Этот протокол описывает уникальный метод построения ортотопической модели поверхностного рака мочевого пузыря.
Методическая статья
Создание модели поверхностного рака мочевого пузыря у мышей с помощью метода внутрипузырного введения клеток
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В данном исследовании представлен инновационный метод создания ортотопической модели опухоли мышиного мочевого пузыря с высокой эффективностью и точной локализацией опухоли. После обезболивания самок мышей C57BL/6J в лежачем положении в мочевой пузырь вводят внутривенную иглу 24 G для эвакуации его содержимого. Затем через катетер вводится дозирующая игла 34 G, которая вращается пять раз для создания очагового повреждения слизистой оболочки купола мочевого пузыря, а затем удаляется. Клеточная суспензия MB49 аспирируется и подключается к дозирующей игле 30 G, которая вводится в мочевой пузырь через катетер. Опухолевые клетки под давлением вводятся подслизистым путем в мочевой пузырь. Этот метод приводит к минимальной травматизации мышей, высокой скорости удаления опухоли и фиксированному расположению опухоли. Он отличается простотой и отличной воспроизводимостью. Эта модель обеспечивает идеальную экспериментальную платформу для разработки внутрипузырной терапии рака мочевого пузыря, способствуя продвижению и оптимизации стратегий лечения этого злокачественного новообразования.
Введение
Рак мочевого пузыря представляет собой значительное глобальное бремя для здоровья с заметными гендерными различиями в заболеваемости и прогнозе. Эта злокачественная опухоль характеризуется различными молекулярными подтипами, каждый из которых связан с различными патогенными путями. Молекулярные и патологические особенности значительно различаются между немышечно-инвазивным раком мочевого пузыря (NMIBC) и мышечно-инвазивным раком мочевого пузыря (MIBC)1,2. На долю NMIBC приходится примерно 75% случаев, при этом опухоли переходного эпителиального происхождения остаются локализованными без метастазирования или распространения. И наоборот, ММРЖ характеризуется инфильтрацией раковых клеток в мышечный слой мочевого пузыря, что сопровождается высоким риском диссеминации, что часто требует цистэктомии в клинической практике3.
В доклинических исследованиях модели, которые точно представляют поверхностную стадию заболевания, имеют важное значение для оценки лекарственной терапии. Таким образом, создание модели поверхностной карциномы мочевого пузыря in situ имеет первостепенное значение, поскольку она служит важнейшим исследовательским инструментом для разработки клинических препаратов и инновационных инстилляционных методов лечения.
Разработка моделей ортотопического рака мочевого пузыря у мышей традиционно сталкивалась с трудностями. Химически индуцированные модели часто начинаются как поверхностные опухоли, но могут эволюционировать в инвазивные формы с изменчивостью, которая ограничивает их полезность в крупномасштабныхэкспериментах. Традиционные модели ортотопической имплантации, которые основаны на введении опухолевых клетокчерез стенку мочевого пузыря, изо всех сил пытаются точно воспроизвести поверхностный рак мочевого пузыря. Альтернативные методы, включая повреждение слизистой оболочки в сочетании с инстилляцией опухолевых клеток 6,7,8,9,10, были опробованы, но они ограничены высокими показателями смертности и низкими показателями выноса опухолей, что препятствует их более широкому применению.
Данное исследование направлено на разработку нового метода построения поверхностной модели рака мочевого пузыря, которая демонстрирует большую стабильность, меньшую смертность и фиксированное расположение опухоли по сравнению с существующими моделями. Достигая более точного представления заболевания на ранних стадиях, нынешняя модель готова улучшить строгую оценку профилактических и терапевтических вмешательств, тем самым продвигая лечение рака мочевого пузыря.
Протокол
Все протоколы и процедуры экспериментов на животных были одобрены Комитетом по этической экспертизе экспериментов на животных Тяньцзиньского медицинского университета, Тяньцзинь, Китай (номер одобрения SYXK: 2020-0010). Для исследования были использованы самки мышей C57BL/6J в возрасте от 6 до 8 недель. Животные содержались в контролируемых условиях окружающей среды, включая 12-часовой цикл света и темноты, температуру от 21 до 25 °C, регулируемый уровень влажности от 30% до 70% и неограниченный доступ к пище и воде, если не указано иное. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.
1. Подготовка клеток
- Культивируйте клеточную линию мышиного рака мочевого пузыря MB49 в полной модифицированной среде Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) для поддержки оптимального роста.
- Клеточные культуры должны содержаться при стандартных условиях при температуре 37 °C в увлажненном инкубаторе с содержаниемCO2 5%. Обновляйте среду каждые 2-3 дня, чтобы обеспечить здоровье и жизнеспособность клеток.
- Соберите клетки с помощью стандартизированной процедуры расщепления трипсина. Аккуратно пипеткой, чтобы выбить клетки из колбы с культурой после применения трипсина и инкубации в течение короткого периода времени.
- Подсчитайте собранные клетки с помощью гемоцитометра, чтобы определить точную плотность клеток. Приготовьте суспензию для одиночных клеток путем ресуспендирования клеток до 2 x 103/мкл в фосфатно-солевом буфере (PBS). Держите эту суспензию на льду, чтобы сохранить жизнеспособность клеток.
2. Подготовка животных
- Групповое содержание мышей (5 мышей в клетке) в индивидуально вентилируемых клетках из поликарбоната.
- Дайте мышам акклиматизироваться в течение 7 дней до начала исследования.
3. Создание модели ортотопической опухоли у животных
- Вводите мышам анестезию путем внутрибрюшинной инъекции с использованием 2,5% раствора авертина (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
- Подождите, пока мыши не достигнут соответствующего уровня анестезии для операции, на что указывает снижение частоты дыхания с увеличением глубины, отсутствие рефлексов век и роговицы, снижение мышечного тонуса и рефлекторных реакций, а также отсутствие реакции на пощипывание хвоста.
- Расположите мышь под наркозом в положении лежа на спине, чтобы облегчить процедуру.
- Для процедуры катетеризации уретры используйте внутривенный катетер 24 G с удаленным стилетом иглы. Нанесите достаточное количество смазки на катетер, чтобы свести к минимуму дискомфорт и обеспечить плавное введение.
- Определите мочеиспускательный канал, расположенный непосредственно позади складок вульвы и спереди от влагалища, при этом удерживая мышь в лежачем положении.
- Начните катетеризацию с приближения к мочеиспускательному каналу под углом 45 градусов для навигации под лобковой костью. Отрегулируйте более мелкий угол, чтобы провести катетер через мочеиспускательный канал в мочевой пузырь.
- Избегайте приложения чрезмерной силы против сопротивления, так как это может привести к перфорации уретры или мочевого пузыря. Подтвердите расположение катетера в просвете мочевого пузыря, проверив наличие мочи в катетере.
- Аккуратно надавите на нижнюю часть живота мыши, чтобы облегчить отток мочи из мочевого пузыря. Убедитесь, что мочевой пузырь полностью опорожнен, чтобы подготовиться к следующим этапам процедуры.
- Осторожно протолкните внутривенный катетер 24 G к верхней части мочевого пузыря. Убедитесь, что кончик катетера соприкасается с верхушкой мочевого пузыря.
- Как только контакт подтвердится, отпустите катетер, позволив ему немного втянуться. Удерживайте катетер в фиксированном положении относительно мыши, чтобы обеспечить устойчивость и предотвратить смещение.
- Введите модифицированную дозирующую иглу 34 G вдоль катетера 24 G. Продвигайте иглу вперед, пока она не достигнет верхней части мочевого пузыря.
- После установки поверните иглу шесть раз, чтобы создать локализованное повреждение слизистой оболочки в верхней части мочевого пузыря. Завершив вращение, осторожно извлеките иглу вдоль катетера.
- Подсоедините дозирующую иглу 30 г к верхней части шприца объемом 1 мл. Обеспечьте надежное соединение между иглой и шприцем.
- После подключения наберите в шприц заранее подготовленную суспензию элементов MB49 2 x 10³/μл, осторожно оттянув поршень. Убедитесь, что клеточная суспензия аспирирована в шприц без пузырьков воздуха.
- Введите дозирующую иглу 30 G вдоль катетера 24 G. Убедитесь, что игла правильно выровнена и закреплена внутри катетера.
- После установки надавите на поршень шприца объемом 1 мл, чтобы ввести содержимое (подготовлено на шаге 1). Поддерживайте постоянное давление на поршень в течение 60 с, чтобы обеспечить подачу содержимого без значительного уменьшения объема.
- Через 60 с осторожно извлеките шприц и дозирующую иглу 30 G из катетера.
4. Послеоперационный мониторинг
- Поместите мышь под наркозом в лежачее положение на грелку до тех пор, пока не вернется рефлекс выпрямления.
- Следите за тем, чтобы животное не оставляли без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание.
- Не возвращайте животное в компанию других животных до тех пор, пока оно полностью не выздоровеет.
Результаты
Эффективность подслизистых инъекций первоначально оценивали с помощью введения Трипана Блю. После инъекции распределение красителя в подслизистом слое было четко визуализировано, что подтвердило точную и контролируемую доставку вводимых веществ (рис. 1).
Развитие опухоли тщательно отслеживалось. Примерно через 14 дней после имплантации наблюдалась заметная частота гематурии, что является критическим симптомом, указывающим на неоплазию мочевого пузыря. Опухоли были идентифицированы как прочно укоренившиеся в подслизистом слое мочевого пузыря. Ранний характер роста этих опухолей характеризовался экспансивным, неинвазивным расширением, что согласуется с классификацией NMIBC. Гистологическое исследование подтвердило отсутствие мышечной инвазии, при этом опухоли были ограничены подслизистым слоем, что соответствует критериям NMIBC (рис. 2).
Макроскопические наблюдения еще больше подтвердили процесс образования опухоли. Опухоли были визуально различимы, демонстрируя папиллярный рост различных размеров и форм (Рисунок 3). Кроме того, опухоли росли относительно медленно, что давало достаточно времени для исследований в эксперименте (Рисунок 4).
В этом исследовании для проверки локализации опухоли и отсутствия посева уретры мы использовали клетки MB49-luc для имплантации с последующей визуализацией мелких животных. На рисунке 5 представлены биолюминесцентные изображения in vivo , сделанные через 35 дней после введения опухолевых клеток, ясно демонстрирующие, что опухоль расположена в мочевом пузыре без признаков эктопического посева, например, в уретре.
Опухолевая ткань обычно становится обнаруживаемой через 14 дней после имплантации. По нашему опыту, у 70% или более мышей к 14-му дню проявляется гематурия. Процедура обычно не приводит к смертности. Без вмешательства эвтаназия становится необходимой к 60-му дню. Критерии эвтаназии включают вялость, кахексию, взъерошенную шерсть, сгорбление, невосприимчивое поведение или потерю ≥20% от первоначальной массы тела.
Рисунок 1: Эффективность подслизистых инъекций трипановым синим. Демонстрация эффективности подслизистых инъекций с использованием Трипана Блю. Стрелками отмечены места инъекций, где остатки Trypan Blue остаются видимыми даже после трех промываний PBS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Гистологическое подтверждение имплантации опухоли. Гистологическое подтверждение имплантации опухоли в подслизистую оболочку путем окрашивания H&E. Масштабная линейка: 50 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Прямая визуализация опухолей мочевого пузыря. Прямая визуализация опухолей мочевого пузыря с выделением выраженного разрастания сосудов у основания опухоли. Масштабная линейка: 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Состояние опухоли на 35-й день после имплантации. Оценка опухолевого статуса на 35-е сутки после имплантации. Стенка мочевого пузыря у основания опухоли демонстрирует расширенные и дезорганизованные кровеносные сосуды, сопровождающиеся обширной опухолевой базой. Масштабная линейка: 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Биолюминесцентная визуализация рака мочевого пузыря in vivo. Биолюминесцентные изображения in vivo мышей через 35 дней после имплантации клеток рака мочевого пузыря MB49-LUC. Изображения имеют цветовую кодировку для представления интенсивности флуоресценции: красный цвет указывает на высокую флуоресценцию (высокую активность опухоли), а синий — на низкую флуоресценцию (низкую активность опухоли). Области интереса (ROI) были выбраны в области мочевого пузыря для количественной оценки сигнала биолюминесценции, специфичного для опухоли. Результаты показывают, что опухоли локализуются в мочевом пузыре без признаков эктопического посева, например, в уретре. Области с низким уровнем сигнала могут быть обусловлены рассеянными сигналами от областей высокой интенсивности, проникающих через ткани, и не обязательно указывают на наличие опухолевых клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 6: Схема внутрипузырного введения раковых клеток. Схематическое изображение внутрипузырного введения раковых клеток для построения ортотопической модели поверхностного рака мочевого пузыря. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 7: Конфигурация модифицированных дозирующих игл. Конфигурация модифицированных дозирующих игл в катетере 24 G. (A) Фотография дозирующей иглы 34 G в катетере 24 G. (B) Фотография дозирующей иглы 30 G в катетере 24 G. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Обсуждение
Исследования рака мочевого пузыря опираются на животных моделях, которые незаменимы как для фундаментальных, так и для прикладных исследований. Для лучшей имитации среды роста опухоли ортотопические модели опухолей мочевого пузыря обеспечивают превосходный подход по сравнению с моделями подкожных опухолей11.
В настоящее время модели ортотопического рака мочевого пузыря могут быть классифицированы на основе экспериментальных целей на два основных типа: модели с иммунодефицитом мышей, такие как ксенотрансплантат пациента (PDX) модели1 и ксенотрансплантат из клеточной линии (CDX) модели5, и модели с использованием иммунокомпетентных мышей, такие как модели сингенного приживления12.
Модель PDX включает в себя имплантацию опухолевых тканей, полученных от пациента, мышам с иммунодефицитом, что позволяет проводить персонализированную оценку реакции опухоли на химиотерапевтические препараты. Тем не менее, отсутствие интактной иммунной системы у этих мышей представляет собой значительные ограничения для изучения механизмов, связанных с иммунитетом. Аналогичным образом, модель CDX, в которой используются линии опухолевых клеток, полученных от человека, обеспечивает высокую скорость образования опухолей, но также страдает от отсутствия иммунного микроокружения.
В контексте иммунокомпетентных мышей основным методом конструирования ортотопических опухолей мочевого пузыря является инъекция клеточных линий MB49, полученных от мыши, в стенку мочевого пузыря с образованием опухолей мочевого пузыря in situ 12. Эта процедура требует лапаротомии и внутрипузырной инъекции опухолевых клеток, что создает такие проблемы, как потенциальная утечка опухолевых клеток и посев игольчатых путей. Следовательно, трудно создать поверхностные опухоли мочевого пузыря, что препятствует точной репликации прогрессирования рака мочевого пузыря человека от немышечно-инвазивных стадий к мышечно-инвазивным стадиям13.
Для установления поверхностных ортотопических опухолей мочевого пузыря традиционные методы моделирования обычно включают индуцирование повреждения слизистой оболочки с использованием таких агентов, как кислотно-щелочные растворы или электрокоагуляция, с последующей внутрипузырной инстилляцией суспензий опухолевых клеток со временем удержания 2 ч или более 8,14. Однако эти методологии имеют ряд существенных ограничений. Во-первых, они не могут обеспечить однородность в количестве и расположении опухолевых имплантатов в мочевом пузыре, тем самым ставя под угрозу воспроизводимость модели. Кроме того, эти методы часто приводят к серьезному повреждению мочевого пузыря, что приводит к высоким показателям смертности. Возникающее в результате рубцевание мочевого пузыря и снижение емкости создают существенные препятствия для исследований новых терапевтических агентов, которые требуют повторных внутрипузырных инстилляций. Это не только подрывает надежность экспериментальных результатов, но и вызывает этические опасения в отношении благополучия животных.
Таким образом, разработка животной модели, которая может точно моделировать поверхностный рак мочевого пузыря человека, обеспечит лучшую экспериментальную платформу для понимания пролиферации и прогрессирования опухоли. Такая модель была бы бесценной для исследования новых внутрипузырных терапевтических агентов и расширения наших знаний о биологии рака мочевого пузыря.
В этом исследовании описан метод имплантации in situ , при котором используется дозирующая игла с тупым наконечником для введения опухолевых клеток подслизистым путем под давлением (Рисунок 6). В исследовании используется клеточная линия MB49 и самки мышей C57BL/6J для построения модели опухоли in situ .
Во время построения этой модели защитный слой на нормальной поверхности слизистой оболочки мочевого пузыря представляет собой значительную проблему для прямого закапывания опухолевых клеток, часто препятствуя эффективному образованию опухоли8. Следовательно, необходимо вызвать локализованное повреждение в области купола мочевого пузыря с помощью тупой иглы 34 G, чтобы создать подходящую «почву» для имплантации опухолевых клеток.
Дозирующие иглы 34 G и 30 G, используемые в данном исследовании, подверглись частичным модификациям. Кончик иглы 34 G был зажат для создания слегка неровного конца, что повышает ее способность вызывать повреждение слизистой оболочки. Точки соединения игл 34 G и 30 G были обрезаны таким образом, чтобы открытые участки катетера 24 G составляли от 0,3 мм до 0,5 мм (рисунок 7A) и от 1 мм до 1,5 мм (рисунок 7B) соответственно.
Вся эта процедура может быть завершена в течение 10 минут, что устраняет необходимость в лапаротомии или длительной лигировании уретры для внутрипузырного инстилляции. Однако у такого подхода есть и ограничения. Из-за множества технических этапов, связанных с этим методом моделирования, таких как введение постоянного катетера через мочеиспускательный канал в мочевой пузырь и вращение тупой иглы 34 G для достижения соответствующей степени повреждения слизистой оболочки без перфорации стенки мочевого пузыря, экспериментаторы должны практиковаться, чтобы повысить вероятность успешной имплантации опухоли. Кроме того, если во время травмирования слизистой оболочки или инъекции опухолевых клеток применяется чрезмерная сила, это может привести к перфорации мочевого пузыря или имплантации опухоли в мышечный слой.
В заключение следует отметить, что этот метод имеет значительные преимущества по сравнению с традиционными методами, включая сокращение времени процедуры, снижение смертности и улучшение стабильности локализации и роста опухоли без необходимости проведения инвазивных процедур или длительной внутрипузырной ретенции. Эти преимущества делают его ценным инструментом для доклинических исследований, направленных на оценку новых терапевтических агентов для лечения рака мочевого пузыря.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Благодарности
Это исследование было поддержано Фондом ключевого проекта муниципальной индустрии здравоохранения Тяньцзиня (грант No. TJWJ2022XK014), Фонд научно-исследовательских проектов Муниципальной комиссии по образованию г. Тяньцзинь (грант No 2022ZD069), Программа финансирования талантов Тяньцзиньского института урологии (грант No 2022ZD069), Программа финансирования талантов Тяньцзиньского института урологии (грант No 2022ZD069) MYSRC202310), Фонд исследовательских проектов в области клинической медицины Второй больницы Тяньцзиньского медицинского университета (грант No 2023LC03), Молодежный фонд Второй больницы Тяньцзиньского медицинского университета (грант No 2022ydey15) и Проект по развитию талантов отделения урологии Второй больницы Тяньцзиньского медицинского университета (грант No 2022ydey15) и Проект по развитию талантов отделения урологии Второй больницы Тяньцзиньского медицинского университета (грант No 2022ydey15) и Проект по развитию талантов отделения урологии Второй больницы Тяньцзиньского медицинского университета (грант No 15. MNRC202313). Спонсоры сыграли свою роль в подготовке, рецензировании и утверждении рукописи.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Дозирующая игла 34 G | Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Сучжоу, Китай | SGL-362 | |
| Игла для дозирования 30 G | Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Сучжоу, Китай | SGL-362 | |
| Avertin | Sigma-Aldrich LLC | T48402 | |
| Трипан синий | Sigma-Aldrich LLC 302643 |
Ссылки
- Tran, L., Xiao, J. F., Agarwal, N., Duex, J. E., Theodorescu, D. Advances in bladder cancer biology and therapy. Nat Rev Cancer. 21 (2), 104-121 (2021).
- Dyrskjøt, L., et al. Bladder cancer. Nat Rev Dis Primers. 9 (1), 58(2023).
- Sim, W. J., et al. C-met activation leads to the establishment of a TGFβ-receptor regulatory network in bladder cancer progression. Nat Commun. 10 (1), 4349(2019).
- Overdevest, J. B., et al. CD24 expression is important in male urothelial tumorigenesis and metastasis in mice and is androgen-regulated. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (51), E3588-E3596 (2012).
- Theodorescu, D., Cornil, I., Fernandez, B. J., Kerbel, R. S. Overexpression of normal and mutated forms of HRAS induces orthotopic bladder invasion in a human transitional cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (22), 9047-9051 (1990).
- Cohen, S. M. Comparative pathology of proliferative lesions of the urinary bladder. Toxicol Pathol. 30 (6), 663-671 (2002).
- Ninalga, C., Loskog, A., Klevenfeldt, M., Essand, M., Tötterman, T. H. Cpg oligonucleotide therapy cures subcutaneous and orthotopic tumors and evokes protective immunity in murine bladder cancer. J Immunother. 28 (1), 20-27 (2005).
- Chade, D. C., et al. Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model. Int Braz J Urol. 34 (2), 220-226 (2008).
- Chan, E. S., et al. Optimizing orthotopic bladder tumor implantation in a syngeneic mouse model. J Urol. 182 (6), 2926-2931 (2009).
- Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An orthotopic bladder cancer model for gene delivery studies. J Vis Exp. 82, e50181(2013).
- Puzio-Kuter, A. M., et al. Inactivation of p53 and PTEN promotes invasive bladder cancer. Genes Dev. 23 (6), 675-680 (2009).
- Tu, M. M., et al. Targeting DDR2 enhances tumor response to anti-PD-1 immunotherapy. Sci Adv. 5 (2), eaav2437(2019).
- Li, G., et al. Fluorinated chitosan to enhance transmucosal delivery of sonosensitizer-conjugated catalase for sonodynamic bladder cancer treatment post-intravesical instillation. ACS Nano. 14 (2), 1586-1599 (2020).
- Watanabe, T., et al. An improved intravesical model using human bladder cancer cell lines to optimize gene and other therapies. Cancer Gene Ther. 7 (12), 1575-1580 (2000).
Перепечатки и разрешения
Эта статья была опубликована
Видео скоро будет доступно