Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Количественный анализ на основе ПЦР для измерения передачи сигналов звукового ежа в клеточной модели цилиогенеза

1.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67407

⸱

31 января 2025 г.

 , 
1CellBio Lab, Institute of Health Sciences, Presidency University

В этой статье

Краткое содержание

В исследовании продемонстрирован количественный анализ на основе ПЦР для активации первичного сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH) с использованием агониста SHH в клеточной модели цилиогенеза.

Аннотация

Цилиопатия относится к совокупности мультисистемных и полигенных заболеваний и расстройств человека, которые возникают из-за аберрации структуры или функции подвижных или неподвижных (первичных) ресничек, которые представляют собой выпячивания клеток на основе микротрубочек. Первичные реснички (РПЖ) присутствуют в большинстве эпителиальных и эндотелиальных тканей человека и служат концентратором для передачи физиологических сигналов, включая передачу сигналов звукового ежа (SHH). Различные ситуации требуют изучения функции ФХ, что может быть достигнуто путем измерения канонического сигнального пути SHH, который почти исключительно опосредован ФХ. Здесь разработана методика, основанная на количественной ПЦР (кПЦР), для измерения уровня транскрипции генов пути SHH в покоящихся клетках hTERT-RPE1 (или RPE1), которые в основном содержат PC. Затишье в клетках RPE1 достигается путем сывороточного голодания в течение 48 ч, в то время как активация пути SHH стимулируется определенным агонистом. Этот анализ на основе клеточных культур прост в использовании и чувствителен. Успешная демонстрация этого анализа на реснитчатых клетках RPE1 указывает на его огромный потенциал в качестве анализа in vitro для изучения надлежащей функции РПЖ при генетическом или эпигенетическом изменении одного или нескольких генов, которые могут быть связаны с различными цилиопатиями.

Введение

Ресничка представляет собой выступ на основе микротрубочек и оболоченный мембраной выступ с поверхности клетки, который собран на базальном теле1. У позвоночных животных наблюдаются два типа ресничек, а именно подвижные и неподвижные. Подвижные реснички расположены в специализированных тканях и придают моторику. Неподвижные первичные реснички (РПЖ) присутствуют в большинстве клеток позвоночных, выполняют сенсорные функции и передают критические сигналы из внеклеточной среды внутрь клеток2. После сборки удлинению ресничек способствует механизм внутрижгутикового транспорта (IFT), который представляет собой двунаправленную транспортную систему, несущую груз, приводимый в движение кинезинами (антероградное движение) и моторными белками динеина-II (ретроградное движение)3,4. Структурные или функциональные дефекты подвижных или первичных ресничек могут привести к множеству мультисистемных заболеваний человека, которые в совокупности известны как цилиопатии 5,6.

ПК служит центром для различных сигнальных процессов развития, таких как бескрылые (Wnt), рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), рецептор-тирозинкиназы (RTK), трансформирующий фактор роста β (TGFβ) и тромбоцитарный фактор роста (PDGF) 7,8. У млекопитающих передача сигналов Sonic Hedgehog (SHH) является критически важной, которая почти исключительно передается PC в клетках, содержащих PC 9,10,11. Аберрантная структура или функция РПЖ приводит к ослаблению сигнальных путей, которые связаны с такими заболеваниями, как врожденные пороки сердца, поликистоз почек, черепно-лицевые аномалии, дистрофия сетчатки и некоторые редкие заболевания, такие как синдром Барде-Бидля (BBS), синдром Жубера (JBTS), синдром Альстрёма, удушающая торакальная дисплазия Жёна:12,13,14,15. Большинство из них являются полигенными заболеваниями эпителиальных или эндотелиальных тканей, что затрудняет раннюю диагностику и лечение этих заболеваний. Определение того, как такие мутации способствуют ослаблению PC-опосредованной передачи сигналов в модели клеточной культуры, может не только дать представление о молекулярной сложности этого сигнального пути, но и облегчить диагностику различных цилиопатий и предложить терапевтические вмешательства. Исходя из этого, был разработан количественный анализ на основе ПЦР (кПЦР) для определения изменений в ПК-опосредованном сигнальном пути SHH в иммортализированных пигментных эпителиальных клетках сетчатки (hTERT-RPE1) теломеразы обратной транскриптазы человека (hTERT-RPE1). Клетки RPE1 представляют собой почти диплоидные, нетрансформированные человеческие клетки, которые широко используются в качестве клеточной модели цилиогенеза, поскольку примерно 75-80% этих клеток собирают ПК после истощения сыворотки (инкубируя клетки в бессывороточной среде) в течение 24-48 часов, по сравнению с 15-18% инфузорий в асинхронно растущей культуре клетокRPE116.

Передача сигналов ежа (HH) сохраняется у позвоночных для эмбрионального развития17. У млекопитающих наблюдаются три различных типа передачи сигналов ежа: звуковая (SHH), индийская (IHH) и пустынная (DHH), из которых SHH и IHH демонстрируют перекрывающиеся функциина тканевом уровне. Передача сигналов SHH играет ключевую роль во время эмбрионального развития, регулируя структуру конечностей и спецификацию типов клеток в нервной системе и поддерживая гомеостаз взрослой ткани 10,11,18. Несмотря на то, что передача сигналов SHH является сложной, появляется все больше доказательств того, что каноническая передача сигналов SHH зависит от PC 7,11,19, которая опосредована коллективными функциями факторов транскрипции Gli (Gli1, Gli2 и Gli3). Было высказано предположение, что передача сигналов HH и ФК эволюционировали совпадая, при этом критические сигнальные компоненты концентрируются в компактном объеме на кончике реснички, чтобы обеспечить эффективный ответ на низкие отношениялигандов.

В отсутствие лигандов SHH Patched1 (Ptch1), который локализован на мембране PC, ингибирует активность Smoothened (Smo) с помощью плохо изученного механизма, который, вероятно, включает транспорт липидов, тем самым поддерживая подавленный путь 7,20. Конститутивно активный цилиарный GPR161, который является G-сопряженным белковым рецептором и негативным регулятором системы, обеспечивает поддержание репрессии за счет сохранения высоких уровней цилиарного циклического АМФ (цАМФ), повышающего активность протеинкиназы А (PKA)21, и за счет поддержания цилиарной локализации PKA7. Активность PKA, наряду с казеинкиназой 1 (CK1) и гликогенсинтазной киназой 3 β (GSK3β), фосфорилирует множественные остатки белков Gli, Gli2 и Gli3, внутри ПК. Gli2 и Gli3 могут выступать как активаторы, так и репрессоры транскрипции генов-мишеней. PKA-опосредованное фосфорилирование вызывает ингибирование активаторной функции Gli2, в то время как фосфорилированный Gli3 расщепляется протеазами с образованием репрессорной формы Gli3R22. В целом, экспрессия генов-мишеней SHH в таких условиях подавляется.

Когда лиганд SHH присутствует, Ptch1 связывается с ним, и GPR161 покидает PC, а Smo, фосфорилированный киназой 2 (GPRK2) и CK1, транспортируется в PC, вместе с β-арестином и мотором микротрубочек KIF3A23. В совокупности локализация Gli2/3, супрессора Fused (SUFU) и Kif7 на кончике реснички способствует снижению расщепления Gli2/3, тем самым увеличивая активаторную функцию Gli2/324,25. После активации Gli2/3 индуцирует экспрессию Gli1, который может функционировать только как активатор, и тем самым усиливает реакцию пути SHH22. Связывание SHH с Ptch1 облегчается CAM-связанным/подавленным онкогенами (CDO), братом CDO (BOC), специфичным для остановки роста 1 (GAS1) и белком 2, связанным с рецептором липопротеинов низкой плотности (LRP2). И наоборот, белок, взаимодействующий с ежом (HHIP), может секвестрировать SHH, напрямую взаимодействуя с ним, а также конкурирует с Ptch1 за счет взаимодействия с SHH26. Важно отметить, что GLI1, HHIP и PTCH1 транскрибируются при активации пути SHH, в то время как последние два участвуют в негативной регуляции пути SHH.

Предыдущие исследования показали, что уровни транскриптов генов-мишеней SHH могут быть измерены для оценки пути SHH, хотя они могут значительно варьироваться у разных типов клеток27,28. Такая вариабельность в ответе пути SHH может быть связана с различными комбинациями PC-опосредованной передачи сигналов SHH и передачи сигналов SHH, которая опосредована клеточной мембраной, вероятно, в отсутствие PC. SAG является Smo-агонистом, который используется в этом методе для имитации активации сигнализации SHH в клетках RPE1, испытывающих сывороточный голод, которые в основном реснитчатые. Уровни транскриптов генов-мишеней SHH, таких как HHIP, GLI1 и PTCH1, а также нецелевого гена SMO измеряли с помощью количественной ПЦР в контрольных клетках и клетках, обработанных SAG, и сравнивали для определения активации пути SHH. Успешная демонстрация этого чувствительного анализа на основе клеточных культур для измерения PC-опосредованной передачи сигналов SHH предполагает его многообещающее применение в биомедицинских исследованиях, связанных с первичной функцией ресничек.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Культура клеток

  1. Проведите почти сливающуюся колбу с клеточными культурами Т-25 с клетками RPE1 в соотношении 1:5 от исходной культуры в свежую колбу для клеточной культуры Т-25, содержащую 5 мл модифицированной среды Игла (DMEM) Дульбекко с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 1% пенициллин-стрептомициновой смеси (конечная концентрация - 100 Ед/мл пенициллина G и 100 мкг/мл стрептомицина). Эта среда называется полной средой. Выращивайте клетки при 37 °C в присутствии 5%CO2.
    Клетки RPE1 являются нетрансформированными клетками, обычно используемыми для изучения молекулярной регуляции сборки и разборки ПК в клеточной культуре. Примерно 80% клеток RPE1 собирают ФК после сывороточного голодания, который снова разбирается при повторном добавлении сыворотки16.
  2. Приготовьте круглые стеклянные покровные стекла толщиной 12 мм, инкубировав их в 50 мл 1 Н HCl в закрытом стеклянном стакане в течение ночи без встряхивания при 60 °C на водяной бане или в инкубаторе.
  3. На следующий день с помощью пипетки объемом 25 мл выведите раствор кислоты и выбросьте его в контейнер с химической опасностью. Затем промойте покровные стекла 3 раза в 100 мл дистиллированной воды путем инкубации в течение 15 минут с периодическим встряхиванием, с последующим дозированием.
  4. Повторите этапы стирки с 70% этанолом и 95% этанолом. Высушите покровные листы, поместив их по отдельности на лабораторную промокательную бумагу в шкафу для биобезопасности. После высыхания стерилизовать ультрафиолетовым излучением в течение 60 минут.

2. Рост клеток, сывороточное голодание и лечение САК

  1. Ресуспендируйте клетки в колбе Т-25 в предварительно подогретой полной среде после вытеснения клеток за счет ферментативной активности предварительно подогретого 0,25% раствора трипсина-ЭДТА. Определяют плотность клеток суспензии путем подсчета клеток с помощью гемоцитометра.
  2. Приготовьте две чашки для клеточных культур диаметром 35 мм и поместите в каждую из них по две стерильные покровные стежки диаметром 12 мм. Пропустите 2 x 105 асинхронно выращивающих клеток RPE1 в каждую 35 мм чашку, содержащую покровные стекла, и выращивайте клетки в 2 мл готовой среды в течение 24 ч.
  3. Через 24 ч удалите среду для выращивания клеток RPE1 и промойте клетки 1x предварительно подогретым 1 мл буфера DPBS. Добавьте 2 мл предварительно подогретой среды DMEM, содержащей 1% пенициллин-стрептомицина, но лишенной FBS (бессывороточной среды) в каждую чашку и инкубируйте клетки в течение 24 ч при 37 °C в присутствии 5%CO2.
  4. Через 24 ч замените среду на бессывороточную среду, содержащую либо SAG до конечной концентрации 250 нМ, либо ДМСО в качестве контрольного растворителя, и инкубировать клетки в течение еще 24 ч. Мультяшная диаграмма протокола культивирования клеток показана на рисунке 1A.

3. Сбор клеток

  1. Перенесите покровные стекла на 24-луночный планшет с одним покровным стеклом в каждой лунке. Добавьте по 0,5 мл охлажденного метанола в каждую лунку и инкубируйте планшет при температуре -20 °C в течение 10 мин для фиксации ячеек на покровных стеклах. Сразу после этого промойте покровные стекла 3 раза 0,5 мл буфера для стирки (1x PBS, содержащий 0,5 мМ MgCl2 и 0,05% Triton-X 100).
  2. Выбросьте среду и добавьте 0,5 мл реагента тризола непосредственно в каждую посуду. Дайте равномерно распределить и держите 5 минут. Сделайте пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы получилась однородная смесь, и соберите ее в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл без нуклеаз.

4. Получение общей РНК и кДНК

  1. Добавьте 0,1 мл хлороформа в каждую пробирку, содержащую лизированные клетки, и инкубируйте в течение 2-3 минут. Центрифугируйте каждый образец в течение 15 мин при 12 000 x g при 4 °C. Перенесите водную фазу, содержащую РНК, в свежие микроцентрифужные пробирки.
  2. Добавьте 0,25 мл изопропанола в водную фазу и инкубируйте в течение 10 мин. Центрифуга в течение 10 мин при 12 000 x g при 4°C. Осадок РНК образует белую гелеобразную гранулу. С помощью микропипетки выбросьте надосадочную жидкость.
  3. Ресуспендируйте РНК-гранулу в 0,5 мл свежеразведенного 75% этанола. Кратковременно обработайте образцы вихрем, а затем центрифугируйте в течение 5 минут при 7500 x g при 4°C. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью микропипетки.
  4. Высушите гранулу РНК на воздухе в течение 10 минут и повторно суспендируйте в 25 μл воды, не содержащей нуклеаз. Определить концентрацию общей РНК путем измерения поглощения на длине волны 260 нм с помощью микрообъемного спектрофотометра.
  5. Используйте 1-3 г общей РНК из обоих образцов для получения кДНК в соответствии с инструкциями производителя для набора для синтеза кДНК. Храните кДНК при температуре -20 °C.

5. Количественная ПЦР

  1. Установите реакции количественной ПЦР (в трех экземплярах, Таблица 1) с использованием 1:5 разбавленных кДНК из каждого образца с наборами праймеров GLI1, PTCH1, HHIP, SMO и β-ACTIN (в качестве гена-домовладельца; Таблица 2) гены с мастер-смесью для количественной ПЦР, содержащей подходящую ДНК-полимеразу, dNTP и буфер, в подходящем многолуночном флуоресцентно-чувствительном ПЦР-планшете.
  2. Накройте планшет подходящим герметиком, поместите его в подходящий прибор для количественной ПЦР и запустите стандартизированную программу количественной ПЦР с 40 циклами амплификации и шагом анализа кривой плавления в конце программы. Стандартизированная программа количественной ПЦР из 40 циклов, включающая анализ кривой плавления, схематически показана на рисунке 1B.
  3. Когда программа количественной ПЦР будет завершена, проверьте кривую расплава каждого ампликона на наличие одного пика при желаемой температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В конце циклов амплификации соответствующий анализ кривой расплавления измеряет температуру плавления ампликона путем повышения температуры каждой лунки с 65°C до 95°C с шагом 0,5°C продолжительностью 5 с.
  4. Экспортируйте данные амплификации в электронную таблицу и рассчитайте относительную экспрессию (метод 2-ΔΔCT) каждого транскрипта путем нормализации по отношению к гена β-ACTIN для каждого образца. Постройте график и рассчитайте статистическую значимость изменений в относительной экспрессии каждого транскрипта с помощью непарного Т-критерия.

6. Иммуноокрашивание и получение изображений с помощью флуоресцентной микроскопии

  1. Инкубируйте фиксированные ячейки на покровных стеклах в 200 мкл блокирующего буфера (2% BSA и 0,1% TritonX-100 в 1x PBS) в течение 30 минут.
  2. Инкубируйте клетки со смесью первичных антител (обычно антимышиного против ацетилированного α-тубулина ФК-аксонемы и антикроличьих антител против цилиарной мембраны и центриола, соответственно), разведенных в блокирующем буфере (см. Таблицу материалов для окончательного разведения) в течение ночи при 4 °C в увлажненной камере.
    1. Сделайте увлажненную камеру, положив влажное бумажное полотенце в нижнюю половину пустой коробки для наконечника для дозатора объемом 1 мл. Положите полоску прозрачной пленки на поверхность штатива и нанесите на пленку каплю (20-25 мкл) раствора антитела, по одной на каждую инкубируемую защитную пленку. Наденьте на капли покровную крышку так, чтобы ячейки были погружены, и закройте крышку коробки для наконечников.
  3. На следующий день снова переверните покровные листы и верните их в чашку на 24 лунки. Промойте покровные стекла с помощью промывочного буфера, а затем инкубируйте их в 150 мкл вторичной смеси антител с предварительно стандартизированным разбавлением антител (в данном случае зелено-флуоресцентный краситель-конъюгированный анти-мышиный и красный флуоресцентный краситель-конъюгированный анти-кролик, разведенный в блокирующем буфере) и ядерных реагентов-красителей для окрашивания ДНК в течение 1 ч при комнатной температуре. Постирайте покровные стекла 3 раза.
  4. Найдите каплю (примерно 3-5 мкл) монтажного раствора, содержащего реагент, препятствующий выцветанию, на предметном стекле микроскопа. Поместите покровное стекло стороной ячейки вниз на монтажный раствор. Вытрите лишнюю жидкость, аккуратно надавливая на чистую салфетку. Нанесите прозрачный лак для ногтей по краю покровного стекла, чтобы приклеить его к предметному стеклу.
  5. Наденьте предметное стекло на микроскоп (см. Таблицу материалов), прикрепленное к нему моторизованным столиком и камерой, способной делать цифровые изображения. Используйте 60-кратный масляный иммерсионный объектив Plan Apo (с числовой апертурой 1,4) для получения изображений клеток RPE1, испытывающих нехватку сыворотки при температуре окружающей среды, для визуализации PC в клетках, отмеченных упомянутыми антителами.
  6. Получение изображений различных образцов на отдельных покровных стеклах с использованием одинакового времени экспозиции для разных флуорофоров вдоль оси Z с помощью программного пакета для цифровой микроскопии. Подсчитайте количество ПК-содержащих клеток не менее чем из 500 клеток, чтобы определить процент инстилизации в условиях 48-часового сывороточного голодания.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Активация ПК-опосредованного пути передачи сигнала SHH — это способ понять правильное функционирование ПК7. В данном случае относительная экспрессия генов-мишеней пути SHH измеряется с помощью анализа RT-qPCR при SAG-опосредованной активации пути SHH в клетках RPE1, которые в основном реснитчатые. Прямые транскрипционные выходы пути SHH GLI1 и PTCH1 часто используются для измерения активности этого пути11. Этот протокол также включает в себя транскрипт HHIP, который регулир...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Изучение функциональности ПК является важным шагом на пути к пониманию динамики образования и заболеваний или расстройств, связанных с дисфункцией РПЖ. Помимо изучения инфузории путем иммуноокрашивания на цилиарные маркеры или структурные компоненты ресничек, меченные флуорофорами, функцию РПЖ обычно определяют путем анализа канонической активации пути SHH путем измерения ресничной транслокации Smo в тканях и клетках с помощью флуоресцентной микроскопии27,31<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа поддерживается стипендией Рамалингасвами для SM от Департамента биотехнологии (DBT) правительства Индии и исследовательским грантом от Совета по научным и инженерным исследованиям (SERB) правительства Индии для SM (CRG/2020/004042). Стипендия PH спонсируется Университетской комиссией по грантам (UGC) правительства Индии. Авторы искренне благодарят д-ра Чандраму Мукерджи и г-на Авика Мукерджи из лаборатории RNABio Института медицинских наук Президентского университета за доступ к инструменту для количественной ПЦР и обучение работе с этим инструментом соответственно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ДМСО, стерильный фильтрованныйSigmaD2650
Осел, антимышиный IgG (H+L) Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA21202
Осел, антикролик IgG (H+L) Alexa Fluor 568ThermoFisher ScientificA10042
модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM)Gibco, ThermoFisher Scientific41965039
Фосфатно-солевой буфер Dulbecco (DPBS)Gibco, ThermoFisher Scientific14190144
Фетальная бычья сыворотка (FBS)HimediaRM1112
с 60-кратным объективомCarl Zeiss Axio observer colibri 5
hTERT-RPE1 клеткиATCCCRL-4000
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad Laboratories1708891
мыши, моноклональное антитело к ацетилированному тубулинуMilipore Sigma-AldrichT7451Окончательное разведение 1:1000
Пенициллин-стрептомицин, 100XGibco, ThermoFisher Scientific15140122
Количественная ПЦР-машина, CFX 96Bio-Rad Laboratories
Кролик, поликлональное антитело Arl13BProteinTech17711-1-APОкончательное разведение 1:250
Кролик, поликлональное антитело Cep135ProteinTech24428-1-APОкончательное разведение 1:500
SlowFade gold Antifade moutantThermoFisher ScientificS36940
Smoothened Агонист (САГ) AbmoleM4865Стоковый раствор: в ДМСО, 5 мМ
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725271
TRIzol ReagentInvitrogen15596026
TrypLEGibco, ThermoFisher Scientific12605028
Флуоресцентный микроскоп

Ссылки

  1. Nigg, E. A., Raff, J. W. Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease. Cell. 139 (4), 663-678 (2009).
  2. Halder, P., Khatun, S., Majumder, S. Freeing the brake: Proliferation needs primary cilium to disassemble. J Biosci. 45, 117(2020).
  3. Eguether, T., Cordelieres, F. P., Pazour, G. J. Intraflagellar transport is deeply integrated in hedgehog signaling. Mol Biol Cell. 29 (10), 1178-1189 (2018).
  4. Ishikawa, H., Marshall, W. F. Intraflagellar transport and ciliary dynamics. Cold Spring Harb Perspect Biol. 9 (3), a021998(2017).
  5. Hildebrandt, F., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N Engl J Med. 364 (16), 1533-1543 (2011).
  6. Reiter, J. F., Leroux, M. R. Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (9), 533-547 (2017).
  7. Hilgendorf, K. I., Myers, B. R., Reiter, J. F. Emerging mechanistic understanding of cilia function in cellular signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (7), 555-573 (2024).
  8. Bansal, R., et al. Hedgehog pathway activation alters ciliary signaling in primary hypothalamic cultures. Front Cell Neurosci. 13, 266(2019).
  9. Gigante, E. D., Caspary, T. Signaling in the primary cilium through the lens of the hedgehog pathway. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 9 (6), e377(2020).
  10. Anvarian, Z., Mykytyn, K., Mukhopadhyay, S., Pedersen, L. B., Christensen, S. T. Cellular signalling by primary cilia in development, organ function and disease. Nat Rev Nephrol. 15 (4), 199-219 (2019).
  11. Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian hedgehog signaling. Cold Spring Harb Perspect Biol. 9 (5), a028175(2017).
  12. Brown, J. M., Witman, G. B. Cilia and diseases. Bioscience. 64 (12), 1126-1137 (2014).
  13. Hanaki, K., et al. Alstrom syndrome: A review focusing on its diverse clinical manifestations and their etiology as a ciliopathy. Yonago Acta Med. 67 (2), 93-99 (2024).
  14. Merrill, A. E., et al. Ciliary abnormalities due to defects in the retrograde transport protein dync2h1 in short-rib polydactyly syndrome. Am J Hum Genet. 84 (4), 542-549 (2009).
  15. Dagoneau, N., et al. Dync2h1 mutations cause asphyxiating thoracic dystrophy and short rib-polydactyly syndrome, type iii. Am J Hum Genet. 84 (5), 706-711 (2009).
  16. Majumder, S., Fisk, H. A. Vdac3 and mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12 (5), 849-858 (2013).
  17. Briscoe, J., Therond, P. P. The mechanisms of hedgehog signalling and its roles in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (7), 416-429 (2013).
  18. Placzek, M., Briscoe, J. Sonic hedgehog in vertebrate neural tube development. Int J Dev Biol. 62 (1-2-3), 225-234 (2018).
  19. Wong, S. Y., et al. Primary cilia can both mediate and suppress hedgehog pathway-dependent tumorigenesis. Nat Med. 15 (9), 1055-1061 (2009).
  20. Deshpande, I., et al. Smoothened stimulation by membrane sterols drives hedgehog pathway activity. Nature. 571 (7764), 284-288 (2019).
  21. Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary g-protein-coupled receptor gpr161 negatively regulates the sonic hedgehog pathway via camp signaling. Cell. 152 (1-2), 210-223 (2013).
  22. Niewiadomski, P., et al. Gli protein activity is controlled by multisite phosphorylation in vertebrate hedgehog signaling. Cell Rep. 6 (1), 168-181 (2014).
  23. Kovacs, J. J., et al. Beta-arrestin-mediated localization of smoothened to the primary cilium. Science. 320 (5884), 1777-1781 (2008).
  24. He, M., et al. The kinesin-4 protein kif7 regulates mammalian hedgehog signalling by organizing the cilium tip compartment. Nat Cell Biol. 16 (7), 663-672 (2014).
  25. Wen, X., et al. Kinetics of hedgehog-dependent full-length gli3 accumulation in primary cilia and subsequent degradation. Mol Cell Biol. 30 (8), 1910-1922 (2010).
  26. Griffiths, S. C., et al. Hedgehog-interacting protein is a multimodal antagonist of hedgehog signalling. Nat Commun. 12 (1), 7171(2021).
  27. Gomez, A. E., Christman, A. K., Van De Weghe, J. C., Finn, M., Doherty, D. Systematic analysis of cilia characteristics and hedgehog signaling in five immortal cell lines. PLoS One. 17 (12), e0266433(2022).
  28. Schmidt, S., et al. Primary cilia and shh signaling impairments in human and mouse models of parkinson's disease. Nat Commun. 13 (1), 4819(2022).
  29. Dutta, A., et al. Increase in primary cilia number and length upon vdac1 depletion contributes to attenuated proliferation of cancer cells. Exp Cell Res. 429 (2), 113671(2023).
  30. De, K., et al. Hyperphosphorylation of cdh1 in glioblastoma cancer stem cells attenuates apc/c(cdh1) activity and pharmacologic inhibition of apc/c(cdh1/cdc20) compromises viability. Mol Cancer Res. 17 (7), 1519-1530 (2019).
  31. Yang, S., Zheng, X. The immunofluorescence-based detection of hedgehog pathway components in primary cilia of cultured cells. Methods Mol Biol. 2374, 89-94 (2022).
  32. Wang, W., et al. The mir-669a-5p/g3bp/hdac6/akap12 axis regulates primary cilia length. Adv Sci (Weinh). 11 (6), e2305068(2024).
  33. Alanazi, A., et al. Identifying the roles of mir-17 in ciliogenesis and cell cycle. Front Cell Dev Biol. 12, 1397931(2024).
  34. Bustin, S. A., et al. The miqe guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time pcr experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

RPE1Smoothened
Количественный анализ на основе ПЦР для измерения передачи сигналов звукового ежа в клеточной модели цилиогенеза
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.