментов. Сохраняйте сердце, аорту и почки в целости и сохранности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургическими инструментами, используемыми для препарирования и удаления органов, являются ножницы для препарирования, ножницы для тонкой радужной оболочки, пружинные ножницы, тупые щипцы, изогнутые щипцы и изогнутые тонкие щипцы.
    5. Обнажите всю аорту от восходящей аорты до бифуркации подвздошной кости под рассекающим стереомикроскопом (30-40-кратное увеличение). Аккуратно удалите тимус и жировую ткань, не травмируя аорту.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не разрезать аорту. Для мышей Apoe-/- сохраняйте минимально окруженную периваскулярную жировую ткань аорты для соединительной структуры.
    6. Соберите всю аорту в чашку Петри, наполненную PBS. Разделите аорту на разные сегменты и разделите всю аорту в продольном направлении с помощью радужной оболочки или пружинных ножниц, чтобы обнажить интимную поверхность, следуя последовательности и направлению, указанным на рисунке 1A для очистки TDE.
    7. Прикрепите лицевую аорту к плоской черной восковой пластине в форме буквы Y, как показано на рисунке 1А. Поместите его в 4% PFA на ночь при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прикрепите аорту к восковой пластине перед фиксацией, чтобы избежать сгибания и скручивания в следующих этапах.
    8. Открепите аорту и переведите ее в PBS. Тщательно промойте аорту в течение 5 мин 5 раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз перекладывайте аорту в разные трубки, наполненные PBS, для промывки.
  2. Окрашивание антителами для аорты на лице
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы инкубации выполняются в пробирках объемом 2 мл с безопасным замком с осторожным вращением или встряхиванием при лучевой терапии.
    1. Переведите неподвижную аорту в раствор для блокировки на 2 ч для блокировки и пермеабилизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Решение для блокирования варьируется в зависимости от первичных и вторичных антител. Например, блокирующий раствор: 0,5 мг/мл CD16/32 (1:100), 10% обычная ослиная сыворотка, 2% Тритон Х-100 в PBS (см. Таблицу материалов)
    2. Инкубируйте аорту с первичными антителами в блокирующем растворе, указанном выше (шаг 1.2.1), например, CD3e (разведение 1:100), NF200 (разведение 1:200) и B220 (разведение 1:200) в течение 24 ч (см. Таблицу материалов). Промойте аорту в PBS в течение 5 мин 5 раз.
    3. Инкубируйте аорту со вторичными антителами в 10% нормальной сыворотке осла (разведение 1:300) и 4',6-диамидино-2-фенилиндоле (DAPI; 1 мг/мл) для ядерного окрашивания в течение ночи (см. Таблицу материалов). Промойте аорту в PBS в течение 5 минут 5 раз и храните аорту в PBS при температуре 4 °C до процедуры очищения тканей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз перекладывайте аорту в разные трубки, наполненные PBS, для промывки. Накройте трубки алюминиевой фольгой, чтобы они оставались в темноте для шага 1.2.3.
  3. Очищение тканей TDE
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы инкубации выполняются в пробирках объемом 2 мл с безопасным замком, аккуратно вращающихся в режиме RT, и накрытых алюминиевой фольгой в темноте. Рабочие растворы TDE (см. Таблицу материалов) обладают высокой проницаемостью, и с ними следует осторожно обращаться в вытяжном шкафу. Собирайте и утилизируйте отходы в соответствии с местными правилами.
    1. Переведите окрашенную аорту в рабочие растворы с 20% TDE и инкубируйте в течение 1 ч.
    2. Переведите аорту в рабочие растворы с 47% TDE и инкубируйте в течение 12 часов. Переведите аорту в рабочие растворы с 60% TDE и инкубируйте в течение 24-36 часов, пока образцы не станут прозрачными в видимом свете, чтобы соответствовать RI.
    3. Храните аорту в 60% TDE при RT в темноте до визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обновляйте рабочие растворы каждые 30 минут для краткосрочного периода инкубации (например, шаг 1.3.1) и каждые 4 часа для длительного периода инкубации (например, шаг 1.3.2). Время инкубации для каждого этапа может быть скорректировано в зависимости от размера ткани для лучшего проникновения антител или прозрачности очистки. Для апоэ-/- мышиной аорты, окруженной жировой тканью, время инкубации должно быть соответствующим образом увеличено.
  4. Визуализация аорты с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (CLSM)
    1. Используйте имеющиеся в продаже двусторонние двусторонние липкие прямоугольные дистанционные отверстия для визуализации толщиной 0,2 мм (см. Таблицу материалов). Приклейте колодец к чистому предметному стеклу и переложите очищенную аорту. Убедитесь, что аортальная адвентиция en face обращена к покровному листу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно постучите по плоской аорте на лицевой поверхности с помощью скошенных щипцов. При необходимости сложите несколько отверстий для спейсера визуализации в соответствии с размером ткани.
    2. Смонтируйте аорту каплями 60% раствора TDE. Осторожно прикрепите покровное стекло к лунке, не допуская попадания пузырьков воздуха между образцом и покровным стеклом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно удалите пузыри иглой до того, как покровная пленка будет закрыта. Не используйте чрезмерное количество монтажного раствора, так как образец может плавать.
    3. Используйте перевернутый инструмент CLSM (см. Таблицу материалов), оснащенный 20-кратным иммерсионным (мульти) объективом (NA: 0,75).
      ПРИМЕЧАНИЕ: CLSM позволяет проводить объемную визуализацию на глубине до 70 мкм с более высоким разрешением, что необходимо для анализа диаметра нерва и взаимодействия нервно-иммунных клеток в адвентиции аорты.
    4. Выберите объектив «Погружение 20x/0,75 (масло)». Настройте гибридные диодные детекторы на основе окрашенных красителей. Отрегулируйте параметры отображения и выберите формат XY 1024 x 1024 пикселя для создания изображений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Масляный иммерсионный объектив улавливает сигналы лучше, чем вода.
    5. Капните погружное масло (с глицерином) равномерно вдоль аорты на покровном стекле. Переместите объектив 63x грубо по направлению к образцу, пока он не коснется погружного масла/покровного стекла.
    6. Переместите объектив 63x точно под микроскопом, чтобы определить интересующую область. Получение Z-стека со стороны придатия лицевой аорты с шагом 2-4 мкм на глубину до 60 мкм для 3D-визуализации.
    7. Присвойте файлу имя с указанием образца, сведения о сканировании и сохраните данные.
  5. Визуализация TDE-очищения аорты с помощью многофотонного микроскопа
    1. Выполните шаги 1.4.1-1.4.2 для установки лицевой аорты на предметное стекло.
    2. Используйте вертикальный многофотонный микроскоп (см. Таблицу материалов), оснащенный 20-кратным объективом (погружение в воду, NA: 1,00, рабочее расстояние = 2 мм), позволяющим получать объемные изображения на глубине до 1,5 мм.
    3. Получение Z-стеков с алюминальной стороны с шагом 10-15 мкм на глубине до 700 мкм. Назовите файл и сохраните данные, как описано в шаге 1.4.7.

2. Иммуноокрашивание всего тела и очищение тканей iDISCO

  1. Подготовка тканей
    1. Выполните шаги 1.1.1-1.1.3 выше для анестезии, фиксации мыши и перфузии.
    2. Удалите кожу и внутренние органы, включая селезенку, печень, легкие, желудочно-кишечный тракт и репродуктивные органы, с помощью хирургических инструментов. Сохраняйте сердце, аорту и почки в целости и сохранности.
    3. Рассеките часть тела выше уровня диафрагмы и зафиксируйте нижнюю часть тела 4% PFA на 1-2 дня (с) при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте фиксацию, промывку и инкубацию в пробирках объемом 50 мл на мягко вращающемся шейкере. Освежите раствор в новых пробирках 2-3 раза.
    4. Тщательно промойте образец в течение 10 мин 3 раза при температуре RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз перекладывайте аорту в разные трубки, заполненные PBS.
    5. Инкубируйте образец в 20% прозрачном, беспрепятственном растворе для визуализации мозга и тела и вычислительном анализе (CUBIC) в течение 48 часов для обесцвечивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для 20% раствора CUBIC растворите 25 г мочевины в 15 мл Triton X-100 и 28 мл Quadrol, и добавьте PBS до конечного объема 100 мл. Готовьте его в вытяжке, так как ингредиенты стимулируют (см. Таблицу материалов).
    6. Тщательно промойте образец в течение 1 ч пять раз в PBS при RT.
  2. Окрашивание антителами
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы инкубации выполняются в пробирках объемом 50 мл с безопасным замком при осторожном вращении или встряхивании при 4 °C.
    1. Инкубируйте образец в растворе PBS-желатин-Triton X-100-сыворотки (PGST) в течение ночи для пермеабилизации и блокировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для блокирования зависит от антител. Например, блокирующий раствор: PBS-желатин-сыворотка Triton X-100 (PGST, см. Таблицу материалов): 0,2% желатин из свиной кожи, 0,5% Triton X-100 и 5% козья сыворотка в PBS.
    2. Инкубируйте образец с первичными антителами в растворе PGST, например, NF200 (разведение 1:200, см. Таблицу материалов) при 4 °С, и осторожно встряхивайте в течение 10-12 дней. Затем тщательно промойте образец в PGST в течение 1 ч 5 раз при RT.
    3. Инкубируйте образец с раствором вторичного антитела (разведение 1:300) и DAPI (1 мг/мл) в PGST при 4 °C в течение 7 дней.
    4. Тщательно промойте образец в PGST в течение 1 часа 5 раз в RT. Перенесите образец в PBS и храните аорту в PBS при температуре 4 °C для дальнейших действий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Накройте трубки алюминиевой фольгой, чтобы они оставались темными на этапах 2.2.3-2.2.4.
  3. Модифицированная очистка тканей iDISCO
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время очистки трубки должны быть покрыты алюминиевой фольгой, чтобы избежать отбеливания/затухания сигнала из-за прямого воздействия естественного/искусственного света. Все органические реагенты, используемые при очистке DISCO, вредны, и все этапы очистки следует выполнять в вытяжном шкафу. При работе с реагентами надевайте лабораторный халат, перчатки и маску, чтобы избежать вдыхания и контакта с кожей и глазами. Соберите и сбросьте отходы уборки в соответствующие контейнеры для мусора в капюшоне.
    1. Переведите окрашенные образцы с шага 2.2.4 на ряд повышенных концентраций тетрагидрофурана (ТГФ, см. Таблицу материалов) рабочих растворов для обезвоживания, то есть 50%, 70%, 90% и 100% (два раза по 100%). Инкубировать в течение 12 ч на каждую концентрацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разведите реагент ТГФ (99%-100%) в дистиллированной воде для рабочих растворов различной концентрации в вытяжке. Обновляйте рабочие растворы каждые 6 ч.
    2. Перенесите образец в раствор абсолютного дихлорметана (ДКМ, см. Таблицу материалов) на 3 ч для удаления липидов.
    3. Перенесите образец в рабочий раствор RI, соответствующий бензиловому спирту-бензилбензоату (BABB) (см. Таблицу материалов). Инкубируйте в течение 3-6 часов, пока ткань не станет полупрозрачной и преимущественно прозрачной в видимом свете.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления рабочего раствора BABB смешайте в стеклянной бутылке 1 часть бензилового спирта и 2 части бензилбензоата (1:2). Аккуратно встряхните его в течение 5 минут в вытяжке.
  4. Визуализация очищающей ткани iDISCO с помощью светового микроскопа
    ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализируйте очищенный образец, как только будет достигнута оптимальная прозрачность. Для получения изображений используется световой микроскоп, такой как ультрамикроскоп-II (см. Таблицу материалов). Заполните резервуар для визуализации окончательным раствором для очистки, раствором BABB. Будьте осторожны, чтобы не пролить BABB на инструмент, чтобы избежать его повреждения.
    1. Используйте воздушный объектив 1x для получения изображений с малым увеличением, охватывающих всю ширину всего образца. Аккуратно переложите образец из очищающего раствора на бумажную ткань и быстро высушите.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте тупые щипцы, чтобы не сдавливать образец.
    2. Выберите держатель для образцов подходящего размера в зависимости от размера образца/ткани и прикрепите заднюю сторону образца к держателю для образцов с помощью суперклея.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите 1-2 минуты, пока образец не будет надежно прикреплен к держателю для образцов.
    3. Заполните емкость для изображения светолистового микроскопа раствором BABB и аккуратно поместите в него образец. Отрегулируйте держатель образца так, чтобы образец был перпендикулярен световому полотну и освещался должным образом.
    4. Опустите объектив, чтобы сфокусировать образец, и отрегулируйте параметры отображения во время фокусировки, чтобы правильно просмотреть образец. Выберите подходящий световой лист (листы) в программном обеспечении микроскопа и отрегулируйте его ширину, чтобы равномерно освещать все поле зрения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В системе ультрамикроскопа с двусторонним лазерным освещением начните с выравнивания и фокусировки лазера с одной стороны. После установки обеих сторон активируйте лазеры с обеих сторон, чтобы наблюдать объединенное изображение сканирования от обоих источников освещения.
    5. Выберите дальний красный канал (680 нм) для изображения окрашенных NF200 нейронных структур и канал автофлуоресценции (488 нм) для изображения неокрашенной аорты и соединительных тканей. Отрегулируйте мощность лазера в зависимости от интенсивности флуоресцентного сигнала для получения оптимального соотношения сигнал/шум, времени экспозиции и ширины светового листа (слоев).
    6. Выберите режим сканирования x-y-z. Установите z-стековое сканирование с шагом z 2-8 мкм и выберите перекрытие 25%-60% вдоль продольной оси y развертки плитки (16 бит), охватывающей вентральную и дорсальную поверхности образцов, чтобы отобразить весь объем образца (глубиной до 6-8 мм).
    7. Назовите сканирование с подробной информацией, включая дату сканирования, название образца, используемое антитело, объектив, коэффициент масштабирования, z-шаги и используемые лазеры. Сохраните данные.
    8. Изменяйте увеличение на большее (2x или 4x) с помощью функции увеличения, чтобы получить изображение определенных областей тела, представляющих интерес.
    9. Выполните шаги 2.4.4-2.4.7 выше для создания образа и сохраните данные.

3. Обработка и анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Для обработки требуется высокопроизводительная рабочая станция. Обеспечьте резервное копирование данных сразу после обработки благодаря большому объему изображений (5-100 ГБ на образ).

  1. Обработка изображений CLSM и многофотонных изображений
    1. Загружайте мозаичные изображения Z-стека с CLSM и многофотонных микроскопов на рабочую станцию обработки изображений, оснащенную программным обеспечением Las X, Imaris (программное обеспечение для анализа изображений) или программное обеспечение Fiji для 3D- и двумерной (2D) визуализации, сегментации и количественной оценки.
    2. Чтобы обозначить цветом объемную глубину ячейки или структуры, используйте программное обеспечение для восстановления изображений (см. Таблицу материалов) для деконволюции исходного изображения и создания проекции максимальной интенсивности деконволютированных данных с использованием временного цветового кодирования в Лас-Х или на Фиджи.
  2. Обработка световых изображений
    1. Загрузите серию изображений TIFF с Z-стеком в программное обеспечение Fiji. Сшивайте изображения с помощью плагина сшивки Fiji и сохраняйте сшитые изображения в формате TIFF.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости сожмите сшитые изображения в формате LZW, чтобы обеспечить быструю обработку с помощью различных программ.
    2. Загрузите сшитые изображения в программное обеспечение для 3D-визуализации (см. Таблицу материалов) для сегментации изображений. Вручную проследите нейронные и сосудистые структуры по оси x-y-z. Для ручного отслеживания мелких нервных волокон вручную выберите сигналы NF200+ пиксель за пикселем в каждой z-плоскости по всему пути нервного волокна между аортой и ганглиями.
    3. Загрузите предварительно обработанные изображения в программное обеспечение для анализа изображений (см. Таблицу материалов) для создания видео, 2D и 3D визуализации изображений.
    4. Используйте автофлуоресценцию для сегментации аорты и соединительных тканей, включая лимфатические узлы и мышцы, в программном обеспечении для анализа изображений. Применяйте отдельные псевдоцвета в программном обеспечении для анализа изображений, чтобы визуализировать отдельные сегменты аорты, такие как стенка аорты и бляшка.
    5. Используйте функцию адаптивного выравнивания гистограммы с ограничением контраста (CLAHE) в программном обеспечении Fiji для усиления локального контраста на фоне обработанных изображений.

Результаты

Чтобы продемонстрировать микроанатомию здоровой и больной аорты и выявить физические связи между иммунной системой, нервной системой и сердечно-сосудистой системой в мышиных моделях атеросклероза, мы использовали два дополнительных подхода к очищению тканей: очищение изолированной аорты TDE и очищение iDISCO всей мыши (рис. 1). После полного иммуноокрашивания аорта была очищена с помощью ряда рабочих растворов TDE. RI подбирают на уровне 1,4-1,5, в зависимости от концентрации TDE на заключительном этапе, для достижения оптимальной прозрачности ткани аорты без изменения ее объема (рис. 1A). В отличие от очистки TDE, протокол очистки iDISCO включает этапы обесцвечивания и пермеабилизации перед полным иммуноокрашиванием, за которыми следует делипидация и дегидратация с использованием различных химических растворителей, а также совпадение RI при 1,56 (рис. 1B). Очистка iDISCO позволяет визуализировать ткани большого размера и даже все тело мыши за счет усадки ткани.

Конфокальная и многофотонная 3D-визуализация полностью очищенной TDE аорты позволяет визуализировать структуры, включая интимальные бляшки, адвентицию клеточности и нейрональные проекции адвентиции среди других структур, в то время как световая послойная визуализация очищенной мыши iDISCO позволяет визуализировать и реконструировать артериальное дерево вместе с периваскулярной жировой тканью, почечными лимфатическими узлами и связанными с ними нервными компонентами, включая нервы и ганглии (Рисунок 1C). Например, конфокальная визуализация атеросклеротической аорты, очищенной от TDE, обнаружила множественные CD3e-окрашенные Т-клетки в бляшке и обширный неогенез окрашенных NF200 нервных волокон разного диаметра в ATLO, в то время как многофотонная визуализация TDE полностью очищенной больной брюшной аорты у старых мышей Apoe-/- показала территориальность прорастания аксонов, экспрессирующих NF200, в областях B220-отрицательных Т-клеток в ATLO (рис. 2A). И наоборот, световая послойная визуализация всего брюшной полости мыши с помощью светового листа визуализировала пространственные отношения между аортой и прилегающими симпатическими ганглиями. Сегментация 3D-изображений и трассировка отдельных аксонов от ганглиев до поверхности аорты выявили устойчивую нейрональную реструктуризацию, включая недавно сформированные окрашенные NF200 аксоны в адвентиции аорты, прилегающей к атеросклеротической бляшке (рис. 2B).

figure-results-1
Рисунок 1: Рабочий процесс исследования. (A) Очистка ТЭД на водной основе в обращенной к лицу аорты. (B) Очистка iDISCO на основе растворителей от всей мыши. (C). 3D объемная визуализация и обработка изображений оптически очищенных образцов изолированной аорты или целой мыши. Этот рисунок был изменен с разрешения Sun et al.17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Пример 3D-изображений очищенных тканей TDE и iDISCO. (A) 3D-изображение очищенных тканей TDE в лицевой аорте. Верхняя панель: Конфокальные изображения показали CD3e+ Т-клетки (красные, стрелка) в интимальной бляшке и аксоны нерва NF200+ (зеленые) в атеросклеротической адвентиции аорты (ATLO); Нижняя панель: Многофотонные изображения показали аксоны нервов NF200+ (зеленые, стрелки), B220+ B-клетки (красные, открытый треугольник), полученную из коллагена вторую гармоническую генерацию (ГВГ, белые) в ATLO 78-недельных самцов мышей Apoe-/- . Sytox (синий) и DAPI (синий) показали ядра. (B) 3D-реконструированные и сегментированные изображения всего брюшной полости мыши iDISCO. Световая 3D-реконструкция, сегментация и трассировка нервов и аксонов NF200+ (стрелки, зеленые) и их пространственное соотношение с симпатическими ганглиями (стрелками) интактной брюшной аорты. Открытый треугольник указывал на новообразованный аксон, примыкающий к атеросклеротическим бляшкам. Аутофлуоресцентная (авто) использовалась для визуализации аорты и соединительной ткани, включая бляшки (голубой) и почечные лимфатические узлы (RLN, синий). КГ, чревные ганглии, SycG, симпатические ганглии цепи. Этот рисунок был изменен с разрешения Mohanta et al.6 и Sun et al.17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Атеросклероз можно рассматривать как трансмуральное воспалительное заболевание артерий, вовлекающее все три слоя артериальной стенки. Кроме того, артерии окружены периваскулярной жировой и нейрональной тканями. Во время прогрессирования атеросклероза каждая из этих тканей претерпевает значительные клеточные и структурные изменения, что требует методов приобретения субклеточного оптического доступа к интактным тканям, окружающим здоровые и больные артерии. Эти методы представлены здесь для лучшего понимания межклеточных и межклеточных взаимодействий и для углубления понимания патогенеза сердечно-сосудистых заболеваний. Очищение тканей и последующая 3D-микроскопическая визуализация позволяют визуализировать крупномасштабные, ранее недоступные неповрежденные тканевые компартменты, выявляя детальные реконструкции артерий. В этой статье мы представляем протоколы для методов очищения тканей TDE и iDISCO, подчеркивая их эффективность и простоту в достижении почти полной прозрачности тканей, эффективной визуализации с помощью конфокальной/многофотонной или световой микроскопии и, в то же время, при сохранении структурной целостности.

При очистке TDE используется водорастворимый реагент для достижения прозрачности тканей путем регулировки RI, тем самым эффективно сохраняя сигналы флуоресценции в ткани. Он представляет собой эффективный метод очищения тканей для кровеносных сосудов меньшего размера, то есть от микрометра до миллиметра без усадки ткани. Однако для более крупных тканей, то есть для объемов тканей размером от миллиметра до сантиметра, требуется больше времени обработки. Важно отметить, что процедура может быть адаптирована к потребностям пользователя путем регулировки концентрации реагентов и времени инкубации. С другой стороны, iDISCO использует ряд органических растворителей для удаления липидов и воды, что приводит к лучшей прозрачности тканей больших тканей, целых органов, всей мыши или более крупных тканей человека. Он обладает уникальными преимуществами короткого времени обработки и пригодности для больших объемов тканей. Однако это приводит к усадке очищенных образцов, гашению сигналов флуоресценции и удалению липидов, что является основным ограничением для богатых липидами атеросклеротических тканей. Кроме того, световая листовая микроскопия, в отличие от конфокальной или многофотонной микроскопии, не может визуализировать субклеточные детали на микрометровом уровне и визуализировать нейрональные проекции малого диаметра, такие как одиночные аксоны и их связи с другими сосудистыми клетками.

Сосудистая иннервация играет значительную роль в развитии атеросклероза 6,7,18. Изучение распределения периферических нервов вдоль артериального дерева и их изменений поможет понять прогрессирование заболевания. Благодаря своей эффективной вычислительной способности, iDISCO обычно используется для визуализации всей сосудистой сети в моделях атеросклероза у крыс и мышей 12,19,20,21, обеспечивая трехмерные изображения с высоким разрешением. TDE, с другой стороны, подходит для исследований, требующих сохранения флуоресцентных меток, таких как наблюдение за специфическими нейронными маркерами, тем самым точно выявляя тонкую структуру и изменения в сосудистойиннервации. Оба протокола очищения тканей необходимы, поскольку очищение TDE не включает в себя усадку и может визуализировать липиды, в то время как iDISCO приводит к сокращению тканей из-за обезвоживания и делипидации. Кроме того, модифицированный протокол iDISCO может быть использован для очистки тканей сердечно-сосудистой системы человека 22,23. Оба метода очищения дают дополнительные преимущества в изучении артериального ремоделирования при атеросклерозе. Комбинируя сильные стороны обоих методов, можно достичь более полного и глубокого понимания патологических механизмов атеросклероза.

Раскрытие информации

SKM, CJY и AJRH являются соучредителями компании Easemedcontrol R &D GmbH and Co. KG.

Благодарности

Эта работа финансировалась Немецким научно-исследовательским обществом (DFG) SFB1123/Z1, Немецким центром сердечно-сосудистых исследований (DZHK) DZHK 81X2600282 и грантом фонда Corona (S199/10087/2022) для SKM; и ERA-CVD (PLAQUEFIGHT) 01KL1808 и правительственный грант для AJRH в Easemedcontrol R &D GmbH and Co. KG.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2,2'-тиодиотанол (ТДЭ)Сигма 166782Очищающий реактив
AmiraThermo Fisher Scientific3D визуализация; Программное обеспечение для обработки изображений, используемое для ручной сегментации и трассировки в 3D изображениях
Бензиловый спиртSigma W213713Очищающий реагент
БензилбензоатSigmaB6630Очищающий реагент
CD16/32eBioscience14-0161-82Блокирующий раствор
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп Leica MicrosystemsTCS-SP8 3XImaging device для многомерной визуализации с высоким разрешением интактных биологических тканей или срезов с высокой специфичностью при субклеточном разрешении.
DAPIInvitrogenD3571Маркер ядер
дихлорметана (DCM)Sigma 270997Очищающий реагент
Рассекающий пан-черный воск Термо Научный S17432Диссекция и фиксация аорты 
Диссекционный стереомикроскопLeica Microsystems Stemi 2000Мышиный органный диссекционный
этанолSigmaE7023Defection 
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)Roth 8040.1Перфузионный буфер 
Фиджи (ImageJ, NIH)Программное обеспечение с открытым исходным кодом для обработки изображений 2D и 3D изображений
Goat Anti-Hamster IgG, Cy3Dianova 127-165-099Вторичное антитело
Goat Anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 680Thermo Fisher Scientific / InvitrogenA-21109Вторичное антитело 
Goat Anti-Rat IgG, Cy5Dianova712-175-150Вторичное антитело
Hamster Anti-CD3e BD Bioscience145-2C11 Маркер Pan-T клеток
Huygens ProfessionalScientific Volume Imaging, НидерландыВерсия 19.10Программное обеспечение для восстановления изображений; Программное обеспечение для обработки изображений, используемое в основном для деконволюции 2D и 3D изображений
Рабочая станция обработки изображенийMIFCOM Рабочая станция обработки изображений MIFCOM X5оснащена всеми программами обработки изображений, включая приложения Leica Suite X, Fiji и Imaris для постобработки изображений, полученных конфокальными, многофотонными и световыми листовыми микроскопами
ImarisBitplaneверсии 8.4Программное обеспечение для анализа изображений; Программное обеспечение для обработки изображений, используемое для автоматизированной сегментации 3D изображений
Инкубатор и ротатор Маршалл Научный Innova 4230Устройство для инкубации и вращения во время очищения тканей<бр/> 
iSpacerSunjin LabIS4020Прямоугольная лунка в качестве держателя образца
KetamineLivistoAnesthetic
Leica Application Suite X (LAS-X) Leica MicrosystemsVersion 3.5Программное обеспечение для обработки изображений, полученных с помощью микроскопа Leica
Световой микроскопLeica MicrosystemsDM LBУстройство визуализации для яркого поля
Световой лист  микроскопLaVision BioTechUltramicroscope IIМетод визуализации для быстрой визуализации с высоким разрешением крупных биологических образцов или целой мыши при слабом освещении путем быстрого получения изображений тонких оптических сечений.
Многофотонная микроскопияLeica MicrosystemsTCS-SP5II MP Метод визуализации для многомерной визуализации с высоким разрешением интактных и жизнеспособных биологических тканей на субклеточном и молекулярном уровне в течение длительных периодов времени, глубоко в образце и с минимальной инвазией.
Обычная козья сыворотка SigmaG9023Блокирующий раствор
параформальдегида (PFA) Сигма -6148 Фиксация 
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Sigma P4417-100TAB Буфер для стирки
Желатин из свиной кожиSigma G1890Инкубационный буфер
КвадролСигма122262CUBIC очищающий реактив
Кролик Anti-NF200SigmaN4142Паннейрональный маркер
Крыса Анти-B220 BD BioscienceRA3-6B2Pan-B клеточный маркер
СахарозаSigma 90М003524В Обезвоживание 
SytoxThermo Fisher ScientificS11380Ядра маркера
тетрагидрофуранаSigma 401757Очищающий реагент 
Triton X-100Roth 3051.1Проникающая способность мочевины
сигма U5128Реагент для очистки CUBIC
Ксилол Фишер Кемикал x/0250/17 Обезболивающее 

Ссылки

  1. Libby, P. The changing landscape of atherosclerosis. Nature. 592 (7855), 524-533 (2021).
  2. Mohanta, S., Yin, C., Weber, C., Hu, D., Habenicht, A. J. Aorta atherosclerosis lesion analysis in hyperlipidemic mice. Bio Protoc. 6 (11), e1833(2016).
  3. Yin, C., Mohanta, S. K., Srikakulapu, P., Weber, C., Habenicht, A. J. Artery tertiary lymphoid organs: Powerhouses of atherosclerosis immunity. Front Immunol. 7, 387(2016).
  4. Mohanta, S. K., et al. Artery tertiary lymphoid organs contribute to innate and adaptive immune responses in advanced mouse atherosclerosis. Circ Res. 114 (11), 1772-1787 (2014).
  5. Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring. Nature. 436 (7048), 193-200 (2005).
  6. Mohanta, S. K., et al. Neuroimmune cardiovascular interfaces control atherosclerosis. Nature. 605 (7908), 152-159 (2022).
  7. Mohanta, S. K., et al. Cardiovascular brain circuits. Circ Res. 132 (11), 1546-1565 (2023).
  8. Hu, D., Yin, C., Luo, S., Habenicht, A. J. R., Mohanta, S. K. Vascular smooth muscle cells contribute to atherosclerosis immunity. Front Immunol. 10, 1101(2019).
  9. Newland, S. A., et al. Type-2 innate lymphoid cells control the development of atherosclerosis in mice. Nat Commun. 8, 15781(2017).
  10. Grabner, R., et al. Lymphotoxin beta receptor signaling promotes tertiary lymphoid organogenesis in the aorta adventitia of aged Apoe-/- mice. J Exp Med. 206 (1), 233-248 (2009).
  11. Mai, H., et al. Whole-body cellular mapping in mouse using standard igg antibodies. Nat Biotechnol. 42 (4), 617-627 (2024).
  12. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for disco tissue clearing. Mol Syst Biol. 17 (3), e9807(2021).
  13. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  14. Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. J Anat. 238 (2), 489-507 (2021).
  15. Adolfs, Y., Raj, D. D. A., Brignani, S., Pasterkamp, R. J. Protocol for tissue clearing and 3d analysis of dopamine neurons in the developing mouse midbrain. STAR Protoc. 2 (3), 100669(2021).
  16. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  17. Sun, T., et al. Tissue clearing approaches in atherosclerosis. Methods Mol Biol. 2419, 747-763 (2022).
  18. Chistiakov, D. A., Ashwell, K. W., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Innervation of the arterial wall and its modification in atherosclerosis. Auton Neurosci. 193, 7-11 (2015).
  19. Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Mol Metab. 14, 71-81 (2018).
  20. Kirst, C., et al. Mapping the fine-scale organization and plasticity of the brain vasculature. Cell. 180 (4), 780-795.e25 (2020).
  21. Todorov, M. I., et al. Machine learning analysis of whole mouse brain vasculature. Nat Methods. 17 (4), 442-449 (2020).
  22. Bhatia, H. S., et al. Spatial proteomics in three-dimensional intact specimens. Cell. 185 (26), 5040-5058.e19 (2022).
  23. Mai, H., et al. Scalable tissue labeling and clearing of intact human organs. Nat Protoc. 17 (10), 2188-2215 (2022).

Перепечатки и разрешения

Теги

Трехмерная визуализация тканей аорты при атеросклерозе
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.