Визуализация кальция в отдельных клетках для изучения активации ионных каналов кальция

Краткое содержание

В данной статье представлен метод количественного мониторинга концентраций ионов кальция (Ca²⁺) в клетках в режиме реального времени с помощью визуализации Ca²⁺ в одиночных клетках с помощью красителя Fura-2/AM. Этот метод обеспечивает эффективную загрузку красителя и точный расчет уровней^Ca2+ с помощью соотношений интенсивности флуоресценции, что делает его простым и быстрым подходом для исследовательских применений.

Аннотация

Визуализация Ca²⁺ в одиночных клетках имеет важное значение для изучения каналов Ca²⁺ , активируемых различными воздействиями, такими как температура, напряжение, нативное соединение, химические вещества и т. д. В первую очередь он опирается на технологию микроскопии и связанный с ней индикатор Ca²⁺ Fura-2/AM (AM — это аббревиатура от ацетоксиметилового эфира). Внутри клеток Fura-2/AM гидролизуется эстеразами в Fura-2, который может обратимо связываться со свободным цитоплазматическим Ca²⁺. Максимальная длина волны возбуждения смещается от 380 нм до 340 нм (при насыщении Ca²⁺) при связывании. Интенсивность излучаемой флуоресценции количественно связана с концентрацией связанного Ca²⁺. Измеряя соотношение 340/380, можно определить концентрацию Ca²⁺ в цитоплазме, что исключает ошибки, вызванные различиями в эффективности загрузки флуоресцентного зонда среди различных образцов. Эта технология позволяет проводить количественный и одновременный мониторинг изменений^Ca2+ в нескольких клетках в режиме реального времени. Результаты сохраняются в формате ". XLSX» для последующего анализа, который является быстрым и генерирует интуитивно понятные кривые изменений, значительно повышая эффективность обнаружения. С различных экспериментальных точек зрения в этой статье перечислено использование этой технологии для обнаружения сигналов Ca²⁺ в клетках с эндогенными или сверхэкспрессированными белками канала. Между тем, были также показаны и сравнены различные методы активации клеток. Цель состоит в том, чтобы дать читателям более четкое представление об использовании и применении визуализации одиночных клеток Ca²⁺ .

Введение

Ca²⁺ играет решающую роль в передаче клеточного сигнала, регулируя различные клеточные функции, такие как сокращение мышц¹, нервная проводимость², секреция³ и экспрессия генов⁴, тем самым влияя на многочисленные физиологические процессы. Аномальные концентрации Ca²⁺ могут привести к таким заболеваниям, как аритмии⁵, нарушения свертываемости крови⁶ и гормональный дисбаланс⁷. Поэтому изучение механизмов внутриклеточного изменения концентрации^Са2....

Протокол

Экспериментальные методы были одобрены и соответствовали рекомендациям IACUC Университета Цинхуа и Пекинского университета китайской медицины. Этот протокол вводит методы визуализации одиночных клеток Ca²⁺ для различных типов клеток, включая первичные кератиноциты, выделенные из кожи нескольких новорожденных мышей (в течение трех дней после рождения, с однопометниками, рандомизированными по полу, мышами C57BL/6). Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в данном исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка клеток

Результаты

Обнаружение температурной реакции
Первичный кератиноцит
Первичные кератиноциты выделяли от новорожденных мышей и готовили в соответствии с установленными протоколами¹⁰. Эти ячейки были засеяны в 24-луночные планшеты, содержащие стеклянные предметные стекла. После загрузки зонда Fura-2 фокус был скорректирован под микроскопом на длине волны 380 нм для достижения четкой визуализации морфологии клетки, как показано на рисунке 2A. Если зон.......

Обсуждение

Системы визуализации Ca²⁺ для отдельных клеток широко распространены, что позволяет изучать сигналы Ca²⁺ в различных типах клеток, включая кератиноциты, стволовые клетки¹⁶, клетки печени, клетки сердца¹⁷, подоциты¹⁸, иммунные клетки и клеточные линии с гиперэкспрессией белков-мишеней^10,19. Этот метод измеряет изменения и абсолютные значе.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фотоаппарат	Nikon
Capsaicine	Sigma	211275
CL-100 регулятор температуры	Warner Instruments
Циклопиазоновая кислота (CPA)	Sigma	C1530
DG-4 свет	Sutter Instrument Company
Диметилсульфоксид (ДМСО)	Amresco	231
DPBS	Thermofisher	14190144
MetaFluor, Платное программное обеспечение)	Молекулярные приборы:
флуоресцентный микроскоп	Nikon
Fura-2/AM	Invitrogen	F1201
HBSS буфер	Gibco	14175103
HEPES	Sigma	H3375
Липофектамин 3000	Инвитроген	L3000008
плуроновой F-127	Beyotime	ST501
поли-D-лизин	Beyotime	ST508
SC-20 устройство для нагрева/охлаждения с циркуляцией жидкости	Гарвардский аппарат
Источник белого света	Nikon

Программное обеспечение для флуоресцентной визуализации (, , ,