Методическая статья

Активная иммунизация для индуцирования аутоиммунной мышечно-специфической киназы (MuSK) миастении у мышей

DOI:

10.3791/67408

⸱

3 июля 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Aziz Sancar Institute of Experimental Medicine, Istanbul University, 2Department of Immunology, Hellenic Pasteur Institute

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье представлен комплексный протокол экспериментальной мышиной модели аутоиммунной мышечно-специфической киназы (MuSK) миастении, направленный на изучение патофизиологии и потенциальных терапевтических стратегий для этого заболевания.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Миастения (МГ) — это аутоиммунное заболевание, поражающее нервно-мышечное соединение. В то время как у большинства пациентов с МГ вырабатываются аутоантитела против ацетилхолинового рецептора (AChR), у подгруппы пациентов проявляются аутоантитела, нацеленные на мышечно-специфическую киназу (MuSK). MuSK MG характеризуется выраженной мышечной слабостью, резистентными к лечению клиническими проявлениями и миастеническими кризами, часто требующими искусственной вентиляции легких. Следовательно, пациентам часто требуется длительное применение иммунодепрессантов, что связано с долгосрочными побочными эффектами. Учитывая тяжесть и редкость MuSK-MG, разработка экспериментальной модели на животных имеет решающее значение для продвижения новых методов лечения и более глубокого понимания лежащих в основе патофизиологических механизмов. Экспериментальная аутоиммунная миастения (EAMG) служит животной моделью для MuSK-MG, эффективно, но частично имитируя клинические и иммунологические особенности человеческого MG. Индукция аутоиммунных животных моделей может быть достигнута с помощью активной или пассивной иммунизации. В представленном здесь экспериментальном протоколе активная иммунизация проводилась путем подкожного введения очищенного внеклеточного домена человеческого MuSK, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда с убитой теплом микобактерией туберкулеза. Иммунизация проводилась в четырех центрах с последующей бустерной инъекцией MuSK на 28-е сутки. Этот адъювант с M. tuberculosis обеспечивает активацию иммунной системы через TLR4 и усиленный фагоцитоз вводимого антигена. В этой статье подробно описывается разработка и характеристика MuSK-EAMG от начала до завершения.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Миастения (МГ) — это аутоиммунное заболевание, которое развивается через Т-клеточно-зависимые, опосредованные антителами механизмы. В первую очередь это вызвано антителами против никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (AChR) на постсинаптической мембране нервно-мышечного перехода (NMJ) у 80-85% пациентов и антителами против мышечно-специфической киназы (MuSK) примерно у 5% пациентов, а также других белков NMJ. МГ стал прототипом аутоиммунных расстройств и моделью для понимания постсинаптической функции1. Животные модели аутоиммунных расстройств можно разделить на две основные категории: (1) спонтанные модели, в которых у животных естественным образом развивается аутоиммунное заболевание, и (2) индуцированные модели, в которых аутоиммунное заболевание искусственно имитируется и воспроизводится. Исследования миастении (МГ) показали, что как активная, так и пассивная иммунизация может вызывать заболевание, что вносит значительный вклад в понимание антитело-опосредованных состояний2.

Пассивный перенос является высокоэффективным методом оценки острых эффектов аутоантитело-опосредованных заболеваний и широко используется для изучения антител, полученных от пациента, в МГ. Этот подход оказался полезным для расширения понимания иммунологических факторов, лежащих в основе заболевания. Например, исследования пассивного переноса показали патогенетическое влияние анти-MuSK IgG4 на снижение кластеров AChR3. Тем не менее, существуют некоторые ограничения модели пассивного переноса, такие как функциональные различия между IgG человека и грызуна и иммунной системой, а также недостаточность модели пассивного переноса для имитации начальных механизмов активации аутоиммунитета анти-MuSK, происходящего в лимфоидных тканях.

С другой стороны, потенциальным ограничением исследований иммунизации является иммуногенетическая изменчивость среди различных линий мышей4. Например, в то время как мыши C57BL/6 (B6) чувствительны к активной иммунизации AChR, мыши AKR/J устойчивы. Поэтому при создании животной модели EAMG крайне важно правильно выбрать вид животного, метод иммунизации и содержание протокола, чтобы точно отразить болезнь5.

Кроме того, использование целевого антигена в качестве цельного белка часто приводит к высоким титрам антител. Однако не все антитела могут вступать в перекрестную реакцию с антигеном мыши или образовывать болезнетворные эпитопы. Поэтому модели активной иммунизации не всегда точно отражают патологию человека. Тем не менее, когда они успешно создают соответствующий клинический и физиологический фенотип, эти модели обеспечивают долгосрочную платформу для тестирования экспериментальных методов лечения.

Клинические исследования указывают на дивергентные механизмы заболевания и терапевтические требования к MuSK-MG, подчеркивая необходимость дальнейшей идентификации специфических патогенетических особенностей этого подтипа МГ 4,5,6. Предыдущие исследования MuSK EAMG, основанные на активной иммунизации, показали преобладающее участие иммунитета типа Th2 и антимышиного IgG1 в аутоиммунитете MuSK и определили ряд потенциальных методов лечения (например, терифлуномид, мезенхимальные стволовые клетки, FCRLB shRNA) для человеческого MuSK MG 7,8,9. Это продемонстрировало значимость модели MuSK EAMG в тестировании новых терапевтических мишеней и исследовании патофизиологии MuSK MG.

В этой статье подробно описаны процедуры индукции животной модели, мониторинга прогрессирования заболевания и валидации индукции EAMG. Клиническая оценка включала в себя мониторинг веса, осанки, силы хвата и клинических баллов наблюдателем. Мышей усыпляли через 28 дней после второй иммунизации, и для подтверждения установления заболевания были собраны различные ткани, включая кровь, мышцы задних конечностей, селезенку, подмышечные и паховые лимфатические узлы. Антитела к MuSK количественно определяли в сыворотках крови методом ИФА. Кроме того, проводилось иммунофлуоресцентное окрашивание мышечных тканей для визуализации отложений в нервно-мышечном соединении. Чтобы продемонстрировать и сравнить клинические и иммунные ответы в группах мышей с различной восприимчивостью к MuSK EAMG, мыши, получавшие шРНК KCNS3, показали провоспалительное действие (не опубликовано), а шРНК FCRLB продемонстрировала противовоспалительноедействие9, как было определено в предыдущих исследованиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол был одобрен Местным комитетом по этике экспериментов на животных Стамбульского университета (HADYEK) за номером 2020/29. В наших предыдущих исследованиях 7,8,9 модель EAMG индуцировалась у 8-10-недельных мышей BALB/c или B6 путем активной иммунизации белком MuSK. В данной статье представлены примерные данные, полученные в различных экспериментах с использованием мышей, иммунизированных MuSK BALB/C (4-8 мышей в группе). Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

1. Производство и подготовка MuSK человека к иммунизации

  1. Клонировать аминокислоты 24-495 внеклеточного домена MuSK человека (референсная последовательность NCBI: NP_005583.1) в вектор pPIC9.
  2. Экспрессия секрета в системе дрожжей Pichia pastoris (штамм GS115).
  3. Индуцирование экспрессии путем добавления метанола (2,5% v/v) в питательную среду.
  4. Добавьте С-клемму 6xHIS метку для очистки.
  5. Экспрессируйте белок в виде секретируемого гликозилированного белка и очищайте его в нативных условиях. Диализ питательной среды проводят против 50 мМ фосфатного буфера pH 8,0, 300 мМ NaCl.
  6. Продолжайте проводить никель-ионную аффинную хроматографию с использованием Ni2+/нитрилотриацетата агарозы (Ni-NTA). Хранить очищенный белок после добавления 10% глицерина при температуре -80 °С, где он стабилен не менее двух лет10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Уровни экспрессии, оцениваемые после очистки Ni-NTA, составляют примерно 0,4 мг/л культуры. Других белковых примесей в образцах, проанализированных с помощью SDS-PAGE, обнаружено не было.
  7. Перед иммунизацией проверьте чистоту изолированного внеклеточного домена белка MuSK с помощью гель-электрофореза (дополнительный рисунок 1).
  8. Приготовьте MuSK для каждой мыши в концентрации 45 мкг/100 мкл PBS.
  9. Гомогенизировать (эмульгировать) MuSK в соотношении 1:1 с PBS (100 μL) и полным адъювантом Фрейнда (CFA-100 μL), содержащим Mycobacterium tuberculosis H37Ra (10 мг/10 мл) (общий объем эмульсии составляет 200 μл на одну мышь).

2. Процедура анестезии и иммунизации

  1. Перед иммунизацией разведите пропофол в PBS (соотношение 1:5).
  2. Вводите внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг на мышь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изофлуран также можно использовать для ингаляционной анестезии (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Начальная концентрация обычно устанавливается на уровне 3%-5% при расходе кислорода 1-2 л/мин, в то время как поддерживающая концентрация обычно составляет 1%-3% при расходе кислорода 0,5-1 л/мин.
  3. Первая иммунизация: Введите в общей сложности 45 мкг/200 мкл приготовленного препарата MuSK в ЦФА подкожно в плечи и внутренние задние лапы (примерно 11,25 мкг/50 мкл на каждую часть).
  4. Вторая иммунизация: Введите в общей сложности 45 мкг/200 мкл приготовленного препарата MuSK в КФА подкожно в плечи и бедра (примерно 11,25 мкг/50 мкл на каждую часть).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вводите инъекции дважды с интервалом в 28 дней, чтобы установить модель. Внутримышечное введение связано с мышечной болью, что может помешать оценке клинической слабости. Поскольку EAMG является мышечным заболеванием, использование внутримышечной инъекции может вызвать немиастеническую слабость, связанную с болью, и, таким образом, действовать как искажающий фактор. Рекомендуется контрольная группа, иммунизированная только CFA (без MuSK).

3. Клиническая оценка

  1. Тренируйте мышей, осторожно перетаскивая их 40 раз по верхней решетке клетки, когда они пытаются ухватиться за сетку, чтобы вызвать усталость, поскольку симптомы миастении у мышей становятся более выраженными после физических упражнений и усталости.
  2. После тренировки внимательно наблюдайте за мышами на предмет изменений в активности, весе и мышечной силе. На основе этих наблюдений назначьте соответствующие баллы, которыми можно руководствоваться при определении критериев оценки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка 0: Мыши остаются активными и продолжают исследовать окружающую среду; Балл 1: После физических упражнений наблюдается сгорбленная поза, но мыши возвращаются к нормальной активности и общительности. В целом поддерживается уход за шерстью. Балл 2: Сгорбленная осанка видна еще до тренировки и становится более выраженной после тренировки. Отмечается снижение самостоятельности и активности. Оценка 3: Драматическая сгорбленная поза наблюдается до и после тренировки. Отмечается значительное снижение подвижности, общительности и мышечной силы, сопровождающееся потерей веса на 1-2 грамма каждые 2-3 дня. Происходит обезвоживание, что затрудняет мышам доступ к воде и пище. Обезвоживание определяется тем, что кожа не восстанавливается быстро после защемления и изменениями в кале. Для мышей при боли характерно прищуривание и сгорбленная осанка. Мышей с признаками сильной боли и потерей веса, превышающей 20%, приносят в жертву. Оценка 4: Мышь найдена мертвой в клетке. Умершую мышь следует немедленно удалить, а клетку поменять5.
  3. Ежедневно проверяйте мышей, так как симптомы быстро прогрессировали примерно через 10 дней после второй иммунизации. Выполняйте клиническую оценку и измерения еженедельно в течение первых 28 дней, а затем два раза в неделю.
  4. Выполните измерение веса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение веса является важным параметром для отслеживания прогрессирования заболевания. Из-за высокой скорости метаболизма у мышей масса тела может значительно варьироваться. Важно использовать одну и ту же шкалу для всех измерений и проводить эти измерения в одно и то же время суток для обеспечения согласованности.
  5. Выполните измерение мышечной силы. Используйте горизонтальный динамометр с сетчатой проволокой для измерения мышечной силы.
    1. Тренируйте мышей для клинической оценки, осторожно протащив их по клетке 40 раз, чтобы вызвать усталость.
    2. Сразу же поместите каждую мышку на сетку динамометра и аккуратно потяните за хвост, следя за тем, чтобы все лапы крепко держались за сетку. Рассматривайте только те измерения, где мыши захватывают сетку всеми четырьмя лапами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь прикладывать одинаковое количество силы во время каждого измерения, и рекомендуется, чтобы один и тот же исследователь проводил все измерения для поддержания надежности и снижения вариабельности. Поскольку утомляемость является отличительной чертой слабости MG, серию тестов на прочность хвата следует проводить без измерения силы хвата. После этого было проведено семь измерений для каждой мыши, а максимальные и минимальные значения были отброшены. Среднее значение остальных пяти измерений рассчитывается для обеспечения надежных результатов.

4. Подготовка образца ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: Умерщвляйте мышей через 28 дней после второй иммунизации в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами. Сбор крови, мышц, селезенки и лимфатических узлов у убитых мышей будет полезен для дальнейших исследований.

  1. Забор сердечной крови
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы собрать сердечную кровь, обезболите мышей с помощью соответствующего анестетика (например, пропофола), одобренного этическим комитетом. Пункция сердца требует анестезии и является терминальной процедурой, что означает, что животные должны быть усыплены сразу после нее.
    1. После глубокой анестезии крысы положите ее на спину, вскройте брюшную полость и найдите сердце, примерно на 1 см выше самого нижнего ребра и немного правее.
    2. С помощью иглы 25-35 G осторожно набирайте кровь из левого желудочка под углом 45 градусов, не перемещая шприц, чтобы избежать осложнений11.
    3. Переложите образцы крови в сухие пробирки для разделения сыворотки и/или в пробирки ЭДТА для выделения РНК - если это планируется.
    4. Отделите сыворотку центрифугированием и держите образцы сыворотки при температуре -20 °C до тех пор, пока она не будет использована.
  2. Консервация и подготовка мышечного образца
    1. Соберите переднюю большеберцовую мышцу 11,12,13. Промойте ледяным PBS.
    2. Поместите образцы в криопробирки, немедленно погрузите в охлажденный жидким азотом изопентан при температуре -20 °C и храните в морозильной камере при температуре -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны быть заморожены для получения более точных результатов в экспериментах.
    3. Поместите ткани вертикально на режущее крепление; Можно использовать пробку. Внедрите образцы для иммунофлуоресцентного окрашивания в состав OCT (Optimal Cutting Temperature compound).
    4. Дайте ткани всплыть на жидком изопентане, охлажденном азотом. Хранить в морозильной камере при температуре -80 °C до разрезания с помощью криостата.

5. Оценка нервно-мышечных соединений с помощью иммунофлуоресцентного мечения

  1. Секционирование и фиксация криостата
    1. Разрез замороженных тканей, введенных в ОКТ, при -24 °C до толщины 7 мкм с помощью криостата.
    2. Зафиксируйте секции в ацетоне, охлажденном до -20 °С. Промыть с PBS в течение 5 минут.
    3. Снова промойте PBS, содержащий 0,4% Triton X (PBS-T) в течение 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этап пермеабилизации может быть выполнен для коррекции конформации молекул, затронутых фиксацией, обеспечивая более точное связывание. Пермеабилизация включала обработку PBS, содержащим 1% FBS, в течение 10 мин и PBS-T в течение еще 10 мин.
    4. Заблокируйте участки PBS-T, содержащим 10% FBS, на 30 минут, чтобы предотвратить неспецифическое связывание.
  2. Иммунофлуоресцентное окрашивание
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для окрашивания могут быть использованы следующие антитела: C3, IgG, маркер ацетилхолиновых рецепторов α-бунгаротоксин.
    1. Разведите выбранные антитела в PBS-T, содержащем 1% FBS.
    2. Выдерживать в темноте при комнатной температуре в течение 2,5 ч.
    3. Промойте секции PBS-T, содержащим 1% FBS.
    4. Контрокрашивание с помощью DAPI.
    5. Храните срезы до исследования под флуоресцентным микроскопом в темноте и влажности при температуре 4 °C.
    6. Выполнение визуализации и анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Бунгаротоксин (BTX)-положительные нервно-мышечные соединения в каждом отделе следует подсчитывать с помощью флуоресцентного микроскопа. Снимайте изображения с 20-кратным увеличением. Для анализа BTX и C3 или IgG-положительные нервно-мышечные соединения подсчитывали вручную под микроскопом. Для анализа следует использовать процент двойных положительных переходов по отношению к общему количеству BTX-меченых соединений в последовательных секциях.

6. Вестерн-блот

  1. Выделение и количественное определение белка
    1. Используйте образцы мышц, которые были заморожены.
    2. Приготовьте буфер для лизиса с ингибиторами протеазы и фосфатазы.
    3. Добавьте 0,5 мм гранул оксида циркония, равных весу образца и в 2 раза больше объема буфера для лизиса.
    4. Гомогенизация образцов с помощью гомогенизатора.
    5. Центрифуга лизат при 12 000 x g в течение 15 мин при 4 °C.
    6. Соберите надосадочную жидкость, содержащую лизат белка.
    7. Используйте набор для анализа BCA или реагент Брэдфорда для количественного определения концентрации белка.
    8. Подготовьте образцы белка до нужной концентрации с помощью буфера для лизиса. Белок 25 мкг на лунку эффективен для выявления АЧР.
  2. Гель-электрофорез SDS-PAGE
    1. Смешайте образцы белка с 4-кратным буфером Laemmli.
    2. Нагрейте образцы до 95 °C в течение 5 минут для денатурации.
    3. Загрузите равное количество белка и белковую лестницу в лунки геля SDS-PAGE.
    4. Запустите гель при напряжении 200 В в течение 30 минут (время может варьироваться в зависимости от источника питания).
  3. Перенос белка
    1. Для полусухого переноса с нитроцеллюлозной мембраной смочите каждый компонент с помощью буфера для холодного переноса.
    2. Установите сэндвич для переноса: губка, фильтровальная бумага, гель, мембрана, фильтровальная бумага, губка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что между слоями нет пузырьков. Программа переноса должна быть выбрана в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
  4. Блокирование и инкубация антител
    1. Заблокируйте мембрану в 5% обезжиренном сухом молоке или BSA в TBST на 1 ч при комнатной температуре с легким покачиванием.
    2. Инкубировать мембрану с первичным антителом (анти-AChR), разведенным в 2,5% блокирующем буфере, в течение ночи при температуре 4 °C с легким покачиванием.
    3. Промойте мембрану 3 раза по 10 мин каждый в TBST.
    4. Инкубируют мембрану с HRP-конъюгированным вторичным антителом (IgG HRP), разведенным в 2,5% блокирующем буфере в течение 1 ч при комнатной температуре.
    5. Промойте мембрану 3 раза по 10 мин каждый в TBST.
  5. Обнаружение и визуализация
    1. Нанесите на мембрану подложку ECL в соответствии с инструкцией производителя.
    2. Захват хемилюминесцентного сигнала с помощью системы визуализации.
    3. Анализируйте каналы с помощью программного обеспечения для обработки изображений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите белки и реагенты на льду, чтобы предотвратить разложение. Обеспечьте равномерную нагрузку, запустив в качестве контроля вспомогательный белок (например, бета-актин, альфа-тубулин или GAPDH). Оптимизируйте концентрацию антител и время инкубации для достижения наилучших результатов. Демонстрация того, что белок AChR менее экспрессируется у мышей, иммунизированных MuSK, имеет решающее значение.

7. Самодельный анти-MuSK IgG ИФА

  1. Приготовьте антиген MuSK в концентрации 0,5 мкг на лунку в 100 мкл карбонатного бикарбонатного буфера (Plate Coating).
  2. Дозируйте по 100 мкл раствора антигена в каждую лунку иммуноферментного планшета.
  3. Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 4 °C.
  4. Вымойте пластину PBS, содержащим 0,5% Tween 20 (моющий раствор).
  5. Инкубируйте планшет с PBS, содержащим 5% FBS (блокирующий раствор) в течение 90 минут при 4 °C для блокирования неспецифических сайтов связывания (блокировка).
  6. Поскольку исследования по оптимизации показали высокие уровни MuSK-IgG, разведите образцы сыворотки в 1/50 000 в блокирующем растворе.
  7. Не промывая после закупорки, добавьте разведенные образцы сыворотки в лунки.
  8. Инкубируйте пластину при температуре 37 °C в течение 90 минут.
  9. Вымойте тарелку трижды моющим раствором.
  10. Разведите HRP-конъюгированное антимышиное вторичное антитело IgG (ab97023) 1/5000 в блокирующем растворе.
  11. Добавьте по 100 мкл разведенного вторичного антитела в каждую лунку.
  12. Инкубируйте пластину при температуре 37 °C в течение 90 минут.
  13. Вымойте тарелку трижды моющим раствором.
  14. Добавьте по 100 мкл субстрата TMB в каждую лунку и наблюдайте за изменением цвета.
  15. Остановите реакцию в подходящее время с помощью 2 М Н2СО4.
  16. Измерьте оптическую плотность на длине волны 450 нм с помощью спектрофотометра.
  17. Выполняйте все образцы в двух экземплярах и на одной и той же пластине для согласованности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа следует использовать значения оптической плотности, так как стандартные разведения образцов недоступны. В отрицательных контрольных лунках (пустых) не должно быть изменения цвета. Ожидается быстрое изменение цвета, поэтому стоп-раствор следует держать рядом, чтобы немедленно остановить реакцию в лунках.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При оценке и валидации экспериментальной модели аутоиммунной миастении (EAMG) MuSK несколько ключевых параметров и экспериментальных результатов имеют решающее значение для демонстрации успешной индукции и характеристики модели заболевания. Ниже приведены репрезентативные результаты, которые подтверждают создание модели MuSK EAMG.

Клиническая оценка
Мыши контролируются и оцениваются на клинические симптомы миастении с использованием стандартизированной клинической системы о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мышиный MuSK-EAMG имитирует человеческий MuSK-MG как в клинических, так и в иммунопатогенетических аспектах с точки зрения мышечной слабости, потери веса из-за бульбарной мышечной слабости, циркулирующих анти-MuSK антител и снижения мышечного AChR. Что касается основных этапов и предполагаемых сроков для этой модели MuSK-EAMG, клинические признаки мышечной слабости должны появиться в течение первой недели после второй иммунизации. Примерно у 5% мышей после первой иммунизации могут развит...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Никаких разглашений, о которых можно было бы декларировать, нет.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы выразить признательность за поддержку и вклад Института медицинских наук Стамбульского университета и Института экспериментальной медицины Азиза Санджара в завершение этого исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
125I-α-бунгаротоксинInvitrogenBTX T1175
2-метилбутанSigma-AldrichM32631
40 μ m Сетчатый фильтрNEST258369
96 лунок Maxisorp пластинаSigma-AldrichM9410
Адъювант неполногоBecton Dickinson & Co. 263910
Анти-АХР альфа1 AlomoneANC-001
Anti-mouse IgG HRPAbcamab97023
Пуле-блендер StormNext AdvanceГомогенизатор
тканей C3NovusNB200-540G
Карбонатно-бикарбонатный буферMerckC3041
CryostatLeicaCM1860 
Динамометр Imada DST-50NMuromachiMK380Si
Флуоресцентный микроскопLeicaDM4M
Стеклянный шприц с люэровским замкомISOLAB094.92.005
IgGAbcamab96871
Микропланшетный фотометр, Multiskan FCThermo Scientific51119000
Мышиный хирургический наборKent Scientific CorparationINSMOUSEKIT
Mycobacterium tuberculosis H37RaBecton Dickinson & Co. 
Шприцы OCT CompoundAgar ScientificAGR1180
, 1 млBecton Dickinson & Co. 
Шприцы, 2 млB. Braun7389
Универсальный удерживающий устройство для животныхMerckZ756911-1EA
WesternBright Sirius-Western набор для обнаружения блоттингаAdvanstaK-12043-D10ECL
231141309625

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Keesey, J. A. A history of treatments for myasthenia gravis. Semin Neurol. 24, 5-16 (2004).
  2. Giannoccaro, M. P., Wright, S. K., Vincent, A. In vivo mechanisms of antibody-mediated neurological disorders: Animal models and potential implications. Front Neurol. 10, 1394(2020).
  3. Verschuuren, J. J. G. M., Plomp, J. J. Passive transfer models of myasthenia gravis with muscle-specific kinase antibodies. Ann N Y Acad Sci. 1413 (1), 111-118 (2018).
  4. Berman, P. W., Patrick, J. Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis. J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).
  5. Kusner, L. L., et al. Guidelines for pre-clinical assessment of the acetylcholine receptor-specific passive transfer myasthenia gravis model-recommendations for methods and experimental designs. Exp Neurol. 270, 3-10 (2015).
  6. Koneczny, I., et al. IgG4 autoantibodies in organ-specific autoimmunopathies: Reviewing class switching, antibody-producing cells, and specific immunotherapies. Front Immunol. 13, 834342(2022).
  7. Ulusoy, C., et al. Dental follicle mesenchymal stem cell administration ameliorates muscle weakness in MuSK-immunized mice. J Neuroinflammation. 12, 231(2015).
  8. Yilmaz, V., et al. Effects of teriflunomide on B cell subsets in MuSK-induced experimental autoimmune myasthenia gravis and multiple sclerosis. Immunol Invest. 50 (6), 671-684 (2021).
  9. Koral, G., et al. Silencing of Fcrlb by shRNA ameliorates MuSK-induced EAMG in mice. J Neuroimmunol. 383, 578195(2023).
  10. Trakas, N., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. J. Development of a highly sensitive diagnostic assay for muscle-specific tyrosine kinase (MuSK) autoantibodies in myasthenia gravis. J Neuroimmunol. 240-241, 79-86 (2011).
  11. JoVE, Science Education Database. Blood withdrawal I. JoVE Sci Educ. , (2023).
  12. Peretti, A. L., et al. Action of vanillin (Vanilla planifolia) on the morphology of tibialis anterior and soleus muscles after nerve injury. Einstein (Sao Paulo). 15 (2), 186-191 (2017).
  13. Van Der Meulen, J. H., Kuipers, H., Stassen, F. R., Keizer, H. A., Van Der Vusse, G. J. High energy phosphates and related compounds, glycogen levels and histology in the rat tibialis anterior muscle after forced lengthening and isometric exercise. Pflugers Arch. 420 (3-4), 354-358 (1992).
  14. Kucukerden, M., et al. MuSK-induced experimental autoimmune myasthenia gravis does not require IgG1 antibody to MuSK. J Neuroimmunol. 295-296, 84-92 (2016).
  15. Ulusoy, C., et al. Preferential production of IgG1, IL-4 and IL-10 in MuSK-immunized mice. Clin Immunol. 151 (2), 155-163 (2014).
  16. Mori, S., et al. Antibodies against muscle-specific kinase impair both presynaptic and postsynaptic functions in a murine model of myasthenia gravis. Am J Pathol. 180 (2), 798-810 (2012).
  17. Wu, B., Goluszko, E., Huda, R., Tuzun, E., Christadoss, P. Experimental autoimmune myasthenia gravis in the mouse. Curr Protoc Immunol. Chapter 15, Unit 15.23. , (2011).
  18. Klooster, R., et al. Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice. Brain. 135 (Pt 4), 1081-1101 (2012).
  19. Vergoossen, D. L. E., et al. Functional monovalency amplifies the pathogenicity of anti-MuSK IgG4 in myasthenia gravis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (13), e2020635118(2021).
  20. Oh, S., et al. Precision targeting of autoantigen-specific B cells in muscle-specific tyrosine kinase myasthenia gravis with chimeric autoantibody receptor T cells. Nat Biotechnol. 41 (9), 1229-1238 (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MuSK
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи