Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Рецептура наноматериалов на основе цинка с использованием экстракта коры Eucommia ulmoides и их ранозаживляющий потенциал

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67416

⸱

27 декабря 2024 г.

 ,  ,  , 
1Biological Experiment Center, School of Life Sciences, Central South University, 2Department of Cell Biology, School of Life Sciences, Central South University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе мы представляем протокол синтеза наночастиц оксида цинка (ZnO) с использованием богатого полиизопреном водного экстракта, полученного из коры дерева Eucommia ulmoides . Ранозаживляющий потенциал, проявляемый синтезированными наночастицами ZnO на эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVECs), оценивали с помощью скретч-анализа, простого, экономически эффективного и эффективного метода.

Аннотация

Водный экстракт из коры Eucommia ulmoides служит богатым источником биологически активных соединений с многочисленными преимуществами для здоровья. Протокол направлен на изучение получения наночастиц оксида цинка (ZnO) с использованием опосредованного корой полиизопрена водного экстракта Eucommia ulmoides . Между тем, предложенный протокол связан с подготовкой ранозаживляющего материала путем облегчения процесса. Кроме того, ранозаживляющий потенциал синтезированных наночастиц (Eu-ZnO-NPs) был оценен с помощью простого анализа царапин на монослое эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC). После 24 ч лечения Eu-ZnO-NP оценивали пролиферацию клеток и миграцию клеток HUVEC. В конце исследования пролиферация и миграция клеток наблюдались в поцарапанном монослое, обработанном различными концентрациями Eu-ZnO-NPs, в то время как в контрольных клетках наблюдалась плохая миграция и скорость пролиферации. Из выбранных концентраций наноматериалы Eu-ZnO с концентрацией 20 мкг/мл показали лучшую миграцию клеток и повышенный потенциал заживления ран.

Введение

Было показано, что лекарственные растения и соединения растительного происхождения обладают многочисленными преимуществами для здоровья1. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) сообщила, что 80% населения мира зависит от традиционных лекарственных растений для оказания первичной медико-санитарной помощи. Китай хорошо известен и популярен благодаря своим практикам традиционной китайской медицины (ТКМ). Сообщалось, что китайские лекарственные травы лечат различные заболевания и используются из-за их биологического потенциала. Лекарственные растения служат резервуарами для биологически активных соединений и выполняют множество терапевтических функций. Для лечения ран также использовались лекарственные растения. Существует несколько типов подходов, применяемых для лечения хронических ран2. Недавнее исследование показало, что лекарственные растения участвуют в процессе заживления ран, обеспечивая благоприятные условия для заживления, свободные от инфекций и ускоряя регенерацию тканей3. Между тем, антибактериальные и противогрибковые свойства биоактивных соединений, присутствующих в лекарственных растениях, могут помочь вылечить раны и ускорить эффективность заживления ран4.

Наноматериалы на основе металлов привлекают внимание благодаря своим биосовместимым и биоразлагаемым свойствам. Eucommia ulmoides, обычно называемая китайским каучуковым деревом, является местным видом Китая. Листья и кора дерева используются в лечебных практиках. Самое главное, что вид растения культивировался в центральных и западных провинциях Китая5. Peng et al.6сообщили, что листья, кора и тычиночные цветы являются съедобными с терапевтическим потенциалом. Кроме того, E. ulmoides служит лучшим источником лигнанов, фенилпропаноидов, иридоидов, флавоноидов, аминокислот и микроэлементов. Кроме того, кора использовалась для различных биомедицинских целей, таких как контроль артериального давления, снижение жира и содействие антиостеропорозу и гипогликемическойактивности. Следовательно, несомненно, доказано, что экстракт коры E. ulmoides имеет давнюю историю в традиционной китайской медицине. Более ранние сообщения предполагали, что природный полимерный полиизопрен богат корой Eucommia ulmoides8. Основываясь на приведенной выше информации, настоящая работа направлена на получение наноматериалов с использованием экстрактов коры Eucommia ulmoides . Комбинация цинка с экстрактом коры является привлекательным выбором для получения наноматериалов. В целом, конечной целью настоящего исследования было создание нового гибридного наноматериала для заживления ран.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед приготовлением экстракта полученный материал коры дважды промывали с использованием деионизированной воды и сушили в затененном месте. Высушенная в тени кора хранилась в герметичном контейнере.

1. Приготовление экстракта коры Eucommia ulmoides

  1. Измельчите кору, собранную с дерева Eucommia ulmoides, на небольшие кусочки с помощью ножниц.
  2. Измельченные материалы коры дважды промыть водой двойной дистилляции.
  3. Высушите кусочки коры при температуре 37 °C в течение 24 часов в затененных условиях.
    1. Отрегулируйте продолжительность процесса сушки в зависимости от количества коры, используемой для исследования. Убедитесь, что кора полностью высохла, прежде чем нарезать кору на мелкие кусочки. Избегайте попадания прямых солнечных лучей.
  4. Переложите 20 г высушенной в тени коры в коническую колбу, содержащую 220 мл стерильной воды двойной дистилляции, и нагрейте до 130 °C в течение 20 минут.
    1. Цвет реакционного раствора меняется на светло-желтый. Изменение цвета раствора происходит через 10 мин. Дайте раствору нагреться еще 10 минут. Отрегулируйте объем воды двойной дистилляции в зависимости от количества образца.
  5. Сырой экстракт, содержащий полиизопрен, хранить при температуре 4 °C для дальнейшего использования. Образование нитевидной структуры свидетельствует о наличии полиизопрена в экстрактах.

2. Биосинтез наночастиц ZnO, опосредованных корой E. ulmoides

  1. Добавьте 1 М дигидрата нитрата цинка Zn (NO3)2 в 50 мл деионизированной воды в коническую колбу объемом 500 мл. Непрерывно перемешивайте с помощью магнитного перемешивания (60 об/мин). Для полного растворения Zn (NO3)2 требуется 30 минут.
  2. Добавьте 15 мл экстракта коры E. ulmoides по каплям в 20 мл 1 М раствора дигидрата нитрата цинка (Zn (NO3)2).
  3. Поместите закрытую реакционную смесь на магнитную мешалку, включите мешалку и вращайте со скоростью (60 об/мин) в течение 3 часов.
  4. Добавьте 1 Н раствор гидроксида натрия NaOH (3 мл) по каплям в реакционную смесь, чтобы довести pH до 9. Добавляйте NaOH до тех пор, пока смесь раствора не станет молочно-белой и pH не будет больше 9. Раствор приобретает молочно-белый цвет при образовании наночастиц ZnO.
    1. Объем приготовления 1 М раствора дигидрата нитрата цинка Zn (NO3)2 может варьироваться в зависимости от экспериментальных потребностей. Обязательно используйте свежеприготовленные экстракты коры. Если pH превышает 10, это приведет к агрегации наночастиц.
  5. Перенесите синтезированные Eu-ZnO-NP в центрифужную пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте ее при 100 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Загрязнений можно избежать путем немедленной промывки.
  6. Соберите промытые Eu-ZnO-NP в стеклянную тарелку и высушите их при температуре 45-50 °C в течение 1 часа в духовке с горячим воздухом.
    Примечание: Если Eu-ZnO-NP хранятся более 30 минут, это может повлиять на физико-химическую природу наночастиц

3. Подтверждение размера с помощью ПЭМ

  1. Приготовьте 1 мг/мл наночастиц в DDH2O и загрузите 5 мкл образца Eu-ZnO-NP в медную сетку и дождитесь полного высыхания. Проведите вихревую обработку образца перед загрузкой на медную сетку.
  2. Загрузите медную сетку, содержащую Eu-ZnO-NP, в держатель образца TEM и получите изображения с 50-кратным и 100-кратным увеличением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе сетки необходимо подбирать с помощью пинцета.

4. Оценка цитотоксичности

  1. Высадите 1 ×10 4 HUVEC в каждую лунку 96-луночного планшета и поместите его в инкубатор с 5% CO2 37 °C.
  2. Добавьте 10 мкл различных концентраций 0, 10, 20, 30, 40 и 50 мкг/мл Eu-ZnO-NP в 90% сливающихся клеток и инкубируйте в течение 24 ч.
  3. После инкубации удалите старую среду, не потревожив клетки, добавьте по 10 мкл раствора CCK-8 в каждую лунку, содержащую 90 мкл свежей среды DMEM, и инкубируйте в инкубаторе с 5% CO2, 37 °C.
  4. Измерьте поглощение клеток, обработанных раствором CCK8, на длине волны 450 нм с помощью спектрофотометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Абсорбция была измерена немедленно в течение 15 минут, чтобы избежать изменений абсорбции.

5. Подготовка клеток HUVEC к скретч-анализу

  1. Засейте соответствующее (1 ×10 5) количество HUVEC в 12 луночных культуральных планшетах, содержащих модифицированную среду Dulbecco Eagle с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% перьевым стрептококком, и инкубируйте его в инкубаторе с 5% CO2 37 °C.
    1. Перед проведением анализа царапин проверьте слияние с помощью инвертированного микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения анализа царапин будут использоваться 6 луночных планшетов или 12 планшетов в зависимости от требований, а плотность клеток будет варьироваться для разных культуральных планшетов. Использование 70%-80% сливающихся клеток является идеальным и рекомендуется для анализа царапин. Объем среды DMEM может варьироваться в зависимости от используемых в исследовании культуральных планшетов. Например, для 6-луночных планшетов требуется 1-1,5 мл питательной среды, а для 12-луночных планшетов требуется 0,5-1,0 мл питательной среды.
  2. Аккуратно сделайте царапину стерильным наконечником пипетки объемом 200 мкл в репрезентативной ране с шириной раны 200 мкм.
  3. Следите за тем, чтобы наконечник, используемый для нанесения царапин на монослое ячеек, соприкасался с поверхностью ячеек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз при нанесении царапины используйте стерильный наконечник.
  4. Удалите всю среду и промойте монослой HUVEC, используя 1 мл 1x PBS для удаления отделенных клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что отделенные монослойные ячейки полностью удалены из соответствующих лунок. Убедитесь, что в области образовавшейся раны не произошло никаких повреждений.
  5. Для оценки ранозаживляющего потенциала синтезированных Eu-ZnO-НЧ добавьте в лунки 0 (контроль), 10 и 20 мкг/мл наночастиц Eu-ZnO в сочетании с полной средой с 10% FBS. Поддерживайте экспериментальные планшеты при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не нарушайте монослой клеток во время добавления свежей, полноценной среды. Следите за тем, чтобы монослойные клетки оставались нетронутыми во время инкубации.
  6. Получите микрофотографию через 0 ч и 24 ч с помощью инвертированного микроскопа. Используйте инструмент аннотации для измерения закрытия раны в разные временные интервалы.
    1. Рассчитайте процент закрытия раны по следующей формуле: Закрытие раны (%) = [(миграция клеток (в мкм) в 0 ч - миграция клеток (в мкм) в 24 ч) / миграция клеток (в мкм) в 0 ч] x 100.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Настоящее исследование направлено на синтез наночастиц с использованием коры дерева Eucommia ulmoides . Материал коры полностью высушивали в затененной среде (рис. 1). Материалы коры использовали для приготовления водного экстракта сырой нефти в горячей воде путем нагревания образцов при 130 °С в течение 20 минут. Небольшое изменение температуры и продолжительности может нарушить работу фитосоединений и сделать их непригодными для приготовления водного экстракта. Для синтеза наночас...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Считается, что кора, семена и листья E. ulmoides обладают многочисленными преимуществами для здоровья. Наши результаты показали, что синтез наночастиц EU-ZnO был достигнут с использованием простого и экономически эффективного подхода. Водный экстракт был использован для синтеза наночастиц. Нагревание материала коры при высоких температурах может привести к деградации некоторых фитокомпонентов и снижению эффективности добычи. Фитокомпоненты, присутствующие в водном травяном экстр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать

Благодарности

Авторы хотели бы искренне поблагодарить кафедру клеточной биологии Центрального южного университета, Чанша, Китай, за предоставление приборов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
12-луночный планшетNEST703011Используется для культивирования клеток и анализа
ЦентрифугаSCILOGEXSC1406Используется для отделения наночастиц из коллоидной смеси
Центрифужная пробирка – 15 млBIOFILCFT-312150Для центрифугирования синтезированного раствора 
Центрифужная пробирка – 5 млBiosharp BS-50-CM-SДля хранения наночастиц
CO2 инкубаторThermo scientific3010Для культивирования клеток HUVEC
Шумоподавление водыМиллипорыНе применяется Для приготовления экстракта 
ДМ средаЦитиваSH30243.01Используется для работы с клеточными культурами
ВоронкаТермонаучная42600060Для удержания фильтровальной бумаги во время фильтрации
Стеклянные стаканыБоросиликат 1102-50Используется для приготовления водного экстракта
Печь с горячим воздухомGenetimesNot Apply Используется для сушки наночастиц и сбора в виде порошка
Магнитная мешалкаKYLIN-BELLGL-5250-AИспользуется для синтеза наночастиц
МикроскопNikon EclipseTs2Используется для фотосъемки 
Чашка ПетриNEST753001Используется для сбора наночастиц 
Пипетка 1 млLab Science YEA17AD0055580Взять/добавить определенный объем раствора/извлечь
наконечники для пипетки 1 млSAINING 3014200-TДля взятия/добавления определенного объема раствора/экстракции
Магнитный смеситель из ПТФЭ МешалкиLANRAN Не применимо Используется для процесса синтеза наноматериалов
Гидроксид натрияSigma Alrich71690Используется для регулировки pH во время синтеза
Нержавеющие ножницыDeli6034Используется для измельчения материалов коры
T25 Колба для культуры тканейNEST707001Используется для поддержания клеток 
Весы для взвешивания Radwag AS220R2Используется для взвешивания химикатов 
Ватман фильтровальная бумага No1NewstarGB/T1914-2017Используется для фильтрации экстракта для синтеза
нитрата цинка Sigma Alrich13778-30-8Используется в качестве прекурсора для наночастиц Синтез

Ссылки

  1. Williamson, E. M., Liu, X., Izzo, A. A. Trends in use, pharmacology, and clinical applications of emerging herbal nutraceuticals. Br. J. Pharmacol. 177 (6), 1227-1240 (2020).
  2. Cedillo-Cortezano, M., Martinez-Cuevas, L. R., López, J. A. M., Barrera López, I. L., Escutia-Perez, S., Petricevich, V. L. Use of medicinal plants in the process of wound healing: a literature review. Pharmaceuticals. 17 (3), 303(2024).
  3. Budovsky, A., Yarmolinsky, L., Ben-Shabat, S. Effect of medicinal plants on wound healing. Wound Repair Regen. 23 (2), 171-183 (2015).
  4. Yazarlu, O., et al. Perspective on the application of medicinal plants and natural products in wound healing: A mechanistic review. Pharmacol Res. 174, 105841(2021).
  5. Zhu, M. Q., Sun, R. C. Eucommia ulmoides Oliver: a potential feedstock for bioactive products. J Agric Food Chem. 66 (22), 5433-5438 (2018).
  6. Peng, M., Zhou, Y., Liu, B. Biological properties and potential application of extracts and compounds from different medicinal parts (bark, leaf, staminate flower, and seed) of Eucommia ulmoides: A review. Heliyon. 10 (6), e27870(2024).
  7. Xing, Y. Y., et al. Inhibition of rheumatoid arthritis using bark, leaf, and male flower extracts of Eucommia ulmoides. Evid Based Complement Alternat Med. 2020, 3260278(2020).
  8. Guo, M., et al. Quantitative detection of natural rubber content in Eucommia ulmoides by portable pyrolysis-membrane inlet mass spectrometry. Molecules. 28 (8), 3330(2023).
  9. Yusof, H. M., Rahman, N. A., Mohamad, R., Zaidan, U. H., Samsudin, A. A. Biosynthesis of zinc oxide nanoparticles by cell-biomass and supernatant of Lactobacillus plantarum TA4 and its antibacterial and biocompatibility properties. Sci Rep. 10, 19996(2020).
  10. Gosens, I., et al. Impact of agglomeration state of nano-and submicron sized gold particles on pulmonary inflammation. Part Fibre Toxicol. 7 (1), 37(2010).
  11. Zare, Y. Study of nanoparticles aggregation/agglomeration in polymer particulate nanocomposites by mechanical properties. Compos A Appl Sci Manuf. 84, 158-164 (2016).
  12. Kim, M. G., et al. Effects of calcination temperature on the phase composition, photocatalytic degradation, and virucidal activities of TiO2 nanoparticles. ACS Omega. 6 (16), 10668-10678 (2021).
  13. Aydin Acar, C., Gencer, M. A., Pehlivanoglu, S., Yesilot, S., Donmez, S. Green and eco-friendly biosynthesis of zinc oxide nanoparticles using Calendula officinalis flower extract: Wound healing potential and antioxidant activity. Int Wound J. 21 (1), e14413(2024).
  14. Sana, S. S., et al. Crotalaria verrucosa leaf extract mediated synthesis of zinc oxide nanoparticles: assessment of antimicrobial and anticancer activity. Molecules. 25 (21), 4896(2020).
  15. Zhang, H., Liang, Z., Zhang, J., Wang, W. P., Zhang, H., Lu, Q. Zinc oxide nanoparticle synthesized from Euphorbia fischeriana root inhibits the cancer cell growth through modulation of apoptotic signaling pathways in lung cancer cells. Arab J Chem. 13 (7), 6174-6183 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

наночастицы оксида цинкаэкстракт Eucommia ulmoidesсинтез наноматериалованализ заживления царапины (scratch assay)эндотелиальные клетки человекамиграция клетокэкстракт полиизопренаоценка цитотоксичностимагнитное перемешивание
Рецептура наноматериалов на основе цинка с использованием экстракта коры Eucommia ulmoides и их ранозаживляющий потенциал
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.