Характеристика спектров биологического поглощения, охватывающих видимый и коротковолновый инфракрасный

Краткое содержание

Биологические образцы имеют различные оптические характеристики в коротковолновом инфракрасном (SWIR) диапазоне по сравнению с видимым (VIS) и ближним инфракрасным (NIR) диапазонами длин волн. Тем не менее, регистрация чистых спектров поглощения SWIR является сложной задачей и редко проводится для биологических молекул. В данной статье представлен метод характеристики спектров поглощения биологических поглотителей VIS-SWIR.

Аннотация

Для неинвазивного физиологического мониторинга на основе света оптимальные длины волн отдельных компонентов тканей могут быть определены с помощью абсорбционной спектроскопии. Однако из-за недостаточной чувствительности аппаратуры на больших длинах волн абсорбционная спектроскопия обычно применяется для длин волн в видимом (VIS) и ближнем инфракрасном (NIR) диапазоне от 400 до 1000 нм. Достижения в области коротковолнового инфракрасного излучения (SWIR) позволили исследователям исследовать длины волн в диапазоне от ~1000 нм до 3000 нм, в которых приходятся характерные пики поглощения липидов, белков и воды. Эти молекулы трудно визуализировать в VIS-NIR, и они могут служить безмаркерными источниками биологического контраста. Кроме того, более низкая абсорбция SWIR наблюдалась для меланина, основного хромофора, ответственного за пигментацию кожи. Было обнаружено, что оптические приборы in vivo, такие как клинически стандартные пульсоксиметры, имеют более низкую точность у людей с темной пигментированной кожей, возможно, из-за более сильного поглощения меланина в диапазоне VIS. Таким образом, погрешность, связанная с пигментацией кожи, может быть уменьшена за счет использования устройств, работающих в SWIR. Проектирование оптических приборов облегчается пониманием абсорбционных свойств компонентов основных тканей от VIS до диапазона SWIR. В данной статье описаны протоколы и аппаратура для получения спектров поглощения VIS-SWIR распространенных тканевых абсорберов: оксигенированного гемоглобина, дезоксигенированного гемоглобина, меланина, воды и липидов.

Введение

Большинство биологических поглотителей были оптически охарактеризованы в видимом (VIS, ~400-700 нм) и ближнем инфракрасном (NIR, ~700-1,000 нм) спектральных диапазонах, но не в коротковолновом инфракрасном (SWIR, ~1,000-3,000 нм)1,2,3,4 (Рисунок 1). И это несмотря на то, что SWIR обеспечивает более глубокое проникновение света из-за меньшего рассеяния тканей и меньшего поглощения меланина, а также дополнительный биологический контраст без меток для воды, липидов и белка ^1,5,6. Отсутствие спектров поглощения, охватывающих VIS-SWIR, создало пробел в знаниях, который препятствует разработке биомедицинских оптических устройств, использующих эти преимущества SWIR. Несмотря на то, что в прошлом было представлено несколько попыток охарактеризовать спектры, высококачественные спектры поглощения VIS-SWIR чистых компонентов без значительных артефактов растворителя отсутствуют ^1,7,8. Например, водорастворимые вещества, такие как гемоглобин, были охарактеризованы в SWIR с использованием воды в качестве растворителя и вычитанием поглощения чистой воды из результирующих спектров⁹. Однако точность этого подхода неясна, потому что вода является доминирующим поглотителем в этом регионе.

Работа в SWIR имеет дополнительное преимущество, заключающееся в уменьшении или, возможно, устранении смещения, вызванного сильным поглощением меланина в VIS при использовании оптической диагностики in vivo. Многочисленные исследования показали, что пульсоксиметры переоценивают оксигенацию у чернокожих пациентов, и поэтому чернокожие пациенты с большей вероятностью имеют опасно низкий уровень кислорода, который пульсоксиметры не обнаружили¹⁰. Это смещение пигментации кожи привело к задержке и неадекватному медицинскому лечению многих чернокожих пациентов с гипоксией^11,12 и побудило к действию в сообществах оптиков и инженеров для повышения точности оптических устройств для всех оттенков кожи¹³. Переход от высоких поглощающих меланин длин волн VIS к NIR и SWIR является одним из захватывающих технических новшеств, которое может уменьшить расовое неравенство в критически важных технологиях биомедицинской оптики.

Регистрация наземных спектров поглощения биомолекул имеет важное значение для понимания оптических свойств образцов тканей, которые используются в различных инженерных и биомедицинских приложениях¹⁴. Абсорбционная спектроскопия измеряет молекулярное поглощение света в зависимости от длины волны. Золотой стандарт метода получения измерений поглощения в растворе заключается в том, чтобы направлять коллимированный монохроматический свет через растворенный образец и регистрировать проходящий свет с помощью детектора, расположенного на противоположной стороне образца от источника света. Поглощение (А) образца затем определяется уравнением (1).

A = log₁₀(I₀/I) (1)

Где I_o — интенсивность падающего света на образец, а I — интенсивность света, проходящего через образец, который попадает на детектор. I_o получается путем измерения эталона, которым обычно является растворитель исследуемого растворенного вещества, с использованием тех же настроек регистрации, что и I. Абсорбционная спектроскопия обеспечивает количественные свойства поглощения и регулируется законом Бера-Ламберта (уравнение 2), который не применяется к образцам с оптическим рассеянием. Это уравнение гласит, что оптическое поглощение определяется коэффициентом молярной абсорбтивности образца (ε, единиц L·моль⁻¹·^см−1) на длине волны λ, умноженной на его молярную концентрацию (C, единицы моль∙^L-1) и длиной пути (L, единицы см), которая определяется как расстояние, пройденное через образец¹⁵:

A(λ) = ε(λ)*L*C (2)

Важно отметить, что молярный коэффициент поглощения уникален для каждого биологического поглотителя и показывает, насколько сильно образец поглощает свет на определенной длине волны¹⁶.

При проведении измерений абсорбционной спектроскопии от VIS до SWIR требуется корректировка оборудования, подготовка образцов и постобработка спектра, выходящая за рамки стандартных спектров VIS-NIR:

Скобяные изделия
Для измерений VIS-NIR обычно используется кремниевый детектор или фотоумножитель (PMT) с фотокатодами, чувствительными к фотонам UV-VIS, в то время как для поглощения SWIR требуется фотодетектор, чувствительный к фотонам SWIR, такой как детектор арсенида индия-галлия (InGaAs)¹⁷. Для систем VIS, NIR и SWIR также обычно требуются дисперсионные элементы, зависящие от длины волны, такие как оптические решетки, для дисперсии света в этих оптических диапазонах. Кроме того, для поглощения SWIR требуются стеклянные или кварцевые кюветы, которые имеют более высокую пропускную способность, чем пластиковые кюветы в SWIR, что делает их более подходящими для спектров VIS-SWIR. Следует выбирать источник или источники света с широким и относительно равномерным излучением, охватывающим VIS-SWIR, такие как вольфрам-галогенная лампа (используемая в настоящем протоколе). Регулировка мощности падающего света, времени экспозиции или продолжительности воздействия света на фотодетектор может помочь оптимизировать измерения поглощения.

Подготовка образцов
Концентрация образца или длина пути кюветы будет линейно изменять величину поглощения, которая происходит, как описано выше в уравнении (2), и, таким образом, может быть изменена для достижения высокого отношения сигнал/шум (SNR, рассчитывается здесь как отношение пиковой амплитуды к стандартному отклонению области спектра без тренда, обычно SNR > 30 считается высококачественным) в различных участках спектра с относительно высоким или низким абсорбция. Для оптимизации измерений SWIR в водном растворе вместо воды (H₂O) можно использовать оксид дейтерия (D₂O), также называемый тяжелой водой или дейтерированной водой, поскольку он имеет значительно более низкие пики поглощения в SWIR¹. Это позволяет определить характеристики растворенного вещества без вмешательства доминирующего водопоглощения в SWIR.

Спектральная постобработка
Постобработка необходима, потому что для спектров VIS-SWIR требуются два детектора, один для видимого NIR (обычно кремниевый или чувствительный к UV-VIS PMT) и один для SWIR (обычно InGaAs), и спектры должны быть сшиты вместе, чтобы получить полный спектр VIS-SWIR. Когда спектры охватывают VIS-SWIR, поглощение может значительно варьироваться в зависимости от области длины волны, и для предотвращения насыщения может потребоваться разбавление образца или уменьшение длины пути в некоторых областях. Спектры должны быть линейно масштабированы с учетом изменений концентрации образца или длины пути, а затем сшиты вместе, чтобы создать единый спектр, включающий две области длины волны.

В следующих протоколах будет подробно описана подготовка и спектроскопическое измерение от VIS до SWIR пяти примеров биологических поглотителей: воды (составляет ~60% массы тела), меланина (основного поглотителя пигментации кожи), кукурузного масла (используется в качестве аналога человеческих липидов, поскольку оно имеет низкую изменчивость между партиями, близкий химический состав к липидам человека и животных). и минимальное рассеяние), а также оксигенированный и дезоксигенированный гемоглобин (основные абсорбенты в крови).

Протокол

1. Подготовка образцов

1. Подготовка пробы воды
   1. Чтобы подготовить образец, наполните чистую емкость сверхчистой водой и отфильтруйте ее с помощью шприцевого фильтра длиной 0,22 мкм. Убедитесь, что выход шприца направлен на кювету из чистого стекла или кварца, чтобы провести измерения абсорбционной спектроскопии образца.
   2. Чтобы подготовить справку, наполните чистую емкость дейтерированной водой и отфильтруйте ее с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм. Убедитесь, что выход шприца направлен на такую же кювету из чистого стекла или кварца, как кювета для образца, которая будет служить эталоном.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этап фильтрации сводит к минимуму оптическое рассеяние от образца за счет отфильтровывания мелких частиц в воде, которые вносят значительный вклад в видимую область.
2. Подготовка образца меланина
   1. Приготовьте раствор меланина в дозе 1,7 мг/мл, добавив порошкообразный меланин в центрифужную пробирку, заполненную 3,5 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Для начала измерения должны начинаться на длинах волн с наименьшим ожидаемым поглощением, где требуется наибольшая концентрация меланина. Начните измерения меланина с приблизительно 1,7 мг/мл для SWIR, а затем разбавьте его ДМСО до 10-кратного разведения (примерно 0,17 мг/мл) для областей VIS/NIR.
   2. Проработайте трубку ультразвуком в течение 10 минут, чтобы убедиться, что порошкообразный меланин растворился в ДМСО, и перенесите раствор в чистую стеклянную или кварцевую кювету для спектроскопических измерений.
   3. Оставайтесь в пределах линейного диапазона поглощения спектрометра и обеспечьте измерения высокого отношения сигнал/шум, изменяя концентрацию и/или длину пути (например, переключаясь с короткой длины пути (1 или 2 мм) на кювету с длиной пути 10 мм). Абсорбция меланина имеет широкий диапазон, охватывающий от VIS до SWIR. Для ВИС используйте кювету с наименьшей концентрацией и/или длиной пути меланина из-за его высокого коэффициента затухания моляров; Для SWIR используйте самую высокую концентрацию меланина и/или кювету с длиной пути, чтобы получить качественно чистое спектроскопическое измерение.
3. Подготовка пробы кукурузного масла
   1. Добавьте кукурузное масло в чистую стеклянную или кварцевую кювету для спектроскопических измерений.
   2. Используйте открытый воздух в качестве эталона. В качестве эталона не будет использоваться кювета или раствор.
4. Получение образца оксигенированного гемоглобина из цельной гепаринизированной крови человека
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цельная гепаринизированная человеческая кровь была куплена и собрана в лицензированных FDA центрах сбора, расположенных в Соединенных Штатах.
   1. Чтобы выделить гемоглобин из эритроцитов (эритроцитов) и удалить как можно больше воды из крови, сначала пипеткой ввели 1800 μл цельной гепаринизированной крови человека в микроцентрифужные пробирки и центрифугировали в дозе 9,6 × г в течение 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать примерно 4-6 микроцентрифужных пробирок
   2. После центрифугирования извлеките пробирки из микроцентрифуги, затем удалите и выбросьте надосадочную жидкость (примерно 850 мкл) из центрифугированного образца крови, не повреждая гранулу (Рисунок 2). Надосадочная жидкость содержит жидкость (в основном плазму и тромбоциты) над гранулой эритроцитов. Ищите гранулу эритроцитов на дне микроцентрифужной пробирки.
   3. Восстановите каждую гранулу с тем же объемом дейтерированной воды, что и объем надосадочной жидкости, который был отброшен. Снова центрифугируйте при 9,6 × г в течение 10 мин.
   4. Извлеките пробирки из центрифуги, затем выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив гранулу.
   5. Восстановите гранулу с тем же объемом дейтерированной воды, что и объем надосадочной жидкости, который был отброшен. Повторно центрифугировать при 9,6 × г в течение 10 мин.
   6. Извлеките пробирки из центрифуги, затем удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и выбросьте ее.
   7. Лизирование эритроцитов (эритроцитов): Восстанавливают гранулы эритроцитов с большим объемом (4,5 мл) дейтерированной воды, что вызывает гипотонический взрыв. Если гранула прилипает к трубке, промойте ее небольшим количеством отмеренных 4,5 мл дейтерированной воды, чтобы разрыхлить ее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем надосадочной жидкости будет увеличиваться после каждой стадии центрифугирования. Этот объем надосадочной жидкости может составлять от 800 мкл до 1 600 мкл. Объем дейтерированной воды для лизинга может меняться в зависимости от желаемой концентрации образца, но должен быть достаточно высоким, чтобы вызвать гипотонический взрыв.
   8. Удалите из пробирки лизированный раствор крови с помощью иглы и шприца; Затем осторожно извлеките иглу шприца с тупым концом и выбросьте ее в контейнер для биологически опасных острых предметов. Подсоедините шприц к шприцевому фильтру 0,22 мкм и протолкните содержимое шприца через фильтр на стеклянную или кварцевую кювету длиной 10 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этап фильтрации сводит к минимуму оптическое рассеяние от образца за счет фильтрации клеточных органелл и мембран в растворе. Если образец имеет высокую концентрацию и шприцевой фильтр становится трудно протолкнуть, используйте несколько шприцевых фильтров.
   9. Закрепите кювету воздухонепроницаемой пробкой над кюветой, чтобы предотвратить загрязнение образца водяным паром из воздуха. Нанесите парапленку на внешнюю сторону пробки, чтобы еще больше предотвратить загрязнение и обеспечить герметичное уплотнение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерений от 600 нм до 1 600 нм приблизительно 1 200-1 600 мкл гранул, растворенных в 4,5 мл дейтерированной воды, даст качественно чистые измерения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для спектральных областей с высоким ожидаемым поглощением (от 400 нм до 600 нм) образцы необходимо разбавлять дейтерированной водой, чтобы получить ненасыщенные значения поглощения и убедиться, что значения поглощения находятся в пределах линейного диапазона детектора. Кроме того, образцы и эталон должны быть размещены в кюветах с короткой длиной пути (1 или 2 мм). Для спектров, показанных здесь, образцы разбавляли в 10 раз для 400-500 нм и в 5 раз для 500-600 нм и измеряли в кюветах длиной пути 2 мм.
      Более короткая длина пути (1 или 2 мм) обеспечит меньшее поглощение света на волнах с высокой степенью поглощения, что поможет гарантировать, что некоторые фотоны пройдут через детектор и останутся в пределах линейного диапазона обнаружения.
   10. Получите чистую кювету с той же длиной пути и объемом, что и кювета для образца, содержащая отфильтрованный раствор крови, и заполните ее дейтерированной водой для исходных и эталонных измерений. При изменении длины пути кюветы для разных спектральных диапазонов запишите новый эталонный спектр для каждой длины пути кюветы.
5. Получение образца дезоксигенированного гемоглобина из цельной гепаринизированной крови человека
   1. Выполните шаги 1.4.1-1.4.8.
   2. Добавьте дитионит натрия в кровяной раствор в кювете и аккуратно размешайте. Закрепите кювету воздухонепроницаемой пробкой над кюветой, чтобы предотвратить загрязнение образца водяным паром из воздуха. Нанесите парапленку на внешнюю сторону пробки, чтобы еще больше предотвратить загрязнение и обеспечить герметичное уплотнение. Осторожно наклоняйте кювету из стороны в сторону, чтобы убедиться, что дитионит натрия растворился в растворе; Кровяной раствор изменится с красного цвета на более темный фиолетово-красный цвет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для полного деоксигенирования гемоглобина требуется масса дитионита натрия, которая составляет примерно 0,007 г на мл раствора крови. По данным Briley-SÕbø и Bjørnerud, для полного деоксигенирования цельной^{крови необходимо} не менее 2,5 мг дитионита натрия на г крови. Тем не менее, в исследованиях здесь было обнаружено, что эта концентрация недостаточна. Было обнаружено, что концентрация примерно 3,4 мг/г цельной крови полностью деоксигенирует раствор крови без введения оптического рассеяния. Для измерений от 400 до 600 нм раствор крови нужно будет разбавить дейтерированной водой. Рассчитайте требуемую массу дитионита натрия исходя из объема используемого раствора буда, а не из объема после разбавления. При измерениях в диапазоне от 600 нм до 1 600 нм приблизительно 1 200-1 600 мкл гранул, растворенных в 4,5 мл дейтерированной воды, даст высокие измерения SNR.
      Кювета с более короткой длиной пути (1 или 2 мм) обеспечит меньшее поглощение света на волнах с высокой степенью поглощения, что поможет гарантировать, что некоторые фотоны пройдут через детектор и останутся в пределах линейного диапазона обнаружения.
   3. Заполните другую кювету с соответствующей длиной пути в качестве кюветы отфильтрованным раствором крови с дейтерированной водой для исходных и контрольных измерений. При изменении длины пути кюветы для разных спектральных диапазонов запишите новый эталонный спектр для каждой длины пути кюветы.

2. Получение высококачественных измерений поглощения

1. Подготовьте образцы и эталоны, как описано в разделе 1, и поместите их в стеклянные или кварцевые кюветы для измерений VIS NIR-SWIR. Включите лампу спектрометра и детекторы и дайте системе прогреться не менее 5-20 минут, в зависимости от системы спектрометра и источника света.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пять минут обеспечили достаточное охлаждение детектора и стабильность выходной мощности лампы для спектров, собранных в настоящем документе, но это должно быть охарактеризовано для каждой системы до начала измерения поглощения.
   Держите образец и справочный материал под рукой в течение этого периода сбора. Убедитесь, что крышки на кюветах надежно закреплены. Держите измерительное пространство как можно более темным, чтобы предотвратить искажение результатов измерений поглощения окружающим светом.
2. Повторите следующие шаги для разных областей спектра из-за большого разброса поглощения в VIS-SWIR.
   1. При использовании двухлучевой конфигурации (два отдельных детектора для образца и эталона) убедитесь, что система находится в исходном положении. Получите исходный уровень, поместив идентичные эталонные образцы, содержащие растворитель, перед каждым детектором, и проведите измерение поглощения с использованием точных параметров сбора, которые будут использоваться для сбора спектра поглощения образца. Хотя детекторы теоретически должны показывать нулевое поглощение, обычно оно не идеально. Вычтите полученный спектр поглощения из всех спектров поглощения образца, полученных с использованием одних и тех же настроек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Базовый уровень следует повторять каждый раз при изменении настроек сбора данных.
   2. Поместите образец в спектрометр и выберите детектор, соответствующий измеряемой области (VIS-NIR = кремний или UV-VIS PMT, SWIR = InGaAs) и просмотрите поглощение в режиме реального времени, в котором измерение постоянно обновляется по мере настройки параметров измерения.
   3. Начиная со стандартных параметров спектрометра, отрегулируйте мощность падающего света и время экспозиции до тех пор, пока не будет получен качественно чистый спектр поглощения без насыщения.
      1. Если настройка параметров не приводит к получению качественно чистых спектров, измените такие параметры , как мощность падающего света, время экспозиции, длина пути и концентрация образца. Во-первых, попробуйте отрегулировать мощность и время экспозиции. Если настройка этих параметров не приводит к получению высокого спектра SNR, измените концентрацию образца или длину пути образца и опорного сигнала.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартные параметры, используемые при сборе спектров, показанных здесь, включали мощность падающего света 15 нВт при 400 нм и 20 нВт при 1000 нм, время экспозиции 30 мс, длину пути кюветы 10 мм и удельные концентрации образца: 100% воды, меланина 1,7 мг/мл, 100% кукурузного масла, гемоглобина насыщенного кислородом (15,9 г/дл), и дезоксигенированный гемоглобин (15,9 г/дл).
      2. Чтобы увеличить отношение сигнал/шум, увеличьте количество операций чтения данных, усредненных по каждой точке данных. Чем больше усредненных прочтений данных, тем больше времени на измерение.
      3. Чтобы увеличить спектральное разрешение, уменьшите размер шага (нм) измерения до предела разрешения спектрометра. Это позволит увеличить время на измерение. Кроме того, уменьшите полосу пропускания падающего света до 1/^{10 от полной} ширины самого узкого пика в половину максимум¹⁹.
      4. После того, как настройки измерений будут оптимизированы для образца, задокументируйте настройки для каждого полученного спектра.
      5. Чтобы получить спектр, используйте оптимизированные настройки для измерения только опорного значения. Затем замените эталонную кювету на образец кюветы и произведите еще одно измерение. Обязательно сохраните эталонные и выборочные измерения отдельно.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно, чтобы эталонное измерение не насыщало. Если это так, уменьшите мощность падающего света и/или время воздействия до тех пор, пока не исчезнет насыщение. Поддерживайте неизменность всех параметров системы между эталонными измерениями и измерениями образца; Если одно нужно изменить, то другое также нужно будет повторить, чтобы соответствовать ему.
      6. Для каждого парного набора эталонных и выборочных измерений рассчитайте поглощение A (уравнение 1), рассматривая эталонное измерение как I_o , а измерение образца как I.
      7. Чтобы сшить различные области, для которых требуются различия в концентрации образца или длине пути, примените коэффициент умножения к одной из областей спектра. Например, для первой области, которая имела 1/10 концентрации и такую же длину пути, как и вторая область, умножьте первую спектральную область на 10, чтобы соответствующим образом масштабировать две области вместе.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент размножения должен быть разницей в концентрации и/или длине пути между областями.
      8. После того, как спектры были скорректированы на различия в длине пути или концентрации, выберите перекрывающуюся длину волны в двух спектральных областях для сшивания двух областей вместе.
      9. Усеките два спектра, чтобы они заканчивались на перекрывающейся длине волны; Выберите один спектр, чтобы включить его спектральное значение перехода. Объедините два усеченных спектра, чтобы создать единый результирующий спектр более широкого диапазона длин волн.

Результаты

Данные доступны через репозиторий цифровых исследовательских материалов WUSTL (DRMR) doi: https://doi.org/10.7936/6RXS-108249

Спектральная характеристика воды
Вода, один из наиболее распространенных биологических поглотителей, имеет характерные, высокопоглощающие пики в NIR и SWIR. Эти характерные пики настолько сильны, что при измерении поглощения воды ее часто приходится разбавлять дейтерированной водой, чтобы предотвратить насыщение. Разница в поглощении между водой и дейтерированной водой показана на рисунке 3, где показано увеличение водопоглощения более чем на порядок по сравнению с дейтерированной водой. Сильное водопоглощение в SWIR также затрудняет получение спектров поглощения других биологических поглотителей, которые содержат воду в образце или используют воду в качестве растворителя и эталона. В качестве решения этой проблемы вместо воды можно использовать дейтерированную воду. Дейтерированная вода действует аналогично воде, являясь при этом гораздо более слабым поглотителем SWIR, что делает ее идеальной заменой воде при измерениях SWIR-спектроскопии.

Для измерения спектра поглощения воды в качестве образца использовалась вода, а в качестве эталона — дейтерированная вода. Чтобы предотвратить насыщение в SWIR, образец разбавляли дейтерированной водой в области SWIR. Полученный спектр водопоглощения показывает низкое поглощение в VIS, которое увеличивается при больших длинах волн. Характерные пики поглощения можно наблюдать на длинах волн приблизительно 750 нм, 970 нм, 1200 нм и 1450 нм (рис. 4). Полученный спектр воды имеет отношение сигнал/шум 3536,6 и был сравнен со спектром водопоглощения Хейла и Куэрри²⁰, показав аналогичную кривую поглощения от ~500 нм до 1600 нм. Однако в диапазоне от 400 до 500 нм кривые поглощения различаются, при этом Хейл и Куэрри показывают более высокое значение поглощения на более низких длинах волн. Эта разница может быть связана с остаточными мелкими частицами в воде, которые будут иметь более высокое рассеяние на более коротких волнах по сравнению с более длинными^{волнами3} , и может опровергнуть предположения об отсутствии рассеяния в измерениях поглощения, основанных на законе Беера-Ламберта.

Спектральная характеристика меланина
Меланин, основной оптический поглотитель кожи, был спектрально охарактеризован с использованием порошкообразного меланина в качестве образца и ДМСО в качестве растворителя и эталона. Полученный спектр имеет отношение отношение сигнал/шум 172 и был сравнен с данными по эумеланину от Sarna et ^al.21,22 и Crippa et ^al.23 (рис. 5). Эумеланин является основным пигментом, отвечающим за цвет кожи, и, следовательно, предоставляет наиболее точные данные о том, как меланин повлияет на оптические устройства. Спектр, собранный с использованием описанного здесь протокола, демонстрирует высокую корреляцию с этими литературными значениями.

Спектральная характеристика кукурузного масла
Для исследования спектра поглощения липида было выбрано кукурузное масло из-за его минимального оптического рассеяния по сравнению с другими липидами и известного сходства по химическому составу с животными жирами¹. Чтобы получить спектр поглощения кукурузного масла, в качестве образца использовали кукурузное масло, а в качестве эталона — воздух. Как видно на рисунке 6, спектр кукурузного масла содержит характерные пики примерно на 930 нм, 1210 нм и 1410 нм. Полученный спектр кукурузного масла имеет отношение сигнал/шум 10363,1 и был наложен на спектр кукурузного масла Cao et al.¹, демонстрируя сильную корреляцию.

Спектральная характеристика оксигенированного и дезоксигенированного гемоглобина
В то время как характеристика абсорбции оксигенированного и дезоксигенированного гемоглобина является одним из наиболее важных достижений в биомедицинской оптике, спектры их поглощения, охватывающие ВИС и SWIR, остаются плохо изученными. Одним из наиболее сложных аспектов определения спектра абсорбции оксигенированного и дезоксигенированного гемоглобина в SWIR является удаление воды из крови, которая подавляет относительно небольшую абсорбцию гемоглобина. Чтобы распутать абсорбцию гемоглобина и воды, гемоглобин сначала был выделен из цельной крови человека с помощью центрифугирования, а надосадочная жидкость была удалена и заменена дейтерированной водой. Дейтерированная вода также использовалась в качестве эталона и растворителя, в который восстанавливался гемоглобин, вызывая гипотонический взрыв. Как показано на рисунке 3, дейтерированная вода имеет гораздо более низкое оптическое поглощение, чем вода, что делает ее идеальным растворителем и эталоном для измерений поглощения методом SWIR. Полученный спектр оксигенированного гемоглобина охватывает VIS до SWIR с отношением сигнал/шум 23118,7 и очень близко соответствует опубликованному Праль спектру оксигенированного гемоглобина⁴  (рис. 7). В ВИС насыщенный кислородом спектр гемоглобина демонстрирует высокую абсорбцию с характерными пиками поглощения на длине волны около 415 нм и пиком дублета на длине волны от 540 до 575 нм. В ближнем инфракрасном диапазоне насыщенный кислородом спектр гемоглобина показывает характерный пик, охватывающий более широкий диапазон длин волн, примерно от 800 нм до 1100 нм. При SWIR абсорбция гемоглобина низкая. Тем не менее, от приблизительно 1400 нм до 1600 нм спектр гемоглобина показывает более высокую абсорбцию с пиками, вероятно, из-за воды в гемоглобине, которая не могла быть полностью удалена в процессе центрифугирования.

Для дезоксигенированного гемоглобина в раствор гемоглобина добавляли дитионит натрия для введения диссоциации дикислорода из оксигенированного гемоглобина и превращения образца в дезоксигенированный гемоглобин. Полученный спектр имеет отношение сигнал/шум 9813,9 и был сравнен со спектром деоксигенированного гемоглобина Праль и показывает очень сильную корреляцию между 400 нм и 1000^нм4  (Рисунок 8). Полученный в результате спектр дезоксигенированного гемоглобина показывает характерные пики поглощения примерно на 430 нм, 560 нм и 760 нм. После этого абсорбция дезоксигенированного гемоглобина падает, но содержит меньшие пики поглощения около 1200 нм и от 1400 нм до 1600 нм. Поглощение от 1400 до 1600 нм, вероятно, связано с водой, которая не была полностью удалена из образца гемоглобина в процессе центрифугирования.

Сравнение биологических поглотителей от VIS-SWIR
Полные спектры VIS-SWIR от всех биологических поглотителей, описанных в этом протоколе, показаны на рисунке 9, масштабированные на основе их биологической концентрации в ткани², что подчеркивает отчетливые спектральные различия между биологическими поглотителями. Например, меланин, оксигенированный гемоглобин и дезоксигенированный гемоглобин имеют сильную характерную абсорбцию в VIS, которая обычно уменьшается с увеличением длины волны, в то время как вода и липиды демонстрируют характерные пики в ближнем ИК-диапазоне и SWIR. В биологических тканях сочетание снижения меланина и гемоглобина, а также уменьшения оптического рассеяния обеспечивает повышенную глубину оптического проникновения в БИК и КИФ. Кроме того, пониженная абсорбция меланина в NIR и SWIR позволяет проводить оптические исследования оксигенированных и дезоксигенированных гемоглобина, липидов и воды с минимальными эффектами из-за пигментации кожи.

Рисунок 1: Ранее опубликованные спектры распространенных биологических поглотителей через УФ-излучение до SWIR. Спектры оксигенированного и дезоксигенированного гемоглобина были построены с использованием данных Prahl⁴. Спектр меланина был построен с использованием данных из Sarna²¹ и Crippa²³. Липидный спектр был построен с использованием данных van Veen²⁴. Спектр воды был построен с использованием данных Хейла и Куэрри²⁰. Сокращение: SWIR = коротковолновый инфракрасный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Фотография надосадочной жидкости и гранулы эритроцитов из центрифугированной цельной крови. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Сравнение спектра поглощения воды и дейтерированной воды, собранной с идентичными настройками сбора данных по логарифмической (слева) и линейной (справа) шкале поглощения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Сравнение спектра водопоглощения, полученного с помощью описанных здесь методов, с методами Хейла и Куэрри²⁰. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Сравнение спектра поглощения меланина, полученного с помощью описанных здесь методов, с Sarna et ^al.21,22 и Crippa et ^al.23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Сравнение спектра поглощения кукурузного масла, полученного с помощью описанных здесь методов, с Cao et ^al.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Сравнение спектра поглощения оксигенированного гемоглобина, полученного с помощью описанных здесь методов, с методом Праль⁴. Спектральные особенности от 1400 до 1600 нм, вероятно, связаны с остаточными водами в образце. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 8: Сравнение спектра поглощения дезоксигенированного гемоглобина, полученного с помощью описанных здесь методов, с методом Праль⁴. Спектральные особенности от 1400 до 1600 нм, вероятно, связаны с остаточными водами в образце. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 9: Спектры VIS-SWIR распространенных биологических поглотителей. Сокращение: VIS-SWIR = видимый-коротковолновый инфракрасный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Протокол(ы), изложенные в этой статье, могут быть использованы для получения спектров поглощения биологических поглотителей и контрастных веществ методом VIS-SWIR. В данной работе мы показываем конкретные шаги по получению спектров воды, меланина, кукурузного масла, оксигенированного гемоглобина и дезоксигенированного гемоглобина в диапазоне от 400 нм до 1600 нм. Нижеследующее обсуждение охватывает важнейшие шаги, советы по оптимизации измерений, ограничения метода и применение этого протокола в биомедицине.

Несмотря на то, что все этапы протокола важны, необходимо выполнить несколько критических шагов для получения точных спектров с помощью этого протокола. Во-первых, образец должен быть нерассеивающим; Например, при получении оксигенированного и дезоксигенированного гемоглобина из крови рассеиватели в образце должны быть отфильтрованы (здесь использовался шприцевой фильтр 0,22 мкм). При приготовлении дезоксигенированного гемоглобина количество добавляемого дитионита натрия не должно превышать указанного веса, так как это приведет к мутному образу образца при более высоких весовых процентах и аннулирует требования закона Бера-Ламберта.

Во-вторых, дейтерированная вода должна использоваться в качестве растворителя образца и эталона для водорастворимых растворенных веществ, таких как гемоглобин. В SWIR водопоглощение сильно поглощается и может маскировать другие поглотители. В-третьих, измерения должны быть получены в пределах линейного диапазона детектора, определяемого как область, в которой изменение количества фотонов, достигающих детектора, приводит к линейному изменению сигнала детектора. Если поглощение минимальное, детектор может зарегистрировать поглощение, равное нулю, даже если поглощение происходит. Это происходит, когда образец слишком разбавлен, время экспозиции слишком малое и/или длина пути кюветы слишком короткая, но может быть исправлено путем увеличения концентрации образца, длины пути кюветы и/или времени экспозиции. Аналогичным образом, если происходит высокое поглощение, детектор может не зарегистрировать фотоны и получить плоскую линию, называемую «насыщением», которая не чувствительна к изменениям поглощения. Это происходит, когда образец слишком концентрирован, время воздействия слишком малое и/или длина пути слишком велика, но это можно исправить путем увеличения концентрации образца, увеличения времени воздействия и/или уменьшения длины пути кюветы.

В-четвертых, используемые детекторы должны быть линейными. Если нет уверенности в том, что детектор показывает линейную реакцию на количество фотонов, достигающих детектора, можно измерить различные разведения образца с одними и теми же настройками сбора данных, чтобы проверить, показывают ли их значения поглощения ожидаемый линейный тренд между поглощением и концентрацией. В качестве альтернативы можно измерить один образец и увеличить время воздействия, чтобы проверить, имеет ли место линейное увеличение интенсивности детектора. Оба теста должны дать линейную зависимость, если пользователь работает в ее линейных пределах (см. третий критический пункт выше).

В-пятых, чтобы оставаться в пределах линейного диапазона детектора во всем спектральном диапазоне VIS-SWIR, концентрация образца, время воздействия детектора и/или длина пути кюветы должны быть изменены для различных спектральных областей со значительно более высокой или меньшей поглощающей способностью по сравнению с начальной спектральной областью.

В-шестых, спектры, полученные с использованием различных концентраций образцов или длин трасс для разных спектральных областей, должны быть сшиты путем линейного масштабирования одной области на основе известных изменений концентрации или длины пути. После масштабирования спектры должны быть сшиты вместе на перекрывающейся длине волны между двумя областями. Если измерение будет охватывать измерения с разных детекторов, должны быть перекрывающиеся спектры поглощения, которые содержат желаемую длину волны перехода детектора (800 нм обычно используется при сшивании областей UV-VIS и SWIR). Каждый спектр усекается по длине волны перехода детектора, и один спектр выбирается для включения исходного значения поглощения при переходе детектора. Затем два усеченных спектра объединяются, чтобы создать один вытянутый спектр.

Дополнительные советы по получению высококачественных спектров поглощения включают использование ранее опубликованного спектра интересующего образца, даже если он не охватывает весь спектральный диапазон для измерения. Зная априори диапазон длин волн с наименьшим поглощением, измерения могут быть начаты в этой области с образцом с самой высокой концентрацией, а затем скорректированы и разбавлены оттуда. Это может помочь определить, сколько отдельных областей необходимо будет измерить, исходя из величины ожидаемых изменений поглощения. Это также может обеспечить уверенность в том, что ожидаемый спектр был получен, если он соответствует опубликованным спектрам, или если он не соответствует опубликованным спектрам, метод подготовки образцов может быть пересмотрен вместе с проблемами, которые могут искажать спектр.

Спектры поглощения могут потребовать постобработки. Например, цифровой фильтр скользящих средних может быть использован для сглаживания измерений поглощения, а точки с известной погрешностью могут быть удалены с помощью восстановления набора данных, при котором ошибочные точки удаляются, а между неошибочными точками выполняется интерполяция.

К ограничениям этого метода относится погрешность для образцов с оптическим рассеянием, таких как цельная кровь. Чтобы точно измерить гемоглобин, образец крови лизируют, а затем фильтруют шприцем, чтобы удалить большинство других остаточных клеточных компонентов, вызывающих оптическое рассеяние. Точно так же этот метод не используется in vivo из-за рассеивания тканей. В то время как измерения поглощения на основе закона Бера-Ламберта могут быть утомительными и иногда сложными для выполнения, это золотой стандарт метода для измерений чистого оптического поглощения. Кроме того, некоторые растворители особенно затрудняют получение чистого спектра поглощения определенных растворенных веществ. Например, нативным растворителем оксигенированного и дезоксигенированного гемоглобина является вода, но абсорбция воды в SWIR сильна, доминируя над абсорбцией оксигенированного гемоглобина. Поэтому мы пытаемся удалить воду из крови с помощью повторного центрифугирования, удаления надосадочной жидкости и повторного восстановления с помощью дейтерированной воды, которая имеет более слабую абсорбцию SWIR. Результирующие оксигенированные и дезоксигенированные спектры гемоглобина из цельной гепаринизированной крови человека, как предполагается, содержат небольшое остаточное поглощение из-за поглощения воды в диапазоне от примерно 1300 нм до 1600 нм, как показано на рисунке 3. Хотя, вероятно, это не идеальное отделение воды от оксигенированного и дезоксигенированного гемоглобина, мы наблюдаем тесное согласование с широко цитируемыми опубликованными спектрами оксигенированного и дезоксигенированного гемоглобина от 400 нм до 1000 нм, и мы расширяем спектр на несколько сотен нанометров^.

Описанные здесь протоколы помогут исследователям расширить библиотеки спектров поглощения, включив в них спектры VIS-SWIR множества биологических компонентов и контрастных веществ. Эти знания могут быть использованы для улучшения понимания основ биологии и физиологии с помощью неинвазивной биомедицинской визуализации и зондирования на более глубоких длинах волн, чем большинство систем в настоящее время. Добавление длин волн SWIR расширяет тип компонентов тканей, которые можно контролировать неинвазивным способом, и может помочь в разработке новых методов мониторинга и диагностики. Кроме того, устройства, работающие в NIR и SWIR, должны помочь свести к минимуму смещение пигментации кожи, о котором сообщалось для оптических устройств, работающих в диапазонах VIS и NIR, и является многообещающей стратегией для создания справедливых медицинских устройств.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,22 & микро; м диаметр шприца Фильтры	Sigma-Aldrich	SLGPM33RS
1000 L Пипетка	Millipore Sigma	EP3124000121
200 &микро; L пипетка	Millipore Sigma	EP3124000083
конические трубки	Avantor VWR	21008-089
Кукурузное масло	Happy Belly	n/a	48 жидких унций
оксида дейтерия	Cambridge Isotope Laboratories	DLM-4-100
Оксид дейтерия	Sigma-Aldrich	7789-20-0
Диметилсульфоксид (ДМСО)	Sigma-Aldrich	D5879-1L
Одноразовый шприц 1 мл	BH Расходные материалы	BH1LL
Одноразовая игла	Atshuhut/Amazon	66941
Морозильная камера (-80 ° c)	Стеклянные стаканы Fisher Scientific	IUE386FARK
	Millipore Sigma	CLS1000PACK
стеклянные или кварцевые кюветы	Sigma-Aldrich	Z802875-1EA	700 &микро; Стеклянные
или кварцевые кюветы	объемом L Thorlabs	CV10Q35EP	объемом 3500 мл
Гепаринизированная кровяная	лампа	человека 7203710
микроцентрифужные пробирки	Costar	3213
Микроцентрифуга--accuSpin Micro 17	Fisher Scientific	13-100-675
MilliQ Вода	Millipore Sigma	ZMQSP0D01
OSRAM FCS 64640 150 Вт 24 В HLX Галогенная лампочка	Amazon	B0001221DG
Парапленка	Millipore Sigma	HS234526B
наконечники для пипеток	Eppendorf	22492055
порошкообразный синтетический меланин	Sigma-Aldrich	8049-97-6
Scale	Sartorius	UX-11976-09
Дитионит	натрияSigma-Aldrich	1065070500
Ультразвуковой аппарат	Fisher Scientific	CPX1800
Spatula	Aozita	000 00 0 1 2 3
UV/VIS/SWIR Спектрофотометр	On Line Инструментальные системы	Olis Cary 14
Весы Amazon