В исследовании продемонстрирован количественный анализ на основе ПЦР для активации первичного сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH) с использованием агониста SHH в клеточной модели цилиогенеза.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Количественный анализ на основе ПЦР для измерения передачи сигналов звукового ежа в клеточной модели цилиогенеза
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Цилиопатия относится к совокупности мультисистемных и полигенных заболеваний и расстройств человека, которые возникают из-за аберрации структуры или функции подвижных или неподвижных (первичных) ресничек, которые представляют собой выпячивания клеток на основе микротрубочек. Первичные реснички (РПЖ) присутствуют в большинстве эпителиальных и эндотелиальных тканей человека и служат концентратором для передачи физиологических сигналов, включая передачу сигналов звукового ежа (SHH). Различные ситуации требуют изучения функции ФХ, что может быть достигнуто путем измерения канонического сигнального пути SHH, который почти исключительно опосредован ФХ. Здесь разработана методика, основанная на количественной ПЦР (кПЦР), для измерения уровня транскрипции генов пути SHH в покоящихся клетках hTERT-RPE1 (или RPE1), которые в основном содержат PC. Затишье в клетках RPE1 достигается путем сывороточного голодания в течение 48 ч, в то время как активация пути SHH стимулируется определенным агонистом. Этот анализ на основе клеточных культур прост в использовании и чувствителен. Успешная демонстрация этого анализа на реснитчатых клетках RPE1 указывает на его огромный потенциал в качестве анализа in vitro для изучения надлежащей функции РПЖ при генетическом или эпигенетическом изменении одного или нескольких генов, которые могут быть связаны с различными цилиопатиями.
Введение
Ресничка представляет собой выступ на основе микротрубочек и оболоченный мембраной выступ с поверхности клетки, который собран на базальном теле1. У позвоночных животных наблюдаются два типа ресничек, а именно подвижные и неподвижные. Подвижные реснички расположены в специализированных тканях и придают моторику. Неподвижные первичные реснички (РПЖ) присутствуют в большинстве клеток позвоночных, выполняют сенсорные функции и передают критические сигналы из внеклеточной среды внутрь клеток2. После сборки удлинению ресничек способствует механизм внутрижгутикового транспорта (IFT), который п....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Культура клеток
- Проведите почти сливающуюся колбу с клеточными культурами Т-25 с клетками RPE1 в соотношении 1:5 от исходной культуры в свежую колбу для клеточной культуры Т-25, содержащую 5 мл модифицированной среды Игла (DMEM) Дульбекко с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 1% пенициллин-стрептомициновой смеси (конечная концентрация - 100 Ед/мл пенициллина G и 100 мкг/мл стрептомицина). Эта среда называется полной средой. Выращивайте клетки при 37 °C в присутствии 5%CO2.
Клетки RPE1 являются нетрансформированными клетками, обычно используемыми для изучения ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Активация ПК-опосредованного пути передачи сигнала SHH — это способ понять правильное функционирование ПК7. В данном случае относительная экспрессия генов-мишеней пути SHH измеряется с помощью анализа RT-qPCR при SAG-опосредованной активации пути SHH в клетках RPE1, которые в основном реснитчатые. Прямые транскрипционные выходы пути SHH GLI1 и PTCH1 часто используются для измерения активности этого пути11. Этот протокол также включает в себя транскрипт HHIP, который регулир.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Изучение функциональности ПК является важным шагом на пути к пониманию динамики образования и заболеваний или расстройств, связанных с дисфункцией РПЖ. Помимо изучения инфузории путем иммуноокрашивания на цилиарные маркеры или структурные компоненты ресничек, меченные флуорофорами, функцию РПЖ обычно определяют путем анализа канонической активации пути SHH путем измерения ресничной транслокации Smo в тканях и клетках с помощью флуоресцентной микроскопии27,31<.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа поддерживается стипендией Рамалингасвами для SM от Департамента биотехнологии (DBT) правительства Индии и исследовательским грантом от Совета по научным и инженерным исследованиям (SERB) правительства Индии для SM (CRG/2020/004042). Стипендия PH спонсируется Университетской комиссией по грантам (UGC) правительства Индии. Авторы искренне благодарят д-ра Чандраму Мукерджи и г-на Авика Мукерджи из лаборатории RNABio Института медицинских наук Президентского университета за доступ к инструменту для количественной ПЦР и обучение работе с этим инструментом соответственно.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| ДМСО, стерильный фильтрованный | Sigma | D2650 | |
| Осел, антимышиный IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A21202 | |
| Осел, антикролик IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | ThermoFisher Scientific | A10042 | |
| модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 41965039 | |
| Фосфатно-солевой буфер Dulbecco (DPBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Himedia | RM1112 | |
| с 60-кратным объективом | Carl Zeiss | Axio observer colibri 5 | |
| hTERT-RPE1 клетки | ATCC | CRL-4000 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
| мыши, моноклональное антитело к ацетилированному тубулину | Milipore Sigma-Aldrich | T7451 | Окончательное разведение 1:1000 |
| Пенициллин-стрептомицин, 100X | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Количественная ПЦР-машина, CFX 96 | Bio-Rad Laboratories | ||
| Кролик, поликлональное антитело Arl13B | ProteinTech | 17711-1-AP | Окончательное разведение 1:250 |
| Кролик, поликлональное антитело Cep135 | ProteinTech | 24428-1-AP | Окончательное разведение 1:500 |
| SlowFade gold Antifade moutant | ThermoFisher Scientific | S36940 | |
| Smoothened Агонист (САГ) | Abmole | M4865 | Стоковый раствор: в ДМСО, 5 мМ |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725271 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| TrypLE | Gibco, ThermoFisher Scientific | 12605028 |
Ссылки
- Nigg, E. A., Raff, J. W. Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease. Cell. 139 (4), 663-678 (2009).
- Halder, P., Khatun, S., Majumder, S. Freeing the brake: Proliferation needs primary cilium to disassemble. J Biosci. 45, 117(2020).
- Eguether, T., ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
